DE3788058T2

DE3788058T2 - Zelltoxischer antikörperkomplex und verfahren zu seiner herstellung.

Info

Publication number: DE3788058T2
Application number: DE87905481T
Authority: DE
Inventors: Takeshi Hara; Yoshinori Kato; Naoji Umemoto
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1986-08-28
Filing date: 1987-08-24
Publication date: 1994-04-21
Anticipated expiration: 2007-08-25
Also published as: EP0279862A4; DE3788058D1; EP0279862B1; WO1988001513A1; EP0279862A1; US5030719A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft zytotoxische Antikörperkonjugate, insbesondere zytotoxische Antikörperkonjugate, worin ein folsäureantagonistisch wirksames Folsäureanaloges mit einem Antikörper, der selektiv an ein spezifisches Antigen bei den abzutötenden Zellen bindet, oder mit einem Fragment dieses Antikörpers einschließlich der Antigenbindungsstelle durch ein Oligopeptid konjugiert wird, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Unter einem folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen versteht man eine Substanz, deren Struktur der Folsäure ähnlich ist, die jedoch die Wirkungen der Folsäure oder ihrer Derivate vollständig oder teilweise hemmt. Es sind eine Vielzahl derartiger Substanzen synthetisiert worden, und einige davon wurden in der Chemotherapie von Krebserkrankungen, wie etwa der Leukämie oder maligner Tumoren, eingesetzt.
Es ist bekannt, daß durch Bindung von Methotrexat an den Antikörper unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids als Kondensationsmittel oder eines aktiven Esters von Methotrexat zytotoxische Konjugate von folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen mit einem Antikörper gebildet werden (siehe P.N. Kulkarni et al., Cancer Research 41 : 2700-2706, 1981). Ferner wurde ein Verfahren zur Konjugierung von Methotrexat mit einem Antikörper über Serumalbumin als Brücke beschrieben (M.C. Garnet, Int. J. Cancer 31 : 661-670, 1983). Weder das Verfahren zur Konjugierung eines folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen mit einem Antikörper oder seinen Fragmenten über ein Oligopeptid noch ein derartiges zytotoxisches Antikörperkonjugat sind bisher bekannt. Gebräuchliche Konjugate, wie sie aus der direkten Konjugierung von Methotrexat mit einem Antikörper entstehen, sind im Ausmaß und der Selektivität ihrer zytotoxischen und Antitumorwirksamkeit unbefriedigend. Oligopeptidvermittelte Konjugate dagegen scheinen die Erwartungen bezüglich einer Verbesserung dieser Problematik zu erfüllen. Eine Verbesserung der Antitumorwirksamkeit eines daunomycinsuccinylierten Serumalbuminkonjugates durch Verwendung eines Abstandshalters (Spacer) ist beschrieben (R. Baurain et al., Drugs Exptl. Clin. Res. IX(4):303-311, 1983; EP 0037388).
Von den Erfindern wurden eingehende Untersuchungen zur Entwicklung von Verfahren zur Konjugierung eines folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen mit einem Antikörper oder einem Antikörperfragment über ein Oligopeptid sowie von brauchbaren zytotoxischen Antikörperkonjugaten durch derartige Verfahren angestellt. Das durch Bindung eines folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen an ein Oligopeptid am N-Terminus erhaltene Zwischenprodukt weist Carboxylgruppen sowohl am Folsäureanalogen als auch am C- Terminus des Oligopeptids auf. Es kann daher nicht selektiv nur über die letztgenannte Carboxylgruppe an den Antikörper oder sein Fragment gebunden werden. Die Entwicklung einer neuen Art der Reaktion des Zwischenprodukts mit einem Antikörper oder seinem Fragment einschließlich der Ableitung einer geeigneten reaktiven Verbindung aus dem Zwischenprodukt war daher notwendig.
Die vorliegende Erfindung kam zustande, indem gefunden wurde, daß ein halogeniertes (besonders iodiertes oder bromiertes) Azetylhydrazid hochreaktiv mit einem Antikörper oder seinem Fragment ist, und daß das folsäureantagonistisch wirksame Folsäureanaloge durch den Oligopeptidanteil zu einem halogenierten Azeytlhydrazid geführt werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft zytotoxische Antikörperkonjugate, worin ein folsäureantagonistisch wirksames Folsäureanaloges über ein Oligopeptid bindet, entsprechend der folgenden allgemeinen Formel (I)
(R'-CO-NH-Y-CO-NHNHCOCH&sub2;-NH)n-Ab (I)
worin R', zusammen mit CO, die restliche Gruppe eines folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen, -NH- Y-CO- die restliche Gruppe eines Oligopeptids, das L- Leucyl-L-alanyl-L-leucin enthält, und Ab einen Antikörper oder sein Fragment bedeuten, das Ab benachbarte N-Atom das vom Antikörper oder seinem Fragment stammende N-Atom ist, und n eine ganze Zahl von 1 bis 30 darstellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von zytotoxischen Antikörperkonjugaten einschließlich der oben genannten Konjugate, in anderen Worten also ein Verfahren zur Herstellung von zytotoxischen Antikörperkonjugaten der allgemeinen Formel (II)
(RCONHNHCOCH&sub2;NH)n---Ab (II)
worin R, zusammen mit CO, eine einwertige, von der zytotoxischen Gruppe abgeleitete Gruppe bedeutet, das die Verbindung zu Ab bildende N-Atom vom Antikörper oder seinem Fragment herstammt, und n eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper oder sein Fragment mit einem halogenierten Azetylhyrazidderivat einer zytotoxischen Substanz der allgemeinen Formel (111) zur Reaktion gebracht wird,
RCONHNHCOCH&sub2;X (III)
worin R die gleiche Bedeutung wie in der Formel (II) besitzt und
X ein Halogen und
RCO die folgende Gruppe bedeutet
R'-CO-NH-Y-CO- (IV)
worin R', zusammen mit dem benachbarten CO, die restliche Gruppe eines folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen und -NH-Y-CO- die restliche Gruppe eines Oligopeptids, vorzugsweise die restliche Gruppe eines Oligopeptids, das L-Leucyl-L-alanyl-L-leucin enthält, bedeuten.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet Antikörper ein Immunglobulin, das sich selektiv mit einem spezifischen Antigen zusammenlagert, welches die abzutötenden Zellen, im Folgenden Zielzellen genannt, tragen. Einen derartigen Antikörper erhält man durch ein bekanntes Fraktionierungsverfahren, wie Ethanolfraktionierung, Ammonsulfatfraktionierung, Ionenaustausch- oder Größenausschluß-Säulenchromatographie, oder Protein-A- sepharose-Säulenchromatographie, aus einem Antiserum, das aus einem mit Zielzellen, wie Tumorzellen, immunisierten Tier, wie Affe, Pferd, Rind, Ziege, Schaf, Kaninchen und Huhn, gewonnen ist, oder aus spezifischen Lymphozyten. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Antikörper kann ferner aus dem Zellkulturgemisch von durch Virustransformation von aus einem mit den Zielzellen immunisierten Tier gewonnenen Lymphozyten erhaltenen, transformierten Zellen oder von spezifischen, durch Fusionierung der Lymphozyten mit Myelomzellen gebildeten, antikörperbildenden Zellen (Hybridomazellen), oder aus Serum oder Peritonealflüssigkeit eines Tieres nach Inokulation dieser transformierten oder durch Fusion gebildeten Zellen erhalten werden. Als Antigen zur Immunisierung bei der Herstellung von Antiserum oder antikörperproduzierenden Lymphozyten werden auch aus den Zielzellen extrahierte antigene Substanzen, synthetisch hergestelltes Zielzellenantigen sowie die Zielzellen selbst verwendet. Ferner können bei der Herstellung des Antikörpers auch die, falls nötig durch Behandlung mit einer antigenen Substanz sensibilisierten, menschlichen Lymphozyten als antikörperproduzierende Lymphozyten für die Zelltransformation oder -fusion verwendet werden. Fünf Antikörperklassen, IgG, IgA, IgM, IgD und IgE, sind als Antikörper bekannt und jede dieser Klassen kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Für die vorliegende Erfindung kann entweder der Antikörper als solcher oder aber ein Fragment davon verwendet werden, solange dieses den Teil, z. B. Fab, mit enthält, der sich mit dem Antigen zusammenlagert.
Bei der vorliegenden Erfindung kann der Antikörper auch, falls nötig, chemisch modifizierte, z. B. azylierte Produkte mit einschließen.
Das zytotoxische Antikörperkonjugat gemäß der vorliegenden Erfindung erhält man allgemein, indem man einen Antikörper oder sein Fragment mit einem halogenierten Azetylhydrazidderivat einer zytotoxischen Substanz entsprechend der allgemeinen Formel (III) zur Reaktion bringt,
RCONHNHCOCH&sub2;X (III)
worin R zusammen mit dem benachbarten CO eine einwertige organische Gruppe, die von einer zytotoxischen Substanz abstammt, und
X Halogen bedeuten.
In der allgemeinen Formel (III) bedeutet R zusammen mit der benachbarten CO-Gruppe eine einwertige, von der zytotoxischen Substanz abstammende organische Gruppe, und es werden Substanzen in einem weiten Bereich als zytotoxische Substanzen eingesetzt, solange sie von vornherein Carboxylgruppen aufweisen oder Carboxylgruppen tragende Derivate sind.
Die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugten zytotoxischen Substanzen sind folsäureantagonistisch wirksame Folsäureanaloge. Unter einem folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen versteht man eine Substanz, die als Antagonist die Wirkung von Folsäure in Zellen hemmt, und die eine der nachfolgend gezeigten Struktur der Folsäure ähnliche chemische Struktur aufweist.
Beispiele solcher Substanzen sind Methotrexat, Aminopterin und 10-Ethyl-10-deaza-aminopterin.
In der allgemeinen Formel (I) bedeutet R' zusammen mit der benachbarten CO-Gruppe die restliche Gruppe des folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen. Mit anderen Worten stellt sie eine durch Entfernen einer Carboxylgruppe von dem folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen abgeleitete, einwertige organische Gruppe dar. Beispiele derartiger organischer Gruppen sind die folgenden:
(1) Methotrexatreste
(2) Aminopterinreste
und
(3) 10-Ethyl-10-deaza-aminopterinreste
Das Oligopeptid zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders eingeschränkt. Die Anzahl der Aminosäuren im Oligopeptid beträgt gewöhnlich 3 bis 6. Geeignete Oligopeptide sind z . B. L-Leucyl-L-alanyl-L-leucin, L-Leucyl- L-alanyl-L-leucyl-L-alanin, L-Alanyl-L-leucyl-L-alanyl-L- leucin, Glycyl-glycyl-glycin, Glycyl-L-phenylalanyl-L-leucylglycin oder Glycyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-leucin.
In der allgemeinen Formel (III) bedeutet X ein Halogenatom, vorzugsweise ein Iod-, Brom- oder Chloratom, und besonders bevorzugt ein Iod- oder Bromatom.
Ferner ist in der vorliegenden Erfindung das die L-Leucyl-L- alanyl-L-leucin-Sequenz enthaltende Oligopeptid nicht speziell eingeschränkt, solange die Abspaltung der L-Leucyl- L-alanyl-L-leucin-Sequenz in den Zellen nicht gehemmt wird. Enthält das Oligopeptid neben L-Leucin und L-Alanin andere Aminosäuren als Struktureinheiten, dann weisen diese Aminosäuren vorzugsweise allerdings keine funktionellen Gruppen mit hoher Reaktivität auf. Besonders bevorzugte, die L-Leucyl-L-alanyl-L-leucin-Sequenz enthaltende Oligopeptide sind z. B. L-Leucyl-L-alanyl-L-leucin, L-Leucyl-L-alanyl-L- leucyl-L-alanin, L-Alanyl-L-leucyl-L-alanyl-L-leucin und dergleichen.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Oligopeptidhalogeniertes Azetylhydrazid-Derivat eines folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen der Formeln (II) und (IV) wird hergestellt, in dem man ein Oligopeptidesterderivat eines folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen der folgenden Formel:
R'-CO-NH-Y-COOCH&sub3;
worin R' und Y die gleiche Bedeutung wie in der allgemeinen Formel (IV) besitzen
durch Behandlung mit Hydrazinhydrat zum Hydrazidderivat umsetzt und das Hydrazid mit einem aktivierten Ester einer Halogenessigsäure zur Reaktion bringt.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird das Oligopeptidhalogeniertes Azetylhydrazid-Derivat des folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen der Formeln (III) und (IV) vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 100 Mol pro Mol Antikörper oder Antikörperfragment eingesetzt. Die Reaktion wird beispielsweise durchgeführt, indem man das in einer geringen Menge eines Lösungsmittels, z. B. N,N- Dimethylformamid, gelöste Oligopeptid-halogeniertes Azetylhydrazid-Derivat des folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen einer Lösung des Antikörpers oder Antikörperfragments in einer Pufferlösung vom pH 6 bis 9 (vorzugsweise ist die Proteinkonzentration auf 1 bis 40 mg/ml eingestellt) unter Rühren bei 0 bis 37ºC zusetzt und 15 bis 24 Stunden beläßt. Dann wird das Reaktionsgemisch zum Entfernen des nicht abreagierten Oligopeptid-halogeniertes Azetylhydrazid-Derivates des folsäureantagonistisch wirksamen Folsäureanalogen einer Gelfiltration oder Dialyse unterzogen, wodurch das gewünschte zytotoxische Antikörperkonjugat der Formel (I) gereinigt wird.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele im Einzelnen erläutert.

Beispiel 1

(a) Herstellung von zytotoxischen Antikörperkonjugaten
Ein monoklonaler IgG2a-Mausantikörper gegen Mouse-Mammary- Tumor-Zellen (MM46) (9,1 mg) wurde in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 8,0) gelöst, die 0,1 M Natriumchlorid enthielt, und die Lösung wurde mit 50 ul einer N,N-Dimethylformamid-Lösung (48,8 mg/ml) eines Gemisches eines Methotrexat (im Folgenden MTX abgekürzt)-Derivates der Formel (III-1)
worin A L-Leucyl-L-leucyl-L-alanyl bedeutet
und eines MTX-Derivates der Formel (III-2)
worin A die gleiche Bedeutung wie in der Formel (III-1) besitzt,
vereinigt, um eine Reaktion bei Raumtemperatur über 17 Stunden zu bewirken. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch gründlich gegen phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (abgekürzt PBS) dialysiert und man erhielt 6,8 mg eines zytotoxischen Antikörperkonjugates, worin durchschnittlich 9,4 Moleküle der MTX-Derivate an ein Molekül anti-MM46-Antikörperkonjugat gebunden sind. Die Anzahl der an IgG gebundenen MTX-Moleküle wurde durch Messung der Extinktionen bei 280 und 372 nm (mit E&sub2;&sub8;&sub0; bzw. E&sub3;&sub7;&sub2; bezeichnet) bestimmt. Mit anderen Worten wurde die Konzentration von MTX aus E&sub3;&sub7;&sub2;, diejenige von IgG aus E&sub2;&sub8;&sub0;, das um den MTX-Beitrag korrigiert war, errechnet. Die durchschnittliche Zahl der an ein IgG-Molekül gebundenen MTX- Moleküle wurde aus den auf diese Weise bestimmten Konzentrationen von MTX und IgG berechnet.
Das MTX-Derivat wurde durch eine Kondensationsreaktion von MTX mit einem Peptid, L-Leucyl-L-alanyl-L-leucyl-L- alaninmethylester, in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, Umsetzung des Methylesterprodukts zum Hydrazid mit Hydrazinhydrat und dann Iodazetylierung des Hydrazinrests mit p-Nitrophenyliodazetat erhalten.
(b) Zytotoxizität des zytotoxischen Antikörperkonjugates gegen kultivierte Tumorzellen
MM46-Zellen wurden in PRMI 1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum suspendiert und in einer Mikrotestplatte mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden wurden 0,2 ml pro Vertiefung ausgesät. Danach wurden 0,02 ml von verschieden konzentrierten Lösungen des unter (a) hergestellten, zytotoxischen Antikörperkonjugates im Medium zugesetzt und die Zellen wurden in 5% Kohlendioxidatmosphäre drei Tage bei 37ºC kultiviert. Dies geschah unter keimfreien Bedingungen. Nach der Zellkultur wurden dem Kulturgemisch 0,02 ml 3% Trypanblau-Lösung zugesetzt, um die mit dem Farbstoff nicht angefärbten, lebensfähigen Zellen unter dem Mikroskop auszuzählen.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt. Ohne Zusatz proliferierten die MM46-Zellen nach dreitägiger Kultur zu einer Dichte von ca. 1 · 106 Zellen/ml. Mit steigender Menge des zugesetzten, in (a) hergestellten zytotoxischen Antikörperkonjugates nahm die Zahl der lebensfähigen Zellen jedoch ab.
Insbesondere die Konzentration von 10 uM MTX-Äquivalenten übte eine starke zytotoxische Wirkung aus, und es fanden sich im Vergleich zur Kultur ohne Zusatz von Antikörperkonjugat nur 1% oder weniger lebensfähige Zellen. Tabelle 1 Konzentration des Konjugates Anzahl lebensfähiger Zellen nach dreitägiger Kultur Hemmrate für lebensfähige Zellen (c) Beweis für die Reaktion zwischen dem Iodazetylhydrazid-Derivat von Methotrexat und der Aminogruppe des Antikörpermoleküls (Immunglobulin)
100 ul der Lösung des Iodazetyl-Derivates von Methotrexat der Formel (III-1) (MTX-Derivat) in N,N-Dimethylformamid (13,4 mg/ml) wurden zu 1 ml einer Lösung eines Kaninchen-γ- Globulins (abgekürzt KGG) (5 mg/ml, gelöst in 0,1 M Tris- Pufferlösung (pH 8,0) mit 0,1 M Natriumchlorid) gegeben. Bei diesem Schritt wurde in einem Versuch der KGG-Lösung 1 M Ethanolamid, im anderen Versuch dagegen 0,9%-ige Natriumchloridlösung, jeweils in einer Menge von 100 ul, vorher zugesetzt.
Nach 14-stündiger Reaktion bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch gründlich gegen 10 M Phosphatpufferlösung mit 0,14 M Natriumchlorid (pH 7,2) (abgekürzt PBS) dialysiert, um niedrigmolekulare Reagentien oder dergleichen zu entfernen. Das Dialysat wurde zentrifugiert und die Extinktionen E&sub2;&sub8;&sub0; und E&sub3;&sub7;&sub2; bestimmt. Die Konzentration von KGG wurde aus E&sub2;&sub8;&sub0; errechnet, das um den Beitrag von MTX korrigiert war. Auf diese Weise wurden die Reaktionsrate des MTX-Derivates und das Bindungsverhältnis von MTX zu RGG berechnet.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Nr. Ethanolamin Reaktionsrate MTX-Derivat Bindungsverhältnis MTX zu RGG zugesetzt nicht zugesetzt
Es wurde gefunden, daß sich ohne Zugabe von Ethanolamin unter den obengenannten Bedingungen durchschnittlich 5,8 Moleküle des MTX-Derivates mit einem Molekül RGG zusammenlagern. Bei Zugabe von Ethanolamin wurde die Reaktion deutlich gehemmt und es wurden nur 0,6 Moleküle des MTX-Derivates pro Molekül RGG gebunden. Dies zeigt offensichtlich, daß die Reaktion zwischen dem MTX-Derivat und RGG über Aminogruppen abläuft.

Beispiel 2

Vergleich der Zytotoxizität zwischen zytotoxischem anti-MM46- Antikörperkonjugat, unspezifischem Globulinkonjugat und MTX- Derivat vor der Globulinkonjugierung.
Anstelle von anti-MM46-Antikörper wurde ein normales (oder unspezifisches) Maus-γ-Globulin zur Herstellung eines unspezifischen Globulinkonjugates verwendet, worin durchschnittlich 7,9 Moleküle des MTX-Derivates aus Beispiel 1 an ein Molekül Globulin auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 gebunden wurden.
Die Zytotoxizität gegen kultivierte MM46-Zellen des zytotoxischen anti-MM46-Antikörperkonjugates, hergestellt in Beispiel 1 (a), des unspezifischen Globulinkonjugats, sowie des MTX-Derivates vor Konjugierung an Globulin wurde wie in Beispiel 1 (b) getestet.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengestellt. Das zytotoxische anti-MM4 6-Antikörperkonjugat zeigte zytotoxische Wirkung bei viel geringeren Konzentrationen als die beiden anderen Substanzen. Mit anderen Worten betrug die zur Absenkung der Anzahl lebensfähiger L1201-Zellen auf 50% der ohne Zusatz gefundenen Zahl nötige Konzentration des Antikörperkonjugates nur 1/10 im Vergleich zum unspezifischen Konjugat.
Ferner wurde der Unterschied in der Wirksamkeit zwischen dem anti-MM46-Konjugat, das MTX über das erfindungsgemäße Tetrapeptid trug, und dem entsprechenden unspezifischen Konjugat verglichen mit dem Unterschied zwischen einem herkömmlichen anti-MM46-Konjugat, worin MTX unter Verwendung eines aktiven Esters von MTX direkt an den Antikörper gebunden war, und dem entsprechenden unspezifischen Konjugat. Dabei fand sich, daß dieser im ersten Fall vier mal größer als im letzteren war. Tabelle 3 Pharmakakonzentration Anzahl lebensfähige Zellen nach dreitägiger Kultur Antikörper-Konjugat unspezifisches Globulinkonjugat MTX-Derivat

Beispiel 3

Herstellung von zytotoxischem anti-Humanmelanom- Antikörperkonjugat und Bewertung seiner Antitumorwirksamkeit Anstelle von anti-MM46-Antikörper wurden ein monoklonaler Maus-IgG2a-Antikörper gegen menschliche Melanomzellen und normales (unspezifisches) Kaninchen-γ-Globulin eingesetzt, um nach der selben Vorgehensweise wie im Beispiel 1 (a) zytotoxisches anti-Humanmelanomantikörperkonjugat und ein unspezifisches Globulinkonjugat herzustellen. Diese Konjugate wurde den folgenden Untersuchungen zur Bewertung der Antitumorwirksamkeit unterzogen.
An drei Gruppen von je 5 nackten Mäusen, denen menschliche Melanomzellen, KHm-1, subkutan an der Flanke implantiert worden waren, wurde anti-Humanmelanomzytotoxisches Antikörperkonjugat, unspezifisches Globulinkonjugat bzw. ein Gemisch von anti-Humanmelanom-Antikörper und MTX in der selben Menge wie in dem anti-Humanmelanomzytotoxischen Antikörperkonjugat jeweils dreimal in 5-tägigen Intervallen und beginnend 10 Tage nach der Tumorimplatation verabreicht.
Nackte Mäuse (10 Mäuse), denen keine Medikamente verabreicht wurden, wurden als Kontrolle mitgeführt. Die Tumoren wurden 30 Tage nach der Tumorimplantation exzidiert und gewogen. Eine deutliche Unterdrückung des Tumorwachstums wurde nur in der mit anti-Humanmelanomzytotoxischem Antikörperkonjugat behandelten Gruppe beobachtet. Das durchschnittliche Tumorgewicht in dieser Gruppe betrug 27% desjenigen in der Kontrollgruppe.

Beispiel 4

Anstelle eines Gemisches von MTX-Derivaten der Formeln (III-1) und (III-2) aus Beispiel 1 wurde ein Gemisch von Aminopterin (abgekürzt AMN)-Derivaten der Formel (III-3)
worin A dieselbe Bedeutung wie in der Formel (III-1) besitzt,
und der Formel (III-4)
worin A die gleiche Bedeutung wie in der Formel (III-1) besitzt,
zur Herstellung eines zytotoxischen anti-MM46- Antikörperkonjugates eingesetzt, worin durchschnittlich 7 , 2 Moleküle der Aminopterinderivate auf die selbe Weise wie in Beispiel 1 (a) an ein Molekül IgG gebunden waren.

Beispiel 5

Anstelle eines Gemisches von MTX-Derivaten der Formeln (III-1) und (III-2) aus Beispiel 1 wurde ein Gemisch von MTX- Derivaten der Formel (III-5)
worin E eine L-Leucyl-L-alanyl-L-leucyl-gruppe bedeutet,
und der Formel (III-6)
worin E die gleiche Bedeutung wie in Formel (III-5) besitzt,
zur Herstellung eines zytotoxischen anti-MM46- Antikörperkonjugates eingesetzt, worin durchschnittlich 5, 7 Moleküle der MTX-Derivate an ein Molekül IgG gebunden waren.

Beispiel 6

Anti-Humanmelanom-Antikörper, anstelle des anti-MM4 6- Antikörpers in Beispiel 1, und ein Gemisch von AMN-Derivaten der Formel (III-7)
worin E die gleiche Bedeutung wie in Formel (III-5) besitzt, und der Formel (III-8)
worin E die gleiche Bedeutung wie in Formel (III-5) besitzt,
anstelle des Gemisches von MTX-Derivaten der Formeln (III-1) und (III-2), wurden zur Herstellung eines anti- Humanmelanomzytotoxisches Antikörperkonjugates eingesetzt, worin durchschnittlich 6,1 Moleküle der AMN-Derivate an ein Molekül IgG auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (a) gebunden waren.

Beispiel 7

Anstelle eines Gemisches von MTX-Derivaten der Formeln (III-1) und (III-2) aus Beispiel 1 wurde ein Gemisch von MTX- Derivaten der Formel (III-9)
worin G eine L-Alanyl-L-leucyl-L-alanyl-L-leucylgruppe bedeutet,
und der Formel (III-10)
worin G die gleiche Bedeutung wie in der Formel (III-9) besitzt,
zur Herstellung eines zytotoxischen anti-MM46- Antikörperkonjugates eingesetzt, worin durchschnittlich 8,2 Moleküle der MTX-Derivate an ein Molekül IgG auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (a) gebunden war.

Beispiel 8

Anstelle eines Gemisches von MTX-Derivaten der Formeln (III-1) und (III-2) aus Beispiel 1 wurde ein Gemisch von 10- Ethyl-10-deaza-aminopterin-Derivaten der Formel (III-11)
worin A die gleiche Bedeutung wie in Formel (III-1) besitzt,
und der Formel (III-12)
worin A die gleiche Bedeutung wie in Formel (III-1) besitzt,
zur Herstellung eines anti-Humanmelanomazytotoxisches Antikörperkonjugates eingesetzt, worin durchschnittlich 8, 1 Moleküle der 10-Ethyl-10-deaza-aminopterin-Derivate an ein Molekül IgG auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (a) gebunden waren.

Beispiel 9

Anstelle eines Gemisches von MTX-Derivaten der Formeln (III-1) und (III-2) aus Beispiel 1 wurde ein Gemisch von AMN- Derivaten der Formel (III-13)
worin E die gleiche Bedeutung wie in Formel (III-5) besitzt,
und der Formel (III-14)
worin E die gleiche Bedeutung wie in Formel (III-5) besitzt,
zur Herstellung eines zytotoxischen anti-MM46- Antikörperkonjugates eingesetzt, worin durchschnittlich 2,2 Moleküle der AMN-Derivate an ein Molekül IgG auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (a) gebunden waren.

Claims

1. Zytotoxische Antikörperkonjugate, worin ein Antikörper oder sein Fragment an Folsäure-antagonistische Folsäureanaloge durch ein Oligopeptid bindet und die die allgemeine Formel (I) haben

(R'-CO-NH-Y-CO-NHNHCOCH&sub2;-NH)n-Ab (I)

worin R' zusammen mit CO die restliche Gruppe des Folsäure-antagonistischen Folsäureanalogen darstellt, -NH-Y-CO- die restliche Gruppe eines Oligopeptids darstellt, das L-Leucyl-L-alanyl-L-leucin enthält, Ab einen Antikörper oder sein Fragment darstellt, wobei das N-Atom benachbart zu Ab das Stickstoffatom ist, das vom Antikörper oder seinem Fragment stammt und worin n eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist.

2. Zytotoxische Antikörperkonjugate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

3. Zytotoxische Antikörperkonjugate nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligopeptid L-Leucyl-L-alanyl-L-leucyl-L-alanin, L-Alanyl-L-leucyl-L-alanyl-L-leucin, oder L-Leucyl-L-alanyl-L-leucin ist.

4. Zytotixische Antikörperkonjugate nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Folsäure-antagonistische Folsäureanaloge Methotrexat, Aminopterin oder 10-Ethyl-10-deaza-aminopterin ist.

5. Verfahren zur Herstellung von zytotoxischen Antikörperkonjugaten der allgemeinen Formel (II)

(RCONHNHCOCH&sub2;NH)n-Ab (II)

worin R zusammen mit CO eine einwertige organische Gruppe darstellt, die von der zytotoxischen Substanz stammt, Ab einen Antikörper oder sein Fragment darstellt, wobei das N-Atom, das mit Ab bindet, von einem Antikörper oder seinem Fragment stammt und n eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Antikörper oder sein Fragment mit einem halogenierten Acetylhydrazidderivat einer zytotoxischen Substanz der allgemeinen Formel (III) umsetzt

RCONHNHCOCH&sub2;X (III)

worin die Definition von R die gleiche ist wie in Formel (II) und X ein Halogen darstellt, wobei RCO in den Formeln (II) und (III)

R'-CO-NH-Y-CO- (IV)

ist, worin R' zusammen mit dem benachbarten CO die restliche Gruppe eines Folsäure-antagonistischen Folsäureanalogen darstellt und -NH-Y-CO- die restliche Gruppe eines Oligopeptids bedeutet.

6. Verfahren zur Herstellung von zytotoxischen Antikörperkonjugaten nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß -NH-Y-CO- in der allgemeinen Formel (IV) die restliche Gruppe von Oligopeptiden ist, die L-Leucyl-L-alanyl-L-leucin enthalten.