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DE3786000T2 - Conjugate dichter sterne. - Google Patents

Conjugate dichter sterne.

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DE3786000T2
DE3786000T2 DE8787307266T DE3786000T DE3786000T2 DE 3786000 T2 DE3786000 T2 DE 3786000T2 DE 8787307266 T DE8787307266 T DE 8787307266T DE 3786000 T DE3786000 T DE 3786000T DE 3786000 T2 DE3786000 T2 DE 3786000T2
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DE
Germany
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conjugate
dendrimer
starburst
dense star
conjugate according
Prior art date
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DE8787307266T
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English (en)
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DE3786000D1 (de
DE3786000T3 (de
Inventor
Roberta C Cheng
Michael J Fazio
David M Hedstrand
Donald A Kaplan
William J Kruper
Donald A Tomalia
Ian A Tomlinson
Larry R Wilson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dendritic Nanotechnologies Inc
Original Assignee
Dow Chemical Co
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Publication date
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Publication of DE3786000T2 publication Critical patent/DE3786000T2/de
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Dichtsternpolymeren als Träger für agrochemische, pharmazeutische und andere Materialien.
  • In den letzten Jahren sind als Dichtsternpolymere oder Starburst- (Warenzeichen) Polymere bezeichnete Polymere entwickelt worden. Es wurde festgestellt, daß die Größe, Form und Eigenschaften dieser Dichtsternpolymere oder Starburst- Polymere molekular zugeschnitten werden können, um spezialisierte Endanwendungen zu erfüllen. Starburst-Polymere besitzen erhebliche Vorteile und können ein Mittel zum Transport hoher Konzentrationen von getragenem Material pro Polymereinheit, zum kontrollierten Transport, zum zielgesteuerten Transport und/oder zum Transport oder zur Anwendung mehrerer Spezies bereitstellen.
  • In ihrem weitesten Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung Polymerkonjugatmaterialien, die Dichtsternpolymere oder Starburst-Polymere in Assoziierung mit erwünschten Materialien enthalten (im folgenden werden diese Polymerkonjugate häufig als "Starburst-Konjugate" oder "Konjugate" bezeichnet), ein Verfahren zur Herstellung dieser Konjugate, die Konjugate enthaltende Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung der Konjugate und Zusammensetzungen.
  • Die Konjugate gemäß vorliegender Erfindung eignen sich zur Anwendung in einer Reihe von Einsatzgebieten, wo ein spezifischer Transport erwünscht ist, und sie eignen sich insbesondere zum Transport biologisch wirksamer Mittel. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Starburst-Konjugate aus einem oder mehreren Starburst- Polymeren in Assoziierung mit einem oder mehreren biologisch wirksamen Mitteln gebildet.
  • Die Starburst-Konjugate bringen einen erheblichen Nutzen gegenüber anderen in der Technik bekannten Trägern aufgrund der vorteilhaften Eigenschaften der Starburst-Polymere. Starburst-Polymere zeigen eine molekulare Architektur, die durch eine regelmäßige dendritische Verzweigung mit radialer Symmetrie gekennzeichnet ist. Diese radial symmetrischen Moleküle werden als eine "Starburst-Topologie" besitzend bezeichnet. Diese Polymere werden auf eine Weise hergestellt, die konzentrische dendritische Schichten um einen Initiatorkern ergeben können. Die Starburst-Topologie wird durch die geordnete Assemblierung von organischen Wiederholungseinheiten in konzentrischen, dendritischen Schichten um einen Initiatorkern erreicht; dies erfolgt durch Einführung von Multiplizität und Selbstreplizierung (innerhalb jeder Schicht) auf eine geometrisch fortschreitende Weise über eine Anzahl molekularer Generationen. Die resultierenden hochfunktionalisierten Moleküle sind als "Dendrimere" wegen ihrer verzweigten (baumartigen) Struktur sowie ihrer oligomeren Natur bezeichnet worden. Somit werden die Bezeichnungen Starburst-Oligomer und Starburst-Dendrimer von der Bezeichnung Starburst-Polymer umfaßt.
  • Topologische Polymere mit Größe- und Form-kontrollierten Domänen sind Dendrimere, die kovalent über ihre reaktiven Endgruppen verbrückt sind, und sie werden als "verbrückte Starburst-Dendrimere" bezeichnet. Die Bezeichnung verbrücktes Dendrimer wird ebenfalls von der Bezeichnung "Starburst- Polymer" umfaßt.
  • Die folgende Beschreibung der Figuren hilft beim Verständnis der vorliegenden Erfindung.
  • Fig. 1 zeigt verschiedene Generationen von Starburst-Dendrimeren.
  • Fig. 2A zeigt ein Dendrimer mit unsymmetrischen (ungleichen) Verzweigungen.
  • Fig. 2B zeigt ein Dendrimer mit symmetrischen (gleichen) Verzweigungen.
  • Fig. 3 zeigt Dendrimergrößen relativ zu Antikörperdimensionen.
  • Fig. 4 zeigt Kohlenstoff-13 Spinngitter-Relaxationszeiten (T&sub1;) für in verschiedene Dendrimergenerationen eingelagertes Aspirin, Beispiel 1.
  • Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der dynamischen Analyse von Beispiel 2.
  • Fig. 6 zeigt den Einfluß eines Dendrimers der Generation 6,5 auf die Dialyserate von Pseudoephedrin bei pH 9,5 aus Beispiel 2.
  • Fig. 7 zeigt die Wirkung einer Dendrimerhydrolyse auf die Durchlässigkeit von Pseudoephedrin von Beispiel 3.
  • Fig. 8 zeigt den Vergleich der prozentualen Salicylsäurefreisetzung in das Rezeptorabteil in Gegenwart eines Starburst-Polymers (Gen. = 4.0) bei pH 5,0 und 6,65 mit einer Salicylsäurekontrolle, Beispiel 4.
  • Fig. 9 zeigt den Vergleich des prozentualen Salicylsäureverlusts aus dem Donor-Abteil mit einem Starburst-Polymer (Gen. = 4,0) im Rezeptorabteil bei pH 8,0 gegenüber dem Salicylsäuregehalt, Beispiel 4.
  • Fig. 10 zeigt den Vergleich des prozentualen Salicylsäureverlusts aus dem Donor-Anteil in Gegenwart eines Starburst- Polymer (Gen. = 4,5) gegenüber einer Salicylsäurekontrolle, Beispiel 4.
  • Fig. 11 zeigt Kohlenstoff-13 Spinngitter-Relaxationszeiten (T&sub1;) für in unterschiedliche Dendrimergenerationen eingelagertes 2,4-D, Beispiel 14.
  • Die Starburst-Polymere werden durch Fig. 1 veranschaulicht, worin I einen Initiatorkern (in dieser Figur einen trifunktionalen Initiatorkern, der durch das Bild links außen gezeigt ist) darstellt, Z eine Endgruppe darstellt, die im ersten Fall durch das als sternverzweigtes Oligomer zu bezeichnende zweite Bild von links gezeigt ist; A, B, C, D und E bestimmte molekulare Generationen von Starburst-Dendrimeren darstellen und (A)n, (B)n, (C)n, (D)n und (E)n verbrückte Starburst-Dendrimere darstellen.
  • Die Starburst-Dendrimere sind unimolekulare Assemblierungen, die drei Unterscheidungsmerkmale im Aufbau besitzen, nämlich (a) einen Initiatorkern, (b) innere Schichten (Generationen G), die aus Wiederholungseinheiten zusammengesetzt sind, die radial an den Initiatorkern gebunden ist, und (c) eine äußere Oberfläche mit Endfunktionalitäten (d. h. funktionalen Endgruppen), die an die außen liegende Generation gebunden sind. Die Größe und Form des Starburst-Dendrimer-Moleküls und der im Dendrimer-Molekül vorliegenden funktionalen Gruppen kann durch die Wahl des Initiatorkerns, die Anzahl der Generationen (d. h. Schichten), die bei der Erzeugung des Dendrimers verwendet werden, und die Wahl der bei jeder Generation verwendeten Wiederholungseinheiten reguliert werden. Da die Dendrimere in jeder beliebigen Generation einfach isoliert werden können, wird ein Mittel bereitgestellt, um Dendrimere mit gewünschten Eigenschaften zu erhalten.
  • Die Auswahl der Starburst-Dendrimer-Komponenten beeinflußt die Eigenschaften der Dendrimere. Die Art des Initiatorkerns kann die Dendrimerform beeinflussen, wobei (abhängig von der Wahl des Initiatorkerns) z. B. kugelförmige Dendrimere, zylindrische oder stabförmige Dendrimere, elliptisch geformte Dendrimere oder pilzförmige Dendrimere erzeugt werden können. Ein sequenzieller Aufbau von Generationen (d. h. Generationszahl und die Größe und Art der Wiederholungseinheiten) bestimmt die Dimensionen der Dendrimere und die Art ihres Inneren.
  • Da Dendrimere verzweigte Polymere sind, die dendritische Verzweigungen mit funktionalen Gruppen enthalten, die an der Peripherie der Zweige verteilt sind, können sie mit unterschiedlichen Eigenschaften hergestellt werden. Beispielsweise können Dendrimere wie etwa diejenigen, die in Fig. 2A und Fig. 2B dargestellt sind, unterschiedliche Eigenschaften aufgrund der Zweiglänge besitzen. Der in Fig. 2A (wie etwa US-A-4289872) gezeigte Denkewalter-Typ besitzt asymmetrische Verzweigungen (mit ungleichen Segmenten), (durch Z' dargestellte) Außen- (d. h. Oberflächen-) Gruppen, (durch Z dargestellte) Innengruppierungen, aber einen viel kleineren inneren Leerraum. Der in Fig. 2B gezeigte Starburst-Typ besitzt symmetrische Verzweigungen (mit gleichen Segmenten) mit (durch Z' dargestellten) Oberflächengruppen, zwei (jeweils mit X und Z bezeichnete) unterschiedliche Innengruppierungen mit einem inneren Leerraum, der als Funktion der Generation (G) variiert. Die Dendrimere wie etwa diejenigen, die in Fig. 2B dargestellt sind, können über genügend Generationen aufgebaut werden, um vollständig einen Leeraum einzuschließen und zu enthalten, so daß sich eine Einheit mit einem vorwiegend hohlen Inneren und einer hochverdichteten Oberfläche ergibt.
  • Starburst-Dendrimere zeigen auch bei einem Aufbau über genügend Generationen eine "dichte Starburst-Packung", wo die Oberfläche des Dendrimers genügend Endgruppierungen enthält, so daß die Dendrimeroberfläche dicht wird und Leerräume im Inneren des Dendrimers einschließt. Diese Abdichtung kann für eine Barriere auf molekularer Ebene sorgen, die zur Kontrolle der Diffusion von Materialien in das Innere des Dendrimers oder aus ihm heraus verwendet werden kann.
  • Die Oberflächenchemie der Dendrimere kann auf eine vorbestimmte Weise reguliert werden, indem eine Wiederholungseinheit ausgewählt wird, welche die gewünschte chemische Funktionalität enthält, oder indem die Oberflächenfunktionalitäten vollständig oder teilweise chemisch modifiziert werden, um neue Oberflächenfunktionalitäten zu erzeugen. Diese Oberflächen können entweder auf spezifische Orte zielgerichtet werden oder so hergestellt werden, daß sie gegen eine Aufnahme durch bestimmte Organe oder Zellen z. B. durch retikuloendotheliale Zellen beständig sind.
  • In einer alternativen Anwendung der Starburst-Dendrimere können die Dendrimere selbst zur Erzeugung polydendritischer Gruppierungen ("verbrückte Starburst-Dendrimere") miteinander verknüpft werden, die sich ebenfalls als Träger eignen.
  • Weiterhin können die Dendrimere derart hergestellt werden, so daß sie Abweichungen von der gleichförmigen Verzweigung in bestimmten Generationen besitzen, wodurch ein Mittel der Einführung von Unregelmäßigkeiten (d. h. Abweichungen von der gleichförmigen Verzweigung an bestimmten Orten innerhalb des Dendrimers) und unterschiedlichen Eigenschaften in das Dendrimer vorgesehen wird.
  • Die in den Starburst-Konjugaten gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Starburst-Polymere können gemäß in der Technik bekannten Methoden, z. B. US-A-4,587,329 hergestellt werden.
  • Starburst-Dendrimere können mit einer sehr gleichförmigen Größe und Form hergestellt werden und am wichtigsten ist, daß sie eine größere Anzahl von funktionalen Gruppen pro Oberflächeneinheit des Dendrimers und eine größere Anzahl von funktionalen Gruppen pro Einheit des Molekularvolumens im Vergleich mit anderen Polymeren besitzen können, die das gleiche Molekulargewicht, die gleichen Kern- und Monomerkomponenten und die gleiche Anzahl von Kernverzweigungen wie die Starburst-Polymere aufweisen. Die erhöhte Dichte an funktionalen Gruppen der dichten Starburst-Polymere kann ermöglichen, daß eine größere Materialmenge pro Dendrimer getragen wird. Da die Anzahl von funktionalen Gruppen auf den Dendrimeren auf der Oberfläche und im Inneren reguliert werden kann, sorgt dies auch für ein Mittel zur Regulierung von beispielsweise der Menge eines biologisch wirksamen Mittels, das pro Dendrimer transportiert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Starburst-Polymere, insbesondere die Starburst-Dendrimere zielgesteuerte Träger von biologisch wirksamen Mitteln, die zum Transport der biologisch wirksamen Mittel zu einem bestimmten Zielorganismus oder zu einer bestimmten Determinante oder Stelle in einem Zielorganismus in der Lage sind.
  • Es kann eine Analogie zwischen Starburst-Dendrimeren der frühen Generationen (d. h. Generation = 1 bis 7) und klassischen sphärischen Micellen festgestellt werden. Die Dendrimer-Micellen-Analogie stammt aus einem Vergleich von Merkmalen, die sie gemeinsam haben, wie etwa Form, Größe und Oberfläche. Tabelle I Parameter Reguläre klassische Micellen Starburst-Dendrimere Form sphärisch Größe (Durchmesser) Oberflächenaggregationszahl Z = 6-192 (Z ist die Anzahl von Oberflächengruppen) (Generation = 2-7) Fläche/Oberflächengruppe (Ų) (1 Å = 10&supmin;¹ nm, 1 Ų 10&supmin;² nm²).
  • In Tabelle I wurde die Form durch Scanner-Transmissionselektronenmikrograph-(STEM)-Mikroskopie und Messungen der intrinsischen Viskosität (n) verifiziert. Die Größe wurde durch Messungen der intrinsischen Viskosität [n] und Größenausschlußchromatographie (SEC) verifiziert. Die Oberflächenaggregationszahlen wurden durch Titrimetrie und Hochfeld-NMR verifiziert. Die Fläche/Oberflächengruppe wurde aus hydrodynamischen SEC-Messungen berechnet.
  • Die ersten fünf Generationen von Starburst-Polyamidamin- (PAMAM)-Dendrimeren sind Mikrodomänen, die klassischen sphärischen Mizellen in nahezu jeder Hinsicht (d. h. Form, Größe, Anzahl von Oberflächengruppen und Fläche/Oberflächengruppen) sehr ähneln. Ein großer Unterschied ist jedoch, daß sie im Vergleich zur dynamischen äquilibrierenden Art von Mizellen kovalent fixiert und robust sind. Dieser Unterschied ist ein erheblicher Vorteil bei Verwendung dieser Mikrodomänen als Verkapselungsvorrichtungen.
  • Wenn weitere konzentrische Generationen über fünf hinaus angefügt werden, tritt eine Verdichtung der Oberfläche ein. Diese Verdichtung kann zu erhöhten Barriereeigenschaften an der Oberfläche führen und zeigt sich als kleinerer Oberflächenbereich pro Kopf- (Oberflächen)-Gruppe, wie aus Tabelle II hervorgeht. Tabelle II PAMAM-Dendrimer Merkmale bezüglich der Generation Generationen Anzahl von Oberflächengruppen, Z Molekulargewicht Durchmesser* gemessen mit SEC Oberflächenbereich pro Dendrimer Z-Gruppe Abstand zwischen Z-Gruppen Leervolumen * Hydrodynamische Durchmesser wurden durch Größenausschlußchromatographie-Messungen bestimmt, die gegen monodisperse (Mw/Mn = 1,02) Polyethylenoxidstandards kalibriert worden waren. 1 Å = 10&supmin;¹ nm; 1 Ų = 10&supmin;² nm²; 1 ų = 10&supmin;³ nm³.
  • Amin-terminierte Generationen 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 und 9,0 haben beispielsweise verringerte Oberflächenbereiche von 104, 92, 73, 47 bzw. 32 Ų (1,04, 0,92, 0,73, 0,47 bzw. 0,32 nm² pro Z-Gruppe. Dieses Merkmal entspricht einem Übergang von einer weniger verdichteten mizellenartigen Oberfläche zu einer stärker verdichteten Doppelschicht/Monoschicht-barriereartigen Oberfläche, die normalerweise bei Vesikeln (Liposomen) oder Membranen von Langmuir-Blodgett-Typ auftritt.
  • Bei Auftreten dieser Oberflächenverdichtung sollte die Veränderung in den physikalischen Eigenschaften und der Morphologie beobachtet werden, wenn sich die Generationen von der mittleren Generation (6 bis 8) zu den fortgeschrittenen Generationen (9 oder 10) erhöhen. Die Scanner-Transmissionselektronenmikrographien (STEM) für Generationen = 7,0, 8,0 und 9,0 wurden erhalten, nachdem das Methanol-Lösungsmittel aus allen Proben entfernt wurde, um farblose, leicht gelbe feste Filme zu ergeben. Die vorhergesagte morphologische Veränderung trat im Stadium der Generation G = 9,0 auf. Die Mikrodomänen bei Generation = 9,0 messen etwa 33 Å (3,3 nm) im Durchmesser und sind von einem farblosen Rand umgeben, der etwa 25 Å (2,5 nm) dick ist. Offensichtlich wurde Methanol- Lösungsmittel im Inneren der 25 Å (2,5 nm), einer äußeren Membran ähnlichen Barriere eingeschlossen, um das dunkel gefärbte Innere zu ergeben. Somit verhält sich bei der Generation = 9,0 das Starburst-PAMAM topologisch wie ein Vesikel (Liposom). Dieses Starburst ist jedoch verglichen mit einem Liposom eine Größenordnung kleiner und stark monodispergiert. Folglich können die vorliegenden Dendrimere zur molekularen Verkapselung von mit Lösungsmittel gefüllten Leerräumen eines Durchmessers von etwa 33 Å (3,3 nm) (Volumen etwa 18.000 ų, 18 nm³) oder mehr verwendet werden. Diese wie Mizellen großen Prototypen scheinen sich in diesem fortgeschrittenen Generationsstadium wie ein kovalent fixiertes Liposom zu verhalten. Dieses Verhalten ermöglicht, daß diese Prototypen eine zusätzliche Fähigkeit als Träger für z. B. nicht-chelatierende Radionuklide in Starburst-Antikörperkonjugaten für die Behandlung verschiedener Krankheiten bei Säugern besitzen.
  • Da die Anzahl von funktionalen Gruppen auf den Dendrimeren an der Oberfläche und im Inneren reguliert werden kann, wird auch ein Mittel zur Regulierung der Menge von pro Dendrimer transportiertem getragenem Material bereitgestellt. In einer Ausführungsform sind die Dendrimere zielgesteuerte Träger von Mitteln, die zum Transport des getragenen Materials, beispielsweise eines biologisch wirksamen Mittels, zu beispielsweise einer Pflanze oder einem Schädling oder einer bestimmten Determinante oder Stelle in einem Zielorganismus in der Lage sind.
  • Dendrimere, die sich zur Anwendung in den Konjugaten gemäß vorliegender Erfindung eignen, umfassen die Dichtsternpolymere oder Starburst-Polymere, die in US-A-4,507,466, 4,558,120, 4,568,737 und 4,587,329 beschrieben sind.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Starburst-Konjugat, das mindestens ein Starburst-Polymer in Assoziierung mit mindestens einem getragenen agrochemischen, pharmazeutischen oder anderen Material enthält. Starburst- Konjugate, die sich innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung befinden, umfassen diejenigen, die durch die Formel dargestellt sind:
  • (P)x * (M)y (I)
  • worin jedes P ein Dendrimer darstellt,
  • x eine ganze Zahl von 1 oder größer darstellt,
  • jedes M eine Einheit (z. B. ein Molekül, Atom, Ion und/oder eine andere Basiseinheit) eines getragenen Materials darstellt, wobei das getragene Material das gleiche getragene Material oder ein unterschiedliches getragenes Material sein kann, wobei das getragene Material vorzugsweise ein biologisch wirksames Mittel ist,
  • y eine ganze Zahl von 1 oder größer darstellt und
  • * bedeutet, daß das getragene Material mit dem Dendrimer assoziiert ist.
  • Bevorzugte Starburst-Konjugate der Formel (I) sind diejenigen, worin M ein Arzneimittel, Pestizid, Radionuklid, Chelatierungsmittel, chelatiertes Metall, Toxin, Antikörper, Antikörperfragment, Antigen, Signalerzeugungsmittel, z. B. fluoreszierende Einheiten, Signalreflektor, z. B. paramagnetische Einheiten oder Signalabsorptionsmittel z. B. Elektronen- Strahl-Trübungsmittel, Duftstoff, Pheromon oder Farbstoff ist. Es ist besonders bevorzugt, daß x = 1 und y = 2 oder mehr ist.
  • Auch umfaßt sind Starburst-Konjugate von Formel (I), worin die Starburst-Dendrimere gegebenenfalls über Linkergruppen kovalent miteinander verknüpft sind, verbrückte Starburst- Dendrimere, so daß polydendritische Assemblierungen gebildet werden (d. h. worin x > 1 ist). Die Anwendungen dieser verbrückten Starburst-Dendrimere umfassen topisch kontrollierte Freisetzungsmittel, Strahlungssynovektomie und andere.
  • Wie hier verwendet bedeutet "assoziiert mit", daß das getragene Material bzw. die getragenen Materialien im Kern des Dendrimers verkapselt oder eingeschlossen, teilweise oder vollständig im Dendrimer dispergiert oder mit dem Dendrimer verbunden oder verknüpft sein können oder jede beliebige Kombination davon. Die Assoziierung des getragenen Materials bzw. der getragenen Materialien und des Dendrimers bzw. der Dendrimere kann gegebenenfalls unter Verwendung von Verbindungsmitteln und/oder Spacern erfolgen, um die Herstellung oder Anwendung der Starburst-Konjugate zu erleichtern. Geeignete Verbindungsgruppen sind Gruppen, die ein Zielsteuerungsmittel (d. h. T) mit dem Dendrimer (d. h. P) verknüpfen, ohne die Wirksamkeit des Steuerungsmittels oder die Wirksamkeit eines oder mehrerer anderer getragener Materialien (d. h. M), die im Starburst-Konjugat vorhanden sind, nennenswert zu beeinträchtigen. Diese Verbindungsgruppen können spaltbar oder nicht spaltbar sein und werden typischerweise verwendet, um eine sterische Hinderung zwischen dem Zielsteuerungsmittel und dem Dendrimer zu vermeiden, vorzugsweise sind die Verbindungsgruppen stabil (d. h. nicht spaltbar). Da die Größe, Form und Dichte der funktionalen Gruppen der Starburst-Dendrimere streng reguliert werden kann, gibt es viele Wege, auf die das getragene Material mit dem Dendrimer assoziiert werden kann. Es kann beispielsweise (a) eine kovalente, Coulomb'sche, hydrophobe oder chelatierende Assoziierung zwischen dem getragenen Material bzw. den getragenen Materialien und Einheiten, typischerweise funktionalen Gruppen bestehen, die sich an oder nahe der Oberfläche des Dendrimers befinden, (b) eine kovalente, Coulomb'sche, hydrophobe oder chelatierende Assoziierung zwischen dem getragenen Material bzw. den getragenen Materialien und Gruppierungen bestehen, die sich im Inneren des Dendrimers befinden, (c) das Dendrimer hergestellt werden, so daß es ein vorwiegend leeres Inneres besitzt, wobei ein physikalischer Einschluß der getragenen Materialien im Inneren (Leervolumen) ermöglicht wird, wobei die Freisetzung des getragenen Materials gegebenenfalls durch Verdichtung der Oberfläche des Dendrimers mit Diffusionskontrollgruppierungen reguliert werden kann oder (d) verschiedene Kombinationen der zuvor genannten Phänomene verwendet werden.
  • Dendrimere, die hier durch "P" dargestellt sind, umfassen die Dichtsternpolymere, die in US-A-4,507,466, 4,558,120, 4,568,737 oder 4,587,329 beschrieben sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die, hier durch "M" dargestellten getragenen Materialien pharmazeutische Materialien. Solche Materialien, die sich zur Anwendung in den Starburst-Konjugaten eignen, umfassen beliebige Materialien für eine in vivo oder in vitro Anwendung zur diagnostischen oder therapeutischen Behandlung von Säugern, die mit dem Dichtstern-Dendrimer assoziiert sein können, ohne die physikalische Beständigkeit des Dendrimers nennenswert zu stören, beispielsweise Arzneimittel wie etwa Antibiotika, Analgetika, Hypertensiva und Cardiotonika wie etwa Acetaminaphen, Acyclovir, Alkeran, Amikacin, Ampicillin, Aspirin, Bisantren, Bleomycin, Necardiostatin, Chlorambucil, Chloramphenicol, Cytarabin, Daunomycin, Doxorubicin, Fluoruracil, Gentamycin, Ibuprofen, Kanamycin, Meprobamat, Methotrexat, Novantron, Nystatin, Oncovin, Phenobarbital, Polymyxin, Probucol, Procarbabizin, Rifampin, Streptomycin, Spectinomycin, Symmetrel, Thioguanin, Tobramycin, Trimethoprim, Valban und Toxine wie etwa Diphtherietoxin, Gelonin, Exotoxin A, Abrin, Modeccin, Ricin oder toxische Fragmente davon, Metallionen wie etwa die Alkali- und Erdalkalimetalle, Radionuklide wie etwa diejenigen, die von Aktiniden oder Lanthaniden oder anderen ähnlichen Übergangselementen oder von anderen Elementen erzeugt werden, wie etwa &sup6;&sup7;Cu, &sup9;&sup0;Y, ¹¹¹In, ¹³¹I, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup0;&sup5;Rh, 99mTe, &sup6;&sup7;Ga, ¹&sup5;³Sm, ¹&sup5;&sup9;Gd, ¹&sup7;&sup5;Yb, ¹&sup7;&sup7;Lu, &sup8;&sup8;Y, ¹&sup6;&sup6;Ho, 115mIn, ¹&sup0;&sup9;Pd, &sup8;²Rb, ¹&sup9;&sup4;Ir, &sup4;&sup0;Ba, &sup4;&sup9;Pm, ¹&sup9;&sup9;Au, ¹&sup4;&sup0;La und ¹&sup8;&sup8;Re, Signalerzeugungsmittel wie etwa fluoreszierende Einheiten, Signalreflektoren wie etwa paramagnetische Einheiten, z. B. &sup5;&sup6;Fe, Gd, &sup5;&sup5;Mn, chelatiertes Metall wie etwa ein beliebiges der angegebenen Metalle, ob sie radioaktiv sind oder nicht, in Assoziierung mit einem Chelator, Signalabsorptionsmittel wie etwa Elektronenstrahl-Trübungsmittel, Antikörper, einschließlich monoklonaler Antikörper und Anti-Idiotyp- Antikörper, Antikörperfragmente, Hormone, Modifizierungsmittel von biologischen Reaktionen wie etwa Interleukine, Interferone, Viren und virale Fragmente, diagnostische Trübungsmittel und fluoreszierende Gruppierungen. Getragene pharmazeutische Materialien umfassen Fängermittel wie etwa Chelatoren, Antigene, Antikörper oder beliebige Gruppierungen, die zum selektiven Einfang therapeutischer oder diagnostischer Mittel in der Lage sind.
  • In einer anderen Ausführungsform sind die hier durch "M" dargestellten getragenen Materialien agrochemische Materialien. Derartige Materialien, die sich zur Anwendung in den Starburst-Konjugaten eignen, umfassen beliebige Materialien für eine in vivo oder in vitro Behandlung, Diagnose oder Ausbringung auf Pflanzen oder Nicht-Säuger (einschließlich Mikroorganismen), die mit dem Starburst-Dendrimer assoziiert sein können, ohne die physikalische Beständigkeit des Dendrimers nennenswert zu stören. Die getragenen Materialien können beispielsweise Toxine wie etwa Diphtherietoxin, Gelonin, Exotoxin A, Abrin, Modeccin, Ricin oder toxische Fragmente davon, Metallionen wie etwa die Alkali- und Erdalkalimetalle, Radionuklide wie etwa diejenigen, die aus Aktiniden oder Lanthaniden oder anderen ähnlichen Übergangselementen oder aus anderen Elementen erzeugt werden, wie etwa &sup6;&sup7;Cu, &sup9;&sup0;Y, ¹¹¹In, ¹³¹I, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup0;&sup5;Rh, 99mTe, &sup6;&sup7;Ga, ¹&sup5;³Sm, ¹&sup5;&sup9;Gd, ¹&sup7;&sup5;Yb, ¹&sup7;&sup7;Lu, &sup8;&sup8;Y, ¹&sup6;&sup6;Ho, 115mIn, ¹&sup0;&sup9;Pd, &sup8;²Rb, ¹&sup9;&sup4;Ir, ¹&sup4;&sup0;Ba, ¹&sup4;&sup9;Pm, ¹&sup9;&sup9;Au, ¹&sup4;&sup0;La und ¹&sup8;&sup8;Re, Signalerzeugungsmittel wie etwa fluoreszierende Einheiten, Signalreflektoren wie etwa paramagnetische Einheiten, Signalabsorptionsmittel wie etwa Elektronenstrahl-Trübungsmittel, Hormone, Modifizierer von biologischen Reaktionen wie etwa Interleukine, Interferone, Viren und virale Fragmente, Pestizide einschließlich antimikrobielle Mittel, Algizide, Arithelmetica, Acarizide, Insektizide, Lockmittel, Abschreckmittel, Herbizide und/oder Fungizide wie etwa Acephat, Acifluorfen, Alachlor, Atrazin, Benomyl, Bentazon, Captan, Carbofuran, Chlorpicrin, Chlorpyrifos, Chlorsulfuroncyanazin, Cyhexatin, Cypermithrin, 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure, Dalapon, Dicamba, Diclofop-methyl, Diflubenzuron, Dinoseb, Endothall, Ferbam, Fluazifob, Glyphosat, Haloxyfop, Malathion, Naptalam, Pendimethalin, Permethrin, Picloram, Propachlor, Propanil, Sethoxydin, Temephos, Terbufos, Trifluralin, Triforin und Zineb sein. Getragene agrochemische Materialien umfassen Fängermittel wie etwa Chelatoren, chelatiertes Metall (ob radioaktiv oder nicht) oder beliebige Gruppierungen, die zum selektiven Einfang therapeutischer oder diagnostischer Mittel in der Lage sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfassen die hier durch "M" dargestellten getragenen Materialien, die sich zur Anwendung in den Starburst-Konjugaten eignen, beliebige Materialien, die von agrochemischen oder pharmazeutischen Materialien verschieden sind und mit dem Starburst-Dendrimer assoziiert werden können, ohne die physikalische Beständigkeit des Dendrimers erheblich zu stören, beispielsweise Metallionen wie etwa die Alkali- und Erdalkalimetalle, Signalerzeugungsmittel wie etwa fluoreszierende Einheiten, Signalreflektoren wie etwa paramagnetische Einheiten, Signalabsorptionsmittel wie etwa Elektronenstrahl-Trübungsmittel, Pheromongruppierungen und Duftstoffgruppierungen, Farbstoffgruppierungen. Getragene Materialien umfassen Fängermittel wie etwa Chelatoren oder andere beliebige Gruppierungen, die zum selektiven Einfang unterschiedlicher Mittel in der Lage sind.
  • Vorzugsweise sind die getragenen Materialien biologisch wirksame Mittel. Wie hier verwendet bedeutet "biologisch wirksam" eine wirksame Einheit wie etwa ein Molekül, Atom, Ion und/oder eine andere Einheit, die zum Nachweisen, Identifizieren, Hemmen, Behandeln, Katalysieren, Bekämpfen, Abtöten, Verstärken oder Modifizieren einer Zieleinheit wie etwa einem Protein, Glycoprotein, Lipoprotein, Lipid, einer Zielzelle, einem Zielorgan, einem Zielorganismus äbeispielsweise ein Mikroorganismus, eine Pflanze oder ein Tier (einschließlich Säuger wie etwa Menschen) oder einer anderen Zielgruppierung in der Lage ist.
  • Die Starburst-Konjugate von Formel (I) werden durch Kontaktieren von P mit M üblicherweise in einem geeigneten Lösungsmittel bei einer Temperatur hergestellt, welche die Assoziierung des getragenen Materials (M) mit dem Starburst- Dendrimer (P) erleichtert.
  • Geeignete Lösungsmittel sind Lösungsmittel, in denen P und M mindestens teilweise mischbar sind und die gegenüber der Bildung des Konjugats inert sind. Wenn P und M mindestens teilweise miteinander mischbar sind, ist ein Lösungsmittel nicht unbedingt erforderlich. Sofern erwünscht, kann man Gemische geeigneter Lösungsmittel verwenden. Beispiele solcher geeigneter Lösungsmittel sind Wasser, Methanol, Ethanol, Chloroform, Acetonitril, Toluol, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.
  • Die Reaktionsbedingungen für die Bildung des Starburst-Konjugats von Formel (I) hängen von dem jeweiligen Dendrimer (P), dem getragenen Material (M) und der Art der gebildeten Bindung (*) ab. Wenn beispielsweise P das PEI (Polyethylenimin) Starburst-Dendrimer mit einer Methylencarboxylat-Oberfläche und M ein Radionuklid z. B. Yttrium ist, dann wird die Reaktion bei Raumtemperatur in Wasser durchgeführt. Wenn jedoch P ein Ester-terminiertes Polyamidamin (PAMAM) Starburst-Dendrimer und M Aspirin ist, dann wird die Reaktion bei Raumtemperatur in Chloroform durchgeführt. Typischerweise kann die Temperatur von Raumtemperatur bis Rückflußtemperatur reichen. Die Auswahl des jeweiligen Lösungsmittels und der jeweiligen Temperatur ist für den Fachmann ohne weiteres zu erkennen.
  • Das Verhältnis von M : P hängt von der Größe des Dendrimers und der Menge von getragenem Material ab. Das molare Verhältnis (Verhältnis von Molen) eines beliebigen ionischen M zu P ist z. B. üblicherweise 0,1 bis 1.000 : 1, vorzugsweise 1 bis 50 : 1 und besonders bevorzugt 2 bis 6 : 1. Das Gewichtsverhältnis eines beliebigen Arzneimittels, Pestizids, organischen Stoffes oder Toxins M zu P ist üblicherweise 0,1 bis 5 : 1 und vorzugsweise 0,5 bis 3 : 1.
  • Wenn ein M ein Radionuklid ist, gibt es drei Wege, auf denen die Starburst-Konjugate hergestellt werden können, nämlich: (1) P kann als Chelator verwendet werden. Ein PEI mit Methylencarboxylat-Oberfläche oder PAMAM chelatiert beispielsweise ein Metall wie etwa Yttrium oder Indium. (2) Ein Chelat kann kovalent an P gebunden werden. Ein Amin-terminiertes PEI Starburst-Dendrimer kann beispielsweise mit 1-(p- Isothiocyanatobenzyl)diethylentriaminpentaessigsäure umgesetzt und dann chelatiert werden, oder ein Komplex wie etwa mit Isothiocyanatobenzyl-2,3,2-tet chelatiertes Rhodiumchlorid kann umgesetzt werden. (3) Ein vorchelatiertes Radionuklid kann mit P durch hydrophobe oder ionische Wechselwirkung assoziiert werden.
  • Andere, besonders zur Verwendung mit pharmazeutischen Materialien bevorzugte Starburst-Konjugate sind diejenigen Konjugate, die ein Zielsteuerungsmittel (hier als "T" bezeichnet) enthalten und die durch die Formel dargestellt sind:
  • (T)e * (P)x * (M)y (II)
  • worin
  • jedes T ein Zielsteuerungsmittel bedeutet,
  • e eine ganze Zahl von 1 oder größer bedeutet und
  • P, x, *, M und y wie hier zuvor definiert sind.
  • Bevorzugt unter den Starburst-Konjugaten von Formel (II) sind diejenigen, in denen M ein Arzneimittel, Pestizid, Radionuklid, Chelatierungsmittel, chelatiertes Metall, Toxin, Signalerzeugungsmittel, Signalreflektor oder Signalabsorptionsmittel ist. Bevorzugte Konjugate sind auch diejenigen Konjugate, in denen e = 1 oder 2 ist und diejenigen, in denen x = 1 und y = 2 oder mehr ist. Besonders bevorzugte Konjugate sind diejenigen, in denen x = 1, e = 2, y = 2 oder mehr ist und M und T mit dem Polymer über die gleichen oder unterschiedliche Verbindungsmittel assoziiert sind.
  • Die Starburst-Konjugate von Formel (11) werden entweder durch Bildung von T*P und dann Zugabe von M oder durch Bildung von P*M und dann Zugabe von T hergestellt. Jedes Reaktionsschema wird bei Temperaturen, die für die jeweilige Konjugatkomponente nicht schädlich sind, und, sofern erforderlich, in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels durchgeführt. Zur Kontrolle des pH-Werts werden Puffer oder die Zugabe einer geeigneten Säure oder Base verwendet. Die Reaktionsbedingungen hängen vom gebildeten Assoziierungstyp (*), dem verwendeten Starburst-Dendrimer (P), dem getragenen Material (M) und dem Zielsteuerungsmittel (T) ab. Wenn T beispielsweise ein monoklonaler Antikörper und M ein Radionuklid ist, dann erfolgt die T*P-Assoziierung durch eine funktionale Gruppe wie etwa ein Isothiocyanat in Wasser oder in Wasser mit einem organischen Modifizierungsmittel wie etwa Acetonitril oder Dimethylformamid. Üblicherweise erfolgt die Konjugation in einem Puffer bei pH 7 bis 10, vorzugsweise pH 8,5 bis 9,5. Das gebildete Konjugat wird dann mit einem Radionuklid wie etwa Yttriumacetat, vorzugsweise bei Raumtemperatur chelatiert. Alternativ können P und M vor der Konjugation mit T chelatiert werden, üblicherweise in Wasser. Die Konjugation mit T erfolgt in einem geeigneten Puffer.
  • Das Verhältnis von T : P ist vorzugsweise 1 : 1, insbesondere wenn T ein Antikörper oder Fragment ist. Das Verhältnis von M P ist wie zuvor.
  • Zielsteuerungsmittel, welche die Starburst-Konjugate zielsteuern können, sind Einheiten, die bei Verwendung in den Starburst-Konjugaten gemäß vorliegender Erfindung dazu führen, daß mindestens ein Teil der Starburst-Konjugate zu einem gewünschten Ziel (z. B. ein Protein, Glycoprotein, Lipoprotein, Lipid, eine Zielzelle, ein Zielorgan, ein Zielorganismus oder eine andere Zielgruppierung) transportiert wird und umfassen Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente wie etwa Fab, Fab', F(ab')&sub2; Fragmente oder beliebige andere Antikörperfragmente mit der erforderlichen Zielspezifität, Hormone, Modifizierungsmittel von biologischen Reaktionen, Epitope und chemische Funktionalitäten, welche Zielspezifität zeigen.
  • Die Antikörper oder Antikörperfragmente, die in hier beschriebenen bevorzugten Starburst-Konjugaten verwendet werden können, sind durch im Fachgebiet wohlbekannte Techniken herstellbar. Hochspezifische monoklonale Antikörper können durch Hybridisierungstechniken hergestellt werden, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, siehe z. B. Köhler und Milstein (1975, Nature 256:495 bis 497 und 1976, Eur. J. Immunol. 6:511 bis 519). Derartige Antikörper besitzen normalerweise eine hochspezifische Reaktivität.
  • In den Antikörper-zielgesteuerten Starburst-Konjugaten können Antikörper verwendet werden, die gegen jedes Antigen oder Hapten gerichtet sind. Obwohl man gewöhnliche polyklonale Antikörper verwenden kann, bieten monoklonale Antikörper mehrere Vorteile. Jeder monoklonale Antikörper ist für ein einzelnes Epitop hochspezifisch. Weiterhin können große Mengen jedes monoklonalen Antikörpers erzeugt werden. In der vorliegenden Erfindung verwendete Antikörper können z. B. gegen Tumoren, Bakterien, Pilze, Viren, Parasiten, Mycoplasmen, Differenzierungs- und andere Zellmembranantigene, pathogene Oberflächenantigene, Toxine, Enzyme, Allergene, Arzneimittel und beliebige biologisch wirksame Moleküle gerichtet sein. Für eine vollständigere Liste von Antigenen, siehe US-A-4,193,983.
  • Es mag wünschenswert sein, mehrere Antikörper oder Fragmente mit dem Dendrimer zu verbinden und in bestimmten Fällen Antikörper unterschiedlicher Spezifitäten zu verbinden. Es kann beispielsweise ein bifunktionales Konjugat, welches die Fähigkeit zur Lokalisierung und Bindung an einen Tumor und zum anschließenden Einfang zirkulierender zytotoxischer, diagnostischer oder biostatischer Verbindungen besitzt, entwickelt werden.
  • In Abwesenheit eines Zielsteuerungsmittels (oder in Gegenwart eines Zielsteuerungsmittels, sofern gewünscht) können aufgrund der Anzahl von funktionalen Gruppen, die an oder nahe der Oberfläche des Dendrimers lokalisiert sein können, alle oder ein erheblicher Teil dieser funktionalen Gruppen anionisch, kationisch, hydrophob oder hydrophil gemacht werden, um den Transport des Starburst-Konjugats zu einem gewünschten Ziel mit der entgegengesetzten Ladung oder zu einem hydrophob oder hydrophil kompatiblen Ziel wirksam zu unterstützen.
  • Die Herstellung der Konjugate von Formel (II) unter Verwendung einer Schutzgruppe (S) ist auch als Verfahren zur Herstellung der Konjugate von Formel (II) anzusehen. Das Reaktionsschema ist im folgenden gezeigt: Beladung Schutzgruppenentfernung Verknüpfung
  • worin
  • S*P das geschützte Dendrimer bedeutet,
  • S*P*M das geschützte Dendrimer konjugiert mit M bedeutet,
  • P*M das mit M konjugierte Dendrimer (Starburst- Konjugat) bedeutet,
  • T*P*M das mit dem Zielsteuerungsmittel verknüpfte Starburst-Konjugat bedeutet.
  • Man kann geeignete Lösungsmittel verwenden, die P*M nicht beeinträchtigen. Wenn S beispielsweise t-Butyloxycarbonyl ist, dann kann S durch eine wäßrige Säure entfernt werden.
  • Wenn die getragenen Materialien pharmazeutische Materialien sind, sind auch Starburst-Konjugat bevorzugt, worin das Polymer direkt oder über Verbindungsmittel assoziiert ist, diese Starburst-Konjugat sind durch die Formel dargestellt:
  • [(T)e - (C')f]g * (P)x * [(C'')h - (M)y]k (III)
  • worin jedes C' die gleiche oder eine verschiedene Verbindungsgruppe darstellt,
  • jedes C'' die gleiche oder eine verschiedene Verbindungsgruppe darstellt,
  • g und k jeweils einzeln eine ganze Zahl von 1 oder größer bedeuten,
  • f und h jeweils einzeln eine ganze Zahl von 0 oder größer bedeuten,
  • - eine kovalente Bindung in Fällen bedeutet, wo eine Verbindungsgruppe vorhanden ist, und
  • P, x, *, M, y, T und e wie hier zuvor definiert sind.
  • Unter den Starburst-Konjugat von Formel (III) sind diejenigen bevorzugt, worin M ein Radionuklid, Arzneimittel, Toxin, Signalerzeugungsmittel, Signalreflektor oder Signalabsorptionsmittel ist. Ebenfalls bevorzugt sind diejenigen Konjugate, worin x = 1. Besonders bevorzugte Konjugate sind diejenigen, worin x, e, f, h und y jeweils 1 sind und g 1 oder mehr ist und k 2 oder mehr ist. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Konjugate, worin x, e, f, h, y und g jeweils 1 sind und k 2 oder mehr ist. Ebenfalls besonders bevorzugt sind diejenigen Starburst-Konjugat, worin M ein biologisch wirksames Mittel wie etwa ein Radionuklid, Arzneimittel oder Toxin bedeutet.
  • Geeignete, durch C'' dargestellte Verbindungsgruppen sind Gruppen, die das getragene pharmazeutische Material mit dem Dendrimer verknüpfen, ohne die Wirksamkeit des getragenen pharmazeutischen Materials oder die Wirksamkeit des Zielsteuerungsmittels oder der Zielsteuerungsmittel, die im Starburst-Konjugat vorhanden sind, nennenswert zu beeinträchtigen. Diese Verbindungsmittel können stabil (d. h. nicht spaltbar) oder spaltbar sein, abhängig von der Wirkungsweise des getragenen pharmazeutischen Materials, und sie werden typischerweise verwendet, um eine sterische Hinderung zwischen dem getragenen pharmazeutischen Material und dem Polymer zu vermeiden.
  • Am meisten bevorzugt sind Konjugate, worin das Dendrimer direkt oder über eine oder mehrere Verbindungsgruppen mit einem einzigen Antikörper oder Antikörperfragment assoziiert ist. Das Polymer in diesen bevorzugten Konjugaten kann gegebenenfalls zusätzlich direkt oder über eine oder mehrere Verbindungsgruppen mit einem oder mehreren anderen getragenen Materialien, vorzugsweise einem Radioisotop, assoziiert sein. Solche Starburst-Konjugat sind durch die Formel dargestellt:
  • [(Antikörper)e - (C')f]g * (P)x * [(C'')h - (M)y]k (IV)
  • worin
  • jeder Antikörper ein zur Wechselwirkung mit einem gewünschten Epitop fähigen Antikörper oder ein derartiges Antikörperfragment bedeutet,
  • - eine kovalente oder Coloumb'sche Bindung in Fällen bedeutet, wo eine Verbindungsgruppe vorhanden ist, und
  • P, x, *, M, T, e, y, C', C'', g, k, f, und h wie hier zuvor definiert sind.
  • Für die obige Synthese von Starburst-Dendrimeren (P), die eine zur Verknüpfung mit einem Zielsteuerungsmittel (T) verfügbare funktionale Gruppe (C' oder C'') besitzen, erfordert das bevorzugte Verfahren, daß die reaktive Funktionalität als synthetischer Vorläufer geschützt ist. Dieser Schutz ist bevorzugt, da er die Synthese von Dendrimer oder Konjugaten mit sehr hoher Qualität ermöglicht. Dieses Verfahren ermöglicht die chemische Bindung einer Einheit von getragenem pharmazeutischem Material (M) an die terminalen funktionalen Gruppen des Starburst-Dendrimers (P) auf Arten, die ansonsten auch zu einer Reaktion mit einer funktionalen Linkergruppe führen würden, wodurch es unmöglich gemacht wird, das Zielsteuerungsmittel (T) anzuheften. Eine anschließende Schutzgruppenentfernung oder synthetische Umsetzung zur gewünschten funktionalen Linkergruppe ermöglicht somit, daß das Starburst-Konjugat mit dem Zielsteuerungsmittel verknüpft wird.
  • Eine der bevorzugten "funktionalen Gruppen zur Verknüpfung" (hier im folgenden als "Linker" bezeichnet) ist eine Anilingruppierung. Diese Gruppe ist bevorzugt, da sie direkt zur Verknüpfung mit dem Zielsteuerungsmittel verwendet werden kann oder auf einfache Weise zu anderen funktionalen Gruppen modifiziert werden kann, die sich zur Reaktion mit dem Zielsteuerungsmittel eignen, z. B. Isothiocyanat, Isocyanat, Semithiocarbazid, Semicarbazid, Bromacetamid, Jodacetamid und Maleimid. Die Anilingruppierung ist ebenfalls als Linker zur Verknüpfung mit den Zielsteuerungsmitteln bevorzugt, da sie zur Verwendung in der Starburst-Dendrimeren-Synthese leicht geschützt werden kann, oder die Nitrogruppe kann als Vorstufe verwendet werden, die am Ende der Synthese zur gewünschten Aminofunktion überführt werden kann.
  • Es gibt eine Anzahl von Schutzgruppen, die sich zum Schutz der Anilin-Aminofunktionalität während der Starburst- Dendrimer-Synthese eignen. (Siehe Theodora W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, Pub. John Wiley & Son, New York, 1981). Eine bevorzugte Klasse von Schutzgruppen sind die im folgenden gezeigten Carbamate.
  • Viele Carbamate werden zum Schutz von Aminen verwendet. Das am meisten bevorzugte Carbamat für die Starburst-Dendrimer- Synthese ist das t-Butoxycarbamat, R = -C(CH&sub3;)&sub3;. Die Schutzgruppenentfernung erfolgt durch eine milde saure Hydrolyse. Ebenfalls bevorzugt ist die Benzylcarbamat-Schutzgruppe,
  • die bevorzugt ist, wenn das Dendrimer gegenüber einer sauren Hydrolyse empfindlich ist. Die Schutzgruppenentfernung erfolgt durch katalytische Hydrierung. Ebenfalls bevorzugt ist das 9-Fluorenyl-methylcarbamat,
  • Die Phthalimid-Schutzgruppe ist ebenfalls ein bevorzugtes Beispiel
  • Andere für Amine verwendete Schutzgruppen, die in der Literatur wohlbekannt sind, können ebenfalls in diesem Synthesenschema verwendet werden. Die obigen Bevorzugungen sind nur als erläuternde Beispiele angegeben, es sind aber nicht die einzigen Schutzgruppen, die verwendet werden können. Jede beliebige Schutzgruppe, die unter den Reaktionsbedingungen stabil ist und ohne Änderung der Beständigkeit des Starburst- Dendrimers entfernt werden kann, ist verwendbar.
  • Beim obigen Verfahren kann eine Aminophenyl-Funktionalität in jedes beliebige Mittel eingeführt werden, das eine Aminogruppe enthält, die dann mit einem biologisch wirksamen Mittel, z. B. einem monoklonalen Antikörper oder Enzym konjugiert werden kann. Das Mittel kann durch oxidative Kopplung an Kohlehydrate auf dem biologisch wirksamen Mittel, z. B. Antikörper konjugiert werden. Die Aminophenylgruppe kann auch in ein Isothiocyanat oder ein Isocyanat für eine nachfolgende Reaktion mit Aminoseitengruppen von Lysinresten auf dem biologisch wirksamen Mittel überführt werden.
  • Ein alternatives Verfahren umfaßt die Reaktion eines aktivierten Arylhalogenids, z. B. 4-Nitrofluorbenzol, mit einer Aminofunktion auf dem Mittel zur Konjugation, z. B. Starburst- Polyethyleniminen (PEI) und die nachfolgende katalytische Hydrierung der Nitrogruppe zur Anilinfunktionalität zur nachfolgenden Konjugation. Es eignet sich besonders für Mittel, z. B. Polyamine, die aufgrund der relativen chemischen Reaktionsträgheit der Nitrophenylfunktionalität gegenüber allen nicht-reduzierenden Reaktionsbedingungen eine weitere Modifizierung vor der Anwendung benötigen. Die gebräuchlicheren bifunktionalen Verknüpfungsmittel, z. B. Aktivester oder Diioscyanate, die unter einer großen Anzahl von Reaktionsbedingungen reaktiv sind und die sie zur Konjugation ungeeignet machen würden, umfassen:
  • Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung nitro-substituierter Arylsulfonylhalogenide, um Sulfonamide zu ergeben,
  • Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber bekannten Verfahren der Einführung einer Aminophenylgruppe zur Konjugation ist, daß diese in einem späten Stadium der Synthese stattfindet. Gansow et al., US-A-4,472,509 führten in ihrem Verfahren die Nitrophenylgruppe im ersten Schritt einer langen Syntheseprozedur ein, wodurch Einschränkungen bezüglich der verfügbaren Chemie auftraten.
  • Bei diesem Verfahren wird auch ein Linker eingeführt, der vom Rest des Moleküls klar differenzierbar ist. Manabe et al. offenbarten, daß die Ringöffnung von Succinanhydrid durch Aminreste eine Kopplungsgruppe ergab, durch welche eine Konjugation an einen Antikörper möglich war. Diese Methode lieferte jedoch kein Mittel zur Differenzierung zwischen nicht-chelatierten Stellen auf dem Polymer, da die Chelatierungsgruppen gleich wie die Verknüpfungsgruppe waren.
  • Das vorliegende Verfahren ermöglicht auch eine direkte Chelatierung von Lanthaniden mit Starburst-Dendrimeren, vorzugsweise mit PEI-Acetat-Dendrimer. Im Gegensatz dazu stellt Denkewalter, US-A-4,289,872 fest, daß die einfache Positionierung von Acetaten an der Oberfläche funktioniert. Die vorliegende Reaktion zeigt jedoch, daß PEI-Acetat viel besser als PAMAM arbeitet, d. h. die Oberfläche von Iminodiacetaten ist nicht alleine wichtig, die Art des Rückgrats und der Verzweigung sind ebenfalls bedeutsam. Das PEI-Acetat besitzt bessere Chelatierungseigenschaften als das PAMAM-Acetat.
  • Bevorzugt unter den Starburst-Konjugaten von Formel (IV) sind diejenigen, worin M ein Radionuklid, Arzneimittel, Toxin, Signalerzeugungsmittel, Signalreflektor oder Signalabsorptionsmittel ist. Ebenfalls bevorzugt sind diejenigen Konjugate, worin x = 1. Besonders bevorzugt sind diejenigen Konjugate, worin x, e, f, h und y jeweils 1 sind und g 1 oder mehr ist und k jeweils unabhängig 2 oder mehr ist. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Konjugate, worin x, e, f, h, y und g jeweils 1 sind und k 2 oder mehr ist. Ebenfalls besonders bevorzugt sind diejenigen Starburst-Konjugate, worin "Antikörper" einen monoklonalen Antikörper oder ein Epitop-bindendes Fragment davon bedeutet und ganz besonders bevorzugt sind diejenigen, worin M ein biologisch wirksames Mittel wie etwa ein Radionuklid, Arzneimittel oder Toxin bedeutet.
  • Die Starburst-Konjugate können für eine Reihe von diagnostischen in vitro oder in vivo Anwendungen wie etwa Radioimmuntests, Elektronenmikroskopie, Enzym-gekoppelte Immunsorbens- Tests, magnetische Kernresonanzspektroskopie, Kontrastabbildung und Immunszintographie, in analytischen Anwendungen, in therapeutischen Anwendungen als Träger von Antibiotika, Radionukliden, Arzneimitteln oder anderen Mitteln, die zum Einsatz bei der Behandlung von Krankheitszuständen wie etwa Krebs, Autoimmunkrankheiten, Störungen des Zentralnerven- Systems, infektiösen Krankheiten und Herzkrankheiten geeignet sind, in Anwendungen zur biologischen Bekämpfung als Mittel zum Transport von Pestiziden wie etwa Herbiziden, Fungiziden, Abschreckmitteln, Lockmitteln, antimikrobiellen Mitteln oder anderen Toxinen verwendet werden oder sie können als Ausgangsmaterialien zur Herstellung anderer geeigneter Mittel verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Starburst-Konjugat- Zusammensetzungen, worin die Starburst-Konjugatee mit anderen geeigneten Vehikeln formuliert werden. Die Starburst-Konjugat-Zusammensetzungen können gegebenenfalls weitere Wirkstoffe, Additive und/oder Verdünnungsmittel enthalten.
  • In der erfindungsgemäßen Ausführungsform mit agrochemischen Materialien können die Starburst-Konjugate mit geeigneten Vehikeln formuliert werden, die in der Agrochemie nützlich sind, wie etwa auf Pflanzen, Brachland oder als Pestizide oder bei einer in vivo oder in vitro Testbehandlung von Nicht-Säugern. Ein agrochemisch verträgliches Träger- oder Verdünnungsmittel, das ebenfalls mit einem oder mehreren Starburst-Konjugaten gemäß vorliegender Verbindung vorhanden sein kann, umfaßt diejenigen Träger- oder Verdünnungsmittel, die üblicherweise in granulären Formulierungen, emulgierbaren Konzentraten, Lösungen oder Suspensionen verwendet werden, wie etwa z. B. Toluol, Xylol, Benzol, Phenol, Wasser, Methan, Kohlenwasserstoffe und Naphthalin.
  • Das bevorzugte Starburst-Polymer zum Einsatz in den Starburst-Konjugaten gemäß vorliegender Erfindung ist ein Polymer, das als Starburst-Polymer bezeichnet werden kann, das mindestens einen Zweig (im folgenden als Kernzweig bezeichnet), vorzugsweise zwei oder mehrere Zweige besitzt, die von einem Kern ausgehen, wobei der Zweig mindestens eine Endgruppe besitzt, vorausgesetzt, daß (1) das Verhältnis von Endgruppen zu den Kernzweigen mehr als eins, vorzugsweise zwei oder größer ist, (2) die Dichte von Endgruppen pro Volumeneinheit im Polymer mindestens 1,5 mal derjenigen eines gestreckten konventionellen Sternpolymers mit ähnlichen Kern- und Monomergruppierungen und einem vergleichbaren Molekulargewicht und einer vergleichbaren Anzahl von Kernverzweigungen ist, wobei alle derartigen Zweige des gestreckten konventionellen Sternpolymers nur eine Endgruppe tragen, und (3) ein Molekularvolumen, das nicht mehr als 80% des Molekularvolumens des gestreckten konventionellen Sternpolymers ist, wie durch Dimensionsuntersuchungen unter Verwendung von proportionalen Corey-Pauling-Molekularmodellen bestimmt wird. Wie hier verwendet bedeutet die Bezeichnung "dicht" in Kombination mit "Sternpolymer" oder "Dendrimer", daß ein kleineres Molekularvolumen als bei einem gestreckten konventionellen Sternpolymer mit dem gleichen Molekulargewicht vorliegt. Das gestreckte konventionelle Sternpolymer, das als Basis zum Vergleich mit dem Dichtsternpolymer verwendet wird, weist das gleiche Molekulargewicht, gleiche Kern- und Monomerkomponenten und die gleiche Anzahl von Kernzweigen wie das Dichtsternpolymer auf. Unter "gestreckt" ist zu verstehen, daß die einzelnen Zweige des konventionellen Sternpolymers auf ihre Maximallänge gestreckt oder ausgedehnt sind, z. B. wie derartige Zweige vorliegen, wenn das Sternpolymer vollständig in einem idealen Lösungsmittel für das Sternpolymer solvatisiert ist. Weiterhin ist, obwohl die Anzahl von Endgruppen für das Dichtsternpolymermolekül größer als für das konventionelle Sternpolymermolekül ist, die chemische Struktur der Endgruppen gleich.
  • In den Konjugaten gemäß vorliegender Erfindung verwendete Dendrimere können durch in der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Die obigen Dendrimere, die verschiedenen Coreaktanten und Kernverbindungen und das Verfahren für ihre Herstellung können wie in US-A-4,587,329 definiert sein.
  • Die Dendrimere zur Verwendung in den Konjugaten gemäß vorliegender Erfindung können Endgruppen besitzen, die ausreichend reaktiv sind, um Additions- oder Substitutionsreaktionen eingehen zu können. Beispiele solcher Endgruppen umfassen Amin, Hydroxy, Mercapto, Carboxy, Alkenyl, Allyl, Vinyl, Amid, Halogen, Harnstoff, Oxiranyl, Aziridinyl, Oxazolinyl, Imidazolinyl, Sulfonat, Phosphonat, Isocyanat und Isothiocyanat. Die Endgruppen können modifiziert werden, um sie biologisch inert zu machen, z. B. um sie nicht-immunogen zu machen oder um eine unspezifische Aufnahme in der Leber, Milz oder einen anderen Organ zu vermeiden. Die Dendrimere unterscheiden sich von konventionellen Stern- oder verzweigten Sternpolymeren dadurch, daß die Dendrimere eine größere Konzentration von Endgruppen pro Einheit Molekularvolumen als konventionelle gestreckte Sternpolymere mit einer äquivalenten Anzahl von Kernzweigen und einer äquivalenten Kernzweiglänge besitzen. Die Dichte von Endgruppen pro Volumeneinheit im Dendrimer ist daher üblicherweise mindestens 1,5 mal der Dichte von Endgruppen im konventionellen gestreckten Sternpolymer, vorzugsweise mindestens 5 mal, besonders bevorzugt mindestens 10 mal, am meisten bevorzugt 15 bis 50 mal. Das Verhältnis von Endgruppen pro Kernzweig im dichten Polymer ist vorzugsweise mindestens 2, besonders bevorzugt mindestens 3, am meisten bevorzugt von 4 bis 1024. Für ein gegebenes Molekulargewicht des Polymers ist das Molekularvolumen des Dichtsternpolymers vorzugsweise weniger als 70 Volumenprozent, besonders bevorzugt von 16 bis 60, am meisten bevorzugt von 7 bis 50 Volumenprozent des Molekularvolumens des gestreckten konventionellen Sternpolymers.
  • Bevorzugte Dendrimere zum Einsatz in den Konjugaten gemäß vorliegender Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, daß sie einen einwertigen oder mehrwertigen Kern besitzen, der kovalent mit dendritischen Zweigen verbunden ist. Eine solche geordnete Verzweigung kann durch die folgende Sequenz veranschaulicht werden, worin G die Anzahl von Generationen bedeutet:
  • Mathematisch kann die Beziehung zwischen der Anzahl (#) von Endgruppen auf einem dendritischem Zweig und der Anzahl von Generationen des Zweigs wie folgt dargestellt werden:
  • # von terminalen Gruppen pro dendritischem Zweig = NrG/2
  • worin G die Anzahl von Generationen ist und Nr die Multiplizität der Wiederholungseinheit ist, die mindestens zwei wie im Falle vom Aminen ist. Die Gesamtzahl von Endgruppen im Dendrimer wird wie folgt bestimmt:
  • # von Endgruppen pro Dendrimer = Nc NrG/2
  • worin G und Nr wie zuvor definiert sind und Nc die Valenz (oft als Kernfunktionalität bezeichnet) der Kernverbindung bedeutet. Demzufolge können die erfindungsgemäßen Dendrimere in ihren Komponentenanteilen wie folgt dargestellt werden: (Kern) (Wiederholungseinheit) Endgruppierung
  • worin der Kern, die Endgruppierung, G und Nc wie zuvor definiert sind und die Wiederholungseinheit eine Valenz oder Funktionalität von Nr + 1 besitzt, worin Nr wie zuvor definiert ist.
  • Ein copolymeres Dendrimer, bei dem es sich für die Zwecke dieser Erfindung um ein bevorzugtes Dendrimer handelt, ist eine einzigartige Verbindung, die aus polyfunktionalen Monomereinheiten in einer hochverzweigten (dendritischen) Anordnung konstruiert ist. Das Dendrimermolekül wird aus einer polyfunktionalen Initiatoreinheit (Kernverbindung), polyfunktionalen Wiederholungseinheiten und Endeinheiten, die gleich wie die Wiederholungseinheiten oder davon verschieden sein können, hergestellt. Die Kernverbindung ist durch die Formel (Zc)Nc dargestellt, worin den Kern bedeutet, Zc die an gebundenen funktionalen Gruppen bedeutet und Nc die Kernfunktionalität bedeutet, die vorzugsweise 2 oder mehr, am meisten bevorzugt 3 oder mehr ist. Somit umfaßt das Dendrimermolekül einen polyfunktionalen Kern der an eine Anzahl (Nc) von funktionalen Gruppen Zc gebunden ist, von denen jede mit dem monofunktionalen Ende einer Wiederholungseinheit X¹Y¹(Z¹)N¹ der ersten Generation verbunden ist und alle Z-Gruppen der Wiederholungseinheit einer Generation an ein monofunktionales Ende einer Wiederholungseinheit der nächsten Generation gebunden sind, bis die Endgeneration erreicht ist.
  • Im Dendrimermolekül sind die Wiederholungseinheiten innerhalb einer einzelnen Generation gleich, können sich aber von Generation zu Generation unterscheiden. In der Wiederholungseinheit X¹Y¹(Z¹)N¹ bedeutet X¹ das monofunktionale Ende der Wiederholungseinheit der ersten Generation, Y¹ bedeutet die die erste Generation bildende Gruppierung, Z¹ bedeutet die funktionelle Gruppe des polyfunktionalen Kopfes der Wiederholungseinheit der ersten Generation und kann gleich wie die funktionalen Gruppen der Kernverbindung (Zc)Nc oder anderer Generationen oder davon verschieden sein und N¹ ist eine Zahl von 2 oder mehr, am meisten bevorzugt 2, 3 oder 4, welche die Multiplizität des polyfunktionalen Kopfes der Wiederholungseinheit in der ersten Generation bedeutet. Im allgemeinen wird die Wiederholungseinheit durch die Formel XiYi(Zi)Ni dargestellt, worin "i" die jeweilige Generation von der ersten bis zur t-1 Generation bedeutet. In einem bevorzugten Dendrimermolekül ist daher jedes Z¹ der Wiederholungseinheit der ersten Generation mit einem X² einer Wiederholungseinheit der zweiten Generation verbunden und so weiter über die Generationen hinweg, so daß jede Zi-Gruppe für eine Wiederholungseinheit XiYi(Zi)Ni in der Generationsnummer "i" mit dem Ende (Xi+1) der Wiederholungseinheit der Generationsnummer "i+1" verbunden ist. Der Abschluß oder das Ende eines bevorzugten Dendrimermoleküls umfaßt Endeinheiten XtYt(Zt)Nt, worin t eine Endgeneration darstellt und Xt, Yt, Zt und Nt gleich wie Xi, Yi, Zi und Ni oder davon verschieden sein können, abgesehen davon, daß es keine mit den Zt-Gruppen verbundene Nachfolgegeneration gibt und Nt weniger als zwei sein kann, z. B. null oder eins. Das bevorzugte Dendrimer hat daher eine molekulare Formel, die dargestellt ist durch
  • worin i 1 bis t-1 ist,
  • worin die Symbole wie zuvor definiert sind. Die π Funktion ist das Produkt aller Werte zwischen ihren definierten Grenzen. Daher ist
  • die die Anzahl von Wiederholungseinheiten XiYi(Zi)Ni ist, umfassend die i-te Generation eines dendritischen Zweigs, und wenn i 1 ist, dann ist
  • π&sup0; = 1.
  • n = 1.
  • In Dendrimer-Copolymeren unterscheidet sich die Wiederholungseinheit für eine Generation von der Wiederholungseinheit in mindestens einer anderen Generation. Die bevorzugten Dendrimere sind sehr symmetrisch, wie in den im folgenden beschriebenen Strukturformeln veranschaulicht ist. Bevorzugte Dendrimere können durch Kontakt mit einem anderen Reagenz in funktionalisierte Dendrimere überführt werden. Die Überführung von Hydroxyl in der Endgeneration zu einem Ester durch Reaktion mit einem Säurechlorid ergibt beispielsweise ein durch Ester terminal funktionalisiertes Dendrimer. Diese Funktionalisierung muß nicht bis zum theoretischen Maximum, das durch die Anzahl verfügbarer funktionaler Gruppen definiert ist, durchgeführt werden und daher braucht ein funktionalisiertes Dendrimer keine hohe Symmetrie oder genau definierte Molekularformel besitzen, wie es beim bevorzugten Dendrimer der Fall ist.
  • In einem Dendrimer-Homopolymer sind alle Wiederholungseinheiten XiYi(Zi)Ni identisch. Da die Werte aller Ni gleich sind (definiert als Nr), vereinfacht sich die die Anzahl von Wiederholungseinheiten darstellende Produktfunktion auf eine einfache exponentielle Form. Daher kann die molekulare Formel in einfacherer Form ausgedrückt werden als:
  • worin i = 1 bis t-1 ist.
  • Diese Form zeigt immer noch den Unterschied zwischen den verschiedenen Generationen i, die jeweils aus NcN(i-1)r Wiederholungseinheiten XiYi(Zi)Ni bestehen. Eine Kombination der Generationen zu einem Term ergibt:
  • oder
  • Kern Wiederholungseinheit Endeinheit
  • worin XrYr(Zr)Nr die Wiederholungseinheit ist, die in allen Generationen i verwendet wird.
  • Wenn demzufolge eine Polymerverbindung unter diese obigen Formeln fällt, dann ist das Polymer ein Starburst-Polymer. Wenn dagegen eine Polymerverbindung nicht unter diese obigen Formeln fällt, dann ist das Polymer kein Starburst-Polymer. Zur Bestimmung, ob ein Polymer ein Starburst-Polymer ist, ist es auch nicht notwendig, das Verfahren zu kennen, durch das es hergestellt wurde, sondern nur, ob es unter die Formeln fällt. Die Formeln zeigen auch die Generationen (G) oder den Schichtaufbau von Dendrimeren.
  • Es ist klar, daß es verschiedene Wege zur Bestimmung des Verhältnisses von Mittel (M) zu Dendrimer (P) gibt, die davon abhängen, wie und wo die Assoziierung von P*M auftritt. Wenn eine innere Verkapselung vorliegt, ist das Gewichtsverhältnis M : P üblicherweise 10 : 1, vorzugsweise 8 : 1, besonders bevorzugt 5 : 1, am meisten bevorzugt 3 : 1. Das Verhältnis kann bis auf 0,5 : 1 bis 0,1 : 1 hinabreichen. Wenn man eine innere Stöchiometrie verwendet, ist das Gewichtsverhältnis von M : P gleich wie für die innere Verkapselung. Wenn man die äußere Stöchiometrie bestimmt, wird das Mol/Mol-Verhältnis von M : P durch die folgenden Formeln angegeben:
  • M : P
  • (A) 5 NcNtNrG-1 1
  • (B) 3 NcNtNrG-1 1
  • (C) 1 NcNtNrG-1 1
  • worin Nc die Kernmultiplizität bedeutet, Nt die Multiplizität der Endgruppe bedeutet und Nr die Multiplizität an den Verzweigungen bedeutet. Der Term NcNtNrG-1 ergibt die Anzahl von Z-Gruppen. Daher ergibt sich beispielsweise das obige (A), wenn Proteine, Enzyme oder hochgeladene Moleküle an der Oberfläche sind, das obige (B), wenn es sich um Aspirin, 2,4- D oder Octansäure handelt, das obige (C) wenn es sich um Carboxylationen oder Gruppen handelt.
  • Natürlich können andere Strukturen unterschiedlicher Dimensionen auf einfache Weise durch den Fachmann durch geeignete Variation der verwendeten Dendrimerkomponenten und Zahl von Generationen hergestellt werden. Ein grober Vergleich drei unterschiedlicher Dendrimerserien bezüglich eines IgG-Antikörpers ist in Fig. 3 ersichtlich. Die durch Fig. 3 (B) I bezeichnete Serie von Abbildungen zeigt die Starburst-Polyamidamine (PAMAM), durch II sind die Starburst-Polyether (PE) gezeigt und durch III sind die Starburst-Polyethylenimine (PEI) gezeigt. Auf eine ähnliche Weise wie in Fig. 1 zeigt in allen drei Serien (I, II und III) die Abbildung links außen den Initiatorkern, die nächste Abbildung von links zeigt das Sternverzweigungsoligomer und die restlichen Abbildungen zeigen die Starburst-Oligomere und die jeweiligen verbrückten Starburst-Dendrimere. Es ist ersichtlich, daß in dieser Serie von maßstäblichen Abbildungen die Dendrimerdimensionen ähnlich wie und in der Tat kleiner als wie für den IgG-Antikörper in Fig. 3 (A) angegeben sind. Der IgG-Antikörper ist links außen in Fig. 3 gezeigt. Der Maßstab ist 1 mm = 3,5 Å (0,35 nm). In Fig. 3 (A) sind die variable Region durch (A), die konstante Region durch (B) und die Kohlehydratbindungsstellen durch (C) bezeichnet. In Fig. 3 gezeigte Maße sind ungefähr (1) = 35 bis 40 Å (3,5 bis 4,0 nm), (2) = 70 Å (7,0 nm) und (3) = 60 Å (6,0 nm). Diese Dimensionseigenschaften beispielsweise bevorzugt, wenn die Zielsteuerung den Austritt aus dem vaskulären System umfaßt. Daher sind Dendrimerdurchmesser von 125 Å-Einheiten (12,5 nm) oder weniger besonders bevorzugt, da sie den Austritt aus dem vaskulären System zu Zielorganen ermöglichen, der durch kontinuierliche oder mit Öffnungen versehene Kapillaren erfolgt. Diese Dimensionen sind bedeutsam, da sie gegenüber der Größe einer möglichen Zielsteuerungskomponente wie etwa einem Antikörper (siehe Fig. 3) klein sind. Ein lineares Polymer mit vergleichbarem Molekulargewicht würde (in seiner vollständig gestreckten Form) einen Rotationsradius aufweisen, der viel größer als der eines Dendrimers mit gleichem Molekulargewicht wäre. Ein lineares Polymer dieses Typs würde vermutlich die molekularen Erkennungseigenschaften vieler bekannter Zielsteuerungskomponenten beeinträchtigen. Es ist auch wünschenswert, daß die Konjugate ein minimales Molekularvolumen besitzen, um nicht eine Extravasation zu verhindern, z. B. durch Kopplung von Fab, Fab' oder einem anderen geeigneten Antikörperfragment an Dendrimere mit geringem Molekularvolumen.
  • Dendrimere sind für den Transport von Radionukliden oder stark paramagnetischen Metallionen an Tumorstellen aufgrund ihrer Fähigkeit zur Chelatierung einer Anzahl von Metallionen in einem kleinen Raumvolumen günstig. Durch Kopplung an Antikörper oder Antikörperfragmente, die für Tumore spezifisch sind, kann man mit nur einer einzigen Modifizierung des Antikörpers mehrere Metalle pro Antikörper transportieren.
  • Die Verknüpfung von Zielsteuerungsmitteln mit Dendrimeren ist ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, insbesondere wenn die Verwendung eines Antikörpers als Zielsteuerungsmittel gewünscht ist, kann ohne weiteres eine reaktive funktionale Gruppe, wie etwa ein Carboxyl, Sulfhydryl, reaktiver Aldehyd, reaktives Olefinderivat, Isothiocyanat, Isocyanat, Amin, reaktives Arylhalogenid oder reaktives Alkylhalogenid auf dem Dendrimer verwendet werden. Die reaktiven funktionalen Gruppen können in das Dendrimer unter Verwendung bekannter Techniken eingeführt werden, beispielsweise:
  • (1) Verwendung eines heterofunktionalen Initiators (als Ausgangsmaterial zur Synthese des Dendrimers), in den funktionale Gruppen unterschiedlicher Reaktivität eingeführt worden sind. In einem solchen heterofunktionalen Initiator dient mindestens eine der funktionalen Gruppen als Initiationsstelle für die Dendrimerbildung mindestens eine andere der funktionalen Gruppen steht zur Verknüpfung mit einem Zielsteuerungsmittel zur Verfügung, ist aber nicht in der Lage, eine Dendrimersynthese zu initieren. Die Verwendung eines geschützten Anilins ermöglicht beispielsweise eine weitere Modifizierung von NH&sub2;-Gruppen im Molekül ohne eine Reaktion des NH&sub2; des Anilins.
  • Die funktionale Gruppe, die zur Verknüpfung mit einem Zielsteuerungsmittel verfügbar ist, kann ein Teil des Initiatormoleküls in einer von drei Formen sein, nämlich:
  • (a) In der Form, in der sie zur Verknüpfung mit dem Zielsteuerungsmittel verwendet wird. Dies ist möglich, wenn keiner der bei der Dendrimersynthese beteiligten Syntheseschritte zu einer Reaktion an diesem Zentrum führen kann.
  • (b) Wenn die zur Verknüpfung mit dem Zielsteuerungsmittel verwendete funktionale Gruppe in den bei der Dendrimersynthese beteiligten Syntheseschritten reaktiv ist, kann sie durch Verwendung einer Schutzgruppe geschützt werden, welche die Gruppe gegenüber den beteiligten Syntheseprozeduren inert macht, aber selbst auf einfache Weise entfernt werden kann, welche die Beständigkeit des Rests des Makromoleküls nicht verändert.
  • (c) Für den Fall, daß keine einfache Schutzgruppe für die zur Verknüpfung mit dem Zielsteuerungsmittel verwendete reaktive Funktionalität herstellbar ist, kann ein Synthesevorläufer verwendet werden, der in allen bei der Dendrimersynthese eingesetzten Syntheseprozeduren inert ist. Nach Beendigung der Synthese muß diese funktionale Gruppe einfach in die gewünschte Verknüpfungsgruppe überführbar sein, auf eine Weise, welche die Beständigkeit des Rests des Makromoleküls nicht verändert.
  • (2) (Kovalente) Kopplung der gewünschten reaktiven funktionalen Gruppe an ein zuvor gebildetes Dendrimer, wobei das verwendete Reagenz eine Funktionalität enthalten muß, die leicht mit den terminalen funktionalen Gruppen des Dendrimers reagiert. Die schließlich zur Verknüpfung mit dem Zielsteuerungsmittel verwendete funktionale Gruppe kann in ihrer Endform, als geschützte Funktionalität oder als Synthesevorläufer sein. Die Form, in der diese Verknüpfungsgruppe verwendet wird, hängt von ihrer Beständigkeit bei der verwendeten Syntheseprozedur und der Fähigkeit des Makromolekül-Endprodukts ab, den Bedingungen zu widerstehen, die notwendig sind, um diese Gruppe für eine Verknüpfung verfügbar zu machen. Bei der bevorzugten Route für PEI verwendet man beispielsweise
  • Beispiele von heterofunktionalen Initiatoren zur Anwendung in (1) oben umfassen die folgenden anschaulichen Beispiele:
  • Es gibt verschiedene Arten von Chemie mit besonderer Bedeutung:
  • 1) Starburst-Polyamidamine ("PAMAM") Chemie,
  • 2) Starburst-Polyethylenimine ("PEI") Chemie,
  • 3) Starburst-PEI-Verbindung mit einer Oberfläche von PAMAM,
  • 4) Starburst-Polyether ("PE") Chemie.
  • Modifikationen der Funktionalitäten an der Dendrimeroberfläche können andere geeignete funktionale Gruppen ergeben, wie etwa die folgenden:
  • -OPO&sub3;H&sub2;, -PO&sub3;H&sub2;, -PO&sub3;H(-1), -PO&sub3;(-2), -CO&sub2;(-1), -SO&sub2;H, -SO&sub2;(-1), -SO&sub3;H, -SO&sub3;(-1), -NR¹R², -R&sup5;, -OH, -OR¹, -NH&sub2;, Polyether, perfluoriertes Alkyl,
  • worin
  • R Alkyl, Aryl oder Wasserstoff bedeutet,
  • R¹ Alkyl, Aryl, Wasserstoff oder
  • bedeutet,
  • R² Alkyl, Aryl oder -N
  • bedeutet,
  • R³ -OH, -SH, -CO&sub2;H, -SO&sub2;H oder -SO&sub3;H bedeutet,
  • R&sup4; Alkyl, Aryl, Alkoxy, Hydroxyl, Mercapto, Carboxyl, Nitro, Wasserstoff, Brom, Chlor, Jod oder Fluor bedeutet,
  • R&sup5; Alkyl bedeutet,
  • X NR, O oder S bedeutet und
  • n die ganze Zahl 1, 2 oder 3 bedeutet,
  • Polyether oder andere immunologisch unempfindliche Gruppierungen.
  • Die Auswahl der funktionalen Gruppe hängt von der jeweiligen Endanwendung ab, für die das Dendrimer vorgesehen ist.
  • Die Verknüpfung von Antikörpern mit Dendrimeren ist ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung. Typischerweise werden die Antikörper oder Antikörperfragmente durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte Techniken mit dem Dendrimer verknüpft, wie etwa Bindung zwischen einer funktionalen Gruppe auf dem Dendrimer und im Antikörper oder Antikörperfragment vorhandenen Gruppierungen, wie etwa Kohlehydrat-, Amin-, Carboxyl- oder Sulfhydrylfunktionalitäten. In manchen Fällen kann man Verbindungsgruppen als Verbindungsmittel oder Spacer zwischen dem Dendrimer und dem Antikörper oder Antikörperfragment verwenden. Die Bindung des Dendrimers an den Antikörper oder das Antikörperfragment sollte auf eine Weise erfolgen, welche die Immunreaktivität des Antikörpers oder Antikörperfragments nicht nennenswert beeinträchtigt, d. h. durch Bindung des Antikörpers oder Antikörperfragments über eine Funktionalität im Antikörper oder Antikörperfragment, die kein Teil der Antigenerkennungs- und Bindungsstelle ist.
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen. Die mit Buchstaben versehenen Beispiele betreffen die Herstellung von Ausgangsmaterialien, die mit Zahlen versehenen Beispiele betreffen die Herstellung von Produkten.
    • Beispiel A: Herstellung von 2-Carboxamido-3-(4'-nitrophenyl)propanamid.
  • p-Nitrobenzylmalonat-diethylester (2,4 Gramm (g), 8,13 mmol) wurde in 35 ml Methanol gelöst. Die Lösung wurde unter Rühren auf 50 bis 55ºC erhitzt und ein Strom von wasserfreiem Ammoniak wurde für 64 Stunden durch die Lösung geblasen. Die Lösung wurde abgekühlt, und das weiße, flockige Produkt wurde filtriert und aus 225 Milliliter (ml) siedendem Methanol umkristallisiert, um 1,85 g (7,80 mmol) Bisamid in 96%iger Ausbeute zu ergeben (Schm.P. = 235,6ºC (Zers.)).
  • Die Struktur wurde durch MS, ¹H und ¹³C NMR-Spektroskopie bestätigt. Anal.: Berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub1;O&sub4;N&sub3; Theor.: Gefunden:
    • Beispiel B: Herstellung von 1-Amino-2-(aminomethyl)-3-(4'- nitrophenyl)propan.
  • 2-Carboxamido-3-(4'-nitrophenyl)propanamid (2,0 g, 8,43 mmol) wurde unter Rühren in 35 ml trockenem Tetrahydrofuran unter einer Stickstoffatmosphäre aufgeschlämmt. Zu diesem Gemisch wurde ein Boran/Tetrahydrofuran-Komplex (106 ml, 106 mmol) über eine Spritze zugegeben. Dann wurde das Reaktionsgemisch für 48 Stunden auf Rückfluß erhitzt, wobei sich während dieser Zeit das suspendierte Amid löste. Die Lösung wurde abgekühlt und das Tetrahydrofuran wurde im Vakuum unter Verwendung eines Rotationsverdampfers entfernt. Das Rohprodukt und der Boranrückstand wurden in 50 ml Ethanol gelöst und diese Lösung wurde mit wasserfreiem Chlorwasserstoffgas gespült. Die Lösung wurde unter Rückfluß für 1 Stunde erhitzt und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde in 15 ml entionisiertem Wasser gelöst und mit zwei 50 ml Portionen Methylenchlorid extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde in einem Eisbad unter einem Argon- Schutzkissen gekühlt und 50% Natriumhydroxid wurden langsam bis zu einem basischen pH von 11,7 zugegeben. Die basische wäßrige Schicht wurde mit vier 25 ml Portionen Methylenchlorid extrahiert und diese vereinigten Extrakte wurden eingedampft (Rotation), um 1,45 g bernsteinfarbenes Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde mit Diethylether (50 ml) trituriert und unter Druck durch eine kurze Silikagelsäule (Grade 62 Aldrich) filtriert. Die Säule wurde 100 ml Ether gewaschen und die vereinigten Filtrate wurden im Vakuum eingedampft, um 1,05 g (5,02 mmol) des im Titel genannten Diamins als klares Öl (Schm.P. = 275 bis 278ºC (Zers.) Bis-HCl-Salz) zu ergeben.
  • Die Struktur wurde durch MS-, ¹H- und ¹³C-NMR Spektroskopie bestätigt. Anal.: Berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub7;N&sub3;O&sub2;Cl&sub2; Theor.: Gefunden:
    • Beispiel C: Herstellung von 1-Amino-2-(aminomethyl)-3-(4'- aminophenyl)propan.
  • Ein Boran/Tetrahydrofuran-Lösung (70 ml, 70 mmol) wurde unter Rühren und Stickstoff über eine Kanülennadel in einem Kolben gegeben, der 4-Aminobenzylmalonamid (1,5 g, 7,24 mmol) enthielt. Die Lösung wurde 40 Stunden lang auf Rückfluß erhitzt. Die farblose Lösung wurde abgekühlt und überschüssiges Tetrahydrofuran wurde durch einen Rotationsverdampfer entfernt, wobei ein klares gelatineartiges Öl zurückblieb. Methanol (50 ml) wurde unter merkbarer Gasentwicklung sorgfältig zum Öl gegeben. Trockener Chlorwasserstoff wurde durch die Suspension geperlt, um ein Auflösen zu bewirken, und die Lösung wurde anschließend für 1 Minute unter Rückfluß erhitzt. Methanol/HCl wurden durch einen Rotationsverdampfer entfernt und das resultierende Hydrochloridsalz wurde erneut durch die gleiche Auflösungs/Rückflußprozedur geführt. Das erhaltene Hydrochloridsalz wurde in 10 ml Wasser gelöst und in einem Eisbad unter Argon gekühlt. Konzentriertes Natriumhydroxid (50%) wurde langsam unter Rühren bis auf einen pH von 11 zugegeben. Der wäßrige Anteil wurde dann mit 2 · 100 ml Portionen Chloroform extrahiert, die vereinigt und durch einen kurzen Silikagelpfropfen ohne Trocknen filtriert wurden. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum (Rotation) entfernt, wobei die Titelverbindung (0,90 g, 5,02 mmol) in 70%iger Ausbeute (Rf = 0,65 - CHCl&sub3;/MeOH/NH&sub4;OH Konz. - 2/2/1) erhalten wurde. Die Struktur wurde durch ¹H- und ¹³C-NMR bestätigt und ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel D: Herstellung von 6-(4-Aminobenzyl)-1,4,8,11-tetraaza-5,7-dioxoundecan.
  • 4-Aminobenzylmalonat-dimethylester (2,03 g, 8,43 mmol) wurde in 10 ml Methanol gelöst. Diese Lösung wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung von frisch destilliertem Ethylendiamin (6,00 g, 103,4 mmol) in 10 ml Methanol unter Stickstoff über eine Dauer von 2 Stunden gegeben. Die klare Lösung wurde 4 Tage lang gerührt, und eine Analyse durch Dünnschichtchromatographie (TLC) zeigte einen vollständigen Umsatz des Diesters (Rf = 0,91) zum Bisamid (Rf = 0,42 - 20% Konz. NH&sub4;OH/80% Ethanol). Dieses Material war stark Ninhydrinpositiv. Der Methanol und überschüssiges Diamin wurden auf einem Rotationsverdampfer entfernt und die resultierende weiße Festsubstanz wurde im Vakuum (10&supmin;¹ mm, 50ºC) über Nacht getrocknet, um ein Rohprodukt (2,45 g, 8,36 mmol) in 99 %iger Ausbeute zu ergeben. Eine analytische Probe wurde aus Chloroform/Hexan umkristallisiert, Schm.P. = 160 bis 161ºC. Die Massenspektrum-, ¹H- und ¹³C-NMR-Daten standen im Einklang mit der vorgeschlagenen Struktur.
    • Beispiel E: Reaktion von Mesylaziridin mit 1-Amino-2-(aminomethyl)-3-(4-nitrophenyl)propan.
  • 1-Amino-2-(aminomethyl)-3-(4-nitrophenyl)propan (400 mg, 1,91 mmol, Reinheit > 96%) wurde unter Stickstoff in 10,5 ml absolutem Ethanol gelöst. Zu der gerührten Diaminlösung wurde Mesylaziridin (950 mg, 7,85 mmol) als Festsubstanz gegeben. Die Reaktion wurde für 14 Stunden bei 25ºC unter Verwendung eines magnetischen Rührers gerührt und während dieser Zeit bildete sich ein weißer, gummiartiger Rückstand an den Rändern des Kolbens. Der Ethanol wurde abdekantiert und der Rückstand wurde mit einer weiteren 15 ml Portion Ethanol trituriert, um nicht umgesetztes Aziridin zu entfernen. Das gummiartige Produkte wurde in Vakuum getrocknet (101 mm, 25ºC), um das Tetrakismethylsulfonamid (1,0 g, 1,44 mmol) in 75%iger Ausbeute zu ergeben (Rf = 0,74 - NH&sub4;OH/Ethanol - 20/80). Die Struktur wurde durch ¹H- und ¹³C-magnetische Kernresonanz- (NMR) -Spektroskopie bestätigt.
    • Beispiel F: Herstellung von 2-(4-Nitrobenzyl)-1,3-(bis-N,N-2- aminoethyl)diaminopropan.
  • Das rohe Methylsulfonamid (650 mg, 0,94 mmol) wurde in 5 ml Stickstoff-gespülter konzentrierter Schwefelsäure (98%) gelöst. Diese Lösung wurde unter Stickstoff gehalten und unter heftigem Rühren für 27 Minuten auf 143 bis 146ºC erhitzt. Es wurde eine leichte Verdunkelung bemerkt, und die gekühlte Lösung wurde in eine gerührte Etherlösung (60 ml) gegossen. Der präzipitierte weiße Salzkuchen wurde filtriert und sofort in 10 ml entionisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 50%iger NaOH unter Argon mit Kühlen auf pH 11 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde mit 90 ml Ethanol gemischt, und die präzipitierten anorganischen Salze wurden filtriert. Das Lösungsmittel wurde aus dem rohen Amin unter verringertem Druck entfernt, und zum resultierenden hellbraunen Öl wurden 190 ml Toluol unter Stickstoff gegeben. Das Gemisch wurde heftig gerührt und Wasser wurde durch azeotrope Destillation (Dean-Stark-Falle) entfernt, bis das zurückbleibende Toluol eine hellgelbe Farbe angenommen hatte (es blieben 30 bis 40 ml im Gefäß). Das Toluol wurde gekühlt und von den dunklen, zähen Resten und Salz abdekantiert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum aus dieser Lösung abgezogen und das resultierende hellgelbe Öl wurde im Vakuum (0,2 mm, 35ºC) über Nacht getrocknet, wobei 210 mg des Produkts (60%) erhalten wurden, das durch MS-, ¹H- und ¹³C-NMR charakterisiert wurde. Beispiel G: Herstellung eines Starburst-Polymers (das ein Anilinderivat enthält) mit einer halben Generation, dargestellt durch das folgende Schema:
  • Verbindung #1
  • Verbindung #2
  • Methylacrylat (2,09 g, 24 mmol) wurde in Methanol (15 ml) gelöst. Die Verbindung 6-(4-Aminobenzyl)-1,4,8,11-tetraaza- 5,7-dioxoundecan (1,1 g, 3,8 mmol) (d. h. Verbindung #1, deren Herstellung in Beispiel D beschrieben ist) wurde in Methanol (10 ml) gelöst und langsam unter heftigem Rühren über 2 Stunden der Methylacrylatlösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für 48 Stunden bei Umgebungstemperaturen gerührt. Das Lösungsmittel wurde auf dem Rotationsverdampfer entfernt, wobei die Temperatur unter 40ºC gehalten wurde. Der Ester (Verbindung #2) wurde als gelbes Öl (2,6 g) erhalten. Es wurde keine Carboxyethylierung der Anilinfunktion beobachtet.
    • Beispiel H: Herstellung eines Starburst-Polymers (das eine Anilingruppierung enthält) mit einer Generation, dargestellt durch das folgende Schema:
  • Verbindung 2 + H&sub2;NCH&sub2;CH&sub2;NH&sub2;/CH&sub3;OH
  • Verbindung #3
  • Der Ester (Verbindung #2) (2,6 g, 3,7 mmol) wurde in Methanol (100 ml) gelöst und sorgfältig zu einer heftig gerührten Lösung von Ethylendiamin (250 g, 4,18 mol) und Methanol (100 ml) mit einer solchen Geschwindigkeit gegeben, daß die Temperatur nicht über 40ºC stieg. Nach vollständiger Zugabe wurde das Reaktionsgemisch für 28 Stunden bei 35 bis 40ºC (Heizmantel) gerührt. Nach 28 Stunden waren durch Infrarotspektroskopie keine Estergruppen nachweisbar. Das Lösungsmittel wurde auf dem Rotationsverdampfer bei 60ºC entfernt. Das überschüssige Ethylendiamin wurde unter Verwendung eines ternären Azeotrops von Toluol-Methanol-Ethylendiamin entfernt. Schließlich wurde das gesamte zurückbleibende Toluol mit Methanol azeotropisch entfernt. Die Entfernung des gesamten Methanols ergab 3,01 g des Produkts (Verbindung #3) als orangefarbene glasige Festsubstanz.
    • Beispiel I: Herstellung eines Starburst-Polymers (das eine Anilingruppierung enthält) mit eineinhalb Generationen, dargestellt durch das folgende Schema:
  • Verbindung #3
  • Verbindung #4
  • Das Amin (Verbindung #3) (2,7 g, 3,6 mmol) wurde in Methanol (7 ml) gelöst und langsam über eine Stunde zu einer gerührten Lösung von Methylacrylat (3,6 g, 44 mmol) in Methanol (15 ml) bei Umgebungstemperaturen gegeben. Bei der Zugabe wurde eine leichte Erwärmung der Lösung beobachtet. Die Lösung wurde bei Umgebungstemperaturen für 16 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde auf dem Rotationsverdampfer bei 40ºC entfernt. Nach Entfernung des gesamten Lösungsmittels und überschüssigen Methylacrylats wurde der Ester (Verbindung #4) in einer Ausbeute von 4,7 g als orangefarbenes Öl erhalten. Beispiel J: Herstellung eines Starburst-Polymers (das eine Anilingruppierung enthält) von einer halben Generation, dargestellt durch das folgende Schema:
  • Verbindung #5
  • Verbindung #6
  • Das Triamin (Verbindung #5, die Herstellung dieser Verbindung ist in Beispiel C gezeigt) (0,42 g, 2,3 mmol) wurde in Methanol (10 ml) gelöst und tropfenweise über ein Stunde zu Methylacrylat (1,98 g, 23 mmol) in Methanol (10 ml) gegeben. Dieses Gemisch wurde bei Umgebungstemperaturen für 48 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde auf dem Rotationsverdampfer entfernt, wobei die Temperatur nicht höher als 40ºC gehalten wurde. Das überschüssige Methylacrylat wurde mehrfach mit Methanol azeotropisch entfernt. Der Ester (Verbindung #6) wurde als orangefarbenes Öl (1,24 g) isoliert.
    • Beispiel K: Herstellung eines Starburst-Polymers (das eine Anilingruppierung enthält) von einer Generation, dargestellt durch das folgende Schema:
  • Verbindung #6 + H&sub2;NCH&sub2;CH&sub2;NH&sub2;/CH&sub3;OH
  • Verbindung #7
  • Der Ester (Verbindung #6) (1,24 g, 2,3 mmol) wurde in Methanol (50 ml) gelöst und tropfenweise über 2 Stunden zu Ethylendiamin (73,4 g, 1,22 mol) in Methanol gegeben. Es wurde eine kleine Exothermie festgestellt, und heftiges Rühren wurde beibehalten. Die Lösung wurde für 72 Stunden bei Umgebungstemperaturen gerührt. Das Lösungsmittel wurde auf dem Rotationsverdampfer bei 60ºC entfernt. Das überschüssige Ethylendiamin wurde unter Verwendung eines ternären Azeotrops von Toluol-Methanol-Ethylendiamin entfernt. Schließlich wurde das gesamte restliche Toluol mit Methanol entfernt, und anschließendes Abpumpen mit einer Vakuumpumpe für 48 Stunden ergab das Amin (Verbindung #7) (1,86 g) als gelb/orangefarbenes Öl.
    • Beispiel L: Herstellung eines Starburst-Polymers (das eine Anilingruppierung enthält) von eineinhalb Generationen, dargestellt durch das folgende Schema:
  • Verbindung #7 + H&sub2;C=CHCOCH&sub3;/CH&sub3;OH
  • Verbindung #8
  • Das Amin (Verbindung #7) (1,45 g, Spuren von Methanol enthaltend) wurde in Methanol (100 ml) gelöst und langsam über eineinhalb Stunden zu einer gerührten Lösung von Methylacrylat (5,80 g) in Methanol (20 ml) gegeben. Die Lösung wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine Entfernung des Lösungsmittels gefolgt von einer wiederholten azeotropischen Behandlung mit Methanol ermöglichte die Entfernung des gesamten überschüssigen Methylacrylats. Nach Abpumpen mit einer Vakuumpumpe für 48 Stunden wurde der Ester (Verbindung #8) als orangefarbenes Öl (2,50 g, 1,8 mmol) isoliert.
    • Beispiel M: Hydrolyse eines Dendrimers der Generation 4,5 und Herstellung eines Calciumsalzes.
  • Ein PAMAM der Generation 4,5 (Ester-terminiert, initiiert aus NH&sub3;) (2,11 g, 10,92 mÄg) wurde in 25 ml Methanol gelöst, und dazu wurde 10%ige NaOH (4,37 ml, 10,92 mAg) (pH = 11,5 bis 12) gegeben. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur war der pH- Wert etwa 9,5. Nach weiteren 20 Stunden wurde die Lösung einrotiert (am Rotationsverdampfer eingedampft), 50 ml Toluol zugegeben und erneut einrotiert.
  • Das resultierende Öl wurde in 25 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 75 ml Diethylether als weißer Gummi präzipitiert. Die Flüssigkeit wurde abdekantiert und der Gummi wurde einrotiert, um ein sehr feines, weißliches Pulver zu ergeben, das nach weiterem Trocknen 2,16 g Produkt (98% Ausbeute) ergibt. Keine Estergruppen wurden durch NMR und Infrarotanalyse gefunden.
  • Das Natriumsalz von PAMAM der Generation 4,5 (Ester terminiert, initiiert aus NH&sub3;) wurde mittels Dialyse durch das Calciumsalz ersetzt. Das Natriumsalz (1,03 g) wurde in 100 ml Wasser gelöst und durch einen Hohlfaserdialyseschlauch (Ausschluß = 5000) mit 3 ml/Minute geleitet. Die Außenseite des Schlauchs befand sich in einem Bad mit einer 5%igen CaCl&sub2;- Lösung. Diese Prozedur wurde anschließend wiederholt.
  • Die resultierende Lösung wurde erneut diesmal gegen Wasser dialysiert, dies wurde zwei weitere Male wiederholt.
  • Ein Eindampfen ergab 0,6 g einer feuchten Festsubstanz, die in Methanol aufgenommen (nicht vollständig löslich) und getrocknet wurde, um 0,45 g weißliche Kristalle zu ergeben.
  • C&sub3;&sub6;&sub9;H&sub5;&sub9;&sub2;O&sub1;&sub4;&sub1;N&sub9;&sub1;Ca&sub2;&sub4; Ber.- 10,10% Ca&spplus;&spplus;
  • Mol.-Gew. = 9526,3 Ber. = C-4432,1, H-601,8, O-2255,9, N-1274,6, Ca-961,9
  • Theor.: C-46,5, H-6,32, N-13,38, Ca-10,10
  • Gefunden: C-47,34, H-7,00, N-13,55, Ca-8,83
    • Beispiel N: Herstellung von Dendrimeren mit Carboxylat-Endgruppen.
  • Starburst-Polyamidamine von einer halben Generation wurden hydrolisiert, um ihre Methylester-Endgruppen in Carboxylate zu überführen. Dies erzeugte kugelförmige Moleküle mit an der Peripherie dispergierten negativen Ladungen. Die hydrolysierten Dendrimere reichten von Generation 0,5 (drei Carboxylate) bis Generation 6,5 (192 Carboxylate).
  • Die Produkte konnten als Na&spplus;-, K&spplus;-, Cs&spplus;- oder Rb&spplus;-Salze erzeugt werden.
    • Beispiel Q: N-t-Butoxycarbonyl-4-aminobenzyl malonat-dimethylester
  • 4-Aminobenzylmalonat-dimethylester (11,62 g, 49 mmol) wurde unter Rühren in 50 ml t-Butanol : Wasser (60 : 40) gelöst. Di-t-Butoxydicarbonat (19,79 g, 90 mmol) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. Der Butanol wurde auf dem Rotationsverdampfer entfernt, was eine gelbe Suspension des Produkts in Wasser ergab. Eine Extraktion in Methylenchlorid, Trocknen (MgSo&sub4;) und Eindampfen ergab ein gelbes Öl (21,05 g, verunreinigt durch di-t-Butoxydicarbonat). Eine Umkristallisation aus 2-Propanol : Wasser (75 25) ergab hellgelbe Kristalle (11,1 g, 33 mmol, 67%). Die Struktur wurde durch ¹³C-NMR bestätigt und die Reinigung wurde durch HPLC-Analyse (Spherisorb ODS-1, 0,05M H&sub3;PO&sub4; pH 3 : CH&sub3;CN 55 : 45) getestet. Das Material wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel P: N-t-Butoxycarbonyl-6-(4-aminobenzyl)-1,4,8,11- tetraaza-5,7-dioxoundecan
  • N-t-Butoxycarbonyl-4-aminobenzylmalonat-dimethylester (8,82 g, 26 mmol), hergestellt in Beispiel O, wurde in 50 ml Methanol gelöst. Diese Lösung wurde tropfenweise (2 Stunden) zu einer Lösung von frisch destilliertem Ethylendiamin (188 g, 3,13 mol) und 20 ml Methanol unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. Die Lösung wurde für 24 Stunden gerührt. Die Ethylendiamin/Methanol-Lösung wurde auf dem Rotationsverdampfer entfernt. Das Produkt wurde unter Zugabe von Toluol in Methanol gelöst. Die Entfernung des Lösungsmittels auf dem Rotationsverdampfer ergab das Rohrprodukt als weiße Festsubstanz (10,70 g, verunreinigt mit Ethylendiamin). Die Probe wurde zur Reinigung in zwei Proben geteilt. Eine azeotrope Entfernung von Ethylendiamin mit Toluol unter Verwendung eines Soxhlet-Extraktors mit sulfonierten Ionenaustauscherkörnern in der Extraktionshülse zum Einfangen des Ethylendiamins führte zu einer teilweisen Zersetzung des Produkts und ergab ein braunes Öl. Das restliche Produkt wurde als weiße Festsubstanz aus dem Toluol nach Kühlung isoliert (2,3 g, etwa 50%). Die Analyse einer 10%igen Lösung in Methanol durch Gaschromatographie (Säule Tenax 60/80) zeigte kein nachweisbares Ethylendiamin in der Probe ( < 0,1 Prozent). Die zweite Fraktion wurde in Methanol gelöst, um eine 10%ige Lösung (Gewicht) zu ergeben, und durch reverse Osmose unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel vom Ethylendiamin gereinigt. (Die verwendete Membran war Filmtec FT-30 in einem Amicon TCIR Dünnkanalseparator, wobei das Ethylendiamin die Membran durchdrang). Das Produkt wurde als weiße Festsubstanz (2,7 g) isoliert, in der keine nachweisbaren Mengen an Ethylendiamin durch Gaschromatographie gefunden werden konnten. Die ¹³C NMR-Daten und die HPLC-Analyse (Spherisorb ODS-1, 0,05M H&sub3;PO&sub4; pH 3 : CH&sub3;CN 55 : 45) standen mit der vorgeschlagenen Struktur im Einklang. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel O: Herstellung eines Starburst-Dendrimers von einer halben Generation aus N-t-Butoxycarbonyl-6(4-aminobenzyl)- 1,4,8,11-tetraaza-5,7-dioxoundecan
  • N-t-Butoxycarbonyl-6-(4-aminobenzyl)-1,4,8,11-tetraaza-5,7- dioxoundecan (5,0 g, 13 mmol), hergestellt in Beispiel P, wurde in 100 ml Methanol gelöst. Methylacrylat (6,12 g, 68 mmol) wurde zugegeben und die Lösung wurde 72 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch HPLC (Spherisorb ODS1, Acetonitril : 0,04M Ammoniumacetat 40 : 60) zur Optimierung des Umsatzes zum erwünschten Produkt überwacht. Die Lösung wurde auf 30% Feststoffe konzentriert, und Methylacrylat (3,0 g, 32 mmol) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperaturen gerührt, bis keine teilweise alkylierten Produkte durch HPLC nachweisbar waren (24 Stunden). Die Entfernung des Lösungsmittels bei 30ºC mit einem Rotationsverdampfer und Abpumpen bei 1 mm Hg für 24 Stunden ergab das Produkt als gelbes viskoses Öl, Ausbeute 7,81 g. Die ¹³C NMR-Daten standen mit der vorgeschlagenen Struktur im Einklang. Das Produkte wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel R: Herstellung eines Starburst-Dendrimers von einer vollen Generation aus N-t-Butoxycarbonyl-6-(4-aminobenzyl)- 1,4,8,11-tetraaza-5,7-dioxoundecan
  • Das Produkt der halben Generation (Beispiel Q) (7,70 g, 10,45 mmol) wurde in 75 ml Methanol gelöst und tropfenweise über 2 Stunden zu einer gerührten Lösung von Ethylendiamin (400 ml, 7,41 mol) und Methanol (50 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperaturen für 48 Stunden gerührt. Das Ethylendiamin und der Methanol wurden mit einem Rotationsverdampfer entfernt, um ein gelbes Öl zu ergeben (11,8 g verunreinigt mit Ethylendiamin). Das Produkt wurde in 90 ml Methanol gelöst und durch reverse Osmose vom Ethylendiamin gereinigt (Filmtec FT-30 Membran und Amicon TCIR Dünnkanalseparator, Methanol als Lösungsmittel). Nach 48 Stunden konnte durch Gaschromatographie (Säule Tenax 60/80) kein Ethylendiamin mehr nachgewiesen werden. Die Entfernung des Lösungsmittels auf dem Rotationsverdampfer, gefolgt vom Abpumpen auf einer Vakuumleitung für 24 Stunden ergab das Produkt als gelbe glasige Festsubstanz (6,72 g). Die Analyse durch HPLC, (PLRP-S Säule, Acetonitril : 0,015M NaOH, 10 bis 20%iger Gradient in 20 Minuten) und die ¹³C NMR-Analyse standen im Einklang mit der vorgeschlagenen Struktur.
    • Beispiel S: Herstellung eines Starburst-Polymers von eineinhalb Generationen aus N-t-Butoxycarbonyl-6-(4-aminobenzyl)- 1,4,8,11-tetraaza-5,7-dioxoundecan
  • Das Produkt von einer Generation (Beispiel R) (2,14 g, 25 mmol) wurde in 12,5 ml Methanol gelöst, und Methylacrylat (3,5 g, 39 mmol) in 5 ml Methanol wurde zugegeben. Die Lösung wurde für 48 Stunden bei Umgebungstemperaturen gerührt, wobei das Fortschreiten der Reaktion durch HPLC (Spherisorb ODS-1, Acetonitril : 0,04M Ammoniumacetat, 60 : 40) überwacht wurde. Ein zweites Aliquot von Methylacrylat wurde zugegeben (3,5 g, 39 mmol) und das Reaktionsgemisch wurde für weitere 72 Stunden bei Umgebungstemperaturen gerührt. Die Entfernung des Lösungsmittels auf dem Rotationsverdampfer ergab das Produkt als gelbes Öl (3,9 g) nach Abpumpen über Nacht mit einer Vakuumpumpe. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel T: Herstellung eines Starburst-Polymers von zwei vollen Generationen aus N-t-Butoxycarbonyl-6-(4-aminobenzyl)- 1,4,8,11-tetraaza-5,7-dioxoundecan
  • Das Produkt von eineinhalb Generationen (Beispiel S) (3,9 g, 2,5 mmol) wurde in 50 ml Methanol gelöst und tropfenweise über 2 Stunden zu einer gerührten Lösung von Ethylendiamin (600 g, 10 mol) und Methanol (50 ml) gegeben. Die Lösung wurde bei Umgebungstemperaturen unter einer Stickstoffatmosphäre für 96 Stunden gerührt. Das Ethylendiamin und der Methanol wurden auf dem Rotationsverdampfer entfernt, um eine gelbe glasige Festsubstanz (4,4 g, mit Ethylendiamin verunreinigt) zu ergeben. Eine 10%ige Lösung des Produkts wurde in Methanol hergestellt und durch reverse Osmose (die verwendete Membran ist Filmtec FT-30 in einem Amicon TCIR Dünnkanalseparator) vom Ethylendiamin gereinigt, bis durch Gaschromatographie (Säule Tenax 60/80) kein Ethylendiamin mehr nachgewiesen werden konnte. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Produkt als gelbe glasige Festsubstanz (3,52 g). Die ¹³C NMR-Daten und die HPLC-Analyse (PLRP-S Säule, Acetonitril : 0,015 M NaOH, 10 bis 20%iger Gradient in 20 Minuten) standen mit der vorgeschlagenen Struktur in Einklang.
    • Beispiel U: Reaktion des Starburst von zwei Generationen mit Bromessigsäure zur Herstellung eines Methylencarboxylatterminierten Starburst-Dendrimers
  • Das Produkt der zweiten Generation (Beispiel T) (0,22 g, 0,13 mmol) wurde in 15 ml entionisiertem Wasser gelöst und die Temperatur wurde auf 40,5ºC äquilibriert. Bromessigsäure (0,48 g, 3,5 mmol) und Lithiumhydroxid (0,13 g, 3,3 mmol) wurden in 5 ml entionisiertem Wasser gelöst und dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Der pH-Wert der Reaktion wurde sorgfältig unter Verwendung eines pH-Reglers (Titration mit 0,1N NaOH) auf 9 bei 40,5ºC über Nacht gehalten. Eine Überwachung durch reverse Phase HPLC (Spherisorb ODS-1 Säule, Elutionsmittel 0,25 M H&sub3;PO&sub4; pH 3 [NaOH], Acetonitril 85 : 15) bestätigte die Synthese von vorwiegend einer einzigen Komponente.
    • Beispiel V: Herstellung einer Isothiocyanat-funktionalisierten, Methylencarboxylat-terminierten Starburst-Dendrimers der zweiten Generation
  • 5 ml einer 2,8 mM Lösung des Methylencarboxylat-terminierten Starburst-Dendrimers der zweiten Generation (Beispiel U) wurden mit 20 ml Wasser verdünnt, und der pH-Wert wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 0,5 eingestellt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde das Gemisch zur Bestätigung der Entfernung der Butoxycarbonylgruppe durch HPLC analysiert und anschließend mit 50% Natriumhydroxid behandelt, um den pH-Wert auf 7 zu bringen. Zum Halten des pH-Werts bei 7 wurde ein pH-Regler (Titration mit 0,1 N NaOH) verwendet, und 225 ul Thiophosgen wurden zugegeben. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde der pH-Wert des Gemisches mit 1N HCl auf 5 eingestellt. Das Gemisch wurde mit Chloroform (2 · 20 ml) gewaschen und dann auf einem Rotationsverdampfer bei verringertem Druck konzentriert. Der erhaltene Rückstand von 0,91 g ist ein Gemisch des Isothiocyanats und von Salzen.
    • Beispiel W: Herstellung eines Starburst-Polyethyleniminmethansulfonamids der zweiten Generation
  • Zu einer Lösung von 125 g N-Methansulfonylaziridin in 50 ml Ethanol wurden 25,0 g Tris(2-aminoethyl)amin gegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 4 Tage gerührt. Wasser wurde zum Reaktionsgemisch in der erforderlichen Menge gegeben, um die Homogenität der Lösung zu erhalten. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation im Vakuum entfernt, um das Starburst PEI-Methansulfonamid der zweiten Generation als gelbes Glas (161 g) zu ergeben.
    • Beispiel X: Spaltung von Methansulfonamiden zur Herstellung eines Starburst-Polyethylenimins der zweiten Generation
  • Eine Lösung von 5,0 g des Starburst PEI-Methansulfonamids der zweiten Generation aus Beispiel W in 20 ml 38%iger HCl wurde in einer Glasampulle eingeschlossen. Die Ampulle wurde für 16 Stunden bei 160ºC erhitzt, dann in einem Eisbad abgekühlt und geöffnet. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in Wasser gelöst. Nach Einstellen des pH's der Lösung auf größer oder gleich 10 mit 50%iger NaOH wurde das Lösungsmittel durch Destillation im Vakuum entfernt. Toluol (150 ml) wurde zum Rückstand gegeben, und das Gemisch wurde unter einer Dean- Stark-Falle auf Rückfluß erhitzt, bis kein Wasser mehr entfernt werden konnte. Die Lösung wurde zur Entfernung von Salzen filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, um 1,9 g Starburst PEI der zweiten Generation als gelbes Öl zu ergeben.
    • Beispiel Y: Herstellung eines Starburst-Polyethyleniminmethansulfonamids der dritten Generation
  • Zu einer Lösung von 10,1 g des Starburst PEI der zweiten Generation aus Beispiel X in 100 ml Ethanol wurden 36,6 g N- Methansulfonylaziridin gegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 Woche gerührt. Wasser wurde in der erforderlichen Menge zugegeben, um die Homogenität der Lösung zu erhalten. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation im
  • Vakuum entfernt, um ein Starburst PEI-Methansulfonamid der dritten Generation als gelbes Glas (45,3 g) zu ergeben.
    • Beispiel Z: Spaltung von Methansulfonamiden zur Herstellung eines Starburst-Polyethylenimins der dritten Generation
  • Die Methansulfonamidgruppen des Starburst PEI-Methansulfonamids der dritten Generation (5,0 g) aus Beispiel Y wurden durch die gleiche Prozedur wie für das Material der zweiten Generation in Beispiel X beschrieben entfernt, um 2,3 g Starburst PEI der dritten Generation als gelbes Öl zu ergeben.
    • Beispiel AA: Reaktion eines Starburst-Polyethylenimins der dritten Generation mit 4-Fluornitrobenzol
  • Das Starburst-Polyethylenimin der dritten Generation (Beispiel Z) (1,06 g, 1,2 mmol) wurde in 12 ml absolutem Ethanol gelöst. Es wurde (4-Fluor)nitrobenzol (120 ul, 1,2 ml) zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht auf Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde auf dem Rotationsverdampfer entfernt, und das leuchtend gelbe Öl wurde in Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wurde zur Entfernung von nicht umgesetzten (4-Fluor)nitrobenzol mit Chloroform gewaschen. Eine Entfernung des Wassers ergab das Produkt als tiefgelbes Öl (0,80 g). Das ¹³C NMR-Spektrum stand mit der vorgeschlagenen Struktur im Einklang. (Es wurde kein Versuch unternommen, die Art der statistischen Verteilung zu bestimmen). Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel BB: Reaktion des Nitrophenylderivats des Starburst- Polyethylenimins der dritten Generation mit Glycolnitril.
  • Das Nitrophenylderivat des Starburst-Polyethylenimins der dritten Generation (Beispiel AA) (0,80 g) wurde in 20 ml entionisiertem Wasser gelöst. Natriumhydroxid (2,80 g, 50% Gew./Gew.) wurde zur gerührten Lösung gegeben, und die Lösung wurde mit durch einen Natriumhydroxidwascher geleiteten Stickstoff gespült. Glycolnitril (2,85 ml einer 70%igen wäßrigen Lösung) wurde bei Umgebungstemperaturen zugegeben. Es wurde die Bildung eines gelben Präzipitats nach wenigen Minuten beobachtet. Nach zwei Stunden wurde die Temperatur langsam auf Rückfluß erhöht, und die Lösung wurde unter Spülen mit Stickstoff 24 Stunden auf Rückfluß gehalten. Eine Entfernung des Wassers ergab das Produkt als gelbe Festsubstanz, die mit Glycolsäure und Natriumhydroxid verunreinigt war. Das ¹³c NMR-Spektrum stand mit der vorgeschlagenen Struktur im Einklang. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel CC: Hydrierung des Nitrophenylderivats zum Aminophenylmethylencarboxylat-terminierten Starburst-Polyethylenimin der dritten Generation.
  • Die gelbe Festsubstanz aus Beispiel BB (1,70 g) wurde in 10 ml entionisiertem Wasser gelöst, wobei der resultierende pH- Wert der Lösung etwa 11 war. Palladium auf Aktivkohle (200 mg 5% Pd/C) wurde zum Reaktionsgemisch in einem Parr-Schüttlergefäß aus Glas gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter einen Druck von 40 psi (275 kPa) Wasserstoff gesetzt und bei Umgebungstemperatur in einer Parr-Hydrierungsvorrichtung für 6 Stunden geschüttelt. Dann wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung des Pd/C durch ein 0,5 m Millipore-Filter filtriert und nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum durch ein Biogel P2-Harz (25 g gequollen mit Wasser) gelfiltriert. Eine Ansäuerung mit HCl führte zu einer orangebraunen Lösung, die mit Stickstoff über Nacht gespült wurde. Die Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum ergab das Produkt als Hydrochloridsalz, das eine hellbraune Festsubstanz (3,98 g, verunreinigt mit NaCl und Glycolsäure, maximale theoretische Menge des Produkts 1,15 g) war. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel DD: Herstellung eines 4-Isothiocyanatophenyl methylencarboxylat-terminierten Starburst-Polyethylenimins der dritten Generation
  • Das Produkt aus Beispiel CC (3,98 g) wurde in 15 ml entionisiertem Wasser gelöst, und ein Aliquot (2,5 ml) dieser Lösung wurde mit 10 ml Wasser verdünnt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit Natriumhydroxid auf 7 eingestellt. Zum Halten des pH- Werts wurde ein pH-Regler (Titration mit IN NaOH) verwendet, und 200 ul Thiophosgen wurden zugesetzt. Nach 10 Minuten wurde der pH-Wert des Gemisches mit Salzsäure auf 4 eingestellt. Wasser wurde auf einem Rotationsverdampfer bei verringertem Druck entfernt (es wurde eine kleine Menge an n- Butanol zur Vermeidung eines Schäumens zugesetzt). Der Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen und dann getrocknet. Das Rohprodukt (0,95 g), ein Gemisch von Isothiocyanat (0,14 g) und Salzen, wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel EE: Herstellung eines Methylencarboxylat-terminierten Starburst-Polyamidamins (initiiert aus Ammoniak) der zweiten Generation
  • Das Starburst-Polyamidamin der zweiten Generation (2,71 g, 2,6 mmol) und Bromessigsäure (4,39 g, 31,6 mmol) wurden in 30 ml entionisiertem Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde unter Verwendung eines pH-Reglers mit 5N NaOH auf 9,7 eingestellt. Die Reaktion wurde für eine halbe Stunde bei diesem pH-Wert gehalten und die Temperatur wurde langsam auf 60ºC erhöht und für drei Stunden bei einem konstanten pH-Wert auf 60ºC gehalten. Der pH-Wert wurde auf 10,3 erhöht, und das Reaktionsgemisch blieb über Nacht bei Umgebungstemperaturen unter Kontrolle des pH-Reglers. Das Reaktionsgemisch wurde vor dem Aufarbeiten weitere vier Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Entfernung des Lösungsmittels und eine azeotrope Entfernung der letzten Wasserspuren mit Methanol ergab das Produkt als hellgelbes Pulver (8,7 g, verunreinigt mit Natriumbromid). Das ¹³C NMR-Spektrum stand mit der vorgeschlagenen Struktur im Einklang (mit einer geringen Verunreinigung aufgrund einer geringen Menge von Nebenprodukt als Ergebnis einer gewissen Monoalkylierung).
    • Beispiel FF: Herstellung eines Methylencarboxylat-termininierten Starburst-Polyethylenimins (initiiert aus Ammoniak) der zweiten Generation
  • Das Starburst-Polyethylenimin der zweiten Generation (2,73 g, 6,7 mmol) aus Beispiel X und Bromessigsäure (11,29 g, 81 mmol) wurden in 30 ml entionisiertem Wasser gelöst. Der pH- Wert wurde langsam auf 9,5 erhöht, wobei die Temperatur unter 30ºC gehalten wurde. Die Temperatur wurde langsam auf 55ºC erhöht, und der pH-Wert der Reaktion wurde für 6 Stunden mit Hilfe eines pH-Reglers (Titration mit 5N NaOH) auf 9,5 gehalten. Der pH-Wert wurde auf 10,2 erhöht und dort über Nacht gehalten. Eine Entfernung des Lösungsmittels auf dem Rotationsverdampfer und eine azeotrope Entfernung der letzten Wasserspuren unter Verwendung von Methanol ergab das Produkt als gelbes Pulver (17,9 g, verunreinigt mit Natriumbromid). Das ¹³C NMR-Spektrum stand mit der vorgeschlagenen Struktur im Einklang (mit einer geringen Verunreinigung aufgrund einer geringen Menge an Nebenprodukt als Ergebnis einer gewissen Monoalkylierung).
    • Beispiel GG: Herstellung eines Starburst PAMAM der Generationen 3,5, 4,5, 5,5 und 6,5
  • Zu einer 10 Gew.-%igen Lösungen von 2,46 g eines Starburst PAMAM der dritten Generation wurden 2,32 g Methylacrylat gegeben. Dieses Gemisch wurde 64 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Entfernung von Lösungsmittel und überschüssigem Methylacrylat wurden 4,82 g Produkt gewonnen (105 % der Theorie).
    • Herstellung von höheren Starburst PAMAM's einer halben Generation:
  • Die Generationen 4,5, 5,5 und 6,5 wurden wie oben beschrieben ohne nennenswerte Unterschiede in den Reaktantenkonzentrationen, den Reaktantenmolverhältnissen oder den Reaktionszeiten hergestellt.
    • Beispiel HH: Herstellung eines Starburst PAMAM's der Generationen 4, 5 und 6
  • Zu 2000 g vordestilliertem Ethylendiamin wurden 5,4 g eines Starburst PAMAM der Generation 4,5 als 15 Gew.-%ige Lösung in Methanol gegeben. Dies wurde für 48 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Der Methanol und der Großteil des überschüssigen Ethylendiamins wurden mit einem Rotationsverdampfer unter einem Wasserstrahlvakuum bei einer Temperatur von weniger als 60ºC entfernt. Das Gesamtgewicht des gewonnenen Produkts war 8,07 g. Durch Gaschromatographie wurde gezeigt, daß das Produkt an dieser Stelle noch 34 Gew.-% Ethylendiamin enthielt. Eine Portion von 5,94 g dieses Produkts wurde in 100 ml Methanol gelöst zur Entfernung des restlichen Ethylendiamins ultrafiltriert. Die Filtration wurde unter Verwendung eines mit einer Amicon YM2 Membran ausgestatteten Amicon TC1R Dünnkanal-Rezirkulationsseparators durchgeführt. Zum Aufrechterhalten eines Drucks von 55 psig (380 kPa) über die Membran wurde ein in-line Überdruckventil verwendet. Die 100 ml wurden zuerst auf 15 ml konzentriert, indem das Lösungsmittel zum ausschließlichen Fließen durch die Membran gezwungen wurde. Nach dieser anfänglichen Konzentrierung wurde der Fluß für 18 Stunden in einen Recyclisierungsmodus unter Beibehaltung eines konstanten Volumens überführt. Nach dieser Zeit waren 60 ml Methanol zur Rückgewinnung von noch im Modul und Verbindungsleitungen befindlichem Produkt über die Membran geleitet worden. Das Produkt wurde vom Lösungsmittel befreit, und 2,53 g eines Starburst PAMAM der Generation 5 wurden gewonnen. Eine Analyse durch Gaschromatographie zeigte einen Restgehalt von 0,3% Ethylendiamin im Produkt.
  • Die Herstellung der Generationen 4 und 6 erfolgte wie oben, wobei der einzige Unterschied das Gewichtsverhältnis von Ethylendiamin zu Ausgangsmaterial war. Zur Herstellung der vierten Generation war dieses Verhältnis 200 : 1 und für die sechste Generation war dieses Verhältnis 730 : 1.
    • Beispiel 1: Einlagerung von 2-(Acetyloxy)benzoesäure (Aspirin) in Starburst-Dendrimere.
  • Eine weithin akzeptierte Methode, um sicherzustellen, ob ein "Testmolekül" im Inneren einer Mizelle eingeschlossen ist, besteht darin, seine Kohlenstoff-13-Spinngitter-Relaxationszeiten (T&sub1;) in einem nicht-mizelliertem gegenüber einem mizelliertem Medium zu vergleichen. Eine erhebliche Annahme von T&sub1; für das mizellierte Medium ist ein Hinweis auf einen Einschluß des "Testmoleküls" in der Mizelle. Da Starburst- Dendrimere "kovalent fixierte" Analoga von Mizellen sind, wurde diese T&sub1; Relaxationszeittechnik verwendet, um den Grad bzw. das Ausmaß zu bestimmen, in dem verschiedene pharmazeutische Moleküle mit Starburst-Polyamidaminen assoziiert waren. In den folgenden Beispielen wurden T&sub1;-Werte für (Acetyloxy)benzoesäure (I) (Aspirin) in einem Lösungsmittel (CDCl&sub3;) bestimmt und dann mit T&sub1;-Werten in CDCl&sub3; bei verschiedenen Molverhältnissen [I : Dendrimer] verglichen.
    • Einschluß von Aspirin (I) in verschiedene Starburst-Polyamid amin-Dendrimere als Funktion der Generation
  • Verschiedene Halbgeneration-Starburst-Polyamidamindendrimere (Ester-terminiert, initiiert aus NH&sub3;) (G = 0,5 &rarr; 5,5) wurden mit 2-(Acetyloxy)benzoesäure in CDCl&sub3; vereinigt, um Verhältnisse von Säure : tertiäres Amin von 1,0 zu ergeben. Eine Auftragung von T&sub1;-Werten für 2-(Acetyloxy)benzoesäure gegenüber der Generation von zugegebenen Starburst-Dendrimer (siehe Fig. 4, worin C-4 bedeutet, C-6 bedeutet und o C- 5 bedeutet) zeigt, daß T&sub1; für die Kohlenstoffatome 4, 5 und 6 in 2-(Acetyloxy)benzoesäure ein Minimum über den Generationsbereich von 2,5 &rarr; 5,5 erreicht. Dies zeigt eine Assoziierung von 2-(Acetyloxy)benzoesäure in den Dendrimeren (G = 2,5 &rarr; 5,5) und bestätigt weiterhin, daß Polyamidamin-Dendrimere (Gen = 2,5 oder größer) als Trägermoleküle wirken können.
    • Beispiel 2: Freisetzung von Pseudoephedrin aus Starburst- Dendrimer-PAMAM
  • Pseudoephedrin (0,83 mg/ml) und Starburst PAMAM Dendrimer [1,0 mg/ml, G = 6,5, Endgruppe (Z) = 192 (Methylester)] wurden in entionisiertem destilliertem Wasser gelöst, und der pH-Wert der Donorphase wurde mit einer Natriumhydroxidlösung auf 9,5 eingestellt und sie wurde bei Raumtemperatur für etwa 12 Stunden aufbewahrt. Eine Lösung von Pseudoephedrin alleine wurde auf gleiche Weise behandelt (Kontrolle). Die Arzneimittel-Dendrimer-Lösung wurde nach dem ersten Experiment bei 40ºC für 8 Stunden aufbewahrt, und es wurde eine dynamische Analyse durchgeführt. Als Dialysemembran wurde Spectrator 7, MWCO 1000 mit einem Durchmesser von 28,6 mm in Spektrumtrennzellen (Halbzellvolumen 5 und 10 ml, Zelldimensionen: 38 mm Durchmesser für beide Zellen und Zelltiefe von 10 bzw. 20 mm für 5 bzw. 10 ml Zellen) verwendet.
  • Die Proben wurden durch eine für Pseudoephedrin entwickelte HPLC-Prozedur analysiert, deren Bedingungen wie folgt sind:
  • Säule: uBondapak C-18
  • mobile Phase: pH 3,2 Phosphatpuffer plus Acetonitril (80 : 20)
  • Fließrate: 0,3 ml/min
  • Nachweis: UV bei 210 nm
  • Retentionszeit: 13,3 min
  • Die Dialysemembran wurde mit entionisiertem Wasser gewaschen und für mindestens 12 Stunden vor der Verwendung in der Rezeptorphase einweichen gelassen. Die Dialysemembran wurde zwischen das Donor- und Rezeptorabteil gegeben und es wurde mit einem kleinen magnetischen Rührstab gerührt. Bekannte Volumina von Donor- und Rezeptorlösungen wurden in die jeweiligen Abteile eingebracht und der Transport von Pseudoephedrin zum Rezeptorabteil wurde als Funktion der Zeit beobachtet. Um Senkungsbedingungen aufrechtzuerhalten, wurde die gesamte Rezeptorphase periodisch (alle 30 Minuten) entfernt und durch eine frische Rezeptorphase ersetzt. Die Menge von Pseudoephedrin wurde in der gesammelten Rezeptorphase bestimmt. Die Experimente wurden bei Raumtemperatur (22ºC) durchgeführt. Die Rezeptorphase war gewöhnliches entionisiertes destilliertes Wasser.
  • Die Ergebnisse der dynamischen Analyse sind in Fig. 5 gezeigt. In Fig. 5 bedeutet Pseudoephedrin alleine (Kontrolle), bedeutet Pseudoephedrin plus das Dendrimer und bedeutet Pseudoephedrin plus das Dendrimer bei 40ºC, 8 Stunden vor Dialyse. Es ist ersichtlich, daß in Gegenwart von G 6,5 Dendrimer im Donorabteil die Dialyserate von Pseudoephedrin verringert wird. Eine Aufbewahrung der Donorlösung bei 40ºC scheint die Dialyserate weiter zu verringern.
  • Das Ergebnis wurde mit geringeren Konzentrationen (das Verhältnis der Anzahl von Arzneimittelmolekülen zur Anzahl von Endgruppen wurde gleich gehalten) G 6,5 Dendrimer 120 u/ml Pseudoephedrin 100 u/ml (122 u/ml Salz) wiederholt.
  • Die dynamische Analyse von Pseudoephedrin (alleine) bei dieser geringeren Konzentration war nahezu identisch mit derjenigen bei höherer Konzentration. Fig. 6 faßt die Ergebnisse dieses Experiments zusammen, worin Pseudoephedrin alleine (Kontrolle) bedeutet und Pseudoephedrin plus Dendrimer bedeutet.
    • Beispiel 3
  • Die Prozedur von Beispiel 2 wurde unter Verwendung der im folgenden angegebenen Modifikationen wiederholt.
  • Rezeptorphase: pH 7,4 Phosphatpuffer
  • Donorphase: pH 7,4 Phosphatpuffer plus Arzneimittel und Dendrimer in den folgenden Verhältnissen:
  • 1. G 6,5 : Arzneimittel :: 1 : 192
  • 2. G 5,5 : Arzneimittel :: 1 : 96
  • 3. G 4,5 : Arzneimittel :: 1 : 48
  • 4. G 6,5H: Arzneimittel :: 1 : 192
  • 5. G 5,5H: Arzneimittel :: 1 : 96
  • 6. G 4,5H: Arzneimittel :: 1 : 48
  • Die obigen Donorphasenzusammensetzungen plus Pseudoephedrin alleine wurden einer dynamischen Analyse unterzogen. Der Buchstabe "H" nach der Generationenzahl des Dendrimers steht für hydrolysiertes Dendrimer. Die Hydrolyse erfolgte durch die in den Beispielen M und N beschriebene Prozedur.
  • Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 7 zusammengefaßt, worin das Donor- und Rezeptorabteil pH 7,4 Phosphatpuffer enthielten. Für Pseudoephedrin alleine (P) ist die mittlere Kurve von drei Experimenten aufgetragen (durch die nicht unterbrochene Linie gezeigt) und für die anderen Experimente ist ein typischer Versuch gezeigt. In Fig. 7 stellen die folgenden Symbole das Dendrimer der angegebenen Generation dar. TABELLE III
  • Symbol Dendrimergeneration
  • 5.5
  • 6.5
  • 4.5
  • 5.5H
  • 6.5H
  • 4.5H
  • Pseudoephedrin scheint mit dem (unhydrolysierten) Dendrimer bei pH 7,4 nicht zu assoziieren. Eine Hydrolyse der Endfunktionalitäten in die Carboxylatform besitzt eine dramatische Wirkung auf die Dialyserate (Verringerung). Die Generationenzahl scheint die Dialyserate nicht zu beeinflußen.
    • Beispiel 4: Wechselwirkungsuntersuchungen von Salicylsäure mit PAMAM Starburst-Dendrimeren
  • In diesem Beispiel wurden die Wechselwirkungseigenschaften von Salicylsäure mit PAMAM Starburst-Dendrimeren gemessen. Diese Dendrimere bestanden aus einem Ammoniak-initiiertem Kern mit von N-(2-Aminoethyl)acrylamid stammenden Wiederholungseinheiten. In den Untersuchen waren sowohl Polymere der vollen (Amin-terminierte Funktionen) als auch der halben (Ester-Endgruppen) Generation eingeschlossen. Das in den Experimenten verwendete Verhältnis von Salicylsäure zu Starburst-Dendrimeren betrug etwa ein Salicylsäuremolekül zu einer Amin-Endfunktionalität für Polymere der vollen Generation. Bei der Untersuchung mit Polymeren einer halben Generation wurde das gleiche Verhältnis mit für das höhere Molekulargewicht des Polymers gemachten Änderungen verwendet.
  • Die Experimente wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung einer statischen Zelldialyse-Gleichgewichtsmethodik verwendet. Durch SpectraPor 6 Membranen (Molekulargewichtsausschluß = 1000) getrennte statische Dialysespektrumzellen (halbes Zellvolumen 10 ml) wurden für alle Experimente verwendet. Der Transport von Salicylsäure wurde als Funktion der Zeit durch Entnahme von Aliquots aus entsprechenden Zellabteilen verfolgt und durch HPLC-Analyse unter Verwendung eines UV-Detektors bei 296 nm bestimmt (Bondupak C-18 Säule, mobile Eluierungsphase Acetonitril/0,1 M Phosphatpuffer (pH 3,2) mit einem Verhältnis von 20 : 80 (V/V), auf eine Fließrate von 30 ml/Stunde eingestellt).
  • 10 ml einer Lösung, die 1 mg/ml Salicylsäure und 2,5 mg/ml Starburst-Polymer (Gen 4,0), auf pH 6,65 und 5,0 mit HCl- Lösung eingestellt, wurden in das Donorabteil der Dialysezelle gegeben und ein gleiches Volumen von gereinigtem Wasser, auf dieselben pH-Werte eingestellt, wurde in das Rezeptorabteil gegeben. Es wurde der Transport von Salicylsäure in das Rezeptorabteil verfolgt. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 angegeben. In Fig. 8 ist die freie Säure durch dargestellt, die Säure plus Dendrimer der Generation 4,0, pH 6,65 ist durch o dargestellt und die Säure plus Dendrimer der Generation 4,0 pH 5,00 ist durch dargestellt.
  • Aufgrund der prozentual geringeren Ionisierung der Amingruppen auf dem Polymer bei pH 6 ist ein größeres Ausmaß der Wechselwirkung mit Salicylsäure bei pH 5 zu erwarten, was zu einem geringeren Verbindungstransport beim tieferen pH-Wert führte. Die in Fig. 8 gezeigten Ergebnisse weisen auf einen viel geringeren Anteil an Salicylsäure hin, der in Gegenwart von Polymer bei beiden untersuchten pH-Werten im Vergleich zur Salicylsäure-Kontrolluntersuchung transportiert wurde. Es wurde ebenfalls beobachtet, daß wie vorhergesagt bei pH 6,65 mehr Salicylsäure als bei pH 5,0 transportiert wird. Die Daten zeigen eine Wechselwirkung des Starburst-Polymers mit Salicylsäure, die durch den pH-Wert geregelt werden kann. Auch verzögerte Freisetzungseigenschaften gehen aus diesen Daten hervor, da der Anstieg der Salicylsäure-Konzentrationen in Gegenwart von Polymer sich über den bei der Kontrolluntersuchung gefundenen Gleichgewichtspunkt von etwa 12 Stunden fortsetzt.
  • Zur weiteren Untersuchung der Wechselwirkungseigenschaften von Salicylsäure mit Starburst-Polymeren (Gen = 4,0) wurde ein Experiment bei pH 8,0 vorgesehen. Der Aufbau der Untersuchung unterschied sich von der vorher beschriebenen dadurch, daß nur die Salicylsäurelösung (1 mg/ml), eingestellt auf pH 8,0, in das Donorabteil und die Polymerlösung (2,5 mg/ml) in das Rezeptorabteil gegeben wurde. Der Verlust von Salicylsäure aus dem Donorabteil wurde wie zuvor beschrieben aufgezeichnet. Das Ergebnis des Experiments ist in Fig. 9 angegeben. In Fig. 9 ist die freie Säure durch - - dargestellt und die Säure plus Dendrimer der Generation 4,0 bei pH 8,0 ist durch dargestellt.
  • Wie aus Fig. 9 hervorgeht, unterscheiden sich die Gleichgewichtseigenschaften von Salicylsäure im Donorabteil mit Starburst-Polymeren im Rezeptorabteil von der Salicylsäure- Kontrolluntersuchung. Auf Basis der Ionisierungseigenschaften der Moleküle bei pH 8 ist eine Wechselwirkung von etwa 6 bis 7% zu erwarten. Das gefundene Ausmaß der Wechselwirkung liegt in der Größenordnung von 4 bis 5%. Die geringere beobachtete Assoziierung kann auf die experimentelle Variabilität oder auf eine Ionisierungskonstante von weniger als 1 zurückzuführen sein.
  • Dieses Experiment zeigt eine Aufnahme oder Entfernung von freier Salicylsäure aus der kontinuierlichen Phase des Systems durch das Polymer. Dieser Wirkungstyp könnte zu einer Unterdrückung der Reaktivität von Molekülen führen, was eine mit den Polymeren assoziierte mögliche Art von Chelatierungseigenschaft vermuten läßt.
  • Es wurden die Wechselwirkungseigenschaften von Salicylsäure bei pH 6,65 mit einem Halbgeneration-Starburst-Polymer (Gen = 4,5) mit Ester-terminierten funktionalen Gruppen gemessen. Salicylsäure (1 mg/ml) wurde mit Starburst-Polymer (Gen - 4,5) 3,6 mg/ml bei pH 6,65 vereinigt. 10 ml der Lösung wurden in das Donorabteil gegeben, und der Transport aus dem Donorabteil wurde wie zuvor beschrieben verfolgt. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 angegeben. In Fig. 10 ist die freie Säure durch - - dargestellt und die Säure plus Polymer ist durch dargestellt.
  • Unter diesen experimentellen Bedingungen kann das Auftreten von keiner Ladungswechselwirkung vorhergesagt werden, da die tertiären Amingruppen bei pH 6,65 nicht ionisiert sind. Wie aus Fig. 10 hervorgeht ist der Verlust von Salicylsäure in Gegenwart von Polymer (Gen 4,5) während der ersten 10 Stunden der Dialyse mit demjenigen der Salicylsäure-Kontrolluntersuchung praktisch identisch.
  • Aufgrund der in diesem Beispiel gezeigten Daten können folgenden Beobachtungen gemacht werden:
  • (1) PAMAM Starburst-Polymere der vollen Generation wirken als Träger für Salicylsäure.
  • (2) PAMAM Starburst-Polymere der vollen Generation besitzen eine verzögerte Freisetzungsfunktionalität für Salicylsäure.
  • (3) Salicylsäure-Trägereigenschaften von PAMAM Starburst-Polymeren der vollen Generation können durch den pH-Wert geregelt werden.
    • Beispiel 5: Nachweis einer multiplen Chelatierung von Eisen durch ein Natriumpropionat-terminiertes Starburst-Polyamidamin der sechsten Generation.
  • Das Natriumpropionat-terminierte Polyamidamin (aus Ammoniak initiiert) der sechsten Generation (97,1 mg, 2,45 Mol) wurde in 1,5 ml entionisiertem Wasser gelöst. Durch Zugabe von 0,5 ml 0,5N HCl wurde der pH auf 6,3 verringert. Durch Zugabe von Eisen-III-Chlorid (0,5 ml einer 0,12 M Lösung, 0,051 mmol) wurde ein hellbraunes gelatineartiges Präzipitat erzeugt. Nach Erhitzen bei 60ºC für 0,5 Stunden wurde das gelatineartige Präzipitat löslich, was zu einer homogenen orangefarbenen Lösung führte. Die Lösung wurde durch Biogel P2 Acrylamidgel (10 g, zweimal) filtriert und die orangefarbene Bande isoliert (frei von Halogenidverunreinigung). Eine Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum ergab das Produkt als orangefarbenen Film (30 mg). Die Analyse stand mit der Chelatierung von etwa 20 Mol Eisen-III-Ionen pro Mol Starburst- Dendrimer im Einklang. Tabelle IV Gefunden Theoretisch SB = C&sub1;&sub5;&sub2;&sub1;H&sub2;&sub4;&sub6;&sub7;N&sub3;&sub7;&sub9;O&sub5;&sub7;&sub3;
  • Diese Ergebnisse bestätigen die Chelatierung von 20 ± 2 Mol Eisen-III-Ionen pro Mol Starburst-Dendrimer.
    • Beispiel 6: Herstellung eines Produkts, das mehr als ein Rhodiumatom pro Starburst-Polymer enthält.
  • PAMAM der Generation 2,5 (Ester-terminiert, aus Ammoniak initiiert) (0,18 g, 0,087 mmol) und Rhcl&sub3;·3H&sub2;O (0,09 g, 0,3 mmol) wurden in Dimethylformamid (DMF) (15 ml) vermischt und für 4 Stunden bei 70ºC erhitzt. Die Lösung wurde purpurfarben und der Großteil des Rhodiums wurde aufgenommen. Das nicht reagierte Rhodium wurde durch Filtration entfernt, und das Lösungsmittel wurde auf dem Rotationsverdampfer entfernt. Das gebildete Öl war in Chloroform löslich. Es wurde mit Wasser gewaschen und vor Entfernung des Lösungsmittels getrocknet (MgSO&sub4;), um ein rotes Öl (0,18 g) zu ergeben. Das NMR-Spektrum wurde in CDCl&sub3; aufgenommen und zeigte nur geringe Unterschiede zwischen dem chelatierten und nicht-chelatierten Starburst. Eine Verdünnung eines Teiles dieser CDCl&sub3;-Lösung mit Ethanol und anschließende NaBH&sub4;-Zugabe führte zu einer Rhodiumpräzipitation. Rhcl&sub3;·3H&sub2;O ist in Chloroform und in Chloroform-Starburst-Lösung unlöslich, wodurch die Chelatierung bestätigt wurde.
    • Beispiel 7: Herstellung eines Produkts, das Pd mit einem Starburst-Polymer chelatiert enthält
  • PAMAM der Generation 3,5 (Ester-terminiert, initiiert aus NH&sub3;) (1,1 g, 0,24 mmol) wurde unter Rühren in Acetonitril (50 ml) gelöst. Es wurde Palladiumchlorid (0,24 g, 1,4 mmol) zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht auf 70 bis 75ºC (Wasserbad) erhitzt. Das PdCl&sub2; wurde in das Starburst aufgenommen. Nach Entfernung des Lösungsmittels bestätigte das NMR in CDCl&sub3;, daß eine Chelatierung stattgefunden hatte. Eine Verdünnung der CDCl&sub3;-Lösung mit Ethanol und Zugabe von NaBH&sub4; führte zu einer Präzipitation des Palladiums. Das chelatierte Produkt (1,23 g) wurde als braunes Öl isoliert.
    • Beispiel 8: Nachweis einer multiplen Chelatierung von Yttrium durch ein Methylencarboxylat-terminiertes Starburst-Polyethylenimin der zweiten Generation durch Trans-Chelatierung aus Yttriumacetat.
  • Das Methylencarboxylat-terminierte Starburst-Polyethyleniminmaterial (0,46 g, 52,5% aktiv, Rest Natriumbromid, 0,18 mmol aktives Starburst-Dendrimer) aus Beispiel FF wurde in 4,5 ml Deuteriumoxid gelöst. Der resultierende pH-Wert war 11,5 bis 12. Eine Lösung von Yttriumacetat wurde durch Lösen von Yttriumchlorid (0,15 g, 0,5 mmol) und Natriumacetat (0,41 g, 0,5 mmol) in 1,5 ml Deuteriumoxid (2,9 Mol Yttrium pro Mol Dendrimer) hergestellt. Aliguots von 0,5 ml der Yttriumacetatlösung wurden der Dendrimerlösung zugesetzt, und die ¹³C NMR-Spektren wurden bei 75,5 MHz aufgenommen.
  • Das ¹³C NMR-Spektrum von Yttriumacetat zeigt zwei Resonanzen, 184,7 ppm für den Carboxyl-Kohlenstoff und 23,7 ppm für den Methyl-Kohlenstoff im Vergleich zu 182,1 und 24,1 ppm für Natriumacetat und 177,7 und 20,7 ppm für Essigsäure (Sadtler 13C NMR-Standardspektren). Eine Überwachung der Positionen dieser Banden zeigt den Chelatierungsgrad mit dem Starburst- Dendrimer. Das informativste Signal für das Starburst-Dendrimer, das auf Chelatierung hinweist, ist das &alpha;-CH&sub2; (der bei der Chelatierung beteiligten Methylencarboxylatgruppe), das im unchelatierten Dendrimer bei 58,4 ppm und im chelatierten Dendrimer bei 63,8 ppm auftritt. Nach Chelatierung mit Yttrium verkürzen sich die Spinngitter-Relaxationszeiten des &alpha;-CH&sub2; wie erwartet von 0,24 ± 0,01s auf 0,14 ± 0,01s, was auf eine Chelatierung hinweist.
  • Nach der Zugabe von 0,5 ml der Yttriumacetatlösung zum Starburst-Dendrimer wurde offenbar das gesamte Yttrium von dem Dendrimer chelatiert, was dadurch bestätigt wurde, daß die Signale für das Acetat diejenigen für Natriumacetat waren. Dieselbe Beobachtung wurde für die Zugabe eines zweiten 0,5 ml Aliquot der Yttriumacetatlösung festgestellt. Nach Zugabe des dritten Aliguots von Yttriumacetat wurde nicht das gesamte Yttrium als Starburst-Chelat aufgenommen, die Acetat- Carboxylresonanz verschob sich auf 183,8 ppm, was zeigte, daß ein Teil des Yttriums mit dem Acetat assoziiert war. Die integrierte Fläche der chelatierten &alpha;-CH&sub2; Gruppen auf dem Dendrimer erhöhte sich, was zeigte, daß ein Teil des dritten Mol-Äquivalents des zugesetzten Yttriums tatsächlich mit dem Dendrimer chelatierte. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Dendrimer 2 bis 3 Yttriumionen pro Dendrimermolekül chelatieren kann.
    • Beispiel 9: Nachweis einer multiplen Chelatierung von Yttrium durch ein Methylencarboxylat-terminiertes Starburst-Polyamidamin der zweiten Generation durch Trans-Chelatierung aus Yttriumacetat.
  • Für diese Untersuchung wurde die gleichen experimentellen Methoden wie für Beispiel 8 verwendet. Das Methylencarboxylat-terminierte Starburst-Polyamidaminmaterial (0,40 g, Aktivität 62,5%, Rest Natriumbromid, 0,12 mmol) wurde in 4 bis 5 ml Deuteriumoxid gelöst. Der resultierende pH-Wert war 11,5 bis 12, der vor dem Experiment mit 6N HCl auf 9,4 verringert wurde. Eine Lösung von Yttriumacetat wurde durch Lösen von Yttriumchlorid (0,1125 g, 0,37 mmol) und Natriumacetat (0,0915 g, 1,1 mmol) in 1,5 ml Deuteriumoxid hergestellt, so daß 0,5 ml der Lösung jeweils ein Mol-Äquivalent Metall enthalten.
  • Die ersten zwei Mol-Äquivalente von zugesetztem Yttriumacetat wurden durch das Starburst-Polyamidamin vollständig chelatiert. Nach Zugabe eines dritten Moläquivalents an Yttrium trat eine Präzipitation des Produkts ein und deshalb konnten keine NMR-Daten erhalten werden. Die Signale, welche die beste Information über eine Chelatierung durch das Starburst- Dendrimer ergaben, waren diejenigen der zwei Kohlenstoffatome in Nachbarschaft zum chelatierenden Stickstoff. Die chemischen Verschiebungen dieser Kohlenstoffatome im nicht-chelatierten Dendrimer traten bei 59,1 ppm für das -CH&sub2; und 53,7 ppm für den ersten Methylenkohlenstoff des Rückgrats auf. Nach Chelatierung wurde gefunden, daß sich diese beiden Resonanzen ins Tieffeld auf 60,8 bzw. 55,1 ppm verschieben. Die Trans-Chelatierung zeigt, daß zwei Metallionen pro Dendrimer leicht chelatiert werden können, nach Chelatierung eines unbekannten Bruchteils eines dritten Moläquivalents präzipitiert jedoch das Produkt aus der Lösung.
    • Beispiel 10: Nachweis einer multiplen Chelatierung von &sup9;&sup0;Y durch ein Methylencarboxylat-terminiertes Starburst-Polyethylenimin der zweiten Generation.
  • Eine Standardlösung von Yttriumchlorid (3 · 10&supmin;² M, mit trägerfreiem &sup9;&sup0;Y versetzt) und Methylencarboxylat-terminiertem Starburst-Polyethylenimin der zweiten Generation (6 · 10&supmin;² M) wurde hergestellt. Diese wurden bei bei verschiedenen Metall : Starburst-Verhältnissen in HEPES-Puffer miteinander umgesetzt. Die Komplexausbeute wurde durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Sephadex G50 Ionenaustauscherkörnern, Elution mit 10% NaCl : NH&sub4;OH, 4 : 1 bei pH 10 bestimmt. Das nicht komplexierte Metall wird auf der Säule entfernt, komplexiertes Metall wird eluiert. Die Ausbeuten wurden durch einen Vergleich der eluierten Radioaktivität mit derjenigen auf der Säule unter Verwendung eines Lochzählers erhalten. Tabelle V Chelatierung von PEI-Acetat Generation 2,5 mit &sup9;&sup0;Y Vol. Y+3 PEI HEPES M : L Theor. %-Komplex Akt. Alle Volumina in Tabelle V sind in Mikrolitern.
  • Innerhalb der Genauigkeit der Experimente zeigen diese Ergebnisse, daß das Starburst PEI Acetat der Generation 2,5 zwischen 2 und 3 Metallatome pro Polymer chelatieren kann, was einen löslichen Komplex ergibt.
    • Beispiel 11: Konjugation von 4-Isothiocyanatophenylmethylencarboxylat-terminierten Starburst-Polyethylenimin der dritten Generation mit einem monoklonalen IgG- Antikörper
  • Das Isothiocyanat aus Beispiel DD, 10 mg (50 umol), wurde in 500 ul 3 mM Indiumchlorid gelöst, das mit radioaktivem Indium-111 Chlorid versetzt worden war, und der pH-Wert wurde mit 660 ul N NaOH auf 9 eingestellt. Dann wurden Aliquots von vollständigem monoklonalem Antikörper IgG CC-46 mit Aliquots des chelatierten Starbursts vermischt. Die Gemische wurden geschüttelt und dann für 18 Stunden stehengelassen. Die Gemische wurden dann durch HPLC (Säule DuPont Zorbax Biosphere GF-250, Elutionsmittel 0,25 M Natriumacetat, pH 6) und einem UV-Detektor bei 254 nm und einem Radioaktivitätsdetektor analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt. Tabelle VI Starburst-IgG-Konjugate IgG Lösung Lösung von chelatiertem Starburst % Radioaktivität auf IgG % IgG konjugiert
    • Beispiel 12: Konjugation von 4-Isothiocyanatophenylmethylencarboxylat-terminiertem Starburst-Polyethylenimin der dritten Generation mit einem monoklonalen IgG- Antikörper
  • Das Isothiocyanat aus Beispiel DD, 4 mg (20 umol) wurde mit 200 ul von 3 mM Indiumchlorid (60 pmol) vermischt. Ein 20 ul Aliquot der Lösung wurde dann mit radioaktivem Indium-III- Chlorid versetzt, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 30 ul 1 N NaOH und 10 ul 0,1 N HCl auf 9 eingestellt. Das Indiumchelat wurde mit 150 ul vollständigem IgG-Antikörper CC-49, 10 mg/ml, in 50 mM HEPES-Puffer bei pH 9,5 vermischt. Nach 18 Stunden bei Raumtemperatur wurde der Antikörper durch präparative HPLC (DuPont Zorbax Biosphere GF 250 Säule, Elutionsmittel 0,25 M Natriumacetat, pH 6) und einem UV- Detektor bei 254 nm und einem Radioaktivitätsdetektor isoliert. Der isolierte Antikörper wurde auf einer Amicon-Membran konzentriert und in PBS-Puffer bei pH 7,4 aufgenommen. Der isolierte Antikörper hatte eine spezifische Aktivität von etwa 0,5 uCi/100 ug.
    • Beispiel 13: In vivo Lokalisierung von ¹¹¹In-markiertem Starburst-Antikörper-Konjugat
  • Die Nützlichkeit des in Beispiel 12 hergestellten markierten Starburst-Antikörper-Konjugats wurde durch Messung der Aufnahme des Materials durch ein Human-Tumor-Fremdtransplantat in einer athymischen Maus gezeigt. Weibliche athymische Mäuse wurden subkutan mit der humanen Colonkarzinomzellinie L-174T (etwa 4 · 10&sup6; Zellen pro Tier) inokuliert. Etwa zwei Wochen nach der Inokulation erfolgte bei jedem Tier eine Injektion in die Schwanzvene. Die Mäuse wurden nach 17 und 48 Stunden (fünf Tiere an jedem Zeitpunkt) getötet, der Tumor und ausgewählte Gewebe wurden entnommen und gewogen und die Radioaktivität wurde in einem Gammazähler bestimmt. Nach 17 Stunden waren 13,5% der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe am Tumor lokalisiert. Nach 48 Stunden waren 21,6% der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe am Tumor lokalisiert.
    • Beispiel 14: Bindung von Herbizidmolekülen (2,4-D) an die Oberfläche von Starburst-Dendrimeren.
  • Ein PAMAM der dritten Generation (Initiatorkern = NH&sub3;) (2,0 g, 0,8 mmol) wurde in H&sub2;O (10 ml) gelöst und mit Toluol (20 ml) vereinigt. Dann wurde das Zweiphasensystem gerührt und mit einem Eisbad gekühlt, wonach das Säurechlorid von 2,4-D [(2,4-Dichlorphenoxy)-essigsäure] (2,4 g, 12 Äquivalente) gelöst in Toluol (10 ml) tropfenweise über 30 Minuten zugegeben wurde. Bei nahezu vollständiger Zugabe wurde NaOH (0,5 g, 12,5 mmol, 50% Gew./Gew-Lösung) zugegeben und die Lösung für weitere 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann zur Trockene eingedampft, und der resultierende feste Rückstand wiederholt in CHCl&sub3;/MeOH (1 : 1) aufgenommen und filtriert. Die braune Festsubstanz war nicht vollständig in CHCl&sub3; löslich und schien in Wasser unlöslich zu sein; der Zusatz von Aceton erleichterte jedoch die Auflösung. Die braune Festsubstanz wurde für 24 Stunden in CHCl&sub3; gerührt und die Lösung filtriert (es wurde eine klebrige braune Festsubstanz erhalten). Nach Trocknen über MgSO&sub4; wurde das Filtrat konzentriert, um ein viskoses orangefarbenes Öl zu ergeben, daß sich beim Stehen verfestigte. Die im ¹³C NMR gemessene teilweise Amidierung an der Oberfläche durch 2,4-D steht mit der Assoziierung von 2,4-D an das Starburst-Polymer im Einklang.
    • Beispiel 15: Einschluß von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4- D) in Starburst-Dendrimere.
  • Eine weithin akzeptierte Methode um sicherzustellen, ob ein "Testmolekül" im Inneren einer Mizelle eingeschlossen ist, besteht darin, seine Kohlenstoff-13-Spinngitter-Relaxationszeiten (T&sub1;) in einem nicht-mizelliertem Medium gegenüber einem mizelliertem Medium zu vergleichen. Eine erhebliche Abnahme von T&sub1; für das mizellierte Medium ist ein Nachweis eines Einschlusses des "Testmoleküls" in der Mizelle. Da Starburst-Dendrimere "kovalent fixierte" Analoga von Mizellen sind, wurde diese T&sub1;-Relaxationszeittechnik zur Bestimmung des Grads/Ausmaßes verwendet, in dem verschiedene Herbizidmoleküle mit Starburst-Polyamidaminen assoziiert waren. In den folgenden Beispielen wurden T&sub1;-Werte für 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (I) (2,4-D) in einem Lösungsmittel (CDCl&sub3;) bestimmt und dann mit T&sub1; -Werten in CDCl&sub3; bei verschiedenen Molverhältnissen [I : Dendrimer] verglichen.
  • Einschluß von 2,4-D in verschiedene Starburst-Polyamidamin-Dendrimere als Funktion der Generation.
  • Verschiedene Halbgeneration-Starburst-Polyamidamin-Dendrimere (Ester-terminiert, aus NH&sub3; initiiert) (Generation (Gen) = 0,5, 1,5, 2,5, 3,5, 4,5 und 5,5) wurden mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (I) in CDCl&sub3; vereinigt, um ein Verhältnis von Säure : tertiäres Amin von 1 : 3,5 und Molverhältnisse von Säure : Dendrimer von 1 : 86 wie in Tabelle VII gezeigt, zu ergeben. Die Relaxationszeiten (T&sub1;), die für die verschiedenen Kohlenstoffatome in 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und Starburst PAMAM Dendrimeren der Generation 3,5 erhalten wurden, sind in Tabelle VIII gezeigt, beide für Säure/Amin- Verhältnisse von 1 : 1 und für gesättigte Lösungen von 2,4- D. Tabelle VII Gen. Säure/Amin Säure/Gesamtstickstoff Molverhältnis (Säure/Starburst) * bedeutet Beispiele eines 2,4-D Einschlusses in das Innere des Dendrimers in überstöchiometrischen Mengen. Tabelle VIII T&sub1; Werte für 2,4-D/PAMAM Starburst G = 3,5 Einschlukomplex: Konzentrationseffekte Kohlenstoff Säure/Amin gesättigt mit 2,4-D ** bedeutet die chemischen ¹³C Verschiebungen bezüglich Chloroform bei 76,9 ppm.
  • Diese Daten zeigen, daß überstöchiometrische Mengen von 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure (d. h. [(1) : Dendrimer Gen = 3,5] = 67) ohne Erhöhung des T&sub1;-Werts in jedem Fall im gesättigen Zustand verwendet werden können (siehe Spalten (A) und (B) in Tabelle VIII). Tatsächlich nehmen die Relaxationszeiten T&sub1; (Spalte (B)) leicht ab, was darauf hinweist, daß überstöchiometrische Mengen an 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure im Inneren des Dendrimers eingeschlossen werden können. Beispielsweise ein Molverhältnis von
  • [(I) : Dendrimer = Gen 2,5] = 34, während [(I) : Dendrimer Gen = 3,5] = 67 (siehe Spalte D in Tabelle VII).
  • Fig. 11 ist eine Auftragung von T&sub1;-Werten für die Kohlenstoffatome-3, 5 und 6 in 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure als Funktion der Dendrimergeneration (d. h. 0,5 &rarr; 5,5). Ein Minimum in T&sub1; wird in allen Fällen der Generationen 2,5 &rarr; 5,5 erreicht, was darauf hinweist, daß eine Einlagerung in diesem Dendrimergenerationenbereich auftritt. Fig. 11 enthält auch T&sub1;-Werte für 2,4-D in Gegenwart von Triethylamin [N(Et)&sub3;] und N(Et)&sub3; + N-Methylacetamid. Es ist ersichtlich, daß diese Werte viel größer als für Dendrimere G = 1,5 &rarr; 5,5 sind, was weiterhin für einen molekularen Einschluß in das Dendrimermolekül spricht.
    • Beispiel 16: Herstellung eines Produkts, das Fluorescein mit einem Starburst-Polymer enthält
  • Eine Probe von 5-Carboxyfluorescein (0,996 g) und Starburst- Polyethylenimin (Gen = 2,0, Amin-terminiert, initiiert aus NH&sub3;) (0,202 g) wurden in 10 ml Methylenchlorid und 5 ml Methanol vermischt und für 10 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach Filtration wurde ein unlösliches rotes Pulver (0,37 g) erhalten (in der Hauptsache nicht reagiertes 5-Carboxyfluorescein). Aus dem Filtrat wurden 0,4 g einer leuchtend roten Festsubstanz filtriert, die einen Erweichungspunkt von 98 bis 103ºC zeigte und bei 175 bis 180ºC zu einer leuchtend roten Schmelze schäumte; NMR-Spektren (D&sub2;O) dieses Produktes entsprachen einem Dendrimer mit an die Oberfläche gebundenem Fluorescein.
    • Beispiel 17:
  • In einer Prozedur ähnlich wie in Beispiel 3 beschrieben wurde Starburst-Polyethylenimin (Gen = 2,0, Amin-terminiert, initiiert aus NH&sub3;) mit Fluoresceinisothiocyanat umgesetzt, um eine leuchtend rote, irisierende Festsubstanz zu ergeben, die sich zur Verwendung als Fluoreszenzmarkierungsmittel eignete.
    • Beispiel 18: Verkapselung von R (+) - Limonen in Polyamid amin-Starburst-Dendrimeren
  • Eine Lösung von Starburst-PAMAM-Dendrimer (MG etwa 175.000, Generation = 9,0) mit einem Feststoffgehalt von 5 bis 50 Gew.-% in Methanol wird tropfenweise bis zur Sättigung zu R(+)-Limonen in Methanol gegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) für mehrere Stunden gerührt und dann auf einem Büchi-Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur von flüchtigen Substanzen befreit, um ein festes Produkt zu ergeben. Eine Erwärmung auf Temperaturen von mehr als 80ºC ergibt in Lösungsmittel unlösliche Produkte, die erhebliche Mengen an R(+)-Limonen in einer verkapselten Form enthalten. Diese Produkte sind hervorragende Prototypen für eine langsame Freisetzung von R(+)-Limonen als Duftstoff und Desodorierungsprodukt.
    • Beispiel 19: Verkapselung von Schwermetallsalzen in Polyamidamin-Starburst-Dendrimeren
  • Eine Lösung von Starburst-PAMAM-Dendrimer (MG etwa 350.000, Generation = 10,0) mit einem Feststoffgehalt von 5 bis 50 Gew.-% in Wasser wird bei Zugabe einer gesättigten Lösung von Bleiacetat [Pb(C&sub2;H&sub3;O&sub2;)&sub2;] gerührt. Die Lösung wird bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) für mehrere Stunden gerührt und dann auf einem Büchi-Rotationsverdampfer von flüchtigen Substanzen befreit, um feste Produkte zu ergeben. Eine Scanner-Transmissions-Elektronenmikrographie dieser Produkte zeigte, daß diese Schwermetallsalze im Inneren der Dendrimere verkapselt sind. Diese Schwermetallsalze enthaltenden Filme eignen sich als Abschirmungen zur Absorption von elektromagnetischer Strahlung.
    • Beispiel 20: Verkapselung von (wasserlöslichem) Fluorescein- Farbstoff in Polyamidamin-Starburst-Dendrimeren
  • Eine Lösung von Starburst-PAMAM-Dendrimer (MG etwa 175.000, Generation = 9,0) mit 5 bis 50 Gew.-% Feststoffen (H&sub2;O/CH&sub3;OH) wird bei Zugabe von Fluorescein-Dinatriumsalz (Acid Yellow 73, Cl. 45350; Uranine; von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI erhältlich) bis zur Sättigung gerührt. Die Lösung wird bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) für mehrere Stunden gerührt und dann bei Raumtemperatur von flüchtigen Substanzen befreit, um ein gefärbtes festes Produkt zu ergeben. Diese Farbstoffverkapselten Dendrimere sind hervorragende Referenzproben zur Kalibrierung von Ultrafiltrationsmembranen.
    • Beispiel 21: Herstellung von Dendrimeren mit Fluoreszenz- Endgruppen A. Reaktion eines Amin-terminierten Dendrimers mit N-Dansylaziridin
  • Eine Probe (1,5 g, 1,6 · 10&supmin;³ Mol) Starburst-Polyethylenimin (LPEI, G = 3,0, Endgruppen (Z) = 12, MG = 920) wird in 20 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird gerührt und 0,884 g (3,84 · 10&supmin;² Mol) einer Lösung von N-Dansylaziridin (ICN Biomedicals, Costa Mesa. CA) wird tropfenweise über eine Dauer von 20 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum ergibt ein festes Produkt. NMR- und Infrarotanalyse zeigen, daß das Produkt kovalent gebundene Dansylgruppen an der Oberfläche des Dendrimer enthält.
    • B. Reaktion von Amin-terminierten Dendrimeren mit Dansylchlorid
  • Eine Lösung von Starburst-Polyamidamin (1,0 g, 1,9 · 10&supmin;&sup4; Mol) (initiiert aus Ammoniak, G = 4,0, Endgruppen (Z) = 24, MG = 5.147) in 30 ml Wasser wird in einem Dreihalskolben mit 80 ml Toluol gerührt, während eine Lösung von Dansylchlorid (1,23 g, 4,5 · 10&supmin;³ Mol) (5-Dimethyl-amino-1-naphthalinsulfonylchlorid von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) in 40 ml Toluol tropfenweise unter Kühlung mit Eis zugegeben wird. Gleichzeitig wird eine Lösung von 10% NaOH (13,3 Mol, 10% Überschuß) zum Reaktionsgemisch gegeben, um eine ölige Kugel zu ergeben. Das Produkt wird mit Wasser gewaschen, in Methanol gelöst und mit Diethylether präzipitiert, um ein festes Produkt zu ergeben. NMR und Infrarotanalyse zeigen kovalent gebundene Dansylgruppen an der Dendrimeroberfläche.

Claims (74)

1. Dichtsternkonjugat, das mindestens ein Dichtsternpolymer assoziiert mit mindestens einer Einheit von mindestens einem getragenen Material umfaßt.
2. Konjugat nach Anspruch 1, worin das Dichtsternpolymer ein Dichtsterndendrimer ist.
3. Konjugat nach Anspruch 2, worin das Dichtsterndendrimer symmetrisch verzweigt ist.
4. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Dichtsternpolymer die gleichen Wiederholungseinheiten innerhalb einer einzelnen Generation besitzt.
5. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Wiederholungseinheit in einer Generation sich von der Wiederholungseinheit in mindestens einer anderen Generation unterscheidet.
6. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das getragene Material ein pharmazeutisches Material ist.
7. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das getragene Material ein agrochemisches Material ist.
8. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin mindestens eines der getragenen Materialien ein Arzneimittel, Pestizid, Radionuklid, Chelatierungsmittel, chelatiertes Metall, Toxin, Antikörper, Antikörperfragment, Antigen, Signalerzeugungsmittel, Signalreflexionsmittel, Signalabsorptionsmittel, Duftstoff, Pheromon oder Farbstoff ist.
9. Konjugat nach Anspruch 8, worin das getragene Material ein Signalerzeugungsmittel, Signalreflexionsmittel oder Signalabsorptionsmittel ist.
10. Konjugat nach Anspruch 9, worin das Signalerzeugungsmittel eine fluoreszierende Einheit ist.
11. Konjugat nach Anspruch 8, worin ein Lanthanid direkt mit dem Dichtsternpolymer chelatiert ist.
12. Konjugat nach Anspruch 9, worin das getragene Material &sup5;&sup6;Fe, Gd oder &sup5;&sup5;Mn ist.
13. Konjugat nach Anspruch 9, worin das getragene Material chelatiertes Eisen, Rhodium, Palladium oder Yttrium ist.
14. Konjugat nach Anspruch 9, worin das getragene Material &sup9;&sup0;Y ist.
15. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das getragene Material ein biologisch wirksames Mittel ist.
16. Konjugat nach Anspruch 15, worin das biologisch wirksame Mittel eine Einheit ist, die zum Nachweisen, Identifizieren, Behandeln, Katalysieren, Bekämpfen, Abtöten, Verstärken oder Modifizieren eines Proteins, Glycoproteins, Lipoproteins, einer Lipidzelle, eines Organs oder eines Organismus in der Lage ist.
17. Konjugat nach Anspruch 8, worin das getragene Material 2-(Acetyloxy)benzoesäure, Pseudoephedrin oder Salicyl- Säure ist.
18. Konjugat nach Anspruch 8, worin das getragene Material 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure ist.
19. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das getragene Material innerhalb des Dichtsternpolymers eingeschlossen ist.
20. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin das getragene Material teilweise oder vollständig innerhalb des Dichtsternpolymers dispergiert ist.
21. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin das getragene Material an das Dichtsternpolymer gebunden oder gekoppelt ist.
22. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Dichtsternpolymer ein Polyethylenimin ist.
23. Konjugat nach Anspruch 22, worin das Polyethylenimin eine Acetatoberfläche hat.
24. Konjugat nach Anspruch 22, worin das Polyethylenimin eine Methylencarboxylatoberfläche hat.
25. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin das Dichtsternpolymer ein Polyether ist.
26. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin das Dichtsternpolymer ein Polyamidamin ist.
27. Konjugat nach Anspruch 26, worin das Polyamidamin Ester-terminiert ist.
28. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin das Dichtsternpolymer ein Polyethylenimin mit einer Oberfläche von Polyamidamin ist.
29. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Oberfläche des Dichtsternpolymers mit einer funktionellen Gruppe modifiziert ist.
30. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das getragene Material durch eine Verbindungsund/oder Spacergruppe mit dem Dichtsternpolymer assoziiert ist.
31. Konjugat nach Anspruch 30, worin die Gruppe ein Ziel- Steuerungsmittel an das Dichtsternpolymer koppelt, ohne die Wirksamkeit des Steuerungsmittels oder die Wirksamkeit von einem oder mehreren anderen getragenen Materialien im Konjugat zu beeinträchtigen.
32. Konjugat nach Anspruch 30 oder 31, worin die Gruppe spaltbar ist.
33. Konjugat nach Anspruch 30 oder 31, worin die Gruppe nicht spaltbar ist.
34. Dichtsternkonjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche der Formel:
(P)x * (M)y (I)
worin jedes P ein Dendrimer bedeutet,
x eine ganze Zahl von 1 oder größer bedeutet,
jedes M eine Einheit eines getragenen Materials bedeutet, wobei das getragene Material das gleiche getragene Material oder ein unterschiedliches getragenes Material ist,
y eine ganze Zahl von 1 oder größer bedeutet und
* bedeutet, daß das getragene Material mit dem Dendrimer assoziiert ist.
35. Konjugat nach Anspruch 34, worin x = 1 und y = 2 oder größer ist.
36. Konjugat nach Anspruch 34 oder 35, worin das molare Verhältnis eines ionischen M zu P von 0,1 bis 1.000 1 ist.
37. Konjugat nach Anspruch 34 oder 35, worin das Gewichtsverhältnis eines Arzneimittels, Pestizids oder Toxins M zu P 0,1 bis 5 : 1 ist.
38. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 33, worin mindestens zwei unterschiedliche getragene Materialien vorhanden sind, von denen mindestens eines ein Zielsteuerungsmittel ist.
39. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 33, worin mindestens zwei unterschiedliche getragene Materialien vorhanden sind, von denen mindestens eines ein Zielsteuerungsmittel und mindestens eines ein biologisch wirksames Mittel ist.
40. Konjugat nach Anspruch 39, worin das Zielsteuerungsmittel eine für einen oder mehrere Zielrezeptoren spezifische Einheit ist und das biologisch wirksame Mittel ein Radionuklid, Arzneimittel, Pestizid oder Toxin ist.
41. Konjugat nach Anspruch 39 oder 40, worin das Zielsteuerungsmittel ein polyklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
42. Konjugat nach Anspruch 39 oder 40, worin das Zielsteuerungsmittel ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
43. Konjugat nach Anspruch 42, worin das Zielsteuerungsmittel IgG ist.
44. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Dendrimer Unregelmäßigkeiten enthält.
45. Dichtsternkonjugat der Formel
[(T)e - (C')f]g * (P)x * [(C'')h - (M)y]k (III)
worin
jedes C' die gleiche oder eine unterschiedliche Verbindungsgruppe bedeutet,
jedes C'' die gleiche oder eine unterschiedliche Verbindungsgruppe bedeutet,
e, g und k jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 1 oder größer bedeuten,
f und h jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 0 oder größer bedeuten,
- eine kovalente Bindung in Fällen bedeutet, in denen eine Verbindungsgruppe vorhanden ist, und
jedes P ein Dendrimer bedeutet,
x eine ganze Zahl von 1 oder größer bedeutet,
T ein Zielsteuerungsmittel bedeutet,
jedes M eine Einheit eines getragenen pharmazeutischen Materials bedeutet, wobei das getragene pharmazeutische Material das gleiche getragene pharmazeutische Material oder ein unterschiedliches getragenes Material ist,
y eine ganze Zahl von 1 oder größer bedeutet und
* bedeutet, daß das getragene pharmazeutische Material mit dem Dendrimer assoziiert ist.
46. Konjugat nach Anspruch 45, worin e, f, g, h, x und y jeweils 1 sind und k 2 oder größer ist.
47. Konjugat nach Anspruch 45 oder 46, worin M ein biologisch wirksames Mittel ist.
48. Konjugat nach Anspruch 47, worin T ein Antikörper oder Antikörperteil ist, der zur Wechselwirkung mit einem gewünschten Epitop in der Lage ist.
49. Konjugat nach einem der Ansprüche 45 bis 48, worin C' oder C'' eine Anilingruppierung ist.
50. Dichtsternkonjugat nach einem der Ansprüche 45 bis 49, worin das Dendrimer wie in einem der Ansprüche 22 bis 28 definiert ist.
51. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Dichtsterndendrimer die Formel besitzt (Kern) (Wiederholungseinheit) Endgruppierung
worin:
# von Endgruppen pro Dendritenzweig =
NrG/2
G die Anzahl von Generationen ist, Nr die Multiplizität der Wiederholungseinheit ist, die mindestens 2 ist, Nc die Valenz der Kernverbindungen ist, wobei die Endgruppierung durch das folgende bestimmt ist:
# von Endgruppierungen pro Dendrimer =
NcNrG/2
worin Nr, G und Nc wie oben definiert sind und die Wiederholungseinheit eine Valenz oder Funktionalität von Nr + 1 besitzt, worin Nr wie oben definiert ist.
52. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Dichtsterndendrimer die Formel besitzt
worin i 1 bis t-1 ist, die Kernverbindung durch die Formel
(Zc)Nc
dargestellt ist, worin
den Kern bedeutet, Zc die funktionellen Gruppen bedeutet, die an
gebunden sind und Nc die Valenz des Kerns bedeutet, die Wiederholungseinheit durch die Formel XiYi(Zi)Ni dargestellt ist, worin "i" wie oben definiert ist, die Abschluß- oder Endeinheiten durch XtYt(Zt)Nt dargestellt sind, worin t die Endgeneration bedeutet und Xt, Yt, Zt und Nt gleich wie Xi, Yi, Zi und Ni oder davon verschieden sein können, abgesehen davon, daß keine Nachfolgegeneration mit den Zt-Gruppen verbunden ist und Nt kleiner als 2 sein kann, die &pi;-Funktion das Produkt aller Werte zwischen ihren definierten Grenzen ist, wie etwa
i-1
&pi; Nn = (N¹) (N²) (N³) . . . (Ni-2) (Ni-1)
n=1
wobei die Zahl der Wiederholungseinheiten XiYi(Zi)Ni ist, umfassend die i-te Generation eines Dendritenzweigs und wenn i 1 ist, dann ist &pi;&sup0; = 1. n=1
53. Formulierung, die ein Dichtsternkonjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche und mindestens ein vorhandenes agrochemisch oder pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel oder Trägermittel umfaßt.
54. Formulierung nach Anspruch 53, in der auch andere Wirkstoffe vorhanden sind.
55. Dichtsternkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 54 zur Anwendung als diagnostisches Mittel.
56. Dichtsternkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 54 zur Anwendung in der Kontrastabbildung.
57. Dichtsternkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 54 zur Verwendung als therapeutisches Mittel.
58. Verfahren zum Transport von mindestens einem getragenen agrochemischen oder pharmazeutischen Material, umfassend das Verabreichen von mindestens einem, das Material enthaltenden Dichtsternkonjugat nach Anspruch 6 oder Anspruch 4 an oder nahe einem Zielort.
59. Verfahren zum Einfangen therapeutischen oder diagnostischer Verbindungen, umfassend das Verabreichen eines bifunktionellen Dichtsternkonjugats, das ein Zielsteuerungsmittel nach Anspruch 39, welches das Konjugat an einen Zielort lokalisiert, und eine Fängergruppierung enthält, die eine sekundär verabreichte therapeutische oder diagnostische Substanz binden kann.
60. Verfahren nach Anspruch 59, worin die Fängergruppierung ein Chelatierungsmittel, Antigen oder Antikörper ist.
61. Verfahren zur Herstellung von
(P)x * (M)y (I)
worin jedes P ein Dichtsterndendrimer bedeutet, x eine ganze Zahl von 1 oder größer bedeutet, jedes M eine Einheit eines getragenen Materials bedeutet, wobei das getragene Material das gleiche getragene Material oder ein unterschiedliches getragenes Material ist, y eine ganze Zahl von 1 oder größer bedeutet und * bedeutet, daß das getragene Material mit dem Dendrimer assoziiert ist, umfassend das Kontaktieren von P mit M gegebenenfalls oder sofern erforderlich in einem geeigneten Lösungsmittel bei einer Temperatur, welche die Assoziierung des getragenen Materials (M) mit dem Dichtsterndendrimer (P) erleichtert.
62. Verfahren nach Anspruch 61, worin die Temperatur von Raumtemperatur bis Rückflußtemperatur ist.
63. Verfahren nach Anspruch 61 oder 62, worin das geeignette Lösungsmittel Wasser, Methanol, Ethanol, Chloroform, Acetonitril, Toluol, Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid ist.
64. Verfahren zur Herstellung eines Dichtsternkonjugats nach Anspruch 1, umfassend die Reaktion von P, das reaktive Gruppierungen besitzt, mit einer Verbindungsgruppe.
65. Verfahren nach Anspruch 64, worin die Verbindungsgruppe eine Anilingruppierung ist, in der die NH&sub2;-Gruppe durch eine Schutzgruppe geschützt sein kann.
66. Verfahren nach Anspruch 65, worin die Schutzgruppe die Formel
besitzt, worin R -C(CH&sub3;)3,
oder
ist.
67. Verfahren nach Anspruch 64, worin an P auch eine Verbindungsgruppe (Linker) C' und/oder C'' der Formel
gebunden ist, worin n 1 oder 2 ist, X F, Cl, Br, I, SO&sub2;Cl ist und wenn n 1 ist, die NO&sub2;-Gruppe in der Para-Position ist.
68. Verfahren nach Anspruch 67, worin die Verbindungsgruppe 4-Fluornitrobenzol ist.
69. Verfahren zur Herstellung eines Dichtsternkonjugats nach Anspruch 1, umfassend die Reaktion eines Dicht- Sterndendrimers, das reaktive Gruppierungen besitzt, mit einer Anilingruppierung, bei der die NH&sub2;-Gruppe durch ein N-Phthalimid der Formel
geschützt sein kann.
70. Verfahren zur Herstellung eines Dichtsternkonjugats nach Anspruch 1, umfassend die Reaktion eines Dicht- Sterndendrimers, das reaktive Gruppen besitzt, in denen die NH&sub2;-Gruppe durch eine beliebige für Amine verwendete Schutzgruppe geschützt sein kann, die unter den für die Dichtsternsynthese verwendeten Bedingungen inert ist.
71. Verfahren zur Herstellung eines Dichtstern-Polyethylenimins, umfassend die Reaktion eines Dichtstern Polyethyleniminmethansulfonamids mit Salzsäure.
72. Verfahren zur Reinigung eines Dichtsterndendrimers in Gegenwart eines Lösungsmittels, umfassend das Entfernen des Lösungsmittels durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran.
73. Verfahren nach Anspruch 72, worin das Lösungsmittel Ethylendiamin ist.
74. Verfahren zur Herstellung eines Dichtsternkonjugats nach Anspruch 1, worin das Dichtsternpolyiner ein Dichtsterndendrimer ist und das getragene Material ein Lanthanid ist, umfassend die Chelatierung des Lanthanids mit einen Dichtstern-Polyethyleniminacetat.
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