DE3418852A1 - Fluoreszierende redoxindikatoren und ihre anwendung in der cytodiagnostik - Google Patents
Fluoreszierende redoxindikatoren und ihre anwendung in der cytodiagnostikInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
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- C09B50/02—Tetrazolium dyes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Fluoreszierende Redoxindikatoren und ihre Anwendung in
der Cytodiagnostik
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Tetrazoliumsalze und die durch Reduktion daraus entstandenen fluoreszierenden
Formazane sowie die Verwendung dieser Tetrazoliumsalz-Formazan-lleaktion
zur Markierung von lebenden oder vorfixierten (Einzel-) Zellen und zum Nachweis der Redoxaktivität
(enzymatisch oder nicht enzymatisch) in biologischem
Material. Verbindungen vom Tetrazoliumsalztyp werden seit über hO Jahren auf dem Gebiet der Biochemie, der
Zytochemie und der Ilistochemie zum Nachweis der reduzierenden Eigenschaften biologischer Rodoxsysteme in Blutserum,
Zellen, Geweben, Tumoren und Bakterien eingesetzt. Durch die Reaktion wird die wasserlösliche, farblose, oxidierte Form,
das Tetrazoliumsalz, in die wasserunlösliche, tiefgefärbte reduzierte Form, das Formazan, überführt. Wegen der Irreversibilität
und der großen Empfindlichkeit dieser Reaktion wird dieses Redoxsystem häufig in bio-, cyto- und histochemischen
Untersuchungen eingesetzt. Eine neuere Übersicht über die Chemie und die Biochemie der Tetrazoliumsalze und
Formazane findet sich bei F. Wohlrab, E. Seidler und K.H.
Kunze, Ilisto- und Zytochemie dehydrierender Enzyme (Verlag
J.A. Barth, Leipzig, 1979).
Im Zusammenhang mit dem zellulären Sauerstoffmetabolismus
und damit gekoppelter Enzymsysteme sind Indikatorreaktionen mit fluoreszierenden Endprodukten von großem Interesse,,
Leider weisen die aus den bisher verwendeten Tetrazoliumsalzen entstehenden Formazane keine Fluoreszenz auf. Auf Grund der
freien Elektronenpaare am Stickstoff und der relativ flexiblen Struktur dieser Verbindungen ist eine ausreichende
B3O COPY
Lichtemission wenig wahrscheinlich. Für die Diagnostik sind automatisierbare Messungen von Einzelzellen günstig.
Dafür ist eine Fluoreszenzmarkierung eine unabdingbare Voraussetzung, da Absorptionsmessungen mit einem zu
großen Meßfehler behaftet sind.
Im Hinblick auf die oben beschriebene Situation bestand der Wunsch, über Tetrazoliumsalze zu verfügen, die durch
biologische Redoxsysteme reduziert ein fluoreszierendes Endprodukt bilden.
Gegenstand der Erfindung sind neue Tetrazoliumsalze der allgemeinen Formel I
NC-< I 2 ΑΘ
N=N ..y^
sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.
In dieser Formel sind X1A2 und γ±/γ2 gleich oder verschieden
mit der Ausnahme X oder Y=II (nur für X^Y)
und haben die Bedeutung von : C1-C^ -Alkyl, gegebenenfalls
substituiertes Aryl, C,-C.-Alkoxy, Hydroxy, Nitro, Halogen, Trifluorinethyl, Cyan, Carboxy (alkyl) CO R
(Ii = II, CH-, CpHe)· Das Anion A hat die Bedeutung:
Chlorid, Bromid, Jodid, Acetat, Tetrafluorborat. In der gesaraten Anmeldung sind unter Halogen "Fluor,
Chlor, Brom und Jod" unter C^C^-Alkyl "Methyl, Äthyl,
Propyl, Butyl und deren Isomere"zu verstehen (Analoges für Alkoxy)~Γ~
Wegen der guten Fluoreszenz ihrer Formazane bevorzugt sind folgende Tetrazoliumsalze der allgemeinen Formel I:
5-Cyan-2.3-di-p-tolyl-2H-tetrazoliumchlorid 5-Cyan-2.3-di-p-anisidyl-2H-tetrazoliumchlorid
5-Cyan-2.3-di-m-cyanphenyl-2II-tetrazoliumchlorid
Bevorzugtes Anion A in der allgemeinen Formel I ist Chlorid, da die Chloride gut wasserlöslich und Ileagenz-
. ιΓ
lösungen daher am schnellsten herstellbar sind.
Die gewünschte Fluoreszenz im festen Zustand zeigten überraschenderweise verschiedene 3-Cyan-1.5-diarylformazane
der allgemeinen Formel II,
die nach Reduktion der neuen 5-Cyan-2.3-diaryl-2II-tetrazoliumsalze
der allgemeinen Formel Ientstehen. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Tetrazoliumsalze
erfolgt nach Standardverfahren, wie sie in der Literatur vielfach beschrieben sind.
Am günstigsten werden die neuen Tetrazoliumsalze hergestellt,
indem man die 3-Cyan-1.5-diarylformazane der allgemeinen Formel II durch Kupplung aromatischer Diazoniumsalze
(erhältlich durch Diazotierung der entsprechenden Amine in bekannter Weise) mit Cyanacetamid, Cyanessigsäure
oder deren organische Ester bei 0 bis -5°C (Eis/ Kochsalz) gegebenenfalls in Gegenwart eines Lösungsmittels
umsetzt.
Zur Herstellung symmetrisch substituierter Formazane (X=Y) werden pro Mol cyan-CH-aktive Verbindung 2 Mol Diazoniumsalz
eingesetzt.
Asymmetrisch substituierte Formazane (ΧψΥ) erhält man
durch Verwendung je eines Mols zweier Diazoniumsalze, mit oder ohne Isolierung des Intermedlärhydrazons (s. DE OS 2460255).
Die Rohprodukte können nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umkristallisation, gereinigt werden,,
3-Cyan-l.5-diarylformazane (Diphenyl-3-formazancarbonitrile)
sind in verschiedenen Zusammenhängen hergestellt worden (US 3 910 877; US 3 592 584; US 3 52Il 107; DE OS
2 460 255; TH 1971, 4305-4316; Inorg. Chemo 1971, 313-317;
Zh. Org. Khim. 1971, 7,1932-7 (russ.), CA 76:3484r; Zh. Orgo Khirn» I966, 2, 708-10 (russo), CA 65:8800b. Von
den zugehörigen 5-Cyan-2.3-diaryl-2H-tetrazoliumsalzen
wurde·da-
EPO GOrT äJ - 5 -
gegen nur der unsubstituierte Grundkörpcr hergestellt
(X=Y=Il) A=Cl oder JJr und zur Kontrastierurig photographischer
Bilder verwendet (CA:90:P 79 112c; CA 91 :P 184 919q ).
Die Oxidation der gereinigten 3-Cyan-1.5-diarylformazane
erfolgt in an sich bekannter Weise durch Umsetzung mit N-Bromsuccinimid in einem organischen Lösungsmittel,
vorzugsweise Essigsäureethylester, zum Tetrazoliumbromid (A=Br) oder durch Reaktion mit Blei-(lV)-acctat in Gegenwart
eines Lösungsmittels, vorzugsweise Chloroform, zum Tetrazoliumchlorid (A=Cl). Weitere Standardverfahren
zur Herstellung der Tetrazoliumacetate (mit Isoamylnitrit) bzw. der Tetrafluorborate (mit Borfluorid-ätherat)
bzw. der Umwandlung Chlorid —> Bromid sind in der chemischen
Literatur beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die Verwendung der neuen Fluoreszenzredoxindikatoren in der cytologischen
Diagnostik sowie allgemein bei bio-, cyto- und histochemischen
Nachweisen der liedoxaktivitat (enzymatisch oder
nicht-enzymatisch) von biologischem Material. Hierbei ist vor allem die Möglichkeit von großem Interesse, auf Grund
der Fluoreszenzeigenschaft des Reaktionsproduktes automatisierbare
Meßverfahren zu verwenden. Als automatisierbare Meßverfahren seien genannt die Impulscytofluorometrie
(flow cytometry) und Messungen mit dem FACS (Fluorescence activated cell sorter).
Es wurde nun in der Tat gefunden, daß nach Inkubation von Zellen mit geeigneten Tetrazoliumsalzen der allgemeinen
Formel I die entstandene Formazanmenge pro Einzelzelle meßbar war. Korrelationen mit anderen Parametern, z.B. mit
dem DNA-Gehalt (markiert mit dem DNA-Farbstoff Hoechst 33258) wurden für Ehrlich Aseites-Tumorzellen (vgl. Abbol),
Hepatozyten, Leukozyten und Makrophagen gemessen. Zur Untersuchung verschiedener Redoxparameter können dem
Inkubationsmedium geeignete exogene Elektronenüberträger zugesetzt werden. Unter exogenen Elektronenüberträgern
sind Substanzen zu verstehen, die eingesetzt werden, weil
- 6 EPO COPY Λ
Elektronen nicht direkt vom reduzierten Coenzym NAD(P)H
auf Tetrazoliumsalze mit hohem Redoxpotential übertragen ; werden können. Genannt seien die Elektronenüberträger
Phenazinmethosulphat (PMS), 1-Methoxy-phenazinmethosulphat
(MPMS)9 Menadion (MEN), Methylenblau (MTB), Meldolablau
(MB) und 2.6-Diehlorindophenol (DCIP).
Zur Verstärkung des Formazanniederschlags können auch Cyanid
oder zelloberflächenaktive Substanzen vie Digitonin oder TPA verwendet werden. Auch Kombinationen der Tetrazoliumsalze mit
exogenen Elefctronenüberträgern, Cyanid und zelloberflächenaktiven
Substanzen werden zur Untersuchung spezieller Fragestellungen verwendet.
Da verschiedene Erkrankungen, z.B. chronisch inflammatorische
Prozesse, psychiatrische und toxikologische oder Autoimmun-Erkrankungen sowie die-Carcinogenese mit einer Störung des
oxidativen Stoffwechsels in Zusammenhang gebracht werden
und andererseits die neuen Redoxindikatoren es gestatten,
eine ausreichend große Anzahl von Zellen zu untersuchen, können die neuen erfindungsgemäßen Tetrazoliumsalze bei der
Früherkennung und der Verfolgung des Therapieerfolgs solcher Erkrankungen eine bedeutende Rolle spielen.
Durch die genannten und die folgenden Beispiele soll die Erfindung näher erläutert werden ohne sie zu begrenzen.
Synthese der Redoxfarbstoffe
2.3-di-p-tolyl-5-cyan-2H-te trazoliumsalze
a) 1.5-di-p-tolyl-3-cyanformazan (l.5-di-p-tolyl-3-formazancarbonitril)
29,5g (0,275^MoI) p-Toluidin werden in warmer Salzsäure
(52,5 ml) gelöst und 10,5 ml Wasser/Eismischung, in denen
21,0g (0,3 Mol) Natriumnitrit gelöst sind, zugegeben. 15,0g (0,175 Mol) Cyanessigsäure werden mit 37,5g Natriumhydroxid
und 120 ml Wasser gelöst und auf 0 C abgekühlt (Eis-Kochsalzinischung).
Zur Cyanessigsäure wird durch einen Tropftrichter innerhalb von 60 Minuten die filtrierte Lösung des Amins zugegeben.
Nach dem Absaugen des Niederschlages beträgt die . Ausbeute an Rohformazan 35g. Nach dem Umkristallisieren aus
,- EPO COPY
Ethanol-Dimethylformamid erhält man 29g (Gu^) reines Produkt
vom Schmelzpunkt 218-9°C. Eine weitere Umkristallisation
aus Chloroform erhöht den Schmelzpunkt bis auf 227°C (Lit. 216-2180C).
Elementaranalyse:
Elementaranalyse:
ber. C 69,30 Il 5,45 N 25,24
gef. C 69,46 η 5,52 N 25,25
b) 2. 3-di-p-tolyl-5-cyan~2II-tetrazoliumchlorid 5,57g (0,02 mmol) l.S-di-p-tolyl-c-cyanformazan werden in
75 ml Chloroform aufgeschlämmt. Dazu werden portionsweise "ι-' l6,5g Bleitetraacetat gegeben. Die weitgehend
entfärbte Lösung wird im Rotationsverdampfer eingeengt und das zurückbleibende rotbraune Öl mit Wasser versetzt. Nach
Ansäuern mit konz. Salzsäure wird das ausgefallene Bleichlorid abfiltriert und die hellgelbe Lösung dreimal mit
je 30 ml Chloroform extrahiert. Nach Einengen der organischen
Phase und Eingießen in trockenen Diäthyläther läßt man die Lösung über Nacht stehen (O C). Die weißen Kristalle
werden abgesaugt, mit Aceton gewaschen und mehrfach aus Ethanol/Äther umgefällt.
Ausbeute 2,5g (ΊΟ'/Ό).
Ausbeute 2,5g (ΊΟ'/Ό).
c) 2. 3-u"i-p-tolyl-5-cyan-2]I-tetrazole umbromid
2j 77g (0,01 mmol) 1.5-di-p-tolyl-3— eyanformazan werden
in 150 ml Ethylacetat aufgeschlämmt. Dazu tropft man
unter Rühren 2,0g (0,011 mmol) N-Bromsuccinimid in 80 ml Ethylacetat. Nach 1 Stunde wird das ausgefallene Tetrazoliumbromid
abgesaugt und mit Aceton gewaschen. Ausbeute !|5g (^5?e). Zur Herstellung eines reinen Produktes wird
mehrfach aus Ethanol/Ether umgefällt. "-\
Bereits die Rohprodukte sind nach dem Auswaschen mit Acetor
für Färbungen verwendbar. Da die Tetrazoliumsalze i" 3 ■
Lösungsmittel und Arbeitsweise unterschiedliche An1 . wasser, Ilalogenwasserstoffsäure und Alkohol bzw. Lösungsmittel
mitreißen (s. z.B. DE OS 26 49 170) ist die exakte Ermittlung
der Zusammensetzung des jeweiligen Salzes nur unter sehr großem Aufwand möglich. Dies zeigen auch Elementaranalysen,
- 8 EPO COPY
die je nach Reaktionsbedingungen unterschiedliche Ergebnisse liefern. Der Anteil an mitgerissenem V/asser bzw.
Lösungsmittel hat aber auf die Reduktion durch biologische Testsysteme keinerlei Einfluß. Die Tetrazoliumsalze wurden daher nach Reduktion mit Ascorbinsäure und anschlie-Bender Dünnschichtchromatographie (Laufmittel CH-Cl,*) des Formazane auf ihre Reinheit untersucht.
Lösungsmittel hat aber auf die Reduktion durch biologische Testsysteme keinerlei Einfluß. Die Tetrazoliumsalze wurden daher nach Reduktion mit Ascorbinsäure und anschlie-Bender Dünnschichtchromatographie (Laufmittel CH-Cl,*) des Formazane auf ihre Reinheit untersucht.
Beispiel 2
2.3-di-p-anisidyl-5-cyan-2H-tetrazoliumchlorid
2.3-di-p-anisidyl-5-cyan-2H-tetrazoliumchlorid
a) 1.5-di-p-anisidyl-3-cyanformazan
18,5g (0,15 Mol) p-Anisidin werden in 29 ml Salzsäure gelöst und 57 ml Wasser/Eismischung, in denen 11,5g Natriumnitrit
gelöst sind, zugegeben.
8,3g (0,1 Mol) Cyanessigsäure werden mit l6,5g Natriumhydroxid und 200 ml Wasser gelöst und auf 0 C abgekühlt
(Eis-Kochsalzmischung). Die Aufarbeitung erfolgt auf die gleiche Weise wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Ausbeute
an Rohformazan: 18-23g. Nach dem Umkristallisieren aus Aceton verbleiben 15g reines Formazan vom Schmp. 183-4°C.
Elementaranalyse:
ber. C 62,13 H 4,89 N 22,64
gef. C 61,87 H 4,94 N 22,55
gef. C 61,87 H 4,94 N 22,55
b) 2.3-di-p-anisidyl-5-cyan-2II-tetrazoliumclllorid
Synthese und Aufarbeitung wie für Ib) angegeben. Einwaagen: 3,09g (0,01 Mol) Formazan, 12g Blei-(lV)-acetat.
Synthese und Aufarbeitung wie für Ib) angegeben. Einwaagen: 3,09g (0,01 Mol) Formazan, 12g Blei-(lV)-acetat.
2lj Ausbeute: 30-50 <jo (1,1-1,7g).
2.3-di-m-cyanphenyl-5-cyan-2H-tetrazoliumchlorid
a) 1.5-di-m-cyanphenyl-3-cyanformazan
a) 1.5-di-m-cyanphenyl-3-cyanformazan
11,8g (0,10 Mol) m-Cyananilin werden in 40 ml warmer SaIz
säure gelöst und 30 ml Eis/Wassermischung, in denen 7>7g Natriumnitrit gelöst sind, zugegeben.
5,48g (0,05 Mol) Cyanessigsäure werden mit 2,2g Natriumhydroxid
und 80 ml Wasser gelöst und auf O0C abgekühlt.
Die Aufarbeitung erfolgt wie bei 1 und 2 beschrieben.
- 9 EPO COPY
Ao
Ausbeute on Jiohf ormozan: ca. 10-14r, noch dem limkri s t.nl 1 i·
Ki(UOIi erliaLl. niuu 7,5κ ruinös Produkt. (Schnip. Li5Ί—5 C).
| Elementaranalyse; | C | 64, | 21 | II | 3, | 03 | N | 32, | 76 |
| ber. | C | 64, | 04 | H | 3, | 30 | N | 32, | 43 |
| gef. | |||||||||
b) 2.3-di-p-cyanphenyl-5-cyan-21I-tetrazoliumehlorid
Einwaagen:
1J 53g (P»005 Mol) Formazan; 6g Blei te traacetat.
Ausbeute: 30-50'/« (0,4-0,7g).
Beispiel 4
2-p-anisidyl-3-phenyl-5-cyan-2H-tetrazoliumbromid
2-p-anisidyl-3-phenyl-5-cyan-2H-tetrazoliumbromid
a) l-p-anisidyl-5-phenyl-cyanformazan
Eine diazotierte Lösung von 9,3g (0,1 Mol) Anilin in 15 ml konz. Salzsäure und I50 ml Wasser wird langsam zu einer
Lösung von 17,8g (0,l6 Mol) Cyanessigsäureethylester und 15g Natriumacetat in 200 ml Wasser gegeben. Der gelbe Niederschlag
wird durch Absaugen isoliert und aus Methanol umkristalli— siert. Schmp. 86-8 C, Ausbeute 12,5g.
| Elementaranalyse: | C | 60, | 82 | JI | 5, | 10 | N | 19 | ,34 |
| ber. | C | 60, | 72 | II | 4, | 94 | N | 19 | ,61 |
| gef. | |||||||||
12,3g (0,1 Mol) p-Anisidin werden in 150 ml Salzsäure bei
O0C mit einer Lösung von 8,0g Natriumnitrit in 70 ml Wasser
diazotiert. Zu der filtrierten Lösung werden 50g kristallines Natriumacetat gegeben. Die so erhaltene Lösung wird zu
einer Lösung von 21,7g (0,1 Mol) des oben beschriebenen 2-Cyan-2-carboxyethyl-phenylhydrazons in 1 1 2,5% Natriumcarbonatlösung
gegeben. Nach 4-5 Stunden Rühren bei 0°C wird das rote Präzipitat abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
Nach der Umkristallisation aus Aceton erhielt man 9,8g reines Formazan.
b) 2-p-anisidyl-3-phenyl-5-cyan-2H-tetrazoliumbromid Aufarbeitung wie 1 a)
- 10 -
COPY
Einwaagen:
1,12g (O,004 Mol) Formazan; 0,80g (0,0045 Mol) N-Brom-
succinimid in 40 ml Essigsäureethylester.
Ausbeute: 0,55g (40$)
Lösen in Aceton und Zugabe von 100 ml trockenen Diethylethers.
In Tabelle I sind weitere zum Teil neue 3-Cyan-1.5-diarylformazane
mit ihren physikalisch-chemischen Kenndaten angegeben. In Tabelle II sind die Schmp. weiterer 2-Cyan-2-carboxyethyl-arylhydrazone,
die für die_Herstellung asymmetrisch substituierter 3-Cyan-formazane verwendet wurden,
angegeben»
- 11 EPO COPY ä
5
ο
P ο m P ο P ο m
P ο P ο ρ
ο m· P ο· m
ο m P 2 2 3 3 2
Χ1 -CH3
-CII3 -CH3
-ClI3O
-CIU0 -CII3O
-C2H5O
-C2H5O
-Cl -Cl -Cl •F •F
■Br •Br •CN •CN ■CN
-CF3 -CF3
-NO2 -NO2 -NO2
-CH, 2-CH^
-CH, -CIL •CIL-0 -CII3O
P P
-NO2 -CII3O H
H H II II 11 H II H H H H H II H H H H H II 11 II II II
-CH, -CIL
4-
CH3O
II
II
NC-
3-CII3 3-CII3 2-CII3O
P-CII3 P-CII3
II
II
| 0-CII3 | H |
| m-CH, | II |
| P-CII3 | II |
| 0-CII3O | H |
| Hi-ClI3O | 11 |
| P-CH3O | H |
| 0-C2H5O | H |
| P-C2H5O | H |
| o-Cl | H |
| m-Cl | H |
| p-Cl | H |
| o-F | II |
| p-F | II |
| o-Br | H |
| p-Br | II |
| o-CN | II |
| m-CN | II |
| p-CN | II |
| 0-CF3 | II |
| Di-CF3 | II |
| 0-NO2 | II |
| m-N02 | H |
| P-NO2 | H |
| 2-CIU | 4-CH |
II H II II Schmp.(0C) 138-9
188-9 225-7 148-9 154
183-4 143-4 I94
I5I-2 23I
257-8 I70-I 239-41 176-8 257
210-2 254-5 258-9 I6I-3 198-200 194-5
200-203 247-9 166-7 170
248
211
208-210 215-8 218-9 173-6
I6I-2
Summenf. Cl6Hl5N5
Il Il
C16II15N5O2
Il
ti
C18ni9N5°2
It
C14H9N5Cl2
it
ti
C14II9N5F2
ti
C14II9N5Br2
C16H9N7
Il Il
C16H9F6N4
C18H19N5
it
ti
C16H15N5O
C15II12N6O3
C15H13N5O
- 12 -
EPO COPY
CN
-N = C
| 5 xi | X2 | Schmp. | Summenf. | El | einen | ta | rana | lys | e | ber. |
| (°c) | C | H | N | gef. | ||||||
| II | Ii | 86-8 | CHNO | 60 | ,82 | 5 | ,10 | 19 | ,34 | ber. gef. |
| 11 11 3 | 60 | ,72 | 4 | ,94 | 19 | ,61 | ber. gef. |
|||
| P-CH 10 |
II | 78-80 | C12II13N3O2 | 62 62 |
,33 ,22 |
5
5 |
,67 ,66 |
18 18 |
,17 ,34 |
|
| P-CII3O | H | 79-80 | C12ni3N3°3 | 58 58 |
,29 ,03 |
5
5 |
,30 ,25 |
17 16 |
,00 ,88 |
|
| p-HO | H | 151 | C11H11N3O3 | - | ||||||
| p-CN | Il | I9O-3 | C12ni0N4°2 | |||||||
| 15 p-co2c0iir | H | 129 | C14H15°4N3 | |||||||
| p-C(CU3)3 | II | 57-9 | C15II19N3O2 | |||||||
| p-Cl | II | 126-8 | C11II10N3O2Cl | |||||||
| P-NO2 | II | 185-6 | CllH10N4°4 | |||||||
| 0-CII3 | II | 144-6 | C12H13N3O3 | |||||||
| 20 o-CN | H | 140-1 | C12H10N4°2 | |||||||
| 2-CIL-O | 4—CII-O | 159-I6O | C13H15N3O^ | |||||||
| 2-CII3 | 4—CII, | I7O-2 | C13II15N3O2 | |||||||
| 3-CH3 | 5-CII3 | 128-9 | ti | |||||||
- 13 -
Verwendung der neuen Redox-Fluoreszenzfarbstoffe für die
cytochemische Diagnostik
Die Zellen wurden sofort nach ihrer Gewinnung weiterbehandelt. Zur Fixierung wurden die Zellen 5 Minuten in
0,3% Glutaraldehyd in PBS-Puffer fixiert. Wurden Experimente
an vitalen Zellen durchgeführt, so erfolgte die Fixierung erst nach der Inkubation. Für die Messung mit einem
Impulscytofluorometer wurden die Zellen nach der Inkubation mit Ethanol nachfixiert (30 cjo Endkonzentration an
Alkohol).
Eine definierte Zellzahl (Leberzellen und Ascites 1 χ 10 ,
Makrophagen 0,5 x 10 , Vollblut 0,1 ml oder 3 χ 106 Leucozyten)
in 1 ml PBS Lösung wurden für 20 Minuten bei 37°C in einem Wasserbad inkubiert. Die einzelnen Proben enthielten
die folgenden Substanzen in verschiedenen Kombinationen:
Tetrazoliumsalz 1,0· 10""·^ M
Substrat 1,0 · ΙΟ""2 Μ
Substrat 1,0 · ΙΟ""2 Μ
Elektronenüberträger 0,1-0,3 · 10~^ M
Cyanid 3,0 · 10~"3 Μ
Digitonin und TPA (l2-0-Tetradecanoyl-phorbol-13-acetat) wurden in den in der Literatur zur Stimulation von Zellen
üblichen Konzentrationen verwendet. Die Inkubation wurde durch Eintauchen der Proben in ein Eisbad gestoppt. Ein
Teil der Proben wurde zur Messung eines zweiten Parameters mit dem DNA-Farbstoff Hoechst 33258 (10 M in PBS) und
255» Ethanol gefärbt. Zur Überprüfung der Färbung wurde ein
Tropfen der^ Zellsuspension auf einen Objektträger gegeben
und unter einenTDeckglas sofort durch ein Fluoreszenzmikroskop
betrachtet (Filter BG 3, dichromatischer Teilerspiegel TK 510, Sperrfilter OG 515, OG 590 oder HG 630).
Für die cytofluorometrisehen Messungen wurde der optische
Teil eines ICP 22 mit einem TK 483 und einem TK 580 ausgerüstet.
Die Grünkomponente des Fluoreszenzlichtes (Primärfluoreszenz) oder der langwellige Teil der DNA-Hoechst
Fluoreszenz wurde von einem Photomultiplier S 20 (Sperr-
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filter OG 515) und die ltotkomponente des Fluoreszenzlichtes
(Formazan-Fluoreszenz) mit einem Photomultiplier RCA Typ
4526 (Sperrfilter OG 590 oder UG 630) gemessen. Die Darstellung
der beiden Fluoreszenzlichtanteile erfolgte getrennt mit einem Vielkanalanalysator SA hl (inter-
technique) und in Kombination mit einem Speicheroszillographen (Tektronix).
In Abb. 1 ist ein solches zweiparametriges Diagramm (Hi-
In Abb. 1 ist ein solches zweiparametriges Diagramm (Hi-
stogramm) für eine Tumorzellpopulation angegeben. (Redoxmediator: 1-Methoxy-phenazinmethosulphat, Redoxfarbstoff:
5-cyan-2.3-di-p-tolyl- 211 -tetrazoliumchlorid, DNA Farbstoff: Hoechst 33258, Zellen 5 Min. mit Glutaraldehyd vorfixiert)
.
Analoge Histogramme wurden für Blutzellen, für Makrophagen und Mäusehepatocyten erhalten,
- 15 -
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- Leerseite
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Claims (1)
- Dr.K.Severin - .... .;. -..-. -Büchnerstr.20 341 9MünsterPATENTANSPRÜCHE1-· 5-Cyan-2o3—diaryl—2H—tetrnzoliumsalze der allgemeinen Formel IN-H-NC-< I - λ N=N. -" MI @ v^y2 worin X./X9 und Y /Y9, die gleich oder verschieden sein können, mit der Ausnahme,wenn X oder Y=H nur X φ Y, die Bedeutung von C -C,-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl, C -C.-Alkoxy, Nitro, Halogen, Hydroxy, Trifluorniethyl, Cyan, Carboxy(alkyl) CO9R (R=H,CH,,C9H ) haben .können und das Anion A die;Bedeutung Chlorid, Bromid, Jodid, Acetat oder Tetrafluoroborat haben.kann.2. Verfahren zur Herstellung der Tetrazoliumsalze gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 3-Cyan-1.5-diarylformazane der allgemeinen Formel IIin aussieh bekannter Weise durch Kuppeln zwischen gegebenenfalls mit X./Xo und Y./Y0 substituierten Diazoniumsalzen, worin X./X9 bzw. Y /Y0 die gleiche Bedeutung haben wie in Anspruch I, und aktiven Methylenverbindungen mit einer Cyanogruppe und einer Carboxy-, Carboalkoxy— oder Carboamidogruppe hergestellt und zu Tetrazoliumsalzen der allgemeinen Formel 1 in an sich bekannter Weise durch Zutropfen von N-Bromsuccinimid in Essigester zum Tetrazoliumbromid (A=Br) oder durch Oxidation mit Blei—(IV)-acetat in Gegenwart eines Lösungsmittels zum Tetrazolium-Chlorid (A=Cl) umgesetzt we^|^as=i^__^3· 5-Cyan-2.3-di-p-tolyl-2]I-tetrazoliurnchlorid k. 5-Cyan-2. 3-di-p-anisidyl-2]J-tetrazoliumchlorid5. 5-Cyan-2.3-di-m-cyanphenyl-2JI-tetrazoliumchlorid6. Verwendung von Tetruzoliumsalzen gemäß Anspruch 1 einschließlich X=Y=II bzw. ΧφΥ, X=U oder Y=II zur Lokalisation und zur bestimmung der Redoxaktivität von Enzymen sowie zur Untersuchung des oxidativen Metabolismus von Phagocyten gekennzeichnet dadurch, daß die Fluoreszenz des nach biologischer Reduktion der Tetrazoliumsalze entstandenen Formazanniederschlags ein Maß für die Redoxaktivität darstellt.7. Verwendung von Tetrazoliumsalzen gemäß Anspruch 6 für automatisierbare Verfahren in der klinisch-cytologischen Diagnostik von Zellen dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz des entstandenen Formazane als einziger Parameteroder neben anderen fluorimetrischen (DNA-Gehalt, Proteingehalt,pH) und physikalischen Parametern (Zellvolumen) gemessen wird.8. Verwendung von Tetrazoliumsalzen gemäß Anspruch 6 für bio-, cyto- und histochemische Färbungs- und Nachweisreaktionen in Geweben, Zellen und Serum, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende(Redox)-Aktivitat auf Grund der Fluoreszenz des Formazans mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops sichtbar gemacht oder gemessen wird.9. Verwendung von Tetrazoliumsalzen nach Anspruch 7 und 8, gekennzeichnet dadurch, iluß zur Erfassung der Redox-Aktivität von Einzelzellen (enzymatisch odor nichtenzyniatisch, iiit-rajzellulär oder auf der Zelloberfläche lokali— siert) und von biologischem Material neben den Tetrazoliumsalzen der allgemeinen Formel I auch exogeneElektronenüberträger (Cyanid und/oder zelloberflächenaktive Substanzen wie Digitonin oder Phorbolmyristinacetat = TPA) eingesetzt werden.10. Verfahren nach Anspruch 6-9 dadurch gekennzeichnet, daß sowohl frische ( lebende) als auch (vor)fixierte Zellen und Gewebe auf ihre Redoxeigenschaften untersucht werden.EPO COPY Λ '
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843418852 DE3418852A1 (de) | 1984-05-21 | 1984-05-21 | Fluoreszierende redoxindikatoren und ihre anwendung in der cytodiagnostik |
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| DE19843418852 DE3418852A1 (de) | 1984-05-21 | 1984-05-21 | Fluoreszierende redoxindikatoren und ihre anwendung in der cytodiagnostik |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3418852A1 true DE3418852A1 (de) | 1985-11-21 |
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ID=6236440
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|---|---|---|---|
| DE19843418852 Withdrawn DE3418852A1 (de) | 1984-05-21 | 1984-05-21 | Fluoreszierende redoxindikatoren und ihre anwendung in der cytodiagnostik |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE3418852A1 (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0287853A3 (en) * | 1987-04-23 | 1990-07-18 | Industria Chimica Profarmaco S.P.A. | A process for the preparation of 1-alkyl-3-carboxy-4-cinnolones. |
| EP0546687A3 (en) * | 1991-11-14 | 1993-10-13 | Eli Lilly And Company | Formazan parasiticides |
| CN120741427A (zh) * | 2025-09-01 | 2025-10-03 | 安徽建筑大学 | 用于异化铁还原菌电子转移的光谱表征方法、系统及应用 |
-
1984
- 1984-05-21 DE DE19843418852 patent/DE3418852A1/de not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0287853A3 (en) * | 1987-04-23 | 1990-07-18 | Industria Chimica Profarmaco S.P.A. | A process for the preparation of 1-alkyl-3-carboxy-4-cinnolones. |
| EP0546687A3 (en) * | 1991-11-14 | 1993-10-13 | Eli Lilly And Company | Formazan parasiticides |
| US5340804A (en) * | 1991-11-14 | 1994-08-23 | Eli Lilly And Company | 1,5-diphenyl-3-formazancarbonitril parasiticides |
| CN120741427A (zh) * | 2025-09-01 | 2025-10-03 | 安徽建筑大学 | 用于异化铁还原菌电子转移的光谱表征方法、系统及应用 |
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