DE3344085C2

DE3344085C2 - Optisch aktive Ï-substituierte ß-Hydroxybuttersäurederivate sowie Verfahren zu deren Herstellung

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Publication number: DE3344085C2
Application number: DE3344085A
Authority: DE
Inventors: Charles J Sih
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 1982-12-06
Filing date: 1983-12-06
Publication date: 1993-10-14
Anticipated expiration: 2003-12-07
Also published as: ES527807A0; NO159291C; LU85115A1; AT393136B; DK163917B; KR840008165A; PH20456A; FR2537130B1; CH661498A5; CA1225956A; ATA423783A; SE455501B; DK163917C; NO834461L; DK559283A; AU566906B2; SE8306714L; DE3344085A1; IT8324018A0; NO159291B

Description

Es ist bekannt, daß Carnitin-(β-hydroxy-γ-trimethylaminobuttersäure) (auch als 3-Hydroxy-4-(trimethylamino)- buttersäure-betain bezeichnet) ein asymmetrisches Zentrum enthält und daher in den beiden stereoisomeren Formen, der D- und der L-Form, vorliegt.

Im Körper liegt gewöhnlich L-Carnitin vor, wo es dazu dient, aktivierte langkettige, freie Fettsäuren durch die Mitochondrialmembran zu transportieren. Da die Mitochondrialmembran gegenüber Acyl-CoA- Derivaten undurchlässig ist, können langkettige freie Fettsäuren nur eintreten, wenn sie mit L-Carnitin verestert sind. Die Trägerfunktion von L-Carnitin macht sich sowohl beim Transport von aktiven langkettigen Fettsäuren von der Stelle ihrer Biosynthese, z. B. den Mikrosomen zu den Mitochondria, wo sie oxidiert werden, bemerkbar, als auch beim Transport von Acetyl-CaO von den Mitochondria, in denen es gebildet wird, zu den extramitochondrialen Stellen, wo die Synthese von langkettigen Fettsäuren stattfindet, z. B. in den Mikrosomen, wobei Acetyl-CoA zur Synthese von Cholesterin und Fettsäuren verwendet werden kann.

Es steht fest, daß das linksdrehende Isomer (L- Carintin) die ausschließlich biologische Form darstellt (D-Carnitin wurde bisher noch nie in Säugetiergewebe nachgewiesen), und das D,L-Carnitin- Racemat wurde in den vergangenen Jahren für zahlreiche Indikationen verwendet. D,L-Carnitin wird beispielsweise in Europa als Appetitstimulans verwendet, und es wurde darüber berichtet, daß dieses Material das Wachstum von Kindern beeinflußt (siehe z. B. Borniche et al., Clinica Chemica Acta, 5, 171-176, 1969; und Alexander et al., "Protides in the Biological Fluids", 6th Colloquium, Bruges, 1958, 306-310. In der US-PS 38 30 931 werden Verbesserungen der myocardialen Kontraktilität und des systolischen Rhythmus bei Stauungsherzversagen beschrieben, wobei man diese Verbesserungen durch die Verabreichung von D,L-Carnitin erzielt hat. In US-PS 39 68 241 ist die Verwendung von D,L-Carnitin bei Herzarythmien beschrieben. In US-PS 38 10 994 wird die Verwendung von D,L-Carnitin für die Behandlung der Fettsucht offenbart.

In jüngerer Zeit besteht jedoch die Tendenz, ausschließlich das linksdrehende Carnitinisomer zumindest bei gewissen therapeutischen Anwendungen einzusetzen. Es wurde tatsächlich festgestellt, daß D- Carnitin ein kompetitiver Inhibitor von Carnitin- verbundenen Enzymen, wie Carnitinacetyltransferase (CAT) und Carnetinpalmityltransferase (PTC) ist. Darüber hinaus geht aus jüngeren Versuchen hervor, daß D-Carnitin eine Verarmung an L-Carnitin im Herzgewebe ergeben kann. Infolgedessen ist es wesentlich, daß ausschließlich L-Carnitin an solche Patienten verabreicht wird, die gegen Herzkrankheiten oder eine Lipämie behandelt werden.

Es gibt eine Reihe von Verfahren zur technischen Herstellung von Carnitin. Die chemische Synthese führt jedoch unvermeidlich zu einem racemischen Gemisch von D- und L-Isomeren. Infolgedessen hat man Spaltmethoden entwickelt, um die getrennten optischen Antipoden aus Racematen zu gewinnen. Solche Spaltmethoden sind jedoch mühselig und teuer.

Aufgabe der Erfindung ist es, optisch aktive γ- substituierte β-Hydroxybuttersäurederivate und ein Verfahren zu deren Herstellung zur Verfügung zu stellen, die geeignet sind, als Zwischenprodukte für die Herstellung eines inneren Salzes von L-Carnitin. Eingeschlossen in die Aufgabe ist es auch, ein Verfahren zur Herstellung der optisch aktiven γ-substituierten β-Hydroxybuttersäurederivate zu zeigen.

Diese Aufgabe wird durch optische aktive γ-substituierte β-Hydroxybuttersäurederivate mit 3(R)-Konfiguration gemäß Anspruch 1 gelöst.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden die optisch aktiven γ-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäurederivate der Formel

worin X und R die im Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, mit der Bedingung, daß, wenn R einen Alkoxyrest bedeutet, dieser 5 bis etwa 15 Kohlenstoffatome hat, dadurch hergestellt, daß man Verbindungen der allgemeinen Formel

worin X und R die vorher angegebene Bedeutung haben, einer fermentativen enzymatischen Einwirkung eines Mikroorganismus unterwirft. Die Mikroorganismen sind in den Tabellen 1 bis 2 angegeben.

Tabelle 1 (Hefen)

1. Candida lipolytica NRRL Y-1095
2. Candida pseudotropicalis NRRL Y-1264
3. Mycoderma cerevisiae NRRL Y-1615
4. Torula lactosa NRRL Y-329
5. Geotrichum candidum NRRL Y-552
6. Hansenula anomala NRRL Y-366
7. Hansenula subpelliculosa NRRL Y-1683
8. Pichia alcoholophila NRRL Y-2026
9. Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12, 632
10. Saccharomyces lactis NRRL Y-1140
11. Zygosaccharomyces priorianus NRRL Y-12, 624
12. Saccharomyces acidifaciens NRRL Y-7253
13. Kloeckera corticis ATCC 20109
14. Cryptococus mascerans ATCC 24194
15. Rhodotorula sp. ATCC 20254
16. Candida albicans ATCC 752
17. Dipodascus albidus ATCC 12934
18. Saccharomyces cerevisiae (commercial Red Star)
19. Rhodotorula rubra NRRL Y-1592
20. Oospora lactis ATCC 14318

NRRL - Northern Regional Research Lab. at Peoria, Illinois.
ATCC - American Type Culture Collection at Rockville, Maryland.

Tabelle 2 (Fungi)

1. Gliocladium virens ATCC 13362
2. Caldariomyces fumago ATCC 16373
3. Linderina pennisopora ATCC 12442
4. Aspergillus ochraceus NRRL 405
5. Trichoderma lignorum ATCC 8678
6. Heterocephalum autantiacum ATCC 16328
7. Entomophthora coronata NRRL 1912
8. Scopulariopsis constantini NRRL 1860
9. Zygorhynchus heterogamus ATCC 6743
10. Scopulariopsis brevicaulis NRRL 2157
11. Rhizopus arrhizus NRRL 2286
12. Penicillium thomii NRRL 2077
13. Mucor hiemalis(-) NRRL 4088
14. Byssochlamys nivea ATCC 12550
15. Penicillium patulum NRRL 1952
16. Metharrhizium anisopliae ATCC 24942
17. Penicillium islandicum ATCC 10127
18. Cunninghamella elegans ATCC 10028a
19. Cunninghamella echinulata ATCC 11585a
20. Aspergillus fumigatus ATCC 16907
21. Aspergillus amstelodami NRRL 90
22. Gliocladium roseum ATCC 10521
23. Aspergillus giganteus ATCC 10059
24. Absidia blakeleeana ATCC 10148b
25. Penicillium roqueforti NRRL 849a

Zur Herstellung von optisch aktiven 4-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäureestern mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist es erforderlich, gereinigte L-β- Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase (EC 1.1.1.35) zu verwenden, z. B. solche aus Schweineherzen, weil intakte Mikroorganismen eine störende Oxidoreduktase der entgegengesetzten Reduktion haben. Infolgedessen ergibt eine mikrobielle Reduktion von beispielsweise 4-Chloroacetoessigsäureestern mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen 4-Chloro-3-hydroxybutyrate einer ungenügenden optischen Reinheit.

Die Erfindung betrifft deshalb auch ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven γ-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäurederivaten der Formel mit der 3(R)-Konfiguration

worin X Chlor, Brom, Jod oder OH und R einen Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten und ist dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der Formel

worin X und R die vorher angegebenen Bedeutungen haben, der enzymatischen Einwirkung von L-β-Hydroxyacyl- CoA-dehydrogenase (EC 1.1.1.35) in reiner Form unterwirft und daß man die gewünschten, optisch aktiven γ-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäurederivate aus dem enzymatischen Reaktionsgemisch gewinnt.

Die optisch aktiven, γ-substituierten L-β-Hydroxybuttersäurederivate können mit Trimethylamin umgesetzt werden, unter Ausbildung der entsprechenden γ-Trimethylammonium-L-β-hydroxybuttersäurederivate, die man leicht in L-Carnitin überführen kann, indem man sie mit wäßrigen Säuren behandelt. Nachfolgend wird ein Reaktionsschema dieses Verfahrens gezeigt.

Es wurde festgestellt, daß die vorstehende Umsetzung I → II leichter abläuft, wenn X Cl bedeutet. Da jedoch die anschließende Umsetzung II → III in besseren Ausbeuten abläuft, wenn X Jod oder Brom bedeutet, ist es bevorzugt, zunächst das Chlorderivat herzustellen und es dann in das entsprechende Jod- oder Bromderivat zu überführen.

Ein 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäureester wird in das entsprechende 4-Jodo- oder 4-bromo- 3(R)-hydroxybutyrat überführt. Aus Gründen der Einfachheit wird nachfolgend auf die Jodderivate verwiesen. Das Jodohydrin (V) kann einfach mit Trimethylamin bei Raumtemperatur umgesetzt werden unter Erhalt von (VI), welches dann nach dem folgenden Reaktionsschema in L-Carnitin überführt wird.

Das obige als Beispiel gezeigte Verfahren kann in zahlreichen Varianten vorliegen. Unabhängig davon, welche Form zur Verfügung gestellt wird, wird der Ester mit Natriumjodid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie 2-Butanon, Aceton oder Butanol, umgesetzt. Die an dieser Stelle gewünschte Hauptreaktion bei der Umsetzung mit Natriumjodid ist die Verdrängungsreaktion unter Ausbildung des Jodohydrins (V), ohne daß das chirale Zentrum am anliegenden Kohlenstoffatom gestört wird. Für diese Umsetzung benötigt man wenigstens soviel Natriumjodid, um das gesamte Chlorid aus (II) zu verdrängen. Im allgemeinen wird ein geringer Überschuß an Natriumjodid verwendet.

Die Umsetzung von (V) mit Trimethylamin kann bei milden Temperaturen (z. B. 25°C) (siehe S. G. Boots und M. R. Boots, J. Pharm. Sci., 64, 1262, 1975) in zahlreichen Lösungsmitteln, wie Methanol oder Ethanol, die einen Überschuß an Trimethylamin enthalten, durchgeführt werden. Es ist bemerkenswert, daß in Abhängigkeit von dem verwendeten alkoholischen Lösungsmittel ein Esteraustausch stattfindet. Verwendet man beispielsweise Methanol als Lösungsmittel, so erhält man den L-Carnitinmethylester bei der Umsetzung. Diese Austauschreaktion ist vorteilhaft, weil man den L-Carnitinmethylester direkt in die freie Base des L-Carnitins überführen kann, indem man ihn durch eine Ionenaustauschsäule (OH⁻) leitet (siehe E. Strack und J. Lorenz, J. Physiol. Chem. [1966], 344, 276).

Aus der Beschreibung des vorhergehenden Verfahrens wird ersichtlich, daß eine Anzahl von neuen und sehr brauchbaren optisch aktiven Zwischenprodukten gebildet wird. Besonders brauchbar sind die 4-Jodo- 3(R)-hydroxybuttersäurealkylester mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe. Ganz besonders bevorzugt wird der Octylester.

Mikroorganismen mit der gewünschten Oxido-Reduktaseaktivität sind bekannt, und alle solche Mikroorganismen können bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden (siehe K. Kieslich, "Microbial Tranformations of Non-Steroid Cyclic Compounds", Georg Thieme Publishers, Stuttgart, 1976), wobei alle der Mikroorganismengenera, die hier spezifisch beschrieben sind, besonders anwendbar sind. Die leicht zugängigen und billigen Mikroorganismen vom Genus Saccharomyces, z. B. Brauerhefe, Bäckerhefe und Weinhefe (Saccharomyces vini), bilden die L-β-Hydroxylacyl-CoA-dehydrogenase (EC 1.1.1.35) und sind ganz besonders vorteilhaft bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das Enzym wird von S. J. Wakil und E. M. Barnes jr. in Comprehensive Biochemistry, Bd. 185 (1971), S. 57-104, beschrieben.

Das 4-substituierte Acetoessigestersubstrat kann in ein Nährmedium von Standardzusammensetzungen eingebracht werden, in welchen solche Organismen kultiviert werden, wobei man die üblichen Fermentationsbedingungen zur Durchführung der reduktiven Transformation anwendet. Alternativ kann das aktive Prinzip von der wachsenden Kultur des Mikroorganismus entfernt werden, z. B. durch Lysis der Zellen unter Freigabe des Enzyms oder indem man die ruhenden Zellen in einem frischen wäßrigen System suspendiert. Bei allen diesen Verfahren wird die β-Keto-Funktion selektiv reduziert, solange das aktive Enzym, welches durch die Mikroorganismen ausgebildet wird, in dem Medium vorhanden ist. Selbstverständlich besteht ein gegenseitiger Zusammenhang zwischen der Temperatur, der Zeit und dem Druck, bei denen der Kontakt des 4-substituierten Acetoessigsäurederivats mit dem reduktiven Enzym durchgeführt wird. Beispielsweise benötigt man bei schwachem Erwärmen und unter Atmosphärendruck weniger Zeit, um die reduktive Umwandlung zu bewirken, als bei Raumtemperatur unter sonst gleichen Bedingungen. Selbstverständlich dürfen weder die Temperatur noch der Druck noch die Zeit so groß sein, daß das Substrat abgebaut wird. Verwendet man eine wachsende Kultur des Organismus, dann sollen die Verfahrensbedingungen ausreichend milde sein, daß die Organismen nicht abgetötet werden, bevor sie das hydrolytische Enzym ausgebildet haben, durch welches die Reaktion ablaufen kann. Im allgemeinen liegen bei Atmosphärendruck die Temperaturen im Bereich von etwa 10°C bis etwa 35°C, und die Zeit beträgt etwa 12 Stunden bis etwa 10 Tage.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung. Die γ-Haloacetoessigsäurederivat- Substrate, die der mikrobiologischen Reduktion unterworfen werden, erhält man aus Diketen nach der allgemeinen Methode von C. D. Hurd und H. L. Abernethy (J. Am. Chem. Soc., 62, 1147, 1940) für die γ-Chlor-acetoessigsäurederivate und F. Chick, N. T. M. Wilsmore (J. Chem. Soc., 1978 [1910]) für die γ-Bromo-acetoessigsäurederivate durch die nachfolgende Reaktionsfolge:

worin bedeuten:

X = Chlor oder Brom,
Y = H oder Alkyl,
R = die vorher angegebene Bedeutung.

Gewünschtenfalls kann man alternativ die γ-Haloacetoessigsäurederivate aus den γ-Haloessigsäureestern durch eine übliche Grignard-Reaktion herstellen. Beispielsweise kann man den γ-Chloro-acetoessigsäureoctylester einfach herstellen, indem man den γ-Chlorooctylester mit zwei Äquivalenten Magnesium in Ether während 48 Stunden unter Rückfluß behandelt. Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde der Acetoessigsäureoctylester in etwa 70%iger Ausbeute gewonnen.

γ-Hydroxyacetoessigsäurederivate erhält man aus den entsprechenden γ-Bromoacetoessigsäurederivaten, indem man in einer Dioxan-Wasser (1 : 1)-Lösung, enthaltend CaCO₃, 12 Stunden bei 25°C rührt.

Jedes der in den nachfolgenden Beispielen hergestellten Produkte wurde durch kernmagnetische Resonanzmessung (NMR), Infrarotspektren (IR) und durch Dünnschichtchromatografie hinsichtlich der Struktur identifiziert. Die optische Reinheit und die absolute Konfiguration der Produkte wurde durch deren Umwandlung in L-Carnitin und auch durch die Umwandlung in ihre Ester, die einfach durch NMR-Spektrometrie analysiert werden können, sowie durch optische Drehung festgestellt.

Beispiel 1 (Hefen)

Der (+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester wurde wie folgt hergestellt

(A) Fermentation

Oberflächenwachstum einer 1wöchigen Agar-Schrägkultur von Torula lactosa NRRL Y-329, gewachsen auf Agar der folgenden Zusammensetzung:


Gramm
Agar\|20
Glucose	10
Hefeextrakt	2,5
K₂HPO₄	1
destilliertes Wasser bis auf	1 l
(15 Minuten bei 1,4 bar sterilisiert)

wurde in 5 ml einer 0,85%igen Kochsalzlösung suspendiert. 1 ml Anteile dieser Suspension wurden zum Inokulieren eines 250-ml-Erlenmeyer-Kolbens (F-1- Stufe), enthaltend 50 ml des nachfolgenden Mediums (Vogel's Medium) verwendet:


Gramm
Hefeextrakt\|5
Casaminosäuren	5
Dextrose	40
Na₃-Citrat-5 1/2 H₂O	3
KH₂PO₄	5
NH₄NO₃	2
CaCl₂ · 2 H₂O	0,1
MgSO₄ · 7 H₂O	0,2
Spurenelementenlösung	0,1 ml
destilliertes Wasser bis auf	1 l
(pH 5,6 (15 Minuten bei 2,1 bar) sterilisiert

Spurenelementenlösung
g/100 ml
Citronensäure · 1 H₂O
5
ZnSO₄ · 7 H₂O	7
Fe(NH₄)₂(SO₄)₂ · 6 H₂O	1
CuSO₄ · 5 H₂O	0,25
MnSO₄ · 1 H₂O	0,05
H₃BO₃	0,05
NaH₂MoO₄ · 2 H₂O	0,05

Der Kolben wurde bei 25°C auf einem Drehschüttler (250 Zyklen/Min., 5 cm Radius) 24 Stunden inkubiert, und anschließend wurden 10 Vol.-% davon in einen anderen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben (F-2-Stufe), enthaltend 50 ml Vogel's Medium, überführt. Nach 24stündiger Inkubation auf einem Drehschüttler wurden 150 mg γ-Chloracetoessigsäureoctylester in 0,1 ml einer 10%igen Tween-80-Lösung zugegeben.

Der Kolben der F-2-Stufe wurde dann weitere 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen, wie sie früher den Kolben der F-1-Stufe verwendet wurden, inkubiert.

(B) Isolierung

24 Stunden nach Zugabe des γ-Chloressigsäureoctylesters wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde gründlich dreimal mit je 50 ml Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wurde über Na₂SO₄ getrocknet und dann abgedampft, wobei man 186 mg eines öligen Rückstandes erhielt. Der Rückstand wurde in 0,5 ml der mobilen Phase gelöst und dann auf eine Kieselgelsäule (1×25 cm) (MN-Kieselgel 60) gegeben. Die Säule wurde mit Skelly B zu Ethylacetat (8 : 1) eluiert, und es wurden 14-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 6 und 7, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden zusammengegeben und zur Trockne konzentriert, wobei man 120 mg eines kristallinen Rückstandes erhielt. Beim Umkristallisieren aus Ethylacetat- Hexan erhielt man 107 mg 4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester.

Elementaranalyse für C₁₂H₂₃O₃Cl:
Berechnet: C 57,47; H 9,25;
gefunden: C 57,52; H 9,07;

(TLC R_f - 0,5, Brinmann-Kieselgelplatte, 0,25 cm EM; Skelly B zu Ethylacetat (5 : 1).)

Beispiel 2 Ruhende Zellen

100 g übliche frische Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae (Red Star) wurden in 250 ml Leitungswasser, zu dem 10 g Saccharose und 3,6 g γ-Chloroacetoessigsäureoctylester gegeben worden waren, suspendiert. Nach 24stündigem Inkubieren bei 25°C auf einem Drehschüttler (250 Zyklen/Min., 5 cm Radius), wurden weitere 10 g Saccharose in den Kolben gegeben, und man ließ die Umsetzung weitere 24 Stunden ablaufen. Die Zellen wurden dann durch ein Zelithbett abfiltriert. Anschließend wurden die Zellen mit Wasser und mit Ethylacetat gewaschen. Die Waschlösungen wurden mit dem Filtrat vereint und gründlich mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde über MgSO₄ getrocknet und abgedampft, wobei man einen öligen Rückstand erhielt, der über einer Kieselgelsäule chromatografiert wurde. Man erhielt 2,52 g 4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester als einen niedrigschmelzenden Feststoff.

[α]²³ + 13,2° (c, 4,0, CHCl₃)

Beispiel 3

Der (+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäurebenzylester wurde wie folgt hergestellt:

(A) Fermentation

Das Oberflächenwachstum einer 1 Woche alten Schrägkultur von Gliocladium virens ATCC 13362, gewachsen auf Agar der folgenden Zusammensetzung:


Gramm
Malzextrakt
20
Glucose	20
Pepton	1
Agar	20
destilliertes Wasser bis auf	1 l
(sterilisiert 15 Minuten bei 1,4 bar)

wurde in 5 ml einer 0,85%igen Kochsalzlösung suspendiert. 1-ml-Anteile dieser Suspension wurden zum Inokulieren eines 250-ml-Erlenmeyer-Kolbens (F-1- Stufe), enthaltend 50 ml des nachfolgenden Mediums (Sojabohnen-Dextrosemedium) verwendet:


Gramm
Sojabohnenmehl
5
Dextrose	20
NaCl	5
KH₂HPO₄	5
Hefe	5
Wasser	1 l
pH eingestellt auf 7,0 (15 Minuten bei 1,05 bar autoklavisiert)

Der Kolben wurde auf einem Drehschüttler (250 Zyklen/ Min., 5 cm Radius) bei 25°C während 24 Stunden inkubiert und anschließend wurde ein 10%iger Volumenanteil in einen anderen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben (F-2-Stufe), welcher 50 ml des Sojabohnen-Dextrosemediums enthielt, gegeben. Nach 24stündigem Inkubieren auf einem Drehschüttler wurden 150 mg γ-Chloro essigsäurebenzylester in 0,1 ml 10%iger Tween 80- Lösung zugegeben. Der F-2-Stufen-Kolben wurde dann weitere 24 Stunden unter den für die Inkubierung in dem F-1-Stufen-Kolben-Bedingungen inkubiert.

(B) Isolierung

24 Stunden nach der Zugabe des γ-Chloroessigsäure benzylesters wurden die Mycele abfiltriert. Das Filtrat wurde gründlich dreimal mit je 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde über MgSO₄ getrocknet und dann im Vakuum konzentriert, wobei man 160 mg eines Rückstandes erhielt. Der Rückstand wurde über eine Kieselgelsäule (MN-Kieselgel 60) (1×25 cm) chromatografiert. Die Säule wurde mit Skelly B und Ethylacetat (10 : 1) eluiert, wobei 12 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen 11 bis 16 enthielten das gewünschte Produkt und wurden zusammengegeben und zur Trockne konzentriert, wobei man 115 mg des 4-Chloro- 3(R)-hydroxybuttersäurebenzylesters erhielt.

[α] +8,7° (c, 5,26; CHCl₃);

Elementaranalyse für C₁₁H₁₃O₃Cl:
Berechnet: C 57,77; H 5,73;
gefunden: C 57,64; H 5,67;

(TLC Kieselgel-EM Brinkmann-Platte, 0,25 cm, Rf=0,43, Skelly B-Ethylacetat (5 : 1)).

Beispiele 4 bis 23

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei die in der Tabelle 1 angegebenen Organismen verwendet wurden, mit der Ausnahme, daß der γ-Chloro essigsäureoctylester in einer Konzentration von 1 mg/ml zugegeben wurde. Man erreichte die Umwandlung in das gewünschte Produkt, den (+)4-Chloro-3(R)-hydroxy buttersäureoctylester. Das Verfahren in diesen Beispielen wurde wiederholt, indem man kontinuierlich Substrat zu den Hefemedien gab. Das Gewichtsverhältnis Substrat/Hefe betrug etwa 1 : 1,5, wobei man eine ausgezeichnete Umwandlung in das gewünschte Produkt erzielte.

Beispiele 24 bis 48

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Chloroessigsäureoctylester (1 mg/ml) verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester.

Beispiele 49 bis 68

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Chloroacetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) als Substrat verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Chloro-3(R)- hydroxybuttersäurebenzylester.

Beispiele 69 bis 93

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit allen in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen unter Verwendung von γ-Chloroacetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) als Substrat wiederholt. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäurebenzylester.

Beispiel 94

(+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureanilid wurde nach dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt, wobei jedoch das 4-Chloroacetoacetanilid bei einer Konzentration von 1 mg/ml

als Substrat für die Umwandlung in das gewünschte optisch aktive Produkt verwendet wurde. F: 110 bis 111°C.

[α] +17,5° (c, 3,0, CHCl₃);

Elementaranalyse für C₁₀H₁₂NO₂Cl:

Berechnet: C 56,21; H 5,66;
gefunden: C 56,17; H 5,47;

Beispiele 95 bis 114

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit allen in Tabelle 1 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Chloroacetoacetanilid in einer Konzentration von 1 mg/ml zugegeben wurde. In allen Fällen erzielte man die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureanilid.

Beispiele 115 bis 139

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt. γ-Chloroacetoacetanilid wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml eingeführt. In diesen Fällen erzielte man die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Chloro- 3(R)-hydroxybuttersäureanilid.

Beispiele 140 bis 159

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle 1 aufgeführten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Bromoacetoessigsäureoctylester (1 mg/ml) als Substrat verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Bromo-3(R)-hydroxy buttersäureoctylester.

Beispiele 160 bis 184

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Bromoacetoessigsäureoctylester (1 mg/ml) verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Bromo-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester.

Beispiele 185 bis 204

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Bromoacetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) als Substrat verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Bromo-3(R)-hydroxy buttersäurebenzylester.

Beispiele 205 bis 229

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Bromoacetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Bromo-3(R)-hydroxybuttersäurebenzylester.

Beispiele 230 bis 249

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Bromoacetanilid (1 mg/ml) als Substrat verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Bromo-3(R)-hydroxybuttersäureanilid.

Beispiele 250 bis 274

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei man jedoch γ-Bromoacetanilid (1 mg/ml) als Substrat verwendete. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte (+)4-Bromo-3(R)-hydroxybuttersäureanilid.

Beispiele 275 bis 294

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Hydroxyacetoessigsäureoctylester (1 mg/ml) als Substrat verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in den gewünschten 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester.

Beispiele 295 bis 319

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Hydroxyacetoessigsäureoctylester (1 mg/ml) als Substrat verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in den gewünschten 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester.

Beispiele 320 bis 339

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Hydroxyacetoacetanilid (1 mg/ml) als Substrat verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureanilid.

Beispiele 340 bis 364

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch γ-Hydroxyacetoacetanilid (1 mg/ml) als Substrat verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureanilid.

Beispiel 365 Methyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat (VIII)

100 mg Methyl-4-chloroacetoacetat (VII) wurden mit 29 Einheiten Schweineherz (EC 1.1.1.35), β-Hydroxy acyl-CoA-dehydrogenase (Sigma, H4626) und 1,36 g NADH (Sigma, 90%) in 30 ml eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers, pH 6,5, inkubiert.

Nach 30 Stunden bei 25°C wurde das Reaktionsgemisch viermal mit je 30 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand (90 mg) wurde über eine Kieselgel (12 g)- Säule (1,3×34 cm) chromatografiert. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelsystem aus Skelly B-Ethylacetat (8 : 1) eluiert und es wurden 20 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 9 bis 11 enthielten das gewünschte Methyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat (VIII), wie durch TLC, [α] +23,5° (c, 5,2 CHCl₃) festgestellt wurde. Diese Fraktionen wurden zusammengegeben.

Beispiel 366

Das Verfahren von Beispiel 365 wurde wiederholt, wobei jedoch als Substrat Ethyl-4-chloroacetoacetat verwendet wurde und man Ethyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat, [α] +22,7° (c, 4,7 CHCl₃) erhielt.

Beispiel 367

Das Verfahren von Beispiel 365 wurde wiederholt, wobei man jedoch als Substrat n-Propyl-4-chloroacetoacetat verwendete und n-Propyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat, [α] +21,5° (c, 5,0, CHCl₃) erhielt.

Beispiel 368

Das Verfahren von Beispiel 365 wurde wiederholt, wobei man jedoch n-Butyl-4-chloroacetoacetat als Substrat verwendete und n-Butyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat, [α] +20,1° (c, 3,1, CHCl₃) erhielt.

Allgemeines Verfahren für die Umwandlung von 4-Halo- 3(R)-hydroxybuttersäureestern und -amiden in L-Carnitin Beispiel 369

Eine Mischung aus 4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester (1,5 g), Ethanol (3 ml) und Trimethylamin (25 Gew.%ige Lösung) in 3 ml Wasser wurde 2 Stunden auf 80 bis 90°C erwärmt. Die Lösungsmittel und überschüssiges Trimethylamin wurden im Vakuum abgedampft, wobei man 1,8 g eines rohen Rückstandes erhielt. 1 g des Rohproduktes wurde in einer Lösung aus 10% HCl (7 ml) 1,5 Stunden bei 80 bis 90°C erwärmt. Nach dem Abdampfen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck wurde das Rohprodukt zweimal mit 10 ml absolutem Ethanol extrahiert und das Ethanol wurde im Vakuum abgedampft. Der kristalline Rückstand wurde in einer kleinen Menge Ethanol gelöst und das L-Carnitinchlorid durch Zugabe von Ether ausgefällt und in einer Ausbeute von 320 mg, F: 142°C (Zersetzung), [α] -23,7° (c, 4,5, H₂O) erhalten.

Das L-Carnitinchlorid kann einfach in das pharmazeutisch bevorzugte innere Salz des L-Carnitins durch Ionenaustausch sowie auf andere Art überführt werden.

Beispiel 370 Octyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrat (IX)

Eine Mischung aus Octyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat (II) (1,426 g) und wasserfreiem NaJ (1,2 g) in 15 ml Methylethylketon wurde 24 Stunden rückflußbehandelt. Die Mischung wurde auf einen Drehverdampfer gegeben und mit 100 ml Ether und 50 ml Wasser umgesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit einer 10%igen Natriumthiosulfatlösung (150 ml), Sole (150 ml) gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft, wobei man 1,762 g (IX) als hellgelbes Öl erhielt.

IR (Dünnschicht) 3460 cm^-1 (OH) und 1730 cm^-1 (Ester C=O);

PMR (CDCl₃) 3,93-4,27 (m, 3H)
3,17 (d, 2H),
2,50 (d, 2H),
1,50-1,87 (m, 2H),
1,30 (bs, 12H),
0,93 (m, 3H).

Umwandlung des Octyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrats (IX) in L-Carnitin

Zu einer Lösung von 1,593 g (IX) in 15 ml Methanol wurden 8 ml einer 25%igen wäßrigen Trimethylaminlösung gegeben. Die Mischung wurde 20 Stunden bei 27°C gerührt. Die Lösungsmittel und das überschüssige Trimethylamin wurden unter vermindertem Druck abgedampft, wobei ein halbkristalliner Feststoff (X) zurückblieb. Dieser Rückstand wurde mit einer geringen Menge Ether zur Entfernung des Octanols gewaschen und dann in Wasser gelöst und über eine Dowex 1-x4 (OH^- Form, 50-100 Mesh, Säulenvolumen 2,5×15 cm) Säule gegeben. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser gewaschen. Beim Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum aus den ersten 200 ml des Eluats erhielt man L-Carnitin als weißen kristallinen Feststoff (490 mg, 65%ige Ausbeute) [α] -29,2° (c, 6,5, H₂O).

Beispiel 371

Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von Hexyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat, wobei man Hexyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyral erhielt, welches dann in L-Carnitin überführt wurde.

Beispiel 372

Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von Heptyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat, wobei man Heptyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrat erhielt, welches dann in L-Carnitin überführt wurde.

Beispiel 373

Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von Decyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat, wobei man Decyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrat erhielt, welches dann in L-Carnitin überführt wurde.

Beispiel 374

Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, wobei man jedoch Methyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat (VIII) verwendete und Methyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrat erhielt, welches dann in das L-Carnitin überführt wurde.

Beispiel 375

Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, unter Verwendung von Ethyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat, wobei man Ethyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrat erhielt, welches dann in das L-Carnitin überführt wurde.

Beispiel 376

Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von n-Propyl-4-chloro-3(R)- hydroxybutyrat, unter Erhalt von n-Propyl-4-jodo- 3(R)-hydroxybutyrat, welches dann in das L-Carnitin überführt wurde.

Beispiel 377

Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von n-Butyl-4-chloro-3(R)- hydroxybutyrat, welches n-Butyl-4-jodo-3(R)-hydroxy butyrat ergab, welches dann in das L-Carnitin überführt wurde.

Claims

1. Optisch aktive γ-substituierte β-Hydroxybuttersäurederivate mit 3(R)-Konfiguration der allgemeinen Formel worin bedeuten:X Chlor, Brom, Jod oder OH,
R einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Rest aus der Gruppe
Alkoxyreste mit 1 bis 15 Kohlenstoffatomen,
Alkylaminoreste mit etwa 5 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen,
Cycloalkoxyreste und Cycloalkylaminoreste mit etwa 5 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen,
Phenoxy- und Phenylalkoxyreste mit 7 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen, die mit einem Niedrigalkyl, einem Halogen oder einer Nitrogruppe substituiert sein können,
Phenylamino- und Phenylalkylaminoreste der Formeln worin Y und Z H, eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl und A H, CH₃, Cl oder Br bedeuten.

2. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven γ-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäurederivaten der Formel worin X und R die im Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, mit der Bedingung, daß, wenn R einen Alkoxyrest bedeutet, dieser 5 bis etwa 15 Kohlenstoffatome hat, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der allgemeinen Formel worin X und R die oben angegebenen Bedeutungen haben, der fermentativen enzymatischen Einwirkung eines der folgenden Mikroorganismen unterwirft:Hefen
1. Candida lipolytica NRRL Y-1095
2. Candida pseudotropicalis NRRL Y-1264
3. Mycoderma cerevisiae NRRL Y-1615
4. Torula lactosa NRRL Y-329
5. Geotrichum candidum NRRL Y-552
6. Hansenula anomala NRRL Y-366
7. Hansenula subpelliculosa NRRL Y-1683
8. Pichia alcoholophila NRRL Y-2026
9. Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12, 632
10. Saccharomyces lactis NRRL Y-1140
11. Zygosaccharomyces priorianus NRRL Y-12, 624
12. Saccharomyces acidifaciens NRRL Y-7253
13. Kloeckera corticis ATCC 20109
14. Cryptococus mascerans ATCC 24194
15. Rhodotorula sp. ATCC 20254
16. Candida albicans ATCC 752
17. Dipodascus albidus ATCC 12934
18. Saccharomyces cerevisiae (commercial Red Star)
19. Rhodotorula rubra NRRL Y-1592
20. Oospora lactis ATCC 14318Fungi
1. Gliocladium virens ATCC 13362
2. Caldariomyces fumago ATCC 16373
3. Linderina pennisopora ATCC 12442
4. Aspergillus ochraceus NRRL 405
5. Trichoderma lignorum ATCC 8678
6. Heterocephalum autantiacrum ATCC 16328
7. Entomophthora coronata NRRL 1912
8. Scopulariopsis constantini NRRL 1860
9. Zygorhynchus heterogamus ATCC 6743
10. Scopulariopsis brevicaulis NRRL 2157
11. Rhizopus arrhizus NRRL 2286
12. Penicillium thomii NRRL 2077
13. Mucor hiemalis (-) NRRL 4088
14. Byssochlamys nivea ATCC 12550
15. Penicillium patulum NRRL 1952
16. Metarrhizium anisopliae ATCC 24942
17. Penicillium islandicum ATCC 10127
18. Cunninghamella elegans ATCC 10028a
19. Cunninghamella echinulata ATCC 11585a
20. Aspergillus fumigatus ATCC 16907
21. Aspergillus amstelodami NRRL 90
22. Gliocladium roseum ATCC 10521
23. Aspergillus giganteus ATCC 10059
24. Absidia blakeleeana ATCC 10148b
25. Penicillium roqueforti NRRL 849a(NRRL - Northern Regional Research Lab. at Peoria, Illinois.
ATCC - American Type Culture Collection at Rockville, Maryland)und daß man das gewünschte optisch aktive 4substituierte 3(R)-Hydroxybuttersäurederivat aus dem fermentativen Reaktionsgemisch gewinnt.

3. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven γ-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäurederivaten der Formel worin X die im Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat und
R ein Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der allgemeinen Formel worin X und R die oben angegebenen Bedeutungen haben, der enzymatischen Einwirkung von L-β- Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase in reiner Form unterwirft und daß man das gewünschte, optisch aktive γ-substituierte 3(R)-Hydroxy buttersäurederivat aus dem enzymatischen Reaktionsgemisch gewinnt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die L-β- Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase in reiner Form aus Schweineherzen isoliert wurde.

5. Verwendung eines optisch aktiven γ-substituierten β-Hydroxybuttersäurederivates gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines inneren Salzes von L-Carnitin.