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DE3588090T2 - Durch Säuren spaltbare Verbindungen - Google Patents

Durch Säuren spaltbare Verbindungen

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Publication number
DE3588090T2
DE3588090T2 DE3588090T DE3588090T DE3588090T2 DE 3588090 T2 DE3588090 T2 DE 3588090T2 DE 3588090 T DE3588090 T DE 3588090T DE 3588090 T DE3588090 T DE 3588090T DE 3588090 T2 DE3588090 T2 DE 3588090T2
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DE
Germany
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cross
moiety
nitrogen
group
coupled
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DE3588090T
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Walter A Blattler
John M Lambert
Peter D Senter
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Dana Farber Cancer Institute Inc
Original Assignee
Dana Farber Cancer Institute Inc
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Description

  • Die Erfindung betrifft die kontrollierte Freigabe von eine Aminogruppe aufweisenden Substanzen in ein flüssiges Medium sowie die Wirkstoffe, die für eine solche Freigabe verwendet werden.
  • Es gibt eine Vielzahl von Gelegenheiten, bei denen es gewünscht wird, die Freigabe von Aminogruppen enthaltenden Substanzen in ein flüssiges Medium zu steuern. Beispielsweise kann es zweckmäßig sein, die Abgabe eines Aminogruppen enthaltenden Medikaments oder Cytotoxins an eine Zellpopulation oder spezielle Mitglieder dieser Zellpopulation zu steuern. Es kann auch wünschenswert sein, die Spaltung unterschiedlicher quervernetzter Proteine oder Peptide zu kontrollieren, beispielsweise beim Analysieren der räumlichen Beziehungen in einem Komplex von Aminogruppen enthaltenden großen Molekülen, wie Peptiden und Proteinen (der Begriff "Peptid" wird in der vorliegenden Anmeldung in dem Sinn verwendet, daß er Proteine, unabhängig von ihrer Größe, ebenso wie kurzkettige Peptide umfaßt).
  • Eine spezielle Gelegenheit, bei der die gesteuerte Freigabe zweckmäßig ist, ist die Übermittlung einer biologisch aktiven Verbindung durch die Zellmembran zu den inneren Zellstrukturen, beispielsweise in Fällen, in denen der Wirkstoff eine geringe oder verminderte Wirkung hat, wenn er in einem Medium außerhalb der Zellmembran eingeschlossen ist, jedoch wirksamer ist, sobald er einmal innerhalb der Zelle freigesetzt ist.
  • Es ist auch wünschenswert, biologisch aktive Verbindungen an bestimmte Zellen in einer heterogenen Zellpopulation zu übermitteln. Beispielsweise bei der Behandlung von erkrankten oder infizierten Zellen, z.B. virusinfizierten Zellen oder transformierten oder malignen Zellen wird es gewünscht, Cytotoxine zu den erkrankten oder malignen Zellen zu liefern, jedoch nicht zu den normalen Zellen.
  • Ein bekannter Weg, um biologisch aktive Verbindungen speziell an maligne Zellen hinzutransportieren, verwendet ein Antikörper-Toxin-Konjugat. Der Antikörper ist für die malignen Zellen spezifisch und liefert das Toxin bei diesen ab. Um wirksam zu sein, sollten solche Systeme das Toxin mit einer hohen Selektivität an die Zielzellen übermitteln, ohne jedoch unnötig die Wirksamkeit der aktiven Substanz zu beeinträchtigen. Diese Probleme sind insbesondere in Fällen von Bedeutung, bei denen es Ziel ist, die infizierten oder erkrankten Zellen in vivo zu zerstören, ohne normale Zellen zu gefährden.
  • Verschiedene spaltbare bifunktionale quervernetzte Wirkstoffe sind bekannt.
  • Lambert et al. beschreiben in J. Mol. Biol. (1981) 149:451-476 und Wang et al. in Isr. J. Chem. (1974) 12:375-389 bifunktionale quervernetzte Wirkstoffe, die eine spaltbare Disulfidbrücke enthalten; diese Wirkstoffe werden dazu verwendet, biochemische Systeme zu charakterisieren.
  • Lutter et al. beschreiben in FEBS Letters (1974) 48:288-292 bifunktionale quervernetzte Wirkstoffe mit einer vic-Glykolbrücke, die durch Periodatoxidation zu spalten ist.
  • In Biochem J. (1978) 173:723-737 beschreiben Carlsson et al. ein Verfahren zur Erzeugung von Disulfidbrücken zwischen zwei unterschiedlichen Proteinen unter Verwendung des bifunktionalen Wirkstoffs N-Succinimidyl-3-(2-Pyridyldithio)-Propionat.
  • Im einzelnen sind verschiedene monoklonale Antikörper, Toxine und Konjugate aus diesen bekannt.
  • Vitetta et al. erläutern in Science (1983) 219:644- 650 und Edwards in Pharmacol. Ther. (1983) 23:147-177 Disulfid-gekoppelte Konjugate aus Toxinen und monoklonalen Antikörpern, die für Zelloberflächenstrukturen spezifisch sind; diese Konjugate werden als Zieltoxine gegen spezifische Zellen verwendet, die Oberflächenstrukturen tragen, die durch die Antikörper erkannt werden.
  • Ramakrishnan et al. zeigen in Cancer Research (1984) 44:1398-1404 die Konjugatbildung zwischen dem antiviralen Kermesbeerenprotein (PAP) und Anti-Thy 1.1 einen monoklonalen Antikörper. Das Konjugat wird dazu verwendet, die Proteinsynthese selektiv bei Thy 1.1-positiven Leukämiezielzellen zu verhindern. Der zur Herstellung des Konjugats verwendete Linker ist N-Succinimidyl-3-(2-Pyridyldithio)-Proprionat. Wenn die Disulfidbrücke aufgespalten wird, entsteht das freie PAP-Toxin.
  • In Nature (1980) 283:583-585 beschreiben Ritz et al. einen monoklonalen Antikörper (J5), der für das gewöhnliche akute lymphoblastische Leukämieantigen spezifisch ist.
  • Barbieri et al. erläutern in Biochem. J. (1982) 203:55-59 die Reinigung und partielle Charakterisierung eines antiviralen Proteins, das als antivirales Kermesbeerenprotein-S ("PAP-S") bekannt ist.
  • In J. Biol. Chem. (1980) 255:6947-6953 zeigen Stirpe et al. ein Verfahren zur Herstellung von Gelonin, einem Proteincytotoxin.
  • Neville et al. beschreiben in dem US-Patent 4 359 457 ein Konjugat aus dem monoklonalen Antikörper Anti-Thy 1.2 und Ricin, das als tumorunterdrückender Wirkstoff gegen Lymphoma verwendet wurde. Die koppelnde Verbindung ist dabei m-Maleimidobenzol-N-Hydroxysucciinimid.
  • Die obigen Lösungen hängen entweder von der Toxizität eines Antikörper-Toxinkonjugats oder von einer Disulfidbrückenspaltung ab, einem Phänomen, das zeitlich und räumlich schwer zu kontrollieren sein kann, wenn es darum geht, die Freisetzung des Toxins vor der Abgabe an die Zielzellen zu vermeiden.
  • Kirby et al. beschreiben in Proc. Biochem. Soc. Symp. (1970) 31:99-103, daß Maleinsäureamide unter einem pH-Wert von 3 schnell hydrolisiert werden und daß die Substitution durch Maleaminsäure die Geschwindigkeit erhöht, wobei ein t-Butylsubsituent die größte Steigerung liefert, hingegen ein Methylsubstituent die geringste.
  • Dixon et al. erläutern in Biochem. J. (1968) 109:312- 314 die reversible Blockierung von Aminogruppen unter Verwendung von 2-Methylmalein ("Citracon") Anhydrid als blockierendem Wirkstoff. Die Amidbrücke zwischen den Citraconylresten und einem Lysinrest von Insulin wurde bei einem pH-Wert von 6,5 nicht gespalten; wenn der pH-Wert über Nacht bei 20º C auf 3,5º C abgesenkt wurde, zeigte sich eine vollständige Freigabe der blockierenden Gruppe, wobei das Insulin unverändert blieb.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Wir haben eine Klasse von quervernetzenden Verbindungen entdeckt, die die kontrollierte Freisetzung einer Aminogruppen enthaltenden Substanz bei mittelsauren Zuständen gestattet.
  • Gemäß einem Aspekt ergibt die Erfindung einen quervernetzenden Wirkstoff zur Bildung einer durch Säure spaltbaren Quervernetzung zwischen dem Aminostickstoff einer Aminogruppen enthaltenden Substanz und einer Substanz, die eine Sulfhydrylfunktion enthält, wobei der quervernetzende Wirkstoff eine der nachstehenden Einheiten aufweist,
  • wobei R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander aus einer Gruppe gewählt sind, die H und eine Alkylgruppe von C&sub5; oder weniger enthält, und A eine Brückeneinheit aufweist; und
  • wobei R&sub2; und A, wie oben definiert sind und s = 2 - 5
  • wobei A die Einheit aufweist
  • wobei R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt sind, die H, Halogene, Alkoxy- und Alkylgruppen mit C&sub5; oder weniger sowie tertiäre Amine enthält; und B eine Amidfunktion aufweist, dessen Stickstoff an den aromatischen Ring von A gebunden ist und dessen Carbonylfunktion an den Stickstoff der Maleimido- Gruppe mittels (CH&sub2;)q, wobei q = 1 - 5, oder mittels einer Arylgruppe gebunden ist.
  • Bei den bevorzugten Ausführungsbeispielen sind R&sub3; - R&sub6; und B so gewählt, daß der Schwefel, der an den Ring der A- Einheit gebunden ist, einen pKa-Wert hat, der in der entsprechenden Thiophenol-Verbindung so niedrig ist, daß während der Bildung der Sulfid-Gruppe in A konkurriende Nebenreaktion, die durch OH&supmin; verursacht werden, vermieden sind; beispielsweise ist der pKa-Wert des Thiophenol unter 10,0.
  • Bei den bevorzugten Ausführungsbeispielen ist außerdem die Sulfidfunktion des aromatischen Rings von A an die Maleinsäurefunktion über eine Gruppe gebunden, die (CH&sub2;)k aufweist, wobei k gleich 1-5 ist. Höchst vorzugsweise enthält B eine Amidfunktion, dessen Stickstoff an den aromatischen Stickstoff von A in para-Stellung zu der Schwefelfunktion gebunden ist und dessen Carbonylfunktion an den Stickstoff der Maleimido-Gruppe über ein (CH&sub2;)q (mit q = 1- 5) oder eine Arylgruppe (höchst vorzugsweise eine unsubstituierte Arylgruppe, bei der sich die Maleimidoverbindung in meta oder para-Stellung zu der Carbonylbindung befindet) gebunden ist.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren einer quervernetzenden Verbindung durch eine Substitutionsreaktion, die ein aktviertes substituiertes Maleinsäurederivat an einen Wirkstoff bindet, der eine Thiophenol enthaltende Funktion aufweist; die Reaktion wird bei einem pH-Wert ausgeführt, der hoch genug ist, um die Sulfhydrylgruppe des Thiophenols zu ionisieren, um dadurch konkurrierende SN&sub2;'-Substitutionsreaktionen zu vermeiden und der andererseits niedrig genug ist, um konkurrierende Reaktionen von OH&supmin; zu vermeiden. Das erhaltene Zwischenprodukt wird dann an die Maleimidofunktion gebunden. Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen des Syntheseverfahrens wird die Substitutionsreaktion bei einem pH-Wert zwischen 10,5 und 11,5 oder etwa bei 11,0 ausgeführt. Ferner enthält bei bevorzugten Ausführungsbeispielen die Thiophenol 3, 4 und 5 enthaltende Funktion ein Amin, das an die Maleimidofunktion durch ein Amid gebunden ist, das den Aminstickstoff enthält.
  • Die Erfindung gestattet die Abgabe einer Aminogruppen enthaltenden Substanz an ein flüssiges Medium, und zwar unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen, die insofern milde sind, als sie keine Oxidations- oder Reduktionsbedingungen oder extreme pH-Werte benötigen, die entweder die die Aminogruppen enthaltende Substanz oder andere Komponenten des flüssigen Systems verändern könnten. Darüber hinaus geschieht die Spaltung bei einem pH-Wert, der nicht nur mild genug ist, um mit in vivo-Systemen verträglich zu sein, sondern die in der Tat durch natürlich auftretende intrazelluläre Phänomene ausgelöst wird. Vorteilhafterweise wird die Aminogruppen enthaltende Substanz zuverlässig bei jenem pH-Wert freigesetzt, ist jedoch bei höheren pH- Werten stabil gebunden. Vorzugsweise wird die Freigabe des Aminosubstituenten bei pH-Werten zwischen 3,5 - 5,5 höchst vorzugsweise bei pH-Werten zwischen 4,0 - 5,0 oder etwa bei 4,5 freigegeben. Ferner fügt weder der Quervernetzungs- noch der Freigabeprozeß Einheiten zu der Aminogruppen enthaltenden Substanz hinzu oder nimmt sie von dieser weg.
  • Andere Merkmale und Vorteile sind aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele und der Patentansprüche ersichtlich.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele
  • Wir wenden uns nun einer Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung zu, wobei zunächst die Figuren kurz erläutert werden.
    • Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt ein Flußdiagramm für die Herstellung einer Klasse von quervernetzenden Reagenzien.
  • Fig. 2 zeigt ein Flußdiagramm für die Herstellung eines speziellen Komplexes, der mittels der Reagenzien, die gemäß Fig. 1 hergestellt sind, quervernetzt ist.
  • Es gibt zwei besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Eine ist ein Zellanlieferungsagens zum Zuführen eines biologisch aktiven Proteins oder eines Peptids zu einer Zelle, wie dies oben beschrieben ist. Das andere ist ein Werkzeug zum Evaluieren eines Komplexes, der ein oder mehrere Aminogruppen enthaltende große Moleküle umfaßt, beispielsweise ein Ribosomkomplex oder ein Multieinheitenenzym. Durch Quervernetzen der Teile des Komplexes ist es möglich, die quervernetzten Komponenten zu separieren und sodann die quervernetzenden Komponenten abzukuppeln, um sie zu analysieren, ohne ihre Struktur zu verändern. Die Analyse des Auftretens und Verschwindens von Mitgliedern des Komplexes und der quervernetzenden Substanz ergibt ein Werkzeug zum Evaluieren von Komponenten lebender Systeme und damit zum Verfolgen der Wirkungen von Behandlungen und Anomalien in diesen Systemen.
    • Ausführungsbeispiel für die Zellzulieferung
  • Die bevorzugte biologisch aktive Substanz, die an die Zelle angeliefert werden soll, ist ein Protein- oder Peptidmedikament oder ein Enzym. Bei einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die aktive Substanz ein Zellgift, das ausgewählten Zellen zugeführt werden soll. Zu solchen Toxinen gehören die antiviralen Kermesbeerenproteine PAP, PAPII und PAP-S, wie sie oben und von Irvin in Pharmac. Ther. (1975) 21:371-387 beschrieben sind. Andere Peptidcytotoxine umfassen die Ricin-A-Kette, die Abrin-A-Kette, die Modeccin-A-Kette ebenso wie Gelonin und andere einkettige ribosomal inaktivierende Proteine, wie jene, die von Barbieri et al. in Cancer Surv. (1982) 1:489-520 beschrieben sind.
  • Peptidtoxine werden bevorzugt, weil sie leicht an das Reagenz zu binden sind und weil sie extrem wirksame Gifte darstellen, die die Zellproteinsynthese sperren, sobald sie in der Zelle bereits in extrem kleinen Mengen vorhanden sind. Andere Aminogruppen enthaltende Cytotoxine, bei denen es sich nicht um Peptide handelt, liegen jedoch ebenso innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung; Beispiele für solche Cytotoxine oder cytotoxische Wirkstoffe sind Meiphalan, Bleomycin, Adriamycin und Daunomycin.
  • Die oben erwähnten Substanzen werden mittels Bindungspartnern für Zelloberflächenmerkmale an die ausgewählten Zellen angeliefert. Die bevorzugten Bindungspartner sind Antikörper für Zelloberflächenantigene. Besonders bevorzugt sind monoklonale Antikörper gegen Zelloberflächenantigene, die für die erkrankten, infizierten, transformierten oder malignen Zellen, jedoch nicht für die normalen Zellen spezifisch sind. Insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, handelt es sich um Antikörper, die durch die Zellen aufgenommen werden. Es ist nicht notwendig, daß die normalen Zellen (d.h. die Nichtzielzellen) völlig frei von dem spezifischen Antigen sind, solange das Antigen auf diesen Zellen nicht in einer Menge präsentiert wird, die ausreicht, um eine signifikante Aufnahme der aktiven Substanz durch die Zellen zu ermöglichen.
  • Einer dieser Antikörper ist der oben beschriebene J5, der von Coulter Immunology, Hialeah Florida, erhältlich ist. Andere Beispiele sind Antikörper gegen Melanom- oberflächenantigene, wie die von Imai et al. in Cancer Imm. (1983) 15:206 ff. beschriebenen. Andere geeignete Antikörper, die von Coulter Immunology erhältlich sind, umfassen Antikörper gegen Oberflächenantigene, wie sie auf T-Zellen und T-Zell-Lymphomen, z.B. T3, T4, T11 und T12 gefunden werden.
  • Zu anderen Bindungspartnern bei diesem Ausführungsbeispiel gehören Nichtantikörper darstellende Agenzien, die zu der Zellmembrane transportieren, wie Transferrin und Proteinhormone, z.B. Insulin.
    • Biologische Systemevaluation
  • Zu den bevorzugten, durch die Quervernetzung evaluierten Systemen gehören Zellstrukturen, wie Ribosomen, Membranen und Komplexproteine. Eine Komponente des Systems wird mit einer Sulfhydrylgruppe funktionalisiert und das oben beschriebene, quervernetzende Agens wird dazu verwendet, um diese Komponente mit einer Aminogruppen enthaltenden Substanz, die der Sulfhydrylgruppe benachbart ist, querzuvernetzen. Z.B. kann ein funktionalisiertes Enzymsubstrat verwendet werden, um die Bindungsdomäne des Enzyms durch eine Quervernetzung während des Prozesses der Enzymkatalysereaktion zu erzeugen.
    • Der Cross-Linker
  • In jedem der beiden oben bezeichneten Ausführungsbeispiele ist der Linker, der die Aminogruppen enthaltende Substanz und die Sulfhydrylgruppe aneinander bindet, von enormer Bedeutung. Die Aminogruppen enthaltende Substanz sollte an den Linker ohne Änderung ihrer Aktivität und vorzugsweise ohne Anderung ihrer Struktur gebunden und von diesem freigebbar sein.
  • Somit sollte die Aminobindung unter milden Bedingungen erzeugt werden, die nicht die Proteinstruktur beeinträchtigen; gleichzeitig sollte die Bindung so fest sein, daß sie nicht vorzeitig gespalten wird und dennoch unter milden Bedingungen spaltbar sein, die mit den empfindlichen Komponenten eines biologischen Systems verträglich sind. Die Spaltstelle sollte bei der Bindung zwischen der Aminogruppe, der Aminogruppen enthaltenden Substanz und dem Linker liegen, so daß die Substanz intakt freigesetzt wird, und zwar ohne zusätzliche Komponenten und ohne Fehlstellen.
  • Wie oben beschrieben ist die Maleinanhydridfunktion zur Erzeugung einer spaltbaren Amidbindung an den Stickstoff der Aminogruppe enthaltenden Substanz geeignet. Ferner ist die Maleimidoeinheit zur Bildung einer stabilen Bindung an die Sulfhydrylfunktion des zweiten Wirkstoffs des Komplexes geeignet.
  • Die Brücke zwischen der oben erwähnten Maleimidoeinheit und der Maleinanhydrideinheit ist deswegen wichtig, weil, falls diese Brücke durch natürliche Vorgänge (beispielsweise durch Enzyme in einem in vivo-System) zur unerwünschten Zeit oder am unerwünschten Ort gespalten wird, die Selekivität des Bindungspartners verlorengeht und das Toxin oder ein Wirkstoff mit einer potentiell toxischen Wirkung in dem Medium außerhalb der Zelle vorhanden ist, ohne daß es Mittel gibt, um die Zielzellen auszusuchen. Andere Einschränkungen hinsichtlich der Brücke sind die Verträglichkeit sowie das inerte Verhalten gegen andere Komponenten des Komplexes, sowie die Leichtigkeit der Herstellung unter Bedingungen, die diese Komponenten nicht gefährden.
  • Die bevorzugten Brücken sind oben unter der Überschrift "Zusammenfassung der Erfindung" im einzelnen beschrieben.
  • Aus Gründen der Erläuterung beschreiben wir nun die Synthese und die Verwendung zweier spezieller repräsentativer Beispiele der nachfolgenden bevorzugten quervernetzenden Reagenzien mit der Formel:
  • Bei dem ersten Beispiel ist W (CH&sub2;)s und in dem zweiten Beispiel ist W:
    • Synthese des Cross-Linkers
  • Die Synthese des ersten Beispiels ist in Fig. 1 veranschaulicht. Kurz zusammengefaßt kann das quervernetzende Reagenz 6 mit den nachfolgenden Hauptschritten synthetisiert werden:
  • 1. Hydrolyse von 2-Brommethylmaleinanhydrid (Verbindung 2);
  • 2. Reaktion des erhaltenen Maleinsäurederivats (Verbindung 3) mit 4-Aminothiophenol, um Verbindung 4 zu erhalten; und
  • 3. Reaktion der Verbindung 4 mit dem Acylchlorid von 6-Maleimidocaproinsäure, um die Disäure zu erhalten, die dehydriert wird, um die Verbindung 6 zu bekommen.
  • Um die Isomerisierung von 2-(Brommethyl)-Maleinsäure (3) zu dem entsprechenden Fumaratanalogen durch Hydrolyse des Anhydrids (2) zu vermeiden, werden die Schritte in einer wässrigen Lösung durchgeführt, und die Disäure (3) unmittelbar nach der vollständigen Hydrolyse neutralisiert. Die gesamten Brommethylfumarinsäurederivate werden beim Reinigen der Verbindung (4) entfernt, wie dies genauer unten beschrieben ist.
  • Unerwünschte SN2'-Substitutionsreaktionen (anstelle der gewünschten SN2-Substitution) von Brommethylmaleinsäure werden unterdrückt, indem der pH-Wert der Reaktionsmischung weit genug angehoben wird, um das p-Amino-Thiophenol in das zugehörige Thiophenolatanion umzuwandeln.
    • 1. 2[2-(4-Aminophenyl-2-Thiaethyl]-Maleinsäure (4).
  • 2-(Brommethyl)-Maleinanhydrid (2) wird gemäß dem Verfahren nach Laursen et al. in (1971) J. Med. Chem. 14:619-621 unter Verwendung der Modifikation nach Breenlee und Woodward (1980) Tetrahedron 36:3367-3375 aus der Verbindung 1 erzeugt. Dieses Material (2 g) wird in Wasser (20 ml) etwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur zu 2-(Brommethyl)-Maleinsäure (3) hydrolysiert, und sodann wird die Lösung mit 1 N NaOH (21,2 ml) neutralisiert, entgast und unter N&sub2; gehalten. Die Lösung wird einer vorher zubereiteten Lösung von 4-Aminothiophenol (1,51 g) zugegeben, die in entgastem 1 N NaOH (11,6 ml) bei mäßiger Erwärmung unter N&sub2; gelöst und gefiltert wurde, um an den unlöslichen Dimer zu entfernen. Das Filtrat wird mit entgastem Wasser (12 ml) verdünnt, ehe es zu der obigen Lösung der Verbindung 3 hinzugegeben wird. Die endgültige Reaktionslösung wird mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert von etwa 11,0 gebracht und über Nacht bei Raumtemperatur unter N&sub2; gerührt. Die Lösung wird sodann gefiltert, um geringe Mengen von Bis-(4-Aminophenyl)-Disulfid zu entfernen, auf Eis gekühlt und mit 1 N HCl angesäuert, wodurch ein gelbes Präzipitat entsteht. n-Butanol wird zugegeben (40 ml) und die Mischung auf Eis 5 Minuten lang heftig umgerührt. Hierdurch wird das Fumarinsäureanalogon der Verbindung 4 entfernt. Der Festanteil wird sodann durch Filtrierung gesammelt, aufeinanderfolgend mit 0,1 N HCL und Wasser gewaschen und schließlich über P&sub2;O&sub5; in einem Vakuumdesiccator getrocknet, um die neutrale Verbindung 4 zu erhalten.
    • 2. Maleimidodisäure 5.
  • 6-Maleimido-Caproinsäure wird nach dem Verfahren nach Keller und Rudinger in (1974) Helv. Chim. Acta 58:531-541 zubereitet und mittels Thionylchlorid in sein Säurechlond transformiert. 6-Maleimido-Caproinsäure (1,06 g) wird in wasserfreiem THF (10 ml) gelöst, mit SOCl&sub2; (0,51 ml) behandelt und sodann wird die Lösung unter Ausschluß von Feuchtigkeit 1,5 Stunden lang am Rückflußkühler gekocht. Die Lösung wird in vacuo zum wasserfreien Zustand eingedampft und das verbleibende öl in wasserfreiem THF (5 ml) gelöst. Diese Lösung wird tropfenweise über 10 Minuten einer Lösung der Verbindung 4 (1,16 g) in wasserfreiem THF (15 ml) und N-Ethylmorpholin (2,16 ml) zugegeben. Nach 2 Stunden wird die Lösung bis zum wasserfreien Zustand unter vermindertem Druck eingedampft. Das erhaltene Öl wird in Ethylacetat aufgenommen und die Lösung wird mit kaltem 0,1 N HCl und sodann mit Wasser gewaschen. Die Ethylacetatlösung wird getrocknet und das Lösungsmittel wird durch Verdampfen entfernt. Das Rohprodukt wird sodann durch Flash-Chromatographie auf einem Silicagel mit CHCl&sub3;-MeOH (95:5, v/v) gereinigt, das 2% Essigsäure als Eluiermittel enthält. Das gereinigte Produkt passiert danach eine Säule von Dowex 50 (H&spplus;-Form) in MeOH-H&sub2;O (1:2, v/v). Das Abdampfen des Lösungsmittels und das Trocknen des öligen Rests im Hochvakuum ergibt einen spröden festen Schaum mit einer 55%-igen Ausbeute (976 mg).
    • 3. Cross-Linker-Reagenz 6.
  • Die Verbindung 5 (200 mg), die sich in wasserfreiem THF (3 ml) befindet, wird bei 0º C mit einer Lösung aus Dicyclohexylkarbodiimid (110 mg) in wasserfreiem THF (2 ml) behandelt. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur 45 Minuten lang gerührt und sodann durch Filtrierung von dem präzipitierten Dicyclohexylharnstoff befreit. Das Filtrat wird in vacuo bis zum trockenen Zustand konzentriert und das erhaltene Öl in Dioxan (2 ml) gelöst und wiederum gefiltert. Das Dioxan wird schließlich durch Lyophilisation entfernt, wodurch ein bräunlicher Feststoff zurückbleibt.
  • Das zweite Beispiel des quervernetzenden Reagenz wird auf die gleiche Weise, wie die oben beschriebene Verbindung 6, zubereitet, wobei p-Maleimidobenzoylchlorid anstelle von 6-Maleimidocaproinsäurechlorid aus Schritt 2, oben, verwendet wird.
    • Cross-Linker
  • Die beiden quervernetzenden Agenzien, die oben beschrieben sind, können dazu verwendet werden, ein Peptidmedikament oder Toxin mit einem zellspezifischen Antikörper, wie unten beschrieben, querzuvernetzen. Das spezielle beschriebene Beispiel verwendet das Toxin Gelonin und den monoklonalen Antikörper J5, wie er oben erwähnt ist. Fig. 2 zeigt in Diagrammform diese Schritte.
  • Gelonin wird aus Samen von Gelonium multiflorum (Euphorbiaceae) erhalten, wie dies von dem oben zitierten Stirpe et al. (1980) beschrieben ist. Die Samen sind von United Chemical und Allied Products, 10 Clive Row, Calcutta-1, Indien, über die Meer Corporation, North Bergen, New Jersey, erhältlich. Eine Probe des Gelonin (1,47 mg/ml) in 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,2, wird 30 Minuten lang bei 20º C mit einem 12-fachen Überschuß der Verbindung 6 in DMSO behandelt. Die Probe wird sodann in eine Säule von Sephadex G-25 (superfein) bei 4º C eingegeben, die mit 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, equilibriert ist und EDTA (1 mM) enthält, um den Überschuß an der Verbindung 6 aus der neu erzeugten Verbindung 7 zu entfernen.
  • Die Verbindung 7 wird sodann dazu verwendet, eine Quervernetzung mit dem monoklonalen Antikörper J5 herzustellen, der mit 2-Iminothiolan, wie unten beschrieben, modifiziert ist, um 2,0 Mol Sulfhydrylgruppen pro Mol Antikörper einzuführen.
  • Der Antikörper J5 (2 mg/ml) 60 mM, der sich Triethanolamin-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0 befindet, der Kaliumphosphat (7 mM) , NaCl (100 mM) sowie EDTA (1 mM) enthält, wird entgast und sodann mit 2-Iminothiolan (1 mM) 90 Minuten lang bei 0º C unter Stickstoff behandelt. Stammlösungen von 2-Iminothiolanhydrochlorid (0,5 M) werden, wie oben beschrieben, zubereitet [Lambert et al. (1978) Biochemistry 17:5406-5416]. Die Reaktion wird durch Gelfiltration bei 4º C durch eine Säule von Sephadex G-25 (fein) beendet, die mit 5 mM Bistrisacetatpuffer, pH-Wert 5,8, equilibriert ist, der NaCl (50 mM) und EDTA (1 mM) enthält. Die Sulfhydrylgruppen, die in den Antikörper auf diese Weise eingebracht sind, werden spektrophotometrisch mit dem Verfahren nach Ellman (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82:70-77 quantifiziert.
  • Wie unten beschrieben, wird der derivierte Antikörper mit dem 5-fach molaren Überschuß der Verbindung 7 gemischt, der eine Maleimidsubstitution in der Größe von 0,7 Gruppen pro Mol Gelonin aufweist. Der hohe Substitutionswert von J5 erhöht die Ausbeute hinsichtlich des Antikörpers, während der niedrige Substitutionswert von Gelonin die Menge an hinsichtlich des Molekulargewichts hohen Aggregaten vermindern, die in der Quervernetzungsreaktionsmischung gebildet werden. Die endgültige Ausbeute an Konjugaten nach der Gelfiltration und Karboxymethylzellulosereinigung beträgt 37% bezogen auf J5.
  • Der modifizierte J5 (8 mg, 0,05 µmol), der sich in 5 mM Bistrisacetatpuffer, pH-Wert 5,8 (15 ml) befindet, der NaCl (50 mM) und EDTA (1 mM) enthält, wird bei 5º C mit dem 5-fachen molaren Überschuß der Verbindung 7 (8 mg Gelonin) in 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0 (11 ml), der EDTA (1 mM) enthält, und sodann mit 0,5 M Triethanolamin- HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, (0,15 ml) gemischt, um einen endgültigen pH-Wert von 7,0 zu erhalten. Die Mischung wird bei 0º C 2 Stunden lang inkubiert und danach wird frisch zubereitetes N-Ethylmaleinimid (1 mM) in Ethanol (0,26 ml) hinzugegeben, um die verbleibenden freien Sulfhydrylgruppen zu blockieren. Nach 30 Minuten bei 0º C wird die Lösung auf Eis gehalten, während sie unter Verwendung einer immersiblen Ultrafiltrationseinheit (Millipore Corporation, CX-10 Filter) auf 13 ml konzentriert wird. Die Mischung wird sodann in eine Säule (95 cm x 2,6 cm) von Sephacryl S-300 gegeben, die bei 4º C mit 5 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, equilibriert ist, der NaCl (15 mM) und NaN&sub3; (0,4 mM) enthält. Die Gelfiltration separiert die Konjugate und nativen J5 (Mr = 160 000) von dem nicht quervernetzten Gelonin [Mr = 30 500; Thorpe et al., (1981) Euro. J. Biochem. 116:447-454] und von einigen Aggregaten mit hohem Molekulargewicht. Der größte Peak, der einem Molekulargewicht in einem Bereich zwischen 160 000 und 220 000 entspricht und bei Polyacrylamid/Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese darstellungsgemäß sowohl nativen J5 als auch quervernetztes Konjugat 8 enthält, wird zusammengefaßt und durch eine Säule (5 ml Bettvolumen) mit Karboxymethylzellulose (Whatman CM-52) passiert, die mit demselben Puffer equilibriert ist. Die Säule wird mit dem einfachen Säulenvolumen von Puffer gewaschen und die Eluate werden zusammengegeben. Unter diesen präzisen Bedingungen der Tonenstärke und des pH-Wertes bindet der native JS an die Säule, während die quervernetzten Komplexe des Typs 8, ohne zurückgehalten zu werden, hindurchgelangen. Die monoklonalen Antikörper sind hinsichtlich der Ladung heterogen [Cowan et al. (1973) FEBS Lett. 30:343-346]: die Probe des in diesem Experiment verwendeten J5 passiert vor der Modifikation eine Karboxymethylzellulosesäule unter gleichen Bedingungen. Nur der J5, der an die Säule bindet, wird für die Quervernetzungsexpenmente verwendet. Er wird mit einem Puffer aus der Säule eluiert (Ausbeute 66%), der 1,0 M NaCl enthält.
  • Die den gereinigten Komplex 8 enthaltende Lösung, die von den nicht quervernetzten monomeren Proteinen separiert wurde, wird unter Verwendung einer immersiblen Ultrafiltrationsmembrane (Millipore, CX-30) bei 0º C konzentriert, gegen 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,8, der Triethanolamin (0,5 mM) und NaCl (145 mM) enthält, dialysiert wird und schließlich nach einer Sterilfiltration durch eine Millex-GV Filtriermembrane (0,22 µm, Millipore) bei 4º C gelagert.
    • Säurespaltung
  • Der gereinigte Komplex 8 oder ein entsprechender Komplex, der unter Verwendung des zweiten Cross-Linker- Beispiels, wie dies oben auf Seite 11 beschrieben ist, zubereitet wurde, kann einer Zellpopulation verabreicht werden, die normale Zellen und gewöhnliche akute lymphoblastische Leukämiezellen enthält, die ein Oberflächenantigen präsentieren, das durch den J5-Antikörper erkannt wird. Die J5-Komponente in dem Komplex behält ihre Fähigkeit, selektiv an die Zellen mit diesem Oberflächenantigen zu binden, wie dies durch indirekte Immunofluoreszenz an Namalwa-Zellen bestimmt wurde, beschrieben von Ritz et al. (1980) in J. Immunol. 125:1506-1514. Die Geloninkomponente des Komplexes 8 zeigt eine verminderte Fähigkeit, die Proteinsynthese zu stoppen, verglichen mit nativem, nicht quervernetztem Gelonin, wie dies mit Hilfe des Karnickel- Reticulocytlysat-Systems festgestellt wurde; ein solches System ist von New England Nuclear Company erhältlich.
  • Somit hat der Komplex die Fähigkeit zur Zellerkennung und, sobald einmal der Antikörper an die Zelle bindet, wird der Komplex in ein Zellkompartment aufgenommen, in dem die Spaltung auftritt. Rezeptoren, die durch eine rezeptorvermittelte Endocytose internalisiert werden, gelangen durch die angesäuerten Kompartments, bekannt als Endosomen oder Rezeptosomen [de Duve (1983), Eur. J. Biochem. 137:391-397]. Somit wird der Komplex vorübergehend einem sauren pH-Wert ausgesetzt, der ausreicht, um die Aminogruppen enthaltende aktive Substanz abzuspalten.
  • Die Abspaltung des nativen Gelonins von dem Komplex 8 geschieht verhältnismäßig schnell bei einer guten Ausbeute oberhalb eines pH-Wertes von 5. Beispielsweise bei 37º C und einem pH-Wert von 4 werden über 30% des gesamten Gelonins in 5 Stunden abgespalten und über 50% nach 10 Stunden. Bei einem pH-Wert von 5 werden etwa 15% nach 5 Stunden abgespalten und etwa 25% nach 10 Stunden. Über einem pH-Wert von 6 ist die Amidbindung an das Gelonin verhältnismäßig stabil.
  • Der Fachmann erkennt, daß bei einem gegebenen Wirkstoff-Antikörper-Komplex die Ausbeuten und Freisetzungsraten für die pH-Werte und Temperaturbedingungen gemessen werden können, die in der Freisetzungsumgebung auftreten und daß auf dieser Basis die Menge des Komplexes bestimmt werden kann, die notwendig ist, um genügend aktive Substanz zu den Zielzellen zu übermitteln. Beispielsweise kann die Wirkstofffreigabe unter Verwendung von Polyacrylamid/Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese bestimmt werden.
  • Ein Verfahren zum Testen der Freisetzungsrate von Gelonin unter unterschiedlichen pH-Wert-Bedingungen wird mit dem nachfolgenden Verfahren exemplarisch dargestellt.
  • Die Proben der Verbindung 8 (0,54 mg/ml) werden 1:2 (v/v) mit 100 mM Zitronensäurephosphatpuffer verdünnt, um endgültige pH-Werte von 4,0, 5,0 und 6,0 zu erhalten. Die Lösungen werden bei 37º C inkubiert und die Proben zwecks Ermittlung der Geloninaktivität und zwecks Analyse mittels Polyacrylamid/Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese zu unterschiedlichen Zeiten entnommen. Die Proben werden hierzu in 150 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,8, 10-fach verdünnt, der Natriumphosphat (9 mM), NaCl (18 mM) und Bovinalbuminserum (0,2 mg/ml) enthält, und sodann werden sie vor dem Test bei 4º C gelagert; der endgültige pH-wert beträgt 8,5. Die Proben (50 µl) für die Polyacrylamid-Gelanalyse werden auf VSWP-025 Dialysemembranen (5 Millipore) plaziert, die auf 5 mM Triethanolamin-HCl-Puffer, pH-Wert 7,8, schwimmen, der Kaliumphosphat (5 mM) und NaCl (70 mM) enthält, und 2 Stunden lang bei 4º C dialysiert, woraufhin der pH-Wert der Proben bei 7,8 liegt.
    • Charakterisierung von Proteinkomrlexen
  • Schließlich kann die quervernetzte Verbindung 6 dazu verwendet werden, um komplexe Strukturen zu analysieren, die viele Polypeptidketten enthalten, wie dies von Lambert et al. in J. Mol. Biol. (1981) 149:451-476; von Wang et al. in ISR. J. Chem. (1974) 12:375-389; von Lomant et al. in J. Mol. Biol. (1976) 104:243-261; von Lutter et al. in FEBS Letters (1974) 48:288-292; oder von Coggins et al. in Biochemistry (1976) 15:2527-2532 beschrieben wurde.
  • Eine interessierende Kette wird mit einer Sulfhydrylgruppe funktionalisiert und der quervernetzenden Verbindung 6 ausgesetzt. Eine Aminogruppe einer benachbarten Kette bildet eine bei einem pH-Wert von 7 oder darüber spaltbare Amidbindung. Die Hydrolyse der Amidbindung bei einem pH-Wert, der die Ketten nicht denaturiert (beispielsweise pH-Wert zwischen 4 bis 5) können sich anschließen, beispielsweise mittels SDS-Gelelektrophorese, um die Ketten zu identifizieren, die sich neben der interessierenden Kette befinden. Die Fähigkeit, die Hydrolyse unter nicht-denaturierenden Bedingungen, nicht-oxidierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen zu kontrollieren, ist von besonderer Bedeutung. Es ist ferner wichtig, in der Lage zu sein, die Quervernetzung mit jeder beliebigen Aminoketten enthaltenden Stelle herzustellen und nicht nur als Antwort auf die Verfügbarkeit freier Sulfhydrylgruppen, die sich innerhalb des Moleküls befinden.
    • Andere Ausführungsbeispiele
  • Andere Ausführungsbeispiele liegen innerhalb des Schutzumfangs der nachstehenden Patentansprüche. Beispielsweise liegen andere Medikamentenlieferkomplexe und Protein-Evaluations-Cross-Linker innerhalb des Schutzumfangs der Patentansprüche.

Claims (9)

1. Quervernetzendes Reagenz, das dafür geeignet ist, eine säurespaltbare Quervernetzung zwischen dem Amino- Stickstoff einer eine Aminogruppe enthaltenden Substanz und einer Substanz herzustellen, die eine Sulfhydryleinheit enthält, wobei das quervernetzende Reagenz eine der nachstehenden Einheiten enthält:
wobei R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander H oder eine Alkhylgruppe mit C&sub5; oder weniger sind und A eine Brückeneinheit aufweist; und
wobei R&sub2; und A wie oben angegeben definiert sind und s zwischen 2 bis 5 (wobei 2 und 5 eingeschlossen sind) liegt, wobei A die Einheit aufweist
wobei R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; unabhängig voneinander gewählt und H, ein Halogen, Alkoxy- und Alkyhlgruppen von C&sub5; oder weniger oder tertiäre Amine sind; und wobei B eine Amideinheit aufweist, deren Stickstoff an den aromatischen Ring von A gekoppelt ist und dessen Karbonyleinheit an den Stickstoff der Maleimino-Gruppe durch (CH&sub2;)q mit q = 1 ... 5, oder durch eine Arylgruppe angekoppelt ist.
2. Reagenz nach Anspruch 1, wobei der Stickstoff der Amideinheit von B an den aromatischen Ring von A in para- Stellung zu der Sulfideinheit gekoppelt ist.
3. Reagenz nach Anspruch 1 der Anspruch 2, wobei die Arylgruppe von B eine nicht substituierte Arylgruppe ist, bei der die Maleimido-Kopplung in meta- oder para-Stellung zu der Karbonylbindung steht.
4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Komplex die Einheit aufweist:
wobei n = 1 ... 5 (wobei 1 und 5 eingeschlossen sind), R&sub1; sowie R&sub2; entsprechend der Verbindung 1 nach Anspruch 1 definiert sind und W (CH&sub2;)q ist mit q = 1 ... 5 oder eine der nachstehenden Einheiten:
5. Quervernetzendes Reagenz nach Anspruch 4 mit n = 1 und W = (CH&sub2;)&sub5;
6. Verfahren zum Herstellen des kreuzreagierenden Reagenz nach Anspruch 1, wobei es zu dem Verfahren gehört:
daß eine aktivierte substitierte Maleinsäureeinheit bereitgestellt wird;
daß die aktivierte substituierte Maleinsäureeinheit an einem Komplex gekoppelt wird, der eine Thiophenol enthaltende Einheit in Folge einer Substitutionsreaktion auzweist, die bei einem pH-Wert durchgeführt wurde, der hoch genug liegt, um die Sulfhydrylgruppe des Thiophenol zu ionisieren und
daß die Thiophenol enthaltende Einheit an einen Maleimidostickstoff gekoppelt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der pH-Wert zwischen 9,5 und 11,5 liegt.
5. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Maleinsäureeinheit durch eine Alkylhalideinheit auf einer Carbon alpha bis einer Karboxylgruppe aktiviert ist.
9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Diophenol enthaltende Einheit ein Amin enthält und die Maleimidoeinheit an den Aminostickstoff gekoppelt ist, in dem eine Amidverbindung mit dem Stickstoff gebildet wird.
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