DE3408502A1

DE3408502A1 - Verfahren zur schnellanalyse

Info

Publication number: DE3408502A1
Application number: DE3408502A
Authority: DE
Inventors: Nobuhiko Tokio/Tokyo Arakawa; Kenichi Ageo Saitama Numazawa; Minoru Ohashi; Osamu Kawagoe Saitama Oka; Yoshio Saitama Utugi
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 1983-03-08
Filing date: 1984-03-08
Publication date: 1984-09-20
Also published as: DE3408502C2; JPH0366614B2; US4725539A; JPS59163555A

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft "ein Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren Bestandteilen und insbesondere ein Verfahren zur bio-elektröchemisehen Analyse von biologischen Substanzen oder Nahrungsmittelsubstanzen, wie Aminosäuren, Nukleinsäuren, Sacchariden, Lipiden oder dergleichen.

Als eine typische konventionelle Methode zur analytischen Trennung von Aminosäuren, Nukleinsäuren, Sacchariden, Lipoiden, Vitaminen oder dergleichen, wurde bisher die chromatographische Methode angewendet. Diese übliche Methode ist jedoch mit Nachteilen behaftet, die darin bestehen, daß eine lange Zeit erforderlich ist, um die einzelnen Bestandteile voneinander zu trennen und daß zahlreiche Reagentien benötigt werden und zur Durchführung der Analyse große Geschicklichkeit erforderlich ist. Ein weiterer Nachteil der üblichen Methode besteht darin, daß die zur Durchführung des Analyseverfahrens erforderliche Vorrichtung komplizierten Aufbau hat und ihre Herstellung entsprechend teuer ist.

In den letzten Jahren wurde ein verbessertes Verfahren vorgeschlagen, welches die rasche und selektive Bestimmung nur eines spezifischen Bestandteils unter zahlreichen weiteren in einfacher Weise mit Hilfe eines elektrochemischen Sensors, wie einer Sauerstoffelektrode, Wasserstoffperoxidelektrode,mit biologischen Katalysatoren, wie Enzymen, bzw. einer biologischen Zelle oder dergleichen ermöglicht (Koteikakoso, Immobilized Enzymes (1977), herausgegeben von Ichiro Chibata und veröffentlicht von Kodansha Scientific Co., Ltd.). Es wurde jedoch festgestellt, daß dieses verbesserte Verfahren nicht die gleichzeitige Analyse von mehreren Bestandteilen ermöglicht.

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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die vorstehend erläuterten Nachteile zu beseitigen und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die gleichzeitige Analyse von mehreren Bestandteilen rasch und in einfacher Weise ermöglicht.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren in einem flüssigen System vorhandenen Bestandteilen, das durch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet ist :

Einfüllen der zu analysierenden Flüssigkeit und einer pH-Pufferlösung in eine Reaktionszelle, die gegenüber dem Zutritt von Außenluft abgedichtet ist, aufeinanderfolgende Zugabe von mehreren biologischen Katalysatoren, welche die Aufnahme und Reaktion von ge— löstem Sauerstoff induzieren,

wobei die in dem flüssigen System vorliegenden mehreren Bestandteile nacheinander stufenweise selektiv oxidiert werden,

automatische Messung des gelösten Sauerstoffes und Aufzeichnung des Oxidationsverfahrens mit Hilfe eines Sensors, wobei eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff erhalten wird, qualitative Bestimmung jedes der Bestandteile durch die jeweilige Art des zugesetzten biologischen Katalysators und die Reihenfolge der Zugabe der biologischen Katalysatoren, und

quantitative Bestimmung jedes Bestandteils aufgrund der Verminderung der Menge des gelösten Sauerstoffes.

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Um zu gewährleisten, daß das erfindungsgemäße Verfahren in zufriedenstellender Weise durchgeführt werden kann, ist es notwendig, ^eine Vorrichtung vorzusehen, welche die kontinuierliche Messung von gelöstem Sauerstoff und die Aufzeichnung des erhaltenen Meßwertes ermöglicht. Als Sensor, der für diese Vorrichtung erforderlich ist, können übliche Sensoren angewendet werden, wie eine polarographische Membran-überzogene Sauerstoffelektrode, eine sogenannte Clark-Elektrode, eine Elektrode für gelösten Sauerstoff vom Typ einer galvanischen Zelle, eine Sauerstoffelektrode auf Basis des Sauerstoffdruckausgleichs, die kürzlich von Connery entwickelt wurde, oder ähnliche Sensoren.

Es ist darüber hinaus notwendig, daß eine Reaktionszelle vorgesehen wird, in der ein Sensor für gelösten Sauerstoff angeordnet oder befestigt ist, mit dessen Hilfe jede Änderung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Reaktionsflüssigkeit exakt gemessen werden kann, ohne daß Sauerstoff von außen zutreten kann, und in die Reagentien, Katalysatoren und andere Materialien, wie sie zur Kontrolle der Reaktion erforderlich sind, zugeführt werden können.

Andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen deutlicher ersichtlich.

Nachstehend sollen die beigefügten Zeichnungen kurz beschrieben werden.

Fig. 1 ist eine schematische Schnittdarstellung einer Reaktionszelle zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;

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— D "· .

^ Fig. 2 zeigt eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff, die während der Analyse von Xanthin (X) und Hypoxanthin (Hx) ausgebildet wird;

Fig. 3 zeigt die Kurve ,"'welche den Zusammenhang zwischen dem Verhältnis von Xanthin-"und Hypoxanthin-Konzentration und" dem Verhältnis der Verminderung Cd₁Zd₂) des Ausgangsstroms wiedergibt, die bei der oxidativen Reaktion in zwei Stufen mit Hilfe von Xanthinoxidase und Uricase erhalten wird, und

Fig. 4 ist eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff während einer oxidativen Reaktion, die aus drei Stufen besteht, während der Analyse einer Mischflüssigkeit, die Inosinsäure, Inosin und Hypoxanthin enthält.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend bevorzugte Ausführungsformen im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen erläutert.

Fig. 1 veranschaulicht schematisch ein Beispiel für eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese Vorrichtung umfaßt eine Reaktionszelle 1 mit einem Fassungsvermögen von etwa 2 ml mit einem Sensor für gelösten Sauerstoff (nachstehend einfach als DO-Sensor bezeichnet), der fest an einer Seitenwand dieser Reaktionszelle 1 angebracht ist. Der obere Teil der Reaktionszelle 1 ist luftdicht mit einem Stopfen 4 verschlossen, durch den sich eine feine Bohrung 3 erstreckt, so daß der Zutritt von Luftsauerstoff von außen in die Reaktionszelle 1 verhindert wird. Ein gewünschtes Volumen eines Mittels zum Regeln der Reaktion kann daher durch diese feine Bohrung 3 mit Hilfe einer Mikroinjektionsspritze oder einer ähnlichen Vorrichtung in die Reaktionszelle 1

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eingefüllt werden. Die Reaktionstemperatur wird durch Leiten von Wasser 6 durch den Mantel 5 geregelt und bei konstanter Temperatur gehalten und die Reaktionsflüssigkeit wird mit Hilfe eines Magnetrührers 7 gut gemischt und gerührt. Die Erfindung ist selbstverständlich nicht auf die Anwendung der beschriebenen spezifischen Reaktionsvorrichtung beschränkt und es ist ersichtlich, daß diese Vorrichtung in jeder beliebigen geeigneten Weise verändert oder modifiziert werden kann.

Als biologischer Katalysator für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich Hydrolasen, wie Invertase, Amylase oder dergleichen, und Oxidasen, wie Glucoseoxidase (nachstehend als GOD bezeichnet) oder dergleichen für die Analyse von Sacchariden; während Proteasen, Peptidasen und Aminosäureoxidasen zur Analyse von Proteinen und Aminosäuren geeignet sind und Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase zur Analyse von Cholesterin verwendbar sind. Außerdem eignen sich Nukleotidase, Nukleosidphosphorylase, Xanthinoxidase oder dergleichen zur Bestimmung von Nukleinsäuren bzw. verwandten Substanzen, beispielsweise Inosinsäure, die durch Zersetzung von Adenosintriphosphat gebildet wird.

Es ist festzuhalten, daß eine Dehydrogenase, bei der keine Sauerstoffaufnahmereaktion eintritt, beispielsweise Milchsäuredehydrogenase, Alkoholdehydrogenase oder dergleichen, zur analytischen Bestimmung von Milchsäure, Alkohol oder dergleichen in Gegenwart eines Coenzyms und einer Hilfssubstanz, wie Phenazinmethasulfat oder dergleichen, die als Wasserstoffübertragungsmittel dienen, anwendbar ist. In einigen Fällen kann die biologische Zelle für die oben genannten Zwecke anwendbar sein.

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^' Verfahren zur Analyse von mehreren nebeneinander vorliegenden Bestandteilen mit höchster Wirksamkeit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können in verschiedener Weise durchgeführt werden. Als vorbereitende Stufe vor der Durchführung des Analyseverfahrens ist es empfehlenswert/ daß die Reaktions-Charakteristika, die einer einzigen Substanz unter diesen Bestandteilen zukommen, vorher unter Bezugnahme auf eine Standardprobe geprüft werden, vorausgesetzt, daß die Existenz dieser Substanz bekannt ist. So werden beispielsweise die Bedingungen, unter denen eine gewünschte Oxidationsreaktion rasch abläuft, im Vergleich mit der Neigung der Sauerstoffaufnahmekurve bestätigt, während die Menge des Enzyms,.der pH-Wert der Reaktionslösung, die Zusammensetzung der Pufferlösung, die Temperatur und andere Parameter variiert werden.

Die qualitative Analyse kann durchgeführt werden, indem festgestellt wird, welche Oxidase und welcher zugehörige Biokatalysator unter den nacheinander für verschiedene Substanzen, deren Vorliegen erwartet wird, zugesetzten für das Eintreten eines Sauerstoff-Verbrauches verantwortlich ist, wobei während dieser Bestimmung gleichzeitig beobachtet wird, ob die Kurve für die Sauerstoffaufnahme weiter abfällt oder nicht.

Da das Ausmaß der Verminderung des Ausgangssignals, welches durch Messung an -zwei verschiedenen Zeitwerten erhalten wird, der Konzentration einer Substanz entspricht, welche auf die Funktion des zugesetzten Katalysators anspricht, wobei einer dieser Zeitwerte sich vor der Zugabe dieses Katalysators und der andere sich an der Stelle befindet, an der die Sauerstoffaufnahmereaktion (aufgrund der Reduktion von gelöstem Sauerstoff) ihr Ende erreicht, können sowohl die quantitative, als auch die qualitative

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Analyse gleichzeitig durchgeführt werden.

Es ist festzuhalten, daß das Ausmaß der Verminderung des AusgangssignaIs in- den Wert des gelösten Sauerstoffes umgerechnet werden kann, indem die Sauerstofflöslichkeit bei der Meßtemperatur mit Hilfe einer Tabelle festgestellt wird (beispielsweise nach dem Abschnitt "gelöster Sauerstoff" in "Prüfmethode für Industriewasser (JIS K 0101)" und "Prüfmethode für Abwasser (JIS K 0102)", nachdem eine bestimmte, mit Luft gesättigte Pufferlösung in die Reaktionszelle eingefüllt worden ist und das Ausgangssignal des Sensors gemessen wurde. Somit kann die Menge des SauerstoffVerbrauches, bezogen auf die Einheitsmenge einer Standardprobe, erhalten werden, indem die bekannte Konzentration der Standardprobe mit dem Wert der Verminderung des gelösten Sauerstoffes verglichen wird. Es ist daher möglich, die Konzentration der Substanz unmittelbar aus der Menge des verbrauchten Sauerstoffes zu errechnen, ohne daß eine Standardlösung angewendet werden muß.

Es ist zu bemerken, daß Substanzen, für die keine Verminderung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff festzustellen ist, beispielsweise Saccharose, nicht der Einwirkung von Glucoseoxidase unterliegt, wenn nicht eine vorhergehende Reaktion durchgeführt wird. Es wird daher eine solche vorhergehende Reaktion ausgewählt, in der Invertase, die eine Hydrolase darstellt, die Saccharose in die reaktive Verbindung Glucose umwandelt, welche dann oxidiert werden kann.
Danach wird die Lösung des Reaktionsgemisches aus Glucose und Saccharose mit Enzymen gemäß der Reihenfolge Glucoseoxidase ■* Invertase versetzt, wobei eine stufenweise abfallende Kurve des gelösten Sauerstoffes erhalten wird,

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die zwei Stufen aufweist.

Die Konzentration an Glucose kann daher aus dem Abfall über die erste Stufe hinweg erhalten werden, während die Konzentration an Saccharose aus dem Abfall über die zweite Stufe erhalten wird. Die vorstehend beschriebene vorhergehende Reaktion kann unter Anwendung von zwei Stufen oder drei.JStufen oder auch von mehr Stufen entsprechend dem Erfordernis durchgeführt werden, wobei Hydrolase, Transferenzym (Transferase) oder dergleichen angewendet wird.

Für die vorhergehende Reaktion kann darüber hinaus eine Vielzahl von Oxidasen angewendet werden. Durch eine geeignete Kombination der vorstehend beschriebenen Reaktionen wird daher ermöglicht, zahlreiche Substanzen qualitativ oder quantitativ zu bestimmen.

Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher anhand einiger Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Analyse einer Mischlösung aus Hypoxanthin (nachstehend als Hx bezeichnet) und Xanthin(nachstehend auch als X bezeichnet)

1. Grundlegende Reaktionen für die Analyse

9 cn 9 „

S¹S XO V^ 29„

„Vif r\

H₂O, H₂O-K)₁ H₂O₂

Hx X

(Hypoxanthin) (Xanthin)

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'S go

2H₂O-K)₂ H₂O

(Harnsäure) (Allantoin)

In den vorstehenden Reaktionen bedeutet das Symbol XO Xanthinoxidase und das Symbol UO üricase.

2. Angewendete Vorrichtung und Materialien

(1) DO-Sensor : Clark-Elektrode mit einer Platinkathode

mit einem Durchmesser von 3 mm, überzogen mit einem FEP-FiIm einer Dicke von 0,025 mm (1/1000 Inch) (Produkt der

Oriental Electric Co., Ltd.). Wenn der Sensor in Betrieb ist, wird Gleichstrom von 0,7 Volt angelegt.

(2) Aufzeichnungsvorrichtung : Hergestellt von Shimazu Manufacturing Co., Ltd. Die Vorrichtung

hat eine vollständige Skala entsprechend 100 mV und ist für den Betrieb bei einer Aufzeichnungsgeschwindigkeit von 1 cm/min bestimmt.

(3) Reaktionszelle : Fassungsvermögen 2000 μΐ, wird bei

konstanter Temperatur von 37°C gehalten.

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(4) Enzym : XO wurde in einer Menge von 0,4 I.E./ml

~£n~Form einer 3,2 m Ammoniumsulfatsuspension angewendet (hergestellt von Boehringer AG, Mannheim). Außerdem wurde UO in einer Menge von 0,41 I.E./ml in Form einer 50 mM Bor

säure-Pufferlösung eingesetzt (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.)

(5) Pufferlösung : Hergestellt in Form einer 1/15 m

Phosphatpufferlösung (pH 7,6), die mit Luft bei einer Temperatur von 37⁰C ge

sättigt war (P.B.S.). Sie hatte eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 0,214 μΜοΙ/ml ( bei einer Temperatur von 37°C).

(6) Zu prüfende Flüssigkeit :

Hx : 10 μΜοΙ (1,36 mg)/ml X : 10 μΜοΙ (1,52 mg)/ml Hx, X : Mischlösung aus beiden Substanzen

3. Verfahren (vgl. Fig. 2 und 3)

Ein Volumen von beträchtlich mehr als 2000 μΐ der Phosphatpufferlösung (P.B.S.) wurde in die in Fig. 1 veranschaulichte Reaktionszelle eingefüllt und die Zelle mit einem Stopfen verschlossen.
Die Lösung wurde bis zu einer solchen Höhe eingefüllt, daß ein Teil der Lösung bis zu dem unteren Ende der feinen Bohrung 3 hochstieg. Dann wurde die zu prüfende X und Hx enthaltende Flüssigkeit (ein Volumen von 5 μΐ bzw. 1O μΐ) in eine Mikroinjektionsspritze gefüllt und unter Rühren durch die feine Bohrung 3 in die Reaktionszelle eingespritzt. Danach wurde XO in einer Menge von 20 μΐ in die

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Reaktionszelle eingespritzt und danach, nachdem durch Beobachtung des Ausgangssignals des DO-Sensors, bezeichnet mit Bezugszeichen d.. in Fig. 2 bestätigt worden war, daß die Verminderung des Ausgangssignals des Sensors ein Ende erreichte, wurde UO in einer Menge von 20 μΐ sofort zugesetzt, wobei eine aus zwei Stufen bestehende,stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff erhalten wurde, wie sie in Fig. 2 dargestellt ist.

Fig. 3 veranschaulicht schematisch den Zusammenhang zwischen der Zusammensetzung einer Einheit der Flüssigkeit zu der Mischlösung und dem Verhältnis des Abfalls, d../d₂. Wie aus der Zeichnung ersichtlich ist, besteht eine lineare Abhängigkeit des Abfalls-Verhältnisses d₁/d₀ von dem Mischungsverhältnis der Bestandteile in der Mischlösung, da die charakteristische Kurve sich linear durch zwei Punkte erstreckt, wobei einer dieser Punkte dem Wert d₁/d_ = 1, erhalten, mit 100 % X, und der andere dem Wert d../d₂ = 2, erhalten mit 100 % Hx. entspricht.

Bei der Prüfung des Zusammenhangs zwischen der Verminderung des Werts an gelöstem Sauerstoff und der Konzentration des Substrats wurde gefunden, daß das Volumen an Sauerstoff 0~/ angegeben in Mol, das durch die Zugabe von UO adsorbiert wurde, dem gleichen Wert der Konzentration des Substrats im Hinblick auf X oder auf Hx entsprach.

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TABELLE 1

Zusammenhang zwischen der Konzentration an X und Hx und dem Volumen des verbrauchten Sauerstoffes O„

Zusammensetzung des zu analy sierenden Substrats in μΜοΙ/ml	Konzentration C während der Reaktion	Volumen des ab sorbierten Sauerstoffes O^ in μΜοΙ/ml
Substanz	0,05	0,054
X	0,25	0,028
Hx

Die molare Konzentration von (Hx + X) ist daher aus dem Wert d₂ der Mischlösung aus X und Hx erhältlich und ihr Volumenverhältnis ist darüber hinaus unter Bezugnahme auf Fig. 3 erhältlich. Im Ergebnis kann die Konzentration jeder der Substanzen bestimmt werden.

Jede der Substanzen ist ein Stoffwechsel-Zwischenprodukt, das im Körper von Säugetieren und Menschen nach der Zer-r setzung von Adenosintriphosphat in Form von Harnsäure ausgeschieden wird. Die Aufstellung einer Methode zur Trennung und quantitativen Bestimmung dieser Substanzen liefert daher einen wichtigen Beitrag für die biochemische Industrie, Nahrungsmittelindustrie und verwandte Industrien. Wie gut bekannt ist, kann mit Hilfe der bisher üblichen Methoden, einschließlich der chromatographischen Methode und der üblichen enzymatischen Methode (die normalerweise durch optische Erfassung und Bestimmung durchgeführt wird) ihre fraktionierte quantitative Bestimmung nur mit großen Schwierigkeiten bewerkstelligt werden. Wie aus Fig. 2 klar

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ersichtlich ist, wird es jedoch mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht, jede dieser Substanzen mit hoher Genauigkeit innerhalb kurzer Dauer von weniger als 5 Minuten quantitativ zu bestimmen, ohne daß eine Standardflüssigkeit erforderlich ist.

Beispiel 2

Quantitative Bestimmung der durch Zersetzung von Adenosintriphosphat erhaltenen Substanzen.

In diesem Beispiel wird die fraktionierte quantitative Bestimmung von Inosinsäure (nachstehend als IMP bezeichnet) , Inosin (nachstehend als HxR bezeichnet) und Hypoxanthin (nachstehend als Hx bezeichnet) beschrieben.

1. Grundlegende Reaktionen für die Analyse

Rib-l-p (IMP) ( HxR )

O₂ H₂O₂ O₂ H₂O₂

darin bedeuten die Bezugszexchen AP Alkaliphosphatase,
NP Nukleosid-Phosphorylase,
UA Harnsäure,

Rib Ribose, und COPY

Pi anorganisches Phosphat.

2. Angewendete Vorrichtung und Materialien

(1) DO-Sensor

(2) Aufzeichnungsvorrichtung (Recorder) _5 (3) Reaktionszelle

In diesem Beispiel werden die gleichen Vorrichtungen (1) bis (3) wie in Beispiel 1 unter den gleichen Betriebsbedingungen eingesetzt.

(4) Enzym

AP wurde in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfat-Suspension zubereitet und in einer Menge von 65 I.E./ml (bei einer Temperatur von 37⁰C) angewendet.

NP wurde in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfat-Suspension gebracht und in einer Rate von 20 I.E./ml (bei einer Temperatur von 25⁰C) angewendet.

XO wurde in Form einer 3,2 m Ammoniumsulfat-Suspension zubereitet und in einer Menge von 0,4 I.E./ml ange-. wendet.

Jedes der vorstehend genannten Enzyme wurde in Form eines Produkts der Boehringer Mannheim AG eingesetzt.

(5) Pufferlösung

Als Flüssigkeit A wurde eine 1/15 m Glycin-NaOH-Pufferlösung mit einem pH von 10,5 hergestellt. Außerdem wurden 2 μΐ einer 0,1 m ZnClj-Lösung und 2 μΐ einer 0,1 m MgCl₂" Lösung in 2 ml der vorstehend genannten Flüssigkeit A gegeben.

Als Flüssigkeit B wurde eine 1/15 m Phosphatpufferlösung in gleicher Weise wie in dem vorhergehenden Beispiel hergestellt.

(6) Zu prüfende Flüssigkeit

Ein Volumen von 4 μΐ einer Mischlösung (10 μΜοΙ/ml), die IMP, HxR und Hx in Form eines Gemisches gleicher Volumteile enthielt/ wurde zur Durchführung dieses Versuches verwendet. .

3. Verfahrensschritte (vgl. Fig. 4)

Das Verfahren kann unter Einhaltung verschiedener Verfahrensschritte durchgeführt werden. Anhand des nachstehenden FließSchemas wird eine typische einfache Verfahrensweise beschrieben, die unter Anwendung einer möglichst geringen Menge an Enzym durchgeführt wird.

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zuprüfende Flüssigkeit Flüssigkeit A	,,,	4 19	μΐ μΐ
AP	1	μΐ

	Einspritzen des Gemisches in die Reaktionszelle

Halten bei einer Temperatur von 37⁰C während etwa 3 Minuten (pH 10/5)

Einfüllen von Phosphatpufferlösung (Flüssigkeit B) in die Reaktionszelle (pH 7,6)

Einspritzen von 20 μΐ XO (Messung von d₁)

Einspritzen von 8 μΐ NP (Messung von d_?)

Eingießen von 4 μΐ der zu prüfenden Flüssigkeit (Messung von d₃)

Errechnung der Konzentration

^HX " ^CIMP

^CHxR

X 0,107 (μ + d₂ -

(3)

X 0,107 ( " ) (4)

χ 0/107

(5)

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Darin bedeuten das Symbol d_Q die Aufzeichnungsbreite (mm), die dem Ausgangssignal für mit Luft gesättigtes Wasser entspricht, und die Symbole C , C__Mp und C_HxR die entsprechenden Konzentrationen (μΜοΙ/ml) von Hx, IMP und · HxR.

Das Prinzip, nach dem die Konzentration jeder der Substanzen durch die vorstehend angegebenen Berechnungen erhalten werden kann, ist für den Fachmann auf diesem Gebiet aufgrund der Reaktionsformel (2) leicht verständlich. Im Hinblick auf die Tatsache, daß jede der Substanzen Sauerstoff O₂ in einer Menge von 2 Mol pro 1 Mol der ersteren absorbiert, wurde ein Koeffizient von 0,214/2 = 0,107 für die Berechnungen angewendet. Da IMP und HxR in Gegenwart von XO Sauerstoff nicht absorbieren, ist ersichtlich, daß C„ mit Hilfe von Gleichung (3)

nX

erhalten werden kann. Danach kann aufgrund der Reaktion entsprechend dem Wert d₂ ^citmp+HxR1 erhalten werden, weil Hx durch Zugabe von XO beseitigt worden ist. Daraus ergibt sich, daß (d.. + d₂) der Molzahl aller Substanzen entspricht. Was die d_ entsprechende Reaktion betrifft, ist die anfänglich zugesetzte Substanz verschwunden und da der pH neutral ist, kann AP seine Aktivität nicht ausüben. Daher können alle Substanzen mit Ausnahme von IMP nachgewiesen werden. Die Konzentration von IMP kann daher mit Hilfe von Gleichung (4) aus der Differenz zwischen (d.. + d₂) und d₃ erhalten werden. Für die Berechnung von C„ _ ist somit keine spezielle

XlXK

Beschreibung erforderlich.

Die Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nachstehend zusammengefaßt.

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(1) Die Vorbehandlung der Proben ist leicht durchzuführen, ohne daß Einflüsse durch die Färbung, Trübung, UV-Absorption und andere Eigenschaften der Flüssigkeit geprüft werden müssen. (2) Die Messungen sind sehr rasch durchzuführen.

(3) Ausgezeichnet hohe Spezifität ist gewährleistet.

(4) Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens kann sehr einfach gestaltet werden.

(5) Die Messungen können bei niederen Konzentrationen im Bereich von O,OO5^bis 0,1 μΜοΙ/ml mit ausgezeichnet hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden.

(6) Die Menge des verbrauchten Enzyms kann durch Anwendung einer kleinen Reaktionszelle bei einem geringen Wert gehalten werden. Wie in Beispiel 2 beschrieben ist, kann einmal zugesetztes Enzym wiederholt verwendet werden {so kann beispielsweise XO dreimal und MP zweimal verwendet werden).

(7) Alle Verfahrensschritte werden bei Raumtemperatur mit hoher Sicherheit durchgeführt und gefährliche Chemikalien sind nicht erforderlich.

Wie aus der vorstehenden Beschreibung leicht ersichtlich ist, bietet das erfindungsgemäße Verfahren zahlreiche Vorteile und ist daher sehr wertvoll für die Analyse von verschiedenen Substanzen, wie sie vorstehend erwähnt wurden.

Die Erfindung wurde zwar anhand typischer Ausführungsformen und Beispiele beschrieben, sie ist jedoch nicht auf diese beschränkt.

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Claims

PATENTANWÄLTE - ' - STREHL SCHÜBEL-HOPF SCHULZ 3408502 WIDENMAYERSTRASSE 17. D-8000 MÜNCHEN 22 DIPL. ING. PETER STREHL· DIPL.-CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPF· DIPL.-PHYS. DR. ROTGER SCHULZ· AUCH RECHTSANWALT DIPL. ING. REINHARD WEISE •ALSO EUROPEAN PATENT ATTORNEY TELEFON (089) 223911 TELEX 5214036 SSSM D TELECOPIER (089) 223915 DEA-13 887 8. März 1984 ^jV-Veffahren zur Schnellanalyse PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Schnellanalyse von mehreren in einem flüssigen System vorhandenen Bestandteilen, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte :
Einfüllen der zu analysierenden Flüssigkeit und einer
pH-Pufferlösung in eine Reaktionszelle, die gegenüber dem Zutritt von Außenluft abgedichtet ist,
aufeinanderfolgende Zugabe von mehreren biologischen
Katalysatoren, welche die Aufnahme und Reaktion von gelöstem Sauerstoff induzieren,

wobei die in dem flüssigen System vorliegenden mehreren Bestandteile nacheinander stufenweise selektiv oxidiert werden,
automatische Messung des gelösten Sauerstoffes und Auf-

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~ Zeichnung des Oxidationsverfahrens mit Hilfe eines Sensors, wobei eine stufenweise abfallende Kurve für den gelösten Sauerstoff erhalten wird,

qualitative Bestimmung jedes der Bestandteile durch die jeweilige Art des zugesetzten biologischen Katalysators — und die Reihenfolge der Zugabe der biologischen Katalysatoren, und

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation der Bestandteile ^ in zwei, drei oder mehr Stufen durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einer Reaktionszelle durchgeführt wird, an deren einer Seitenwand ein Sensor für gelösten Sauerstoff befestigt ist und deren oberer Teil luftdicht mit einem Stopfen verschlossen ist, der mit einer feinen Bohrung versehen ist, die zur Zugabe der Pufferlösung, der zu prüfenden Flüskeit und der biologischen Katalysatoren dient.

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