DE3319066A1 - Verfahren und reagenz zum direkten nachweis eines analyts nach spezifischer entfernung von colloidpartikeln in waessrigen loesungen biologischer herkunft - Google Patents
Verfahren und reagenz zum direkten nachweis eines analyts nach spezifischer entfernung von colloidpartikeln in waessrigen loesungen biologischer herkunftInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Zwecke des
Nachweises eines Analyts,der in verschiedenen Fraktionen an Biopolymere gebunden in einer Flüssigkeit
biologischer Herkunft vorliegt und nur in einer dieser Fraktionen qualitativ und/oder quantitativ gemessen
werden soll.Das Prinzip':des Verfahrens wird am Beispiel der. Untersuchung von Lipiden in Lipoproteinen
des menschlichen Serums erläutert.
Die wasserunlöslichen Fette, Triglyceride, Cholesterin und Phospholipide, werden im wässrigen Milieu
des menschlichen Plasma in lnizellähnlichen Bestandteilen, den Serumlipoproteinen, transportiert.
Es können verschiedene Lipoproteinklassen:im .menschlichen
Nüchternserum nachgwiesen werden. Sie alle enthalten Triglycerid, Cholesterin, Phospholipid
und bestimmte Proteine, sogenannte Apolipoproteine. Die drei im menschlichen Serum nachweisbaren, großen
Lipoproteinklassen unterscheiden sich in ihrer spezifischen Dichte. Sie werden infolge dessen als Very ■
Low Density Lipoproteine (VLDL), Low Density Lipoproteine (LDL) und High Density Lipoproteine (HDL)
bezeichnet. Die Apolipoproteine werden ebenfalls in verschiedene Klassen unterteilt, die mit einem Buchstaben
gekennzeichnet sind (z.B. Apolipoprotein A (Apo-A), Apolipoprotein B (Apo-B), Apolipoprotein C
(Apo-C), Apolipoprotein D (Apo-D) und Apolipoprotein E (Apo-E). Kennzeichnenderweise sind die Apolipoproteinklassen
meist nicht auf eine sondern mehrere Lipoproteinklassen verteilt. So enthalten die VLDL Apo-A,
Apo B, Apo-C und Apo-E, die HDL enthalten Apo-A, Apo-C und Apo-E. Hingegen enthalten die LDL nahezu
ausschließlich Apo-B.
Die pathognomonische Bedeutung der einzelnen Lipoproteinklassen
ist für die Ablagerung von Fetten, insbesondere von Cholesterin, in den Gefäßwänden
unterschiedlich. Die LDL bestehen zum größten Teil aus Cholesterin. Ihr Beitrag zur Ablagerung von
Cholesterin in den Gefäßen - ein Prozeß, der als Atherogenese bezeichnet wird - ist nachgewiesenermaßen
am größten. Die HDL sind Phospholipid-reich. Sie vermögen Cholesterin aus den Zellen der Gefäße
aufzunehmen und abzutransprotieren. Ihnen wird daher eine anti-atherogene Wirkung nachgesagt.
In klinisch-chemischen Untersuchungen wurde herausgefunden,
daß Personen mit erhöhten LDL-Konzentrationen im Plasma oder Serum ein höheres Risiko haben, an Herz-Kreislauf
erkrankungen zu leiden, während Personen mit erhöhten HDL-Konzentrationen deutlich weniger anfällig
sind. Es hat sich daher für die labormedizinische Diagnostik als vorteilhaft erwiesen, nicht nur die Bestimmung
von Gesamtcholesterin im Serum sondern auch die Bestimmung von Cholesterin in der LDL-Praktion
bzw. in der HDL-Fraktion zur prognostischen Beurteilung des Ausmaßes der Gefährdung einer Person in Betracht
zu ziehen. Insbesondere der Bestimmung von Cholesterin in den LDL wird eine herausragende Bedeutung beigemessen.
Die Bestimmung von LDL-Cholesterin aus Plasma oder Serum wird herkömmlicherweise mit Hilfe kombinierter
Verfahren, z.B. der Ultrazentrifugation und PoIyanionenpräzipitation
in Speziallaboratorien (Lipid
Research Clinics Program, DHEW Publication No (NIH) 75-628, Bethesda, Md. (1974)) oder aus den Konzentrationen
von Gesamtcholesterin, Gesamttriglycerid und HDL-Cholesterin im Serum durch Berechnung mit Hilfe
der Formel nach Friedewald (Clin. Chem. 18, 499 (1972) durchgeführt. Der Nachteil dieser Methoden
ergibt sich aus der indirekten Bestimmung der Meßgröße, da hierbei die Fehler aller Messungen in
die Berechnung des Wertes für LDL-Cholesterin einfließen.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die direkte Bestimmung von Lipiden, z.B. Cholesterin, in
einer bestimmten Lipoproteinfraktion, in hervorragender Weise ausgeführt werden kann, wenn aus der
zu untersuchenden Probe die Lipoproteinpartikel, die zwar auch Lipide enthalten, jedoch nicht der zu untersuchenden
Lipoproteinfraktion zugeordnet sind, durch eine spezifische Immunreaktion entfernt werden. Das
Verfahren setzt voraus, daß das Reagenz immunchemische Eigenschaften hat, die ausschließlich gegen
die zu entfernenden Lipoproteine gerichtet sind. Beispielsweise reagiert ein Reagenz mit immunchemischen
Eigenschaften gegen Apo A und Apo C mit VLDL- und HDL-Partikeln, die beide Apo A und Apo C enthalten.
Es reagiert hingegen nicht mit LDL-PartikeIn, die diese
Apolipoproteine nicht enthalten. Mit Hilfe einer spezifischen immunchemischen Reaktion können die in einer
Probe vorhandenen verschiedenen Lipoproteinklassen voneinander getrennt werden. Der Gehalt an Lipiden in
der Restlösung entspricht somit dem Lipidgehalt der nicht umgesetzten Lipoproteinfraktionen unter der Voraussetzung,
daß das Immunreagenz Lipide gleicher Art in Mengen enthält, die die Messung nicht beeinträchtigen.
Aus der Restlösung kann daher der Lipidhehalt -
gegebenenfalls unter Berücksichtigung eines Leerwertes
- direkt gemessen werden. Da das Plasma aller Tierspezies, die zur Antikörpersynthese immunisiert werden,
physiologischerweise Lipide enthält, die den quantitativen Nachweis eines entsprechenden Analyts in einem
Humanserum beeinträchtigen würden, müssen diese zuvor aus dem Immunreagenz entfernt werden. Wie dem Fachmann
vertraut ist, findet die Immunpräzipitation zwischen
ο ο
4 C und 42 C in einem pH-Milieu zwischen 5 und 9, vorzugsweise
bei 25 C und pH 7 bis 8,6 statt.
Wie anhand von Vergleichsuntersuchungen festgestellt wurde, stimmt die in der dargelegten Weise durchgeführte
Analytik der direkten Bestimmung z.B. von Cholesterin in den LDL oder HDL aus Serum oder Plasma
menschlicher Herkunft mit normalen bzw. nur leicht erhöhten Lipidkonzentrationen hervorragend mit den
Messungen mit Hilfe der herkömmlichen Verfahren überein. Bei höheren Lipidkonzentrationen, insbesondere
bei höheren Triglyceridkonzentrationen ist diese Trennung der Lipoproteinfraktionen in vereinzelten
Seren oder Plasmen unvollständig, wenn die Fraktionierung durch eine Immunpräzipitation mit einem Reagenz,
das nicht an eine Festphase gekoppelt ist, ausgeführt wird. Es hat sich daher als vorteilhaft erwiesen,
wenn die Präzipitation in Gegenwart von einem oder mehreren Enzymen, die die kolloid-chemische Stabilität
der Lipoproteinpartikel herabsetzen, ausgeführt wird. Durch die gleichzeitige enzymatische Behandlung
können noch gelöste Immunkomplexe ebenfalls präzipitiert werden.
Die Verwendung verschiedener Enzyme hat sich hierfür als vorteilhaft erwiesen:
EC 3.2.1.18 Neuraminidase
| EC | 3.4.22.2 | Papain |
| EC | 3.4.21.4 | Pronase |
| EC | 3.1.4.12 | Sphingomyelinase |
| EC | 3.1.4.3 . | Phospholipase C |
| EC | 3.1.1.13 | Cholesterinesterase |
| EC | 3.1.1.3 | Triglyceridlipase |
| EC | 3.1.1.1. | Carboxylesterase |
Die notwendigen Mengen der Enzyme für eine Bestimmung sind durch die Art der Immunpräzipitation und
durch Spezifität und Aktivität des jeweiligen Enzyms bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur selektiven Entfernung von störenden Bestandteilen
in einer wässrigen Lösung durch eine Immunreaktion zum Zwecke des nachfolgenden direkten Nachweises eines
Analyts in der Flüssigkeit. Das Reagenz ist dadurch gekennzeichnet, daß es Antikörper gegen die den Nachweis
störenden Bestandteile enthält. Den nachzuweisenden Analyt enthält es hingegen nicht oder nur in Mengen,
deren Beitrag für den quantitativen Nachweis der Konzentrationen des Analyts in einer Probenlösung rechnerisch
berücksichtigt werden kann. Die Spezifität der Antikörper richtet sich, wie sich schon aus der Darlegung
zum Verfahren ergibt, gegen die jeweiligen störenden und damit zu entfernenden Bestandteile in der
Probenlösung. Die Antikörper können hierbei in dem Reagenz in Lösung vorliegen oder auch an eine Festphase
gebunden sein.
Im Falle der Entfernung der störenden Bestandteile
einer Probenlösung durch Immunpräzipitation enthält das Reagenz vorzugsweise ein oder mehrere Enzyme,
die die Oberflächeneigenschaften der störenden Bestandteile in dem Sinne verändern, daß eine
Immunpräzipitation begünstigt wird. Die verwendeten Enzyme entsprechen denen, die in der Darlegung der
Ausführung des Verfahrens vermerkt sind. Im Falle der Aufbereitung der Probe durch Immunadsorption
haben sich die dem Fachmann vertrauten Festphasen zur Fixation der Antikörper (Zellulose, Sepharose,
Dextran, Polyakrylamid, controlled pore glass etc) als anwendbar erwiesen.
η λ 0L
Die folgenden Beispiele sollen die Vorteile des Verfahrens verdeutlichen:
Beispiel 1: Jeweils 5 ul von triglyceridarmen Humanseren
wurden mit jeweils 50 ul eines delipidierten Serums vom Kaninchen mit Antikörpern gegen Human-Apolipoprotein
A durchmischt. Nach einer Stunde Aufbewahrung bei Raumtemperatur wurde die Mischung
in einer Laborzentrifuge zentrifugiert und der Cholesteringehalt in der überständigen Lösung
mit einer gebräuchlichen enzymatischen Meßmethode ermittelt. Aus den gleichen Seren wurde der Gehalt
an LDL-Cholesterin mit Hilfe der herkömmlichen Technik der Ultrazentrifugation und Polyanionenpräzipitation
sowie mit Hilfe der Methode nach Friedewald gemessen. Die Ergebnisse der Messungen von
verschiedenen Serumproben sind in der Tabelle 1 zum Vergleich aufgeführt.
Beispiel 2: Jeweils 50 ul Serum wurden mit jeweils 1 ml 0,15 molarer NaCl verdünnt. In dieser Lösung
wurde eine an Sepharose gekoppelte Immunglobulinfraktion, die Antikörper gegen Human-Apo-A enthielt,
suspendiert, die Lösung wurde 15 min. leicht geschüttelt, die Festphase abzentrifugiert und der Cholesteringehalt
in der überständigen Lösung mit einem chemischen Verfahren (Technicon Bulletin N 24a, Tarrytown
1972) gemessen. Die Ergebnisse sind mit der Bestimmung von LDL-Cholesterin in Tabelle 1 verglichen.
Beispiel 3: 500 Mikroliter der in Beispiel 2 beschriebenen
Serumverdünnungen wurden über eine kleine Säule mit den gleichen an Sepharose gebundenen Immunglobulinen
chromatographiert und der Cholesteringehalt im Eluat gemessen. Zur Ermittlung der durch die
Chromatographie bedingten Verdünnung wurde der Gehalt an Lithium Chlorid,das der Lösung vor der Chromatographie
zugesetzt worden war, vor und nach Eluation gemessen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind
in Tab. 1 ergänzt.
Beispiel 4: 66 verschiedene Seren mit einem normalen Gehalt oder pathologisch erhöhten Gehalt an Cholesterin
und/oder Triglycerid wurden mit einem delipidierten Antiserum, das Antikörper gegen menschliche Apolipoproteine
A und C und Neuraminidase (10 mU) enthielt, wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht. Die Ergebnisse
wurden mit der LDL-Cholesterinbestimmung nach der Methode von Friedewald verglichen. Der Korrelationsfaktor zwischen beiden Bestimmungsmethoden betrug:
r: 0,97 "bei einer Regression von y= 0,89 x + 0,078
(y: Cholesterinkonzentration (g/l) nach Immunpräzipitation; x: Cholesterinkonzentration (g/l) nach Berechnung'
aus der Friedewaldformel).
Beispiel 5 J In gleicher Weise wie in Beispiel 1
beschrieben wurden Humanseren mit einem delipidierten Antiserum gegen Human-Apo B in Gegenwart von
Triglyceridlipase ( 500 mU ) und Carboxylesterase ( 5 U ) vermischt. Nach einer Stunde wurde die
Mischung zentrifugiert und im Überstand der Gehalt an Cholesterin gemessen. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 2 mit Referenzverfahren der HDL-Cholesterinbestimmung nach Pölyanionenpräzipitation aus dem
Vollserum verglichen.
Die Ergebnisse der angeführten Beispiele veranschaulichen, daß mit Hilfe der verschiedenen Variationen
des entwickelten Verfahrens präzise direkte Messungen von Cholesterin in einer Lipoproteinklasse des menschlichen
Serums, die nicht mit einem lipidfreien Reagenz mit bestimmten immunologischen Eigenschaften reagiert,
aus minimalen Probenvolumina ohne aufwendige labortechnische Hilfsmittel möglich sind. Selbstverständlich
gelingt auch die Bestimmung des Gehaltes von anderen Lipiden, z.B. Triglycerid oder Phospholipid,
in der gleichen Lipoproteinfraktion, da auch diese Lipide in dem Reagenz nicht in störender Weise enthalten
sind. Das Verfahren bietet somit beträchtliche Vorteile, z.B. für die klinisch-chemische Differentialdiagnostik
von FettstoffWechselstörungenj insbesondere
ist die neubeschriebene Analytik wesentlich einfacher und kostengünstiger als die herkömmlicherweise eingesetzten
Verfahren.
Das Prinzip des am Beispiel der Analytik von Serumlipoproteinen erläuterten Verfahrens kann in analoger
Weise durch Verwendung eines Reagenz mit geeigneten spezifischen immunologischen Merkmalen zur
Untersuchung eines Analyts in anderen Flüssigkeiten biologischer Herkunft (z.B.Zellkulturmedium,Urin,
Liquor etc.),der an Biopolymere mit unterschiedlichen immunogenen Eigenschaften gebunden ist,problemlos
zu analytischen oder präparativen Zwecken angewandt werden.
Tabelle 1 Bestimmung von "LDL"-Cholesterin
II III IV
| 5,09 | g/L | 5,45 | g/L | 5,21 | g/L | 5,54 | g/L | 5,34 | g/L |
| 1,36 | Il | 1,20 | Il | 1,19 | Il | 1,15 | Il | 1,09 | It |
| 1,37 | Il | 1,53 | Il | 1,32 | Il | 1,24 | Il | 1,32 | η |
| 1,48 | Il | 1,47 | It | 1,45 | It | 1,42 | ti | 1,35 | It |
| 1,24 | Il | 1,30 | Il | 1,12 | It | 1,05 | It | 1,05 | Il |
| 1,11 | Il | 1,23 | Il | 1,19 | It | 1,40 | ti | 1,15 | ti |
| 1,18 | Il | 1,10 | Il | 1,12 | It | 1,22 | Il | 1,24 | ti |
| 1,45 | Il | 1,40 | Il | 1,32 | It | 1,25 | ti | 1,35 | ti |
| 2,14 | Il | 2,22 | Il | 1,98 | It | 2,30 | Il | 1,95 | It |
| 1,01 | Il | 1,02 | Il | 0,95 | It | 1,10 | Il | 0,93 | ti |
I: LDL-Cholesterin (nach Ultrazentrifugation)
II; LDL-Cholesterin (nach Friedewald)
III: Cholesterin (nach Verfahren Beispiel 1)
IV: Cholesterin (nach Verfahren Beispiel 2)
V: Cholesterin (nach Verfahren Beispiel 3)
Tabelle 2 Bestimmung von HDL -Cholesterin
Serum I II
0,400 g/L 0,430 g/L
0,220 " 0,230 »
0,420 » 0,460 »
0,350 » 0,330 "
0,760 " 0,820 »
0,320 » 0,330 "
0,570 " 0,630 «
0,280 » 0,300 "
0,640 » 0,730 "
0,580 " 0,650 "
Cholesterinkonzentrationen im Serum nach Fällung mit Phosphorwolframsäure/MgClp
II Cholesterinkonzentrationen im Serum nach Immunpräzipitation
und Gammaglobulin gegen Apolipoprotein
B in Gegenwart von
Triglyceridlipase (EC 3.1.1.3 ) und Carboxylesterase (EC 3.1.1.1 )
Triglyceridlipase (EC 3.1.1.3 ) und Carboxylesterase (EC 3.1.1.1 )
Claims (11)
- PatentansprücheM./Verfahren zur direkten Bestimmung eines Analyts "" aus einer bestimmten Fraktion einer wässrigen Flüssigkeit biologischer Herkunft,dadurch gekennzeichnet, daß andere den Analyt ebenfalls enthaltende Fraktionen durch eine Immunreaktion entfernt werden und anschließend der direkte Nachweis des Analyts mit Hilfe einer chemischen oder biochemischen Meßmethode geführt wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß außerdem ein oder mehrere Enzyme verwendet werden ,die bewirken,daß die kolloid-chemische Stabilität der zu entfernenden Fraktionen vermindert wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet,daß man als Enzym Neuraminidase (EC 3.2.1.18),Pronase (EC 3.4.21.4),Papain(EC 3.4.22.2),Triglyceridlipase (EC 3.1.1.3),Carboxylesterase (EC 3.1.1.1),Cholesterinesterase (EC 3.1.1.13),Sphingomyelinase (EC 3.1.4.12] Phospholipase C(EC 3.1.4."3) oder eine Mischung derselben verwendet.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung der den Nachweis des Analyts störenden Fraktionen durch eine Immunpräzipitation oder Immunadsorption mit Hilfe spezifischer Antikörper erfolgt.
- 5. Reagenz für den direkten Nachweis eines Analyts in einer bestimmten Fraktion einer wässrigen Flüssigkeit biologischer Herkunft, dadurch gekennzeichnet, daß es den Analyt nicht oder in Mengen enthält,bei deren Berücksichtigung der quantitative Nachweis des Analyts nicht beeinträchtigt wird.
- 6. Reagenz nach Anspruch 5,dadurch gekennzeichnet, daß es spezifische Antikörper enthält,die gegen die immunogenen Determinanten der den Nachweis eines Analyts in einer bestimmten Fraktion störenden und zu entfernenden Fraktionen gerichtet sind.
- 7. Reagenz nach Anspruch 5,dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Enzym oder eine Mischung von Enzymen enthält,deren Wirkung die Kolloid-Stabilität der zu entfernenden Fraktionen vermindert.
- 8. Reagenz zur Entfernung von Apolipoprotein A und/oder Apolipoprotein C haltigen Lipoproteinen aus menschlichem Plasma oder Serum nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet,daß es Antikörper gegen die Apolipoproteine A ,C oder A und C enthält.
- 9. Reagenz zur Entfernung von Apolipoprotein B haltigen Lipoproteinen nach Anspruch 5 und 6,dadurch gekennzeichnet,daß es Antikörper gegen Apolipoprotein B enthält.
- 10.Reagenz nach Anspruch 5,6,8 und 9 ,dadurch gekennzeicnetjdaß die Antikörper zur Entfernung der störenden Fraktionen gelöst oder an eine Festphase gebunden sind.
- 11.Reagenz nach Anspruch 5 und 7,dadurch gekennzeichnet, daß es die in Anspruch 3 genannten Enzyme oder Mischungen derselben enthält .
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- 1984-05-17 DE DE8484901995T patent/DE3477516D1/de not_active Expired
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- 1984-05-17 EP EP84901995A patent/EP0144367B1/de not_active Expired
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