DE3687010T2

DE3687010T2 - Trennung von racemischen gemischen von estern aliphatischer saeuren.

Info

Publication number: DE3687010T2
Application number: DE8686104201T
Authority: DE
Inventors: Samun K Dahod; Patricia Siuta-Mangano
Original assignee: Stauffer Chemical Co
Current assignee: Stauffer Chemical Co
Priority date: 1985-04-01
Filing date: 1986-03-26
Publication date: 1993-03-25
Anticipated expiration: 2006-03-27
Also published as: DE3687010D1; JPS61231999A; EP0196625B1; IL77751A; EP0196625A2; EP0196625A3; US4668628A

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auftrennung racemischer Gemische wasserlöslicher chiraler Ester.

Hintergrund der Erfindung

Bestimmte Herbizide, beispielsweise Napropamide (chemischer Name: 2-(alpha-naphthoxy)-N-N-diethylpropionamid), sind nur in der isomeren dextro (+) Form bzw. d-Form wirksam. Diesbezüglich wird verwiesen auf "Synthesis and Herbicidal Activity of N,N-Diethyl-2-(1-naphthyloxy)propionamide & Its Optical Isomers-Agricultural & Food Chemistry, Band 23, 5 (September/Oktober 1975) Seiten 1008-1010. Dieses Herbizid wird derzeit als racemische Mischung hergestellt. Dies führt zu einem Verlust an Rohmaterial und von Verarbeitungszeit, da die isomere lävo (-) Form bzw. l-Form inert ist. Obwohl es aus ökonomischen Gründen wünschenswert ist, nur die isomere d-Form herzustellen, ist im Stand der Technik kein Verfahren zur ökonomischen Herstellung des gewünschten Isomers bekannt.
Es ist bekannt, daß das d-Isomer aus L-Methyl-2-chlorpropionat hergestellt werden kann. Dieses Isomer kann derzeit nicht zu einem Preis erworben werden, bei dem es in ökonomischer Weise im Verfahren zur Herstellung von Napropamide eingesetzt werden kann.
Verschiedene Enzyme zeigen bekanntlich bei der Auftrennung spezifischer Substrate durch Hydrolyse eine Stereospezifität, beispielsweise Chymotrypsin bei der Auftrennung von D,L-Phenylalaninestern.
Vom Lipaseenzym ist bekannt, daß es Fette in Fettsäuren und Glycerin hydrolysiert. Eine Stereospezifität ist dabei nicht involviert. Aus Cambou et al, Applied Biochemistry and Biotechnology 9 (1984) Seiten 255-260 ist bekannt, daß der Octylester von 2-Chlorpriopionsäure durch Lipase von Candida cylindracea (Lipase-catalyzed Production of Optically Active Acids Via Asymmetric Hydrolysis of Esters: Effect of the Alcohol Moiety - Bernhard Cambou and Alexander M. Klibanov) aufgetrennt werden kann. Dadurch werden unsere früheren Arbeiten bestätigt, wonach Methyl-2-chlorpropionat bei Einsatz des Lipaseenzyms stereospezifisch hydrolysiert werden konnte. Die erfolgreiche Handhabung wird in der Literaturstelle dadurch theoretisch erklärt, daß der Octylester in Wasser unlöslich ist, während der Methylester wasserlöslich ist.
Eine erst neuerlich erschienene Veröffentlichung beschreibt die stereospezifische Auftrennung von Methyl-2-(p-chlorphenoxy)propionat mit Lipase von Candida cylindracea. Ein Vergleich verschiedener Strategien zur lipase-katalysierten präparativen Auftrennung racemischer Säuren und Alkohole findet sich in: Asymmetric Hydrolysis, Esterification and Transesterification, Cambou, B. & Klibanov, A.M., Biotechnology and Bioengineering, Band XXVI, Seiten 1449-1454 (1984). Methyl-2- (p-chlorphenoxy)propionat ist gemäß der hier gegebenen Definition nicht als teilweise wasserlöslich anzusehen. Dieser Artikel erwähnt keine Probleme bei der stereospezifischen Auftrennung durch Hydrolyse.

Die Erfindung

Es wurde gefunden, daß wasserlösliche chirale Ester durch ein Verfahren aufgetrennt werden können, bei dem der wasserlösliche chirale Ester teilweise unlöslich gemacht wird und der teilweise unlöslich gemachte chirale Ester mit einem Lipaseenzym hydrolysiert wird. Das Unlöslichmachen bzw. die Erniedrigung der Wasserlöslichkeit kann durch Einsatz eines organischen Lösungsmittels für den Ester, wobei dieses Lösungsmittel in Wasser unlöslich ist, durch den Einsatz von Salzen und Puffern oder irgendwelchen anderen Mitteln zur Erniedrigung der Wasserlöslichkeit des chiralen Esters bezüglich der wäßrigen Komponente während der enzymatischen Hydrolyse erfolgen. Die Erniedrigung der Wasserlöslichkeit kann auch durch die Beeinflussung der Temperatur herbeigeführt oder verstärkt werden.
Verschiedene andere Merkmale einschließlich der bevorzugten Lipasequellen, der Reaktionsbedingungen und der Substrate werden im anschließenden Text näher erläutert.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die wasserlöslichen chiralen Estersubstrate, die erfindungsgemäß aufgetrennt werden können, können durch die folgende Formel
dargestellt werden, worin
R und R&sub1; für Wasserstoff und C&sub1;-C&sub4; Alkyl stehen können,
R&sub2; für C&sub1;-C&sub4; Alkyl stehen kann und
X für Halogen (Fluor, Chlor, Brom oder Jod), aliphatische oder aromatische Gruppen und für substituierte Derivate davon stehen kann, wobei R, R&sub1; und X verschieden sind. R und R&sub2; stehen unabhängig voneinander vorzugsweise für C&sub1;-C&sub2; Alkyl und insbesondere bevorzugt für C&sub1; Alkyl. R&sub1; steht vorzugsweise für Wasserstoff. X bedeutet vorzugsweise einen Halogenrest und steht vorzugsweise für Chlor oder Brom. X steht am bevorzugtesten für Brom. Die bromierte Verbindung ist weniger löslich als die chlorierte Verbindung.
Während Verbindungen wie Mehtyl-2-(p-chlorphenoxy)propionat, in Wasser ausreichend unlöslich sind, um die Auftrennung durch enzymatische Hydrolyse zu ermöglichen, sind andere substituierte Verbindungen, wie Methyl-2-(p-hydroxyphenoxy)propionat und Methyl-2-(p-hydroxyphenyl)propionat so weit gemäß der hier gegebenen Definition wasserlöslich, daß sie bei der stereospezifischen Auftrennung durch Hydrolyse zu Schwierigkeiten führen. Die Erfindung betrifft Verfahren zur Auftrennung dieser Verbindungen, ohne dabei die Substratverbindung chemisch zu verändern.
Mit dem Ausdruck "aliphatische oder aromatische Gruppen und substituierte Derivate davon" werden lediglich solche Verbindungen der Formel I bezeichnet, die derartige Gruppen aufweisen, die gemäß der hier gegebenen Definition in Wasser teilweise löslich sind. Zu diesen Gruppen zählen Phenyl, Hydroxyphenyl, Phenoxy, Hydrophenoxy, Methyl, Ethyl, Chlormethyl, Hydroxyethyl und dergleichen, mit der Maßgabe, daß die diese Gruppen enthaltenen Verbindungen zumindest teilweise wasserlöslich sind.
So können beispielsweise folgende chirale Verbindungen aufgetrennt werden:
Methyl-2-chlorpropionat
Methyl-2-brompropionat
Ethyl-2-chlorpropionat
Ethyl-2-brompropionat
Propyl-2-chlorpropionat
Butyl-2-chlorbutylat
Hethyl-2-phenoxypropionat
Die Ester sind zumindest teilweise in Wasser löslich. Mit dem Ausdruck "teilweise löslich" wird zum Ausdruck gebracht, daß der Ester zu mehr als 25 mmol in Wasser bei 25ºC lösbar sein muß. Der Ester muß in eine im wesentlichen wasserunlösliche Form überführt werden können, ohne daß dabei die chemische Zusammensetzung der Ester verändert wird. Die Ester müssen in einer organischen Phase löslich sein, die in Wasser unlöslich ist, oder durch Salze oder jede andere zu diesem Zweck eingesetzte Maßnahme in Wasser in einen unlöslichen Zustand, (d. h. die Löslichkeit in Wasser beträgt weniger als 25 mmol) überführt werden können. Der Ester muß durch das Lipaseenzym unter Bildung der entsprechenden freien Säure hydrolysierbar sein. Die Erfindung wird im Zusammenhang mit den bevorzugten Verbindungen, den 2-Halopropionaten, näher erläutert.
Die zur erfindungsgemäßen Auftrennung der chiralen Ester eingesetzte Lipase wird aus der Hefe Candida cylindracea erhalten. Von diesem Enzym hat sich herausgestellt, daß es in dem erfindungsgemäßen Verfahren die höchste Ausbeute an aufgetrennten Isomeren liefert. Es wird daher davon ausgegangen, daß dieses Enzym für ein kommerzielles Verfahren am besten geeignet ist.
Eine wirksamere stereospezifische Hydrolyse macht es erforderlich, daß der lösliche Ester im wesentlichen unlöslich gemacht wird, d. h. das Substrat ist zu weniger als 25 mmol in Wasser löslich. Jedes Verfahren zum Unlöslichmachen des Esters ohne Veränderung dessen chemischer Zusammensetzung kann Anwendung finden. Zum Lösen des Esters kann ein wasserunlösliches organisches Lösungsmittel für den Ester verwendet werden. Die Lösungsmittellösung wird dann mit einer wäßrigen Enzymlösung vermischt. Die Mischung wird vorzugsweise so stark bewegt, daß eine Phase in der anderen fein dispergiert wird.
Das im wesentlichen mit Wasser nicht mischbare inerte organische Lösungsmittelmaterial ist ein Lösungsmittel für das Racemat. Durch den Ausdruck "nicht mischbar" soll zum Ausdruck gebracht werden, daß das organische Lösungsmittel bis zu nicht mehr als 5% und vorzugsweise bis zu nicht mehr als 2% bei den Reaktionsbedingungen mit dem Wasser mischbar ist. Bei dem organischen Material kann es sich um jedes mit Wasser nicht mischbare oder teilweise mischbare organische Lösungsmittel handeln, das mit dem chiralen Estersubstrat oder dem Lipaseenzym nicht reagiert und das das Enzym im wesentlichen nicht negativ beeinflußt. Zu den organischen Lösungsmitteln zählen beispielsweise Perchlorethylen, Tetrachlorkohlenstoff, Toluol, Hexan (entweder normal oder zyklisch), Trichlorethylen, 1,2- Dichlorethan, Fluorchlorethane u. dgl., wobei Perchlorethylen und Tetrachlorkohlenstoff bevorzugt sind. Hinsichtlich der bevorzugten Lipase von Candida cylindracea sind Lösungsmittel wie Trichlorethylen und 1,2-Dichlorethan weniger bevorzugt, da sie die Hydrolysegeschwindigkeit zu verlangsamen scheinen. Das Volumenverhältnis von Lösungsmittel zu Wasser kann von etwa 10 : 1 bis etwa 1 : 10 reichen, wobei ein Verhältnis von etwa 3 : 1 bis etwa 1 : 5 bevorzugt ist. Der Gehalt des organischen Lösungsmittels an chiralem Estersubstrat kann von etwa 2,5 bis etwa 70% betragen, wobei ein Bereich von etwa 10% bis etwa 60%, bezogen auf das Gewicht pro Volumen, bevorzugt ist.
Die racemischen Ester können auch in wäßriger Lösung zeitweise unlöslich gemacht werden, indem man eine so große Menge eines Salzes einsetzt, daß die Löslichkeit des Substrats in dem Wasser weniger als 25 mmol beträgt. Zu den wirksamen Salzen, die man beispielsweise einsetzen kann, zählen die Halogenide, Carbonate, Bicarbonate, Phosphate, Sulfate, Nitrate und Mischungen davon von Alkalimetallen und Erdalkalimetallen. Das Salz muß zumindest teilweise wasserlöslich sein. Geeignete Salze sind beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumbicarbonat, Natriumsulfat u. dgl.
Da der pH-Wert des Mediums im Verlaufe der Hydrolyse aufgrund der Bildung der D-Säure sauer wird, wird es bevorzugt, den pH- Wert während des Ablaufes der Hydrolyse im wesentlichen in einem für die Enzymhydrolyse förderlichen Bereich zu halten, d. h. bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 8. Obwohl ein neutralisierendes Agens, beispielsweise Natriumhydroxyd, direkt zugegeben werden kann, ist diese Vorgehensweise weniger bevorzugt, da durch die Zugabe an lokalisierten Stellen ein erhöhter pH- Wert erhalten wird, bei dem die Hydrolyse nicht stereospezifisch verläuft. Die Ausbeuten an aufgetrenntem Prokukt werden daher verringert. Das Reaktionsmedium für die Hydrolyse wird vorzugsweise gepuffert, um den pH bei einem bestimmten Wert zu halten. Zu den Puffern, die Anwendung finden können, zählen Phosphate, Carbonate, Bicarbonate, Borate und organische Puffer, wie tris{Hydroxymethyl}aminomethan. Erfindungsgemäß ist es am meisten bevorzugt, wenn das "unlöslichmachende" Salz auch als Puffer fungiert.
Als bevorzugtes Material, welches diesen beiden Zwecken dient, kann Natrium- oder Kaliumbicarbonat sowie Calciumcarbonat genannt werden. Am meisten bevorzugt wird das Bicarbonat.
Das Lipaseenzym wird normalerweise in Kombination mit geringen Mengen des Puffers und Natriumchlorid eingesetzt, welches in einer so kleinen Menge eingesetzt wird, daß es die Löslichkeit des Esters nicht verringert, d. h. von etwa 50 bis etwa 20 mmol Natriumchlorid. Das Salz, das zum "Unlöslichmachen" des wasserlöslichen Esters und/oder als Puffer eingesetzt wird, kann in einer Menge zur Anwendung gebracht werden, die von etwa 5% bis etwa 40 Gew.-%, auf Basis des Wassergewichtes, reicht.
Die Lipase kann in reiner oder roher Form hinzugegeben werden. Die Lipase kann auch unter Anwendung bekannter Techniken immobilisiert sein. Das immobilisierte Enzym kann zur Anwendung gebracht werden, um in ökonomischer Weise einen höheren Gehalt an Enzym pro Substratmenge bereitzustellen, da das Enzym am Ende der Umsetzung isoliert und zur weiteren Verwendung zurückgewonnen werden kann.
Die in dem Hydrolysemedium aufrechterhaltene Temperatur wird so gewählt, daß sie die Hydrolysereaktion mit dem zur Anwendung gebrachten Enzym begünstigt. Bei Einsatz des Lipaseenzyms von Candida cylindracea kann die Reaktionstemperatur von etwa 0ºC bis etwa 40ºC reichen. Vorzugsweise werden niedrigere Temperaturen (von 2º bis 8ºC) gewählt, da sie dazu beitragen, das Substrat unlöslich zu halten, obgleich niedrigere Temperaturen für eine maximale Enzymreaktivität weniger förderlich sind. Variationen hinsichtlich der Parameter, um das Enzym wirksam einzusetzen, können von einem Fachmann leicht durchgeführt werden.
Die Lipase kann in einer solchen Menge zur Anwendung gebracht werden, daß eine Enzymaktivität von etwa 1 bis etwa 50 internationalen Einheiten/mg des Substratesters bereitgestellt wird. Die Definition ist dabei folgende: Eine Einheit entspricht derjenigen Enzymmenge, die ein Mikroäquivalent der Fettsäure aus einem Triglyzerid in einer Minute bei einem pH-Wert von 7,7 und 37ºC freisetzen kann.
Die Hydrolysereaktion kann während einer Zeitspanne durchgeführt werden, die von etwa 1 bis etwa 120 und vorzugsweise von etwa 8 bis etwa 60 h reicht. Eine extensive Hydrolyse kann hinsichtlich der Auftrennung schädlich sein, da die aufgetrennte Säure in dem wäßrigen Medium racemisieren kann. Die Aktivität des Enzyms kann durch den entstehenden Alkohol oder das Lösungsmittel geringfügig beeinflußt werden.
Die Verfahren zur Verringerung der Löslichkeit bzw. zum "Unlöslichmachen" können einzeln oder in Kombination zur Anwendung gebracht werden. Das Salz oder das Lösungsmittel können alleine verwendet werden, werden jedoch vorzugsweise zusammen eingesetzt. Somit kann ein Lösungsmittel, wie Tetrachlorkohlenstoff, mit einem die Löslichkeit verringernden Agens und/oder Puffer, wie Natriumbicarbonat verwendet werden. Aufgrund des zweifachen Effektes der Verringerung der Löslichkeit kann das Lösungsmittel in geringeren Mengen zur Anwendung gebracht werden.
Bei der Durchführung des Hydrolyseverfahrens wird so stark bewegt bzw. gerührt, daß die Reaktanten derart in Kontakt miteinander gebracht werden, daß die Umsetzung ablaufen kann. Obwohl das Ausmaß des Bewegens nicht kritisch ist, wird vorzugsweise so stark bewegt, daß Tröpfchen der einen Phase in der anderen Phase fein dispergiert werden. Eine Bewegung, die dadurch erzielt wird, daß Fraktionen in und aus dem Reaktor gepumpt werden, ist akzeptabel. Die Hydrolyse schreitet beim Bewegen wirksamer voran, da sich bei Anwendung eines Puffersalzes, wie Natriumbicarbonat, dieses an den Boden des Reaktors aufgrund seiner begrenzten Löslichkeit ansammeln kann. Aus diesen Gründen wird eine chargenweise Verarbeitung bevorzugt.
Das aufgetrennte Produkt, die isomere D-Säure ist wasserlöslich und sammelt sich in einer wäßrigen Phase an. Die organische Phase wird mit dem isomeren L-Ester angereichert. Die isomere D-Säure kann aus der wäßrigen Phase auf jede bekannte Weise einschließlich der Lösungsmittelextraktion gewonnen werden.
Bei dem isomeren L-Ester handelt es sich um ein bekanntes Produkt, das als Zwischenverbindung bei der Herstellung bekannter Verbindungen eingesetzt werden kann. So kann beispielsweise das D-Isomer des Herbizids Napropamide durch Kondensation von L-Methyl-2-chlorpropionat mit Alpha-Naphthol und durch anschließende Umsetzung mit Diethylamin hergestellt werden.
Die isomeren D-Säuren können zur Herstellung des D-2-phenoxypropionsäureherbizids eingesetzt werden, wie dies in dem britischen Patent Nr. 1 114 040 beschrieben ist. Stellt der L- Ester das gewünschte Produkt dar, dann kann die isomere D- Säure erneut verestert und racemisiert werden, um einen neuen Reaktionszyklus zu starten. Stellt die D-Säure das gewünschte Produkt dar, kann der L-Ester racemisiert und dann erneut aufgetrennt werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

21,5 g D,L-Methyl-2-chlorpropionat wurden zu 90 ml einer 0,2 molaren Kaliumphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 gegeben, die mit Natriumchlorid gesättigt war. Die gerührte Emulsion wurde mit einer Lipase von der Hefe Candida Cylindacea (Gesamtaktivität = 736 internationale Einheiten, Gesamtprotein = 67 mg, Lipase: Substrat (Gewicht:Gewicht) = 1 : 321). Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 5 N Natriumhydroxid mittels eines Systems zur pH-Kontrolle bei 7,0 gehalten.
Nach 42 h und einem Verbrauch von 21 ml an 5 N Natriumhydroxid wurde die Reaktion gestoppt. Nicht umgesetztes L-Methyl-2- chlorpropionat wurde abzentrifugiert und auf die optische Reinheit und Ausbeute untersucht. Die optische Drehung dieser Probe betrug W19,492. Dies zeigt an, daß das Produkt zu 84% aus dem isomeren L-Ester und zu 16% aus dem isomeren D-Methyl-2-chlorpropionat bestand. (Die Alpha-D-Drehung für einen Standard bei 25ºC beträgt -26,8º; Dichte = 1,075 g/ml.) Die Ausbeute der Umsetzung betrug 40%.

Beispiel 2

10,75 g (88 mmol) D,L-Methyl-2-chlorpropionat wurden in 40 ml Tetrachlorkohlenstoff gelöst. Die organische Phase wurde in 50 ml Wasser dispergiert, das 4,43 g Natrimbicarbonat und 20 mg Candida cylindracea Hefelipase (Gesamtaktivität = 220 internationale Einheiten, Lipase: Substrat (Gewicht:Gewicht) = 1 : 538) enthielt. Die Mischung wurde 18 h bei 4ºC heftig gerührt.
Die Tetrachlorkohlenstoffphase wurde abgetrennt und auf die optische Reinheit des nicht hydrolysierten Methyl-2-chlorpropionats und die Ausbeute der Umsetzung untersucht. Die Untersuchung der optischen Drehung ergab, daß das Methyl-2- chlorpropionat zu 92% aus dem L-Isomer und zu 8% aus dem D- Isomer bestand. (Alpha-D-Drehung bei 25ºC beträgt -25,58º, verglichen mit einem Standard von -30,45º in Tetrachlorkohlenstoff.) Die Ausbeute der enzymatischen Umwandlung wurde bestimmt, indem ein Aliquot der Tetrachlorkohlenstoffschicht mit Carboxylesterase, einer nichtspezifischen Esterase, umgesetzt wurde. Es wurde eine Ausbeute von 35% erhalten (die theoretische Ausbeute beträgt 50%).

Beispiel 3

29,94 g D,L-Methyl-2-bromprionat, 60 ml Wasser, 8,25 g Natriumbicarbonat und 80 mg Hefelipaseenzym von Candida cylindracea (Gesamtaktivität = 878 internationale Einheiten, Lipase: Substratverhältnis (Gewicht:Gewicht) = 1 : 374) wurden unter heftigem Rühren 48 h bei 4ºC inkubiert.
Die organischen und wäßrigen Phasen wurden getrennt. Nicht umgesetztes Methyl-2-brompropionat wurde als organische Phase zurückgewonnen. Die optische Drehung dieser organischen Phase betrug -63,95º. (Alpha-D-Drehung für einen Standard bei 25 C beträgt -55,5º; Dichte = 1,49 g/ml.) Dies zeigte an, daß 89% L-Isomer und 11% D-Isomer vorlagen. Die wäßrige Phase wurde nach Erniedrigen des pH-Wertes auf 2,0 verdampft. Die auf diese Weise erhaltene viskose Flüssigkeit besaß bei 25ºC eine Alpha-D-Drehung von +15,0 (Methanol, C = 10,7). Dies deutet auf einen Überschuß von D-2-Brompropionsäure über L-2-Brompropionsäure hin.

Beispiel 4

A. 6,13 g (50 mmol) D,L-Methyl-2-chlorpropionat wurden in 44,3 ml Tetrachlorkohlenstoff in einem mit einem Stopfen versehenen Erlenmeyer-Kolben von 150 ml gelöst. Die organische Phase wurde in 49,2 ml einer 0,75 molaren Natriumphosphatpufferlösung mit pH = 8,2 bei 4ºC dispergiert.
Die gerührte Emulsion wurde mit einer Lösung der Lipase von der Hefe Candida cylindracea versetzt (Gesamtaktivität = 168 internationale Einheiten; Gesamtprotein = 15,3 mg; Lipase: Substrat (Gewicht:Gewicht) = 1 : 400).
Nach einer Umsetzung von 44 h wurde die organische Phase auf die optische Reinheit des nicht hydrolysierten Methyl-2-chlorpropionats und die Ausbeute der Reaktion untersucht. Die Untersuchung der optischen Drehung ergab, daß das Methyl-2- chlorpropionat zu 96% als L-Isomer vorlag. (Alpha-D-Drehung bei 25ºC betrug -28,01º, verglichen mit einem Standard von -30,45º in Tetrachlorkohlenstoff). Die Ausbeute der enzymatischen Umwandlung betrug 37%.
B. Dieses Beispiel wurde unter Verwendung von 48,3 ml einer 0,6 molaren Natriumphosphatpufferlösung, der zweifachen Menge der Lipase (336 internationale Einheiten) bei Raumtemperatur während eines Zeitraumes von 16 h wiederholt und ergab eine Ausbeute von 41% und 88% des L-Isomers.

Beispiel 5

Ein Reaktor, der mit einem thermostatischen Mantel mit einem Einlaß für eine Elektrode zur Durchführung von pH-Messungen, einem Thermometer und einem Einlaß für die Zugabe von 5N NaOH ausgerüstet war, wurde mit 28,5 ml Tetrachlorkohlenstoff, 23,1 g D,L-Methyl-2-chlorpropionat (190 mmol) und 50 ml aus einer 5 millimolaren Natriumphosphatpufferlösung von pH 7,5 (4ºC) und Candida cylindracea Hefelipase (Gesamtaktivität = 411 internationale Einheiten; Gesamtprotein = 38,5 mg; Lipase:Substrat (Gewicht:Gewicht) = 1 : 600) beschickt. Der pH-Wert wurde durch automatische Zugabe von Natriumhydroxyd bei 7,0 gehalten.
Nach 4 Tagen und einem Verbrauch von 22,24 ml 5N Natriumhydroxyd wurde die Umsetzung abgebrochen. Die Ausbeute und optische Reinheit, bestimmt wir in Beispiel 2, betrug 40% und 92% (Alpha-D-Drehung bei 25ºC = -25,6º).

Beispiel 6

A. 11,4 g (95 mmol) D,L-Methyl-2-chlorpropionat wurden in 14,4 ml Perchlorethylen gelöst. Die organische Phase wurde in 46,3 ml einer 50 millimolaren Natriumchloridlösung, die 2,61 g Kalciumcarbonat enthielt, bei 4ºC dispergiert.
Die gerührte Emulsion wurde mit Candida cylindracea Lipase (403 internationale Einheiten; 28,5 mg; Lipase:Substrat (Gewicht:Gewicht) = 1 : 400) versetzt.
Nach 17 h wurde die Lösungsmittelphase auf die optische Reinheit des nicht hydrolysierten Methyl-2-chlorpropionats und die Ausbeute der Umsetzung untersucht. Die optische Drehung ergab, daß das Produkt zu 75% aus dem L-Isomer (Alpha-D-Drehung bei 25ºC = -17,0º, verglichen mit einem Standard : -34,0º in Perchlorethylen) bestand. Die Ausbeute der Umsetzung betrug 49%.
B. Dieses Beispiel wurde bei Raumtemperatur wiederholt. Die Ausbeute betrug 44%. Die optische Drehung ergab, daß das Produkt zu 96% aus dem L-Isomer bestand.

Beispiel 7

Das Verfahren des Beispiels 4 wurde wiederholt, wobei verschiedene Molaritäten von Methyl-2-chlorpropionat, Puffer und Verhältnisse von Enzym zu Substrat (E:S) bei verschiedenen Temperaturen Anwendung fanden. 50 ml Puffer wurden jeweils eingesetzt, außer bei der Probe K, bei der 40,7 ml verwendet wurden. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: Tabelle I Probe MCP Molarität* Puffer Zeit Stunden % Ausbeute * Um eine Wiederholung der Bedingungen zu vermeiden, wurden die Bedingungen nur dann aufgeführt, wenn eine Änderung eintrat. Die Freiräume unter einer Bedingung zeigen an, daß dort die gleichen Bedingungen herrschen wie in der vorhergehenden Zahl in der Spalte. ** NaPi bezeichnet einen Natriumphosphatpuffer (mono- und dibasisch) Orthophosphat gleicher Molaritäten. *** pH-Stat bezeichnet eine kontinuierliche potentiometrische Titration bis zu einem konstanten pH-Wert.

Beispiel 8

Das Verfahren des Beispiels 4B wurde wiederholt, wobei eine 1,0 molare Lösung verschiedener D,L-Propionatester bei 25ºC in einem Tetrachlorkohlenstoff/wäßrigem System eingesetzt wurden, wobei ein Enzym zum Substratverhältnis von 1 : 100 Anwendung fand.
Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: Tabelle II Ester % Ausbeute % L-Ester Methyl Ethyl Propyl Butyl

Beispiel 9

Beispiel 4B wurde wiederholt, wobei verschiedene Lösungsmittel, eine 1,0 molare Lösung von D,L-Methyl-2-chlorpropionat und ein NaPi-Puffer bei einem Verhältnis von wäßrigem zu organischem Lösungsmittel von 1 : 1 Anwendung fanden. Es wurde während eines Zeitraumes von 27 h bei 25ºC umgesetzt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: Tabelle III Beispiel Nr. Lösungsmittel Umsetzungsgrad Ausbeute Tetrachlorkohlenstoff Perchlorethylen Toluol Methylenchlorid Trichlorethylen 1,2-Dichlorethan
Aus diesen Daten ergibt sich, daß die Lösungsmittel in A, B und C eingesetzt werden konnten. Es schien, daß das Lösungsmittel in D bei den Reaktionsbedingungen nicht Anwendung finden konnte. Die Lösungsmittel von E und F sind nur bedingt zu verwenden, da die Hydrolysegeschwindigkeiten niedrig waren.

Beispiel 10

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei 50 ml D,L-Methyl-2-chlorpropionat, 120 mmol Natriumphosphatpuffer (pH = 7,2) und kein organisches Lösungsmittel eingesetzt wurden. Der Puffer wurde nicht in einer solchen Menge eingesetzt, die ausreichte, das Racemat auszusalzen. Die Hydrolyse wurde bei 25ºC während eines Zeitraumes von 10 min bei einem Verhältnis von Enzym (Candida cylindracea) zu Substrat von 1 : 10 durchgeführt. Die Hydrolyseumsetzung betrug 36%, wobei keine Stereospezifizität beobachtet werden konnte.

Claims

1. Verfahren zur enzymatischen Auftrennung racemischer Gemische von wasserlöslichen Estern der folgenden allgemeinen Formel (I)

worin

R und R&sub1; ein Wasserstoffatom und eine C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe bedeuten,

R&sub2; eine C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe bedeutet und

X ein Halogenatom oder eine aliphatische oder aromatische Gruppe und substituierte Derivate davon bedeutet, mit der Maßgabe, daß die Ester der allgemeinen Formel (I) in Wasser bei 25ºC zu mehr als 25 millimolar löslich sind,

wobei R, R&sub1; und X verschieden sind,

wobei man ein racemisches Gemisch dieser Ester in einer wäßrigen Phase mit einem Lipaseenzym von Candida cylindracea, das in der Lage ist, dieses racemische Gemisch durch Hydrolyse stereospezifisch aufzutrennen, in Kontakt bringt,

die Wasserlöslichkeit des racemischen Gemisches dieser Ester durch

a) Lösen des racemischen Gemisches in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel,

b) Zugabe eines Salzes zur wäßrigen Phase in einer solchen Menge, daß die Löslichkeit des Esters in der wäßrigen Phase erniedrigt wird, und

c) eine Kombination von a) und b) erniedrigt und das racemische Gemisch stereospezifisch auftrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin man als Ester der allgemeinen Formel (I) solche einsetzt, bei denen R eine C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe, R&sub1; ein Wasserstoffatom, R&sub2; eine C&sub1;-C&sub4;- Alkylgruppe und X ein Halogenatom bedeuten.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin man als Ester der allgemeinen Formel (I) solche einsetzt, bei denen R eine C&sub1;-C&sub2;-Alkylgruppe und R&sub2; eine C&sub1;-C&sub2;-Alkylgruppe bedeuten.

4. Verfahren nach Anspruch 2, worin man Ester der allgemeinen Formel (I) einsetzt, bei denen R und R&sub2; jeweils eine Methylgruppe bedeuten.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin man Ester der allgemeinen Formel (I) einsetzt, bei denen X ein Chlor- oder Bromatom bedeutet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tetrachlorkohlenstoff, Perchlorethylen und Mischungen davon.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus wasserlöslichen Alkalimetall- und Erdalkalimetallhalogeniden, -carbonaten, -bicarbonaten, -phosphaten, -sulfaten und -nitraten sowie Mischungen davon.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin man als Salz Natriumchlorid, Natriumbicarbonat und Mischungen davon einsetzt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 6 und 8, worin man 2-Halopropionsäureester-Racemate auftrennt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Methylester aufgetrennt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin Methyl-2-brompropionat aufgetrennt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Racemat unter Verwendung des mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels in Kombination mit dem die Löslichkeit verringernden Salz aufgetrennt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Temperatur bei der Hydrolyse zwischen 2ºC bis etwa 8ºC liegt.