DE3642939A1 - METHOD FOR DNA MARKING - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung von DNA- Fragmenten unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen und seine Anwendung in der Sequenzanalyse von DNA.The invention relates to a method for labeling DNA Fragments using fluorescent dyes and its application in the sequence analysis of DNA.
Zur Sequenzanalyse von DNA sind verschiedene Methoden bekannt. Die meisten Verfahren zur Bestimmung der DNA-Sequenz basieren entweder auf einem chemischen Abbau durch basenspezifische chemische Reaktionen (vgl. A. M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 560-564), oder auf enzymatischen Methoden der Sequenzbestimmung auf der Grundlage der durch DNA-Polymerase katalysierten Verlängerung von DNA-Ketten (vgl. F. Sanger und A. R. Coulson, J. Mol. Biol. 94 (1975) 441-448; F. Sanger et al, Nature 265 (1977) 687-695). Nach der sogenannten "Didesoxy- Methode" werden als spezifische Terminatoren der DNA-Kettenverlängerung 2′,3′-Didesoxynukleosid-Triphosphate, z. B. ddA TP, eingesetzt (F. Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467; vgl. zusammenfassend auch R. Knippers, Molekulare Genetik, 4. Auflage, Thieme-Verlag Stuttgart, New York 1985, Seiten 402-407). Die enzymatischen Methoden sind insbesondere zur Bestimmung für lange DNA-Sequenzen geeignet, weil für jede einzelne Sequenzierungsreaktion nur ein geringer Arbeitsaufwand erforderlich ist.Various methods are known for sequence analysis of DNA. Most methods are based on determining the DNA sequence either on chemical degradation through base specific chemical Reactions (see A. M. Maxam and W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 560-564), or on enzymatic methods sequence determination based on that by DNA polymerase catalyzed extension of DNA chains (see F. Sanger and A.R. Coulson, J. Mol. Biol. 94 (1975) 441-448; F. Sanger et al, Nature 265 (1977) 687-695). According to the so-called "dideoxy Method "are used as specific terminators of DNA chain extension 2 ', 3'-dideoxynucleoside triphosphates, e.g. B. ddA TP used (F. Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467; see. in summary also R. Knippers, Molecular Genetics, 4th edition, Thieme-Verlag Stuttgart, New York 1985, pages 402-407). The enzymatic methods are especially for determination suitable for long DNA sequences, because for each one Sequencing reaction requires little labor is.
Zur Bestimmung der DNA-Fragmente ist es bei allen Sequenzierungsmethoden erforderlich, die DNA-Fragmente spezifisch zu markieren. Dies kann durch Markierung mit radioaktiven Isotopen (radioaktive Markierung) erfolgen. Als radioaktive Isotope werden insbesondere ³H, ¹⁴C, ³⁵S und ³²P verwendet. Für einige Bestimmungsmethoden, wie z. B. die "Southern Blot"-Methode, ist eine sehr intensive Markierung erforderlich. Wegen der geringen Strahlungsintensität von ³H und ¹⁴C kam deshalb nur das Phosphor-Isotop ³²P in Betracht. Die Benutzung dieser Substanz hat jedoch viele Nachteile, die bisher insbesondere den Einsatz der "Southern Blotting"-Methode in der medizinischen Routinediagnostik verhindert haben; ³²P ist sehr teuer, hat eine Halbwertzeit von nur 14,3 Tagen (es muß also schnell verbraucht werden, und eine Lagerhaltung ist unmöglich) und muß nach der Benutzung mit großem Aufwand beseitigt werden. Darüberhinaus sind für Personal und Ausstattung des Labors umfangreiche Sicherheitsvorkehrungen unerläßlich. Auch die Zeit bis zum Vorliegen der Ergebnisse ist in der Regel sehr lang, da mit P³² markierte gel-elektrophoretisch aufgetrennte DNA- Fragemente meist mehrere Tage bis Wochen auf einem Röntgenfilm liegen müssen, bevor Signale sichtbar werden.It is the determination of the DNA fragments with all sequencing methods required to specifically label the DNA fragments. This can be done by labeling with radioactive isotopes (radioactive Marking). In particular, radioactive isotopes are used ³H, ¹⁴C, ³⁵S and ³²P are used. For some determination methods like e.g. B. the "Southern Blot" method, is a very intense label required. Because of the low radiation intensity of 3 H and 13 C therefore only the phosphorus isotope 32 P came into consideration. However, the use of this substance has many disadvantages so far in particular the use of the "Southern Blotting" method in routine medical diagnostics; 32 P is very expensive, has a half-life of only 14.3 days (so it must can be consumed quickly and storage is impossible) and must be removed with great effort after use will. In addition, are for staff and equipment of the laboratory extensive safety precautions are essential. Also the The time to get the results is usually very long, since P³² labeled gel electrophoretically separated DNA Fragments usually last several days to weeks on an X-ray film must lie before signals become visible.
Eine noch größere Rolle spielt dieser zeitliche Aspekt für das Isotop ³H, das vorwiegend für die "in-situ-Hybridisierung", also den direkten Nachweis von DNA-Sequenzen in histologischen Präparaten, verwendet wird. Hier betragen die Expositionszeiten oft mehrere Monate.This time aspect plays an even greater role for the Isotope ³H, which is mainly for "in situ hybridization", thus the direct detection of DNA sequences in histological Preparations, is used. Here the exposure times are often several months.
Zur Vermeidung dieser Probleme wurde deshalb vorgeschlagen, die radioaktive Markierung durch eine Markierung mit Nukleotiden zu ersetzen, die über die 5-Stellung des Pyrimidinringes und einen Allylamin-Arm an ein Molekül Biotin gekoppelt sind; solche Nukleotide verhalten sich bei der für die "Southern-Blot"-Methode verwendeten sogenannten "nick-translation" wie ihre unsubstituierten Analoga, wobei die Biotinreste über eine Antikörperreaktion leicht nachgewiesen werden können (vgl. z. B. Nachrichten Chem. Tech. Lab. 34 (1986) Seite 430). Durch Optimierung der experimentellen Bedingungen konnte diese Methode so optimiert werden, daß sie in ihrer Empfindlichkeit mit den radioaktiven Markierungsverfahren vergleichbar ist.To avoid these problems, it has therefore been proposed radioactive labeling by labeling with nucleotides to replace the 5-position of the pyrimidine ring and an allylamine arm is coupled to a molecule of biotin; such Nucleotides behave like for the "Southern blot" method used so-called "nick-translation" like their unsubstituted Analogs, the biotin residues via an antibody reaction can be easily detected (see e.g. Nachrichten Chem. Tech. Lab. 34 (1986) page 430). By optimizing the experimental Conditions this method could be optimized so that they are sensitive to radioactive labeling is comparable.
Nach einer anderen Art der DNA-Markierung wird, in Anwendung auf die "Didesoxy-Methode", der M13 -Primer in jedem der vier Ansätze mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, und zwar mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), 4-Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1- diazol (NBD-Chlorid), Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TMRITC) und mit Texasrot (vgl. Bio Technology 3 (1985) 395-396; Nachrichten Chem. Tech. Lab. 34 (1986) 430-431). Die so markierten DNA-Abschnitte können dann mit einem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und mit einem Laser photometrisch bestimmt werden. Ein Hauptproblem bei dieser Methode ist die optische Empfindlichkeit des photometrischen Systems, weil jedes DNA-Fragment nur ein Molekül des Fluoreszenzmarkers enthält, woraus sich eine Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs im Gel von nur ca. 10-10 M ergibt. Nach dieser Methode wurden bisher nur synthetische Oligonukleotide analysiert.According to another type of DNA labeling, the M13 primer in each of the four batches is labeled with a fluorescent dye, namely with fluorescein isothiocyanate (FITC), 4-chloro-7- nitrobenzo-2-oxa-1-diazole (NBD chloride), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TMRITC) and with Texas red (see Bio Technology 3 (1985) 395-396; Nachrichten Chem. Tech. Lab. 34 (1986) 430- 431). The DNA segments marked in this way can then be separated with a polyacrylamide gel and determined photometrically with a laser. A major problem with this method is the optical sensitivity of the photometric system, because each DNA fragment contains only one molecule of the fluorescent marker, which results in a concentration of the fluorescent dye in the gel of only about 10 -10 M. So far, only synthetic oligonucleotides have been analyzed using this method.
L. M. Smith et al (Nucleic Acids Reserarch 13 (1985) 2399-2412) beschreiben die Synthese von Oligonukleotiden mit einer aliphatischen Aminogruppe an ihrer 5′-Endstelle. Diese Aminogruppe kann mit einer Vielzahl elektrophiler Reagentien umgesetzt werden. Auf diese Weise lassen sich Fluoreszenzfarbstoffe an chemisch synthetisierte DNA-Primer-Oligonukleotide kovaltent binden.L.M. Smith et al (Nucleic Acids Reserarch 13 (1985) 2399-2412) describe the synthesis of oligonucleotides using an aliphatic Amino group at its 5'-end position. This amino group can be reacted with a variety of electrophilic reagents will. In this way, fluorescent dyes to chemically synthesized DNA primer oligonucleotides tie covaltent.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung von DNA-Fragmenten (Oligonukleotiden) unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die DNA-Fragmente (Oligonukleotide) in ihr 5′-(S-Triphenylmethyl- 3-mercapto-propylphospho)-Derivat überführt und dieses nach Abspaltung der Triphenylmethylgruppe (Tritylgruppe) mit einem (5- und/oder 6)-Jodacetamino-Rhodamin oder -Fluorescein (englisch: (5- and/or 6)-Jodacetamido-rhodamine or -fluoresceine) umsetzt.The present invention relates to a method for marking of DNA fragments (oligonucleotides) using of fluorescent dyes, which is characterized that the DNA fragments (oligonucleotides) in it 5 ′ - (S-triphenylmethyl- 3-mercapto-propylphospho) derivative transferred and this after splitting off the triphenylmethyl group (trityl group) with a (5- and / or 6) iodoacetamino rhodamine or fluorescein (English: (5- and / or 6) -Jodacetamido-rhodamine or -fluoresceine).
Als Rhodamingerüst in den Jodacetamino-derivaten können alle Rhodamine, wie z. B. Rhodamin, Tetraethylrhodamin (Rhodamin B), Rhodamin 6G eingesetzt werden, als Fluoresceingerüst alle Fluoresceine, wie z. B. Fluorescein oder Tetrabromfluorescein (Eosin).As a rhodamine backbone in the iodoacetamino derivatives, everyone can Rhodamines such as B. rhodamine, tetraethylrhodamine (rhodamine B), Rhodamine 6G can be used as a fluorescein scaffold all fluoresceins, e.g. B. fluorescein or tetrabromofluorescein (Eosin).
Aufgrund seiner Fluoreszenzeigenschaften wird erfindungsgemäß das (5- und/oder 6)-Jodacetamino-tetramethylrhodamin bevorzugt eingesetzt. Es besitzt einen sehr hohen Extinktionskoeffizienten, eine hohe Quantenausbeute, und eine Emission im langen Wellenbereich ( λ max =560 nm) mit einer Bandbreite bei halbem Maximum von 52 nm. Ein bevorzugt eingesetztes (5- und/oder 6)- Jodacetamino-Fluoresceinderivat ist das 5-Jodacetamino-Fluorescein.Because of its fluorescence properties, the (5- and / or 6) -iodoacetamino-tetramethylrhodamine is preferably used according to the invention. It has a very high extinction coefficient, a high quantum yield, and an emission in the long wavelength range ( λ max = 560 nm) with a bandwidth at half maximum of 52 nm. A (5- and / or 6) - iodoacetamino fluorescein derivative is preferably used 5-iodoacetamino fluorescein.
Die Formeln I und II zeigen die Struktur von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Tetramethylrhodamin (I) und mit Fluorescein (II) markierten DNA-Fragmentes.The formulas I and II show the structure of according to the invention Process with tetramethylrhodamine (I) and with Fluorescein (II) labeled DNA fragment.
Aufgrund ihrer Eigenschaften eignen sich die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren markierten DNA-Fragmente sehr gut zur Sequenzanalyse von DNA. Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Markierung von DNA-Fragmenten zur Sequenzanalyse von DNA.Because of their properties, those according to the invention are suitable Method labeled DNA fragments very well Sequence analysis of DNA. The object of the invention is therefore also the use of the inventive method for Labeling of DNA fragments for sequence analysis of DNA.
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Sequenzanalyse nach der Didesoxy-Methode eingesetzt, wobei man als Primer insbesondere einen M13-Primer mit Fluoreszenzmarkierung verwendet, der durch Umsetzung seines 5′-(S-Triphenyl- methyl-3-mercapto-propylphospho)-Derivats nach Abspaltung der Triphenylmethylgruppe mit einem (5- und/oder 6)-Jodacet- amino-Rhodamin oder -Fluorescein erhältlich ist. Es ist aber auch eine Markierung anderer Oligonukleotide möglich, indem man sie in ihr entsprechendes 5′-(S-Triphenylmethyl-3-mercapto- propylphospho)-Derivat überführt und dieses nach Abspaltung der Triphenylmethylgruppe (Tritylgruppe) mit einem (5- und/oder 6)-Jodacetamino-Rhodamin oder -Fluorescein umsetzt.The sequence analysis method according to the invention is preferred used by the dideoxy method, where as Primer in particular an M13 primer with fluorescent labeling used by the implementation of its 5 '- (S-triphenyl- methyl-3-mercapto-propylphospho) derivative after cleavage the triphenylmethyl group with a (5- and / or 6) iodoacet amino rhodamine or fluorescein is available. But it is labeling of other oligonucleotides is also possible by you put them in their corresponding 5 '- (S-triphenylmethyl-3-mercapto- propylphospho) derivative and this after cleavage the triphenylmethyl group (trityl group) with a (5- and / or 6) iodoacetamino rhodamine or fluorescein implements.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine zuverlässige, einfache und kostengünstige Methode zur Markierung von DNA- Fragmenten dar, mit dem die Nachteile des Standes der Technik weitgehend vermieden werden können. Aufgrund der Empfindlichkeit der markierten DNA-Fragmente eignet sich das Verfahren auch sehr gut zur laser-induzierten photometrischen Bestimmung der markierten DNA-Fragmente in automatischen Geräten, z. B. in dem in der deutschen Patentanmeldung der gleichen Anmelderin vom gleichen Anmeldetag (Titel: Vorrichtung zur Detektion von zur Photonemission anregbaren Stoffen) beschriebenen Gerät, sowie auch für andere Bioresearch- und Biotechnologieverfahren unter Verwendung markierter DNA- Fragmente.The method according to the invention provides a reliable, simple and inexpensive method of labeling DNA Fragments represent the disadvantages of the prior art can be largely avoided. Because of the sensitivity the method is suitable for the labeled DNA fragments also very good for laser-induced photometric Determination of the labeled DNA fragments in automatic Devices, e.g. B. in the in the German patent application same applicant from the same filing date (title: device for the detection of substances that can be excited to emit photons) described device, as well as for other bioresearch and biotechnology processes using labeled DNA Fragments.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von (5- und/oder 6)-Jodacetamino-Rhodaminen oder -Fluoresceinen zur Fluoreszenzmarkierung organischer Verbindungen, insbesondere von DNA-Fragmenten. Another object of the invention is the use of (5- and / or 6) iodoacetamino rhodamines or fluoresceins for fluorescent labeling of organic compounds, especially of DNA fragments.
Die Herstellung der 5′-(S-Triphenylmethyl-3-mercapto-propyl- phospho)-Oligonukleotide kann durch Kondensation von Triethylammonium [S-triphenylmethyl-3-mercaptopropyl, 2-(1-methylimida- zol-2-yl)phenylphosphat] mit der 5′-terminalen Hydroxy-Gruppe eines an einen Träger (z. B. langkettiges Alkylamin/Glas) gebundenen Oligonukleotids erfolgen (vgl. B. S. Sproat et al, Nucleic Acids Research 14 (1986) 1811-1824).The preparation of the 5 ′ - (S-triphenylmethyl-3-mercapto-propyl- phospho) oligonucleotides can be obtained by condensation of triethylammonium [S-triphenylmethyl-3-mercaptopropyl, 2- (1-methylimida- zol-2-yl) phenylphosphate] with the 5'-terminal hydroxy group one bound to a support (e.g. long chain alkylamine / glass) Oligonucleotides take place (cf. B. S. Sproat et al, Nucleic Acids Research 14 (1986) 1811-1824).
Die Abspaltung der Triphenylmethylgruppe (Detritylierung) kann z. B. mit Silbernitrat analog der von B. A. Connolly und P. Rider (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 4485-4502) beschriebenen Methode erfolgen. Die so erhaltene Verbindung mit freier SH-Gruppe wird dann bei einem pH-Wert von ca. 8,5 mit dem (5- und/oder 6)-Jod- acetamido-Rhodamin oder -Fluorescein umgesetzt.The triphenylmethyl group (detritylation) can be split off e.g. B. with silver nitrate analogous to that of B. A. Connolly and P. Rider (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 4485-4502) respectively. The compound with free SH group thus obtained becomes then at a pH of approx. 8.5 with the (5- and / or 6) -iodine- implemented acetamido-rhodamine or -fluorescein.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie darauf zu beschränken. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich Prozent- und Gewichtsangaben auf Gewichtsprozente und Gewichtsteile, die Temperatur auf die Celsius-Skala.The following examples are intended to explain the invention in more detail, without limiting it to that. Unless otherwise stated, Percentages and weights refer to percentages by weight and parts by weight, the temperature on the Celsius scale.
Die Lösungsmittel und Reagentien für die Festphasen-Oligode- oxyribonukleotid-Synthese nach der Phosphotriester-Methode wurden wie bei B. S. Sproat et al, l. c. beschrieben hergestellt. Das S-Triphenylmethyl-3-mercaptopropanol wurde nach B. A. Connolly und P. Rider, l. c. hergestellt. Das (5- und/oder 6)-Jodacetamino- tetramethylrhodamin wurde von Molecular Probes, Inc., Junction City, Oregon, USA, bezogen.Solvents and reagents for solid phase oligode Oxyribonucleotide synthesis using the phosphotriester method were as in B. S. Sproat et al, l. c. described manufactured. The S-triphenylmethyl-3-mercaptopropanol was developed according to B.A. Connolly and P. Rider, l. c. produced. The (5- and / or 6) iodoacetamino tetramethylrhodamine was purchased from Molecular Probes, Inc., Junction City, Oregon, USA.
Die NMR-Spektren wurden an einem Bruker AM250-Spektrometer aufgenommen.The NMR spectra were recorded on a Bruker AM250 spectrometer.
S-Triphenylmethyl-3-mercaptopropanol (3,34 g, 10 mMol) wurde durch die bei B. S. Sproat et al, l. c. beschriebene Methode in die Titelverbindung übergeführt. Das Rohprodukt wurde auf eine Kieselgel 60 H-Säule (170 g, 8 cm × 7 cm; Dichlormethan/Triethylamin =99/1, v/v) aufgebracht und die Säule dann mit Dichlormethan/ Triethylamin (0,5 l, 99/1; v/v), Ethanol/Dichlormethan/Triethylamin (0,5 l, 4/95/1; v/v), und schließlich mit Ethanol/Dichlormethan/ Triethylamin (1,5 l, 10/89/1; v/v) unter Verwendung eines Stickstoffdruckes eluiert. Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen (bestimmt durch Silicagel-Dünnschichtchromatographie; Rf=0,11, unter Verwendung von Ethanol/Chloroform/Triethylamin =10/89/1; v/v als Eluans; das Besprühen der Platte mit 70%iger Perchlorsäure/Ethanol = 3/2; v/v ergab einen gelborangen Fleck) wurden gesammelt und im Vakuum eingedampft, wobei ein etwas hygroskopischer weißer Schaum (1,6 g, 24% Ausbeute) zurückblieb. Das erhaltene Produkt zeigte die entsprechenden ³¹P- und ¹³C NMR-Spektren.S-triphenylmethyl-3-mercaptopropanol (3.34 g, 10 mmol) was converted into the title compound by the method described by BS Sproat et al, lc. The crude product was applied to a silica gel 60 H column (170 g, 8 cm × 7 cm; dichloromethane / triethylamine = 99/1, v / v ) and the column then with dichloromethane / triethylamine (0.5 l, 99/1 ; v / v ), ethanol / dichloromethane / triethylamine (0.5 l, 4/95/1; v / v ), and finally with ethanol / dichloromethane / triethylamine (1.5 l, 10/89/1; v / v v ) eluted using a nitrogen pressure. The fractions containing the pure product (determined by silica gel thin layer chromatography; R f = 0.11, using ethanol / chloroform / triethylamine = 10/89/1; v / v as eluant; spraying the plate with 70% perchloric acid / Ethanol = 3/2; v / v gave a yellow-orange spot) were collected and evaporated in vacuo, leaving a somewhat hygroscopic white foam (1.6 g, 24% yield). The product obtained showed the corresponding 31 P and 13 C NMR spectra.
Vollständig geschütztes [GTAAAACGACGGCCAGT] wurde mittels einer hoch wirksamen Phosphotriester-Methode (vgl. B. S. Sproat et al, l. c.) im 1 µMol-Maßstab an einen Träger (langkettiges Alkylamin/Porenglas) gebunden. Danach wurde ein weiterer Reakionszyklus durchgeführt, bei dem Triethylammonium [S-triphenyl- methyl-3-mercaptopropyl, 2-(1-methylimidazol-2-yl)phenylphosphat] mit der 5′-terminierten Hydroxy-Gruppe des an den Träger gebundenen Oligodesoxyribonukleotids kondensiert wurde. Das modifizierte Oligodesoxyribonukleotid wurde von den Schutzgruppen befreit und vom Träger wie bei B. S, Sproat et al, l. c. beschrieben unter Verwendung von Oximat, gefolgt von 25%igem Ammoniak, abgetrennt. Nach der Ammoniakstufe wurde das Rohprodukt durch Dialyse entsalzt, und das gewünschte 5′-(S-Triphenylmethyl-3-mercaptopropylphospho)- oligodesoxyribonukleotid durch reserved phase- Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) an μ-Bondapak-C₁₈ unter Verwendung von 0,1 M Triethylammoniumacetat (pH=7)/Acetonitril als Eluens gereinigt. Die S-Triphenylmethyl-Verbindung kam bei einer Pufferzusammensetzung von ca. 29% Acetonitril. Die das Produkt enthaltende Lösung wurde im Vakuum zur Trockne verdampft und hinterließ ein weißes Glas (ca. 160 nMol, bestimmt durch UV-Spektroskopie).Fully protected [GTAAAACGACGGCCAGT] was bound to a support (long-chain alkylamine / pore glass) using a highly effective phosphotriester method (cf. BS Sproat et al, lc) on a 1 µmol scale. A further reaction cycle was then carried out, in which triethylammonium [S-triphenylmethyl-3-mercaptopropyl, 2- (1-methylimidazol-2-yl) phenylphosphate] condensed with the 5′-terminated hydroxy group of the oligodeoxyribonucleotide bound to the support has been. The modified oligodeoxyribonucleotide was deprotected and separated from the support as described in B.S., Sproat et al, lc using oximate followed by 25% ammonia. After the ammonia stage, the crude product was desalted by dialysis, and the desired 5 ′ - (S-triphenylmethyl-3-mercaptopropylphospho) - oligodeoxyribonucleotide by reserved phase high pressure liquid chromatography (HPLC) on μ -Bondapak-C₁₈ using 0.1 M triethylammonium acetate ( pH = 7) / acetonitrile as eluent. The S-triphenylmethyl compound came with a buffer composition of approximately 29% acetonitrile. The solution containing the product was evaporated to dryness in vacuo and left a white glass (approx. 160 nmol, determined by UV spectroscopy).
5′-(S-Triphenylmethyl-3-mercaptopropylphospho) d [GTAAAACGACGGCCAGT] (ca. 20 nMol) wurde mit Silbernitrat gemäß der von B. A. Connolly und P. Rider, l. c., beschriebenen Methode mit Silbernitrat detrityliert, und nach Entfernung der Silberionen mit Dithiothreitol wurde eine kleine Menge der Lösung durch reserved-phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) an μ-Bondapak C₁₈ analysiert. Das 5′-(3-Mercaptopropylphospho)oligodeoxyribonukleotid eluierte bei einer Acetonitrilzusammensetzung von ca. 14%. Der pH-Wert der das Mercaptooligodeoxyribonukleotid enthaltenden Lösung wurde mit Natriumbicarbonatlösung auf 8.5 eingestellt, und eine Lösung von (5- und/oder 6)-Jodacetamino-tetramethylrhodamin (200 nMol) in N,N-Dimethylformamid (50 µl) wurde zugefügt. Die Lösung wurde sorgfältig gemischt und im Dunkeln bei Raumtemperatur eine Stunde lang belassen. Die rosafarbene Lösung wurde dann gegen Wasser dialysiert und das mit Tetramethylrhodamin markierte Oligodeoxyribonukleotid wurde durch Ionenaustausch-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) an Partisil 10SAX gereinigt unter Verwendung eines Konzentrationsgradienten von Kaliumdihydrogenphosphat, pH=6,3, in Formamid/Wasser (6/4, v/v) als Eluans. Das gereinigte, mit Tetramethylrhodamin markierte Oligonukleotid wurde dann durch Dialyse entsalzt und im Dunkeln bei -20°C gelagert.5 ′ - (S-triphenylmethyl-3-mercaptopropylphospho) d [GTAAAACGACGGCCAGT] (approx. 20 nmol) was detritylated with silver nitrate using silver nitrate according to the method described by BA Connolly and P. Rider, lc, and after removal of the silver ions with dithiothreitol a small amount of the solution was analyzed by reserved-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) on μ -Bondapak C₁₈. The 5 ′ - (3-mercaptopropylphospho) oligodeoxyribonucleotide eluted with an acetonitrile composition of approx. 14%. The pH of the solution containing the mercapto oligodeoxyribonucleotide was adjusted to 8.5 with sodium bicarbonate solution and a solution of (5- and / or 6) -iodoacetamino-tetramethylrhodamine (200 nmol) in N, N-dimethylformamide (50 µl) was added. The solution was mixed thoroughly and left in the dark at room temperature for one hour. The pink solution was then dialyzed against water and the oligodeoxyribonucleotide labeled with tetramethylrhodamine was purified by high pressure ion exchange liquid chromatography (HPLC) on Partisil 10SAX using a concentration gradient of potassium dihydrogen phosphate, pH = 6.3, in formamide / water (6/4, v / v ) as eluans. The purified oligonucleotide labeled with tetramethylrhodamine was then desalted by dialysis and stored in the dark at -20 ° C.
Der so hergestellte, fluoreszenzmarkierte M13-Primer der Formel I wurde zur Durchführung von verbesserten Standard-Dideoxy- Methoden, wie sie bei S. A. Williams et al, Biotechniques 4 (1986) 138-147 beschrieben sind, eingesetzt, wobei das Dideoxy/Deoxy- Verhältnis so optimiert wurde, um eine gute Markierung der ersten 300 bis 400 Basen sicherzustellen. Es wurden sehr gute Ergebnisse erhalten.The fluorescent-labeled M13 primer of the formula I thus prepared was used to carry out improved standard dideoxy Methods as described in S.A. Williams et al, Biotechniques 4 (1986) 138-147 are used, the dideoxy / deoxy Ratio has been optimized to mark the first well Ensure 300 to 400 bases. The results were very good receive.
Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde das 5′-(3-mercapto-propylphospho)- oligodeoxyribonukleotid mit 5-Jodacetamino-fluorescein anstelle von Jodeacetamino-tetramethylrhodamin umgesetzt. Das mit Fluorescein markierte Oligodeoxyribonukleotid wurde dann zunächst durch Ionenaustausch-Hochdruckflüssigkeits- Chroamtographie (HPLC) gereinigt. Nach Entsalzung durch Dialyse wurde das fluoreszenzmarkierte Oligodeoxyribonuleotid dann weiter durch Umkehrphasen-HPLC an einer Aquapore RP-300 C₈-Säule gereinigt. Das Produkt (fluoreszenzmarkierter M13-Primer) eluiert bei einem Acetonitrilgehalt von ca. 25% und wird danach durch Dialyse entsalzt.As described in Example 3, the 5 ′ - (3-mercapto-propylphospho) - oligodeoxyribonucleotide with 5-iodoacetamino-fluorescein implemented instead of iodeacetamino-tetramethylrhodamine. The fluorescein labeled oligodeoxyribonucleotide was then first by ion exchange high pressure liquid Chroamtography (HPLC) cleaned. After desalination the fluorescence-labeled oligodeoxyribonuleotide was obtained by dialysis then further by reverse phase HPLC on an aquapore RP-300 C₈ column cleaned. The product (fluorescence-labeled M13 primer) elutes at an acetonitrile content of approx. 25% and is then desalinated by dialysis.
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