DE3431780A1 - Herstellen eines selektierbaren shuttle-clonierungsvektors fuer thiobacillus ferrooxidans - Google Patents
Herstellen eines selektierbaren shuttle-clonierungsvektors fuer thiobacillus ferrooxidansInfo
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Description
Beschreibung
Die. Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines
_ rekombinanten, DNA-klonierenden Plasraid-Vektors für Thioo
bacillus ferrooxidans, der ein selektierbares Gen für
Chloratnphenicolresistenz enthält und fähig ist, sich sowohl in T. f errooxidans als auch in Escherichia coli zu
replizieren- · .
Obwohl selektierbare Clonierungsvektoren für andere Bakterien
bereits hergestellt wurden, gibt es, soweit der Anmelderin bekannt ist, bisher keine Berichte Über die
Herstellung eines selektierbaren Clonierungsvektors für
,_ T. ferrooxidans, der sich auch in E. coli replizieren kann.
15
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Plasmid-Vektor
hergestellt, indem ein kryptisches DNA-Plasmid aus einem Stamm der Art T. ferrooxidans extrahiert wird, das
Plasmid aus T. ferrooxidans und ein zweites Plasmid, das
ein Gen für Chloramphenieolresistenz enthält, mit ein und
demselben Restriktionsenzym geschnitten und die Plasmid'e
miteinander verbunden werden, um ein rekombinantes Plasiftid
zu bilden.
Das zweite Plasmid kann das Plasmid pBR325 sein, obwohl
andere geeignete Plasmide anstelle des Plasmids pBR 325 ebenso verwendet werden können. .
Das resultierende rekombinante Plasmid pDRUüt repliziert
30
sich in E. coli.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann das Plasmid pDRMOI reisoliert werden und durch Schneiden mit
__ mindestens einem Restriktionsenzym in der Weise modifi-35
ziert werden, als der E. coli-Origin der Replikation entfernt
wird.
Das deletierte rekombinante Plasmid pDR4i2 enthält das Gen
für Chloramphenicolresistenz und repliziert sich in E. coli
unter. Verwendung des T. ferrooxidans-Origins der Replikae tion.
Die Erfindung erstreckt sich weiterhin auf die rekombitianten
Plasmide pDR401 und pDR4i2, wie sie hier definiert . sind, bei denen es sich um neue, selektierbare Shuttle-Vektoren
handelt, die für genetische Manipulationsexperimente eingesetzt werden können, bei denen T. ferrooxidans
und E. coli verwendet werden.
Die Erfindung stellt somit ein Plasmid pDR4O1 zur Verfügung,
das eine Größe von etwa 17,8 kb aufweist und durch das Restriktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größen
3,5 kb, 6,2 kb bzw. 8,1 kb teilbar ist.
Weiterhin stellt die Erfindung ein Plasmid pDR4i2 zur
Verfügung, das eine Größe von etwa 14,8 kb hat und durch
das Rest-riktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größen
3,5 kb, 5,1 kb bzw. 6,2 kb teilbar ist.
Im folgenden wird die Erfindung an einem Beispiel be-
__ schrieben mit Bezug auf die Zeichnung, in der die Restriktionskarte
des kryptischen Plasmids dargestellt ist sowie die rekoabinanten Plasmide der Erfindung.
Das kryptische Plasmid pTF-FC2 mit einer Größe von 12,4 on Kilobasen (kb) wurde aus einem T. ferrooxidans FC-Stamm
extrahiert, der aus einer auslaugenden Säureflüssigkeit von Fairview Mine, General Mining Union Corporation
Limited, Südafrika isoliert wurde. Die Restriktionskartierung Von pTF-FC2 zeigt, daß je einmal"Restriktionseroc
kennungsstellen der Restriktionsenzyme Pstl, Xhol, Kpnl,
EcoRI, Apal, CIaI sowie zwei Restriktionserkennungsstellen
des Restriktionsenzyms Pvul vorliegen, wie es in der anliegenden
Zeichnung dargestellt ist.
34317-99 Das rekombinante Plasmid pDR401 wird durch Insertion des !
E. coli-Plasmids pBR325 in die Pstl-Erkenrtungsstelle des
Plasmids pTF-FC2 hergestellt. Das Plasmid pBR325 enthält die Gene für Ampicillinresistenz (Ap), Chloramphenicolresistenz
(Cm) und Te t racy el in resistenz (Tc). Das Cionieren an
der Pstl-Erkennungsstelle inaktiviert durch Insertion
das Ap'-Gen, so daß E. coli-Transformanten. isoliert warden, die bezüglich der Antibiotikaresistenzen den Geno-
RRS
typ Cm , Tc und Ap aufweisen. Das rekombinante Plasmid
typ Cm , Tc und Ap aufweisen. Das rekombinante Plasmid
1^ pDR401 (etwa 17,8 kb) wird aus den Έ. coli-Transformanten
extrahiert und durch Restriktionsanalyse charakterisiert,.
Dieses neue rekombinante Plasmid enthält die Gerte für
RR
Cm und Tc und ist fähig, sich sowohl in T, ferrooxidans
Cm und Tc und ist fähig, sich sowohl in T, ferrooxidans
als auch E. coli zu replizieren.
15
15
Ein Deletionsplasmid pDR4i2 (etwa 14,8 kb) wird als Folge
einer Sall/Xhol-Verdauung des Plasmids pDR401 hergestellt,
wobei das Sall/Xhol-Fragment (etwa 3,0 kb).entfernt wird,
das den pBR325-Origin der Replikation und annähernd die Hälfte des Tc-Gens, sowie ein Stück von der Größe 0,3 kb
der DNA von T. ferrooxidans pTF-VC2 enthält. Durch Restriktionsanalyse
kann bestätigt werden, daß das Sall/Xhol-Fragment
mit der Größe von 3,1 kb im Plasmid pDR4i2 deletiert
ist. Dieses neue rekombinante Plasmid enthält da3 Gen Cm und ist fähig, sich sowohl in T. ferrooxidans
als auch E. coli zu replizieren.
Die beiden Plasmide pDR401 und pDR4i2 wurden durch endonucleolytisches
Schneiden mit einem Re'striktionsenzym' charakterisiert.
Das Restriktionsenzym Pvul schneidet das Plasmid pDR40.1
in drei Fragmente mit den Größen 3,5 kb, 6,2 kb bzw. 8,1
kb.
35
35
Dasselbe Restriktionsenzym Pvul schneidet das Plasmid
pDR4i2 in drei Fragmente mit. den Größen 3,5 kb, 5,1 kb bzw.
6,2 kb.
Claims (11)
1. Verfahren zum Herstellen eines Plasmid-Vektors, dadurch·
gekennzeichnet , daß ein kryptisches
Plasmid aus einem Stamm der Art Thiobacillus ferrooxidans extrahiert wird, das Plasmid aus Thiobacillus ferrooxidans
sowie ein zweites Plasmid, das ein Gen für Chloramphenicol-• resistenz enthält, mit ein und demselben Restriktionsenzyrr.
geschnitten und die Plasmide miteinander verbunden werden. um ein.rekombinantes Plasmid zu bilden.
2. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das kryptische DNA-Plasmid das
Plasmid pTF~FC2 ist und eine Größe von 12 ,'-t kb aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das zweite Plasmid das Plasmid
pBR 325 ist. .
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß das Plasmid pBR 325 in die Pstl-Erkennungsstelle
des Plasmids pTF-FC2 inseriert wird. .
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , 'daß' das rekombinante
Plasmid reisoliert wird und das rekombinante Plasmid mit mindestens einem Restriktionsenzym geschnitten wird,
um den E. coli-Restriktionsorigin zu entfernen, um ein deletiertes rekombinantes Plasmid zu bilden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß durch das Schneiden des rekombinanten
Plasmids ein etwa 3,0 kb großes Fragment, das den Replikationsorigin des zweiten Plasmids enthält, aus dem
rekombinanten Plasmid entfernt wird.
7. Rekombinantes Plasmid pDR 401 mit einer Größe von etwa 17,8 kb, das durch das Verfahren nach mindestens
einem der Ansprüche 1 bis 4 hergestellt wurde.
8. Deletiertes rekombinantes Plasmid pDR 412 mit. einer Größe von etwa 14,8 kb, das durch das Verfahren nach,
Anspruch 5 oder 6 hergestellt wurde.
9. Ein Plasmid pDR 401, dadurch gekennzeichnet,
daß es eine Größe von etwa 17,8 kb hat und durch das Restriktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größen
3,5 kb,. 6,2 kb bzw. 8,1 kb teilbar ist.
10. Ein Plasmid pDR '!12, dadurch gekennzeichnet,
daß es eine Größe von etwa 14,8 kb. hat und durch das Restriktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größen
3,5 kb, 5,1 kb bzw. 6.2 kb teilbar ist.
1
11. Plasniid pDR4O1 und Plasmid pDR4i2, im wesentlicher,
gekennzeichnet durch die vorliegende Be- ·
Schreibung mit Bezug auf die anliegende Zeichnung.
5 12.' Verfahren zum Herstellen eines Plasmid-Vektors, im
wesentlichen gekennzeichnet durch die vorliegen.de Beschreibung mit Bezug auf die anliegende
Zeichnung.
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