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DE3208919A1 - Anordnung zur messung der fluoreszenzpolarisation - Google Patents

Anordnung zur messung der fluoreszenzpolarisation

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DE3208919A1
DE3208919A1 DE19823208919 DE3208919A DE3208919A1 DE 3208919 A1 DE3208919 A1 DE 3208919A1 DE 19823208919 DE19823208919 DE 19823208919 DE 3208919 A DE3208919 A DE 3208919A DE 3208919 A1 DE3208919 A1 DE 3208919A1
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Wolfgang 3008 Garbsen Beisker
Wolfgang Dr. 3000 Hannover Eisert
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Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
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STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
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Description

Beschreibung:
Die-Erfindung betrifft eine Anordnung zur Messung der Fluoreszenzpolarisation von Zellen und Partikeln, welche, vereinzelt längs eines Fadens ausgerichtet mittels eines Beleuchtungsfeldes bestrahlt werden.
Bei der Messung des Fluoreszenzpolarisationsgrades wird das Fluoreszenzlicht üblicherweise entweder unter 90 mit einem gewissen Öffnungswinkel oder in Rückwärtsrichtung (0°) in einem Winkelbereich erfaßt. Zum Abgleich der beiden Detektionskanäle (Photodetektor, Elektronen-Verstärker) für parallel bzw. senkrecht polarisiertes Fluoreszenzlicht wird bei einer 90 Anordnung die Polarisationsebene des Anregungslichtes so gedreht, daß sie in der durch die beiden optischen Achsen (Anregung, Detektion) aufgespannten Ebene liegt. Die beiden Detektionskanäle empfangen dann unpolarisiertes Licht und können so auf gleiche Empfindlichkeit eingestellt werden. Bei de.r eigentlichen Messung steht der Polarisationsvektor senkrecht auf dieser Ebene. Da die Fluoreszenz mit einem gewissen Öffnungswinkel aufgenommen wird, spielen Brechungsindex- unterschiede in jeder Zelle, aber auch in den umgebenden Medien eine wesentliche Rolle bei der Abschwächung einer einzelnen Polarisationskomponente bei der Messung. Ein solcher Abgleich müßte daher in der 90 -Anordnung bei jeder zu messenden Zelle erfolgen. Dieses ist jedoch besonders dann unpraktikabel, wenn für die Registrierung einer Verteilungsfunktion große Mengen von Zellen in kurzer Zeit nacheinander vermessen
werden müssen, wie dies zum Beispiel bei der Durchflußzytometrie der Fall ist.
Bei der Auflichtfluoreszenzpolarisationsmessung besteht ein gewisser Vorteil darin, daß die Einflüsse der Streuung des Fluoreszenzlichtes an internen Strukturen auf die Messung des realen Fluoreszenzpolarisationsgrades von wesentlich geringerer Bedeutung als bei der 9O°-Messung sind. Zum Abgleich der beiden Photodetektoren, wird auch hier bei einer Einzelmessung die Polarisationsrichtung des Anregungslichtes um 90° gedreht, so daß der Detektor für parallel polarisiertes Fluoreszenzlicht dann das senkrecht polarisierte Fluoreszenzlicht empfängt und umgekehrt. Dieses Verfahren hat darüberhinaus noch"den Voretil, daß beide Einzelmessungen zur Verbesserung der Genauigkeit der Messung des Fluoreszenzpolarisationsgrades beitragen.
Bei der schnellen Einzelmessung an einem großen Zeilkollektiv wird das Kollektiv willkürlich in ein oder mehrere jeweils gleich große Zeilpopulationspaare zerlegt. Bei jedem Paar wird dann zunächst der Fluoreszenzpolarisationsgrad der einen Hälfte der Population mit einer Anregungspolarisation in.einem Histogram aufgezeichnet, dann die Anregungspolarisation um 90 gedreht und der Fluoreszenzpolarisationsgrad der zweiten Hälfte in einem zweiten Histogram aufgezeichnet. Bei perfektem Abgleich der Detektorkanäle müssen unter der Voraussetzung, daß beide Hälften der Zellpopulation ein gleiches Verhalten bezüglich ihres Fluoreszenzpolarisationsgrades haben die beiden Polarisationsgradhistogramme gleich sein. Sind diese
nicht gleich, was bei der Mehrzahl der Messungen beobachtet werden kann, so müssen im Gegensatz zu
ο
der Messung in einer 90 -Anordnung die gewonnenen Werte nicht verworfen werden, sondern können mit der Hilfe eines Tischrechners miteinander verrechnet werden, daß sich ein korregiertes Histogram des Fluoreszenzpolarisationsgrades ergibt (Siehe: W.G. Eisert und W. Beisker; Biophys. J. 21' 97 (1980)).
Alle diese Meßverfahren benötigen zum Abgleich des Meßsystems sowie zur Korrektur am Einzelobjekt zwei Einzelmessungen. Diese Korrektur kann wie im Fall der 90 -Anordnung gar nicht, bzw. nur durch Abgleich vor und Kontrolle des Abgleichs nach der Messung oder wie im Fall der Auflichtfluoreszenzpolarisation über eine statistische Analyse von- Subpopulationen durchgeführt werden.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht nunmehr darin, eine Anordnung zu bieten, mit der eine Messung der Polarisation des Fluoreszenzlichtes im gleichen Halbraum der Anregung der Fluoreszenz von Einzelpartikeln mit Selbstkorrektur möglich wird, wobei die Zellen oder Partikel einzeln und nacheinander durch ein Meßfeld geführt werden und der Polarisationsgrad der Fluoreszenzemission dabei so gemessen worden ist, daß unvermeidbare Schwankungen im optischen uhd elektronischen Meßsystem den Meßwert nicht beeinflussen.
Die Lösung dieser Aufgabe ist in den kennzeichnenden Merkmalen der Anspruches 1 beschrieben.
Die weiteren Ansprüche geben vorteilhafte Ausführungsbeispiele und Weiterbildungen der Erfindung wieder.
Bei der erfindungsgemäß durchgeführten Korrektur der Fluoreszenzpolarisationsmessung an einem Einzelobjekt in Auflichtanordnung durch eine weitere Messung mit um 90 gedrehter Anregungspolar
prinzipiell zwei Möglichkeiten:
um 90 gedrehter Anregungspolarisation bestehen somit
1) Einstrahlsystem: Während die Zelle im Meßfeld ist, bzw. sich durch dieses bewegt, wird die Polarisationsrichtung im 90 gedreht und durch eine geeignete elektronische Schaltung werden vier Meßwerte für dieses Objekt registriert (2 parallele, 2 senkrechte Intensitätsmessungen). Diese Möglichkeit ist bei langsamen Wechsel der Objekte realisierbar.
2) Doppelstrahlsystem: Ein Objekt passiert in einem Meßfeld zwei Lichtstrahlen zur Anregung der Fluo-reszehz nacheinander. Die Polarisationsrichtungen der Anregungsstrahlen stehen dabei senkrecht aufeinander. Die beiden Polarisationskomponenten der Fluoreszenz an beiden Anregungsstellen werden nacheinander mit Hilfe eines Paares von Detektionskanälen registriert. Ein Spezielles elektronisches Analysesystem berechnet aus den vier vorliegenden Meßwerten den korregierten Fluoreszenzpolarisationsgrad bevor das nächste Objekt in das Meßfeld eintritt. Bei der Aufspaltung eines unpolarisierten Anregungsstrahls in seine beiden Polarisationsrichtungen können diese bei der Verwertung eines
ft ti * C-
entsprechend geschnittenen Calzid Kristalls auch in zwei parallele Strahlen räumlich getrennt werden.
Diese erfindungsgemäße Anordnung gestattet erstmals unter Beibehaltung einer internen Korrektur Veränderungen im Polarisationsgrad der Einzelzellen eines Kollektives in schneller Abfolge zu messen. Die derzeit erzielte Geschwindigkeit der elektronischen Meß-.wertverarbeitung - und speicherung läßt eine Messung alle ca. 100 ,usec zu. Damit werden bei einer Abspeicherung der Meßdaten in einer Liste auch schnelle Änderungen des Fluoreszenzpolarisationsgrades in einer sich verändernden Population meßbar. Die Berechnung des Polarisationsgrades aus vier Einzelmessungen ermöglicht weiterhin für jede Zelle die numerische Korrektur der sogenannten Apertur und Beugungsfehler.
Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels mittels der Figuren 1 - 4 näher erläutert.
Die Figur 1 zeigt schematisch die Bestrahlungsanlage der auf einem Strömungsfaden 1 vereinzelt ausgerichteten Zellen 2,2",... Ein Laserstrahl 3 wird hierzu in einem Polarisationsteiler 4 in zwei Einzelstrahlen 5, 6 zerlegt, deren Polarisationsrichtungen E senkrecht zueinander stehen (Doppelpfeile). Ein im Winkel zu bei-.den Strahlen 5, 6 stehender Umlenkspiegel 7 richtet die beiden parallel zueinander verlaufenden Strahlen 5, 6 auf die Optik 8 mit u.a. den beiden Linsen 9 und 10. Die Linse 9 fokussiert die beiden Strahlen 5, "6 mit zueinander senkrechter Polarisationsrichtung auf
zwei Bereiche 11,12 innerhalb des Strömungsfadens 1, durch die die einzelnen Zellen 2, 2' hindurchtreten und die einen konstanten Abstand voneinander aufweisen. Die Extinktion wird mittels der beiden Detektoren 13, 14 gemessen, auf die die Strahlung mittels der Linie 10 gerichtet ist.
Die Figur 2 gibt die Detektoranordnung der von den Zellen 2 (hier wird nur der Durchgang einer Zelle 2 durch beide Fokusbereiche 11, 12 betrachtet) abgegebene Fluoreszenzstrahlung wieder (Die Beleuchtungseinrichtung mit den beiden Strahlen 5, 6 ist der Einfachheit halber weggelassen; die Strahlengänge lägen jedoch auf der gleichen optischen Achse). Die in den Bereichen 11, 12 in der Zelle 2, 2' von der Strahlung 5, 6 durch das plane Fenster 18 hindurch angeregte -Fluoresze'nzstrahlung mit senkrecht zueinander stehender Polarisationsrichtung und unterschiedlicher Intensität bezüglich des Anregungsbereiches 11, 12 bzw. des Aufenthaltsortes der Zelle 2 (einmal im Bereich 11 und nach der Zeit Afc im Bereich 12) wird gleichzeitig mit dem Detektor 15 (PM . und gleichzeitig mit dem Detektor 16 (PM )gemessen. Die Fluoreszenzstrahlungen werden hierzu mit einem weiteren Polarisationsstrahlungsteiler 17 je nach Polarisationsrichtung und entsprechend des Polarisationsgrades der angeregten Zelle 2 wiederum aufgeteilt, so daß ■jeweils zwei Meßwertpaare der Detektoren 15 bzw. 16 im Zeitabstand At,d.h. jweils beim Durchlaufen der Meßorte 11 und 12,voneinander aufgenommen werden. Diese vier Meßwerte dienen dann der Selbstkorrektur des Fluoreszenznolarisationsmeßsystems der vorliegenden
erfindungsgemäßen Art. Die Extinktion wird, wie bereits in Figur 1 dargestellt, mit den beiden Detektoren 13 und 14 gemessen, wobei die Anregungsbzw. Fluoreszenzstrahlung das Strömungsystem durch das ebenfalls plane Fenster 19 verläßt.
Die Rechner- und Kontrollschaltung für diese Selbstkorrektur ist in Figur 3 schematisch wiedergegeben. Die vier Meßwerte 2 χ PM , 2 χ PM der Detektoren 15, 16, deren Intensität und Form im Zeitabstand At dargestellt ist, werden über eine Maximum-Dekodierschaltung mit TTL-Control-Logic 20, die die Amplituden X1, X„, Y.., Y- abgibt, dem Analog-Digitalümwander 21 und dann über den Data-Adress- and Control-BUS 22 dem Z-80 Mikrokomputer 2 3 zugeführt. Dieser Mikrokomputer 23 mit entsprechenden "Peripheriegeräten 24, 25 berechnet jeweils die Selbstkorrektur pro Zelle 2 und dient zur Datenabspeicherung, sofern keine sofortige Übertragung über 25 auf einen Minicomputer stattfindet. Die Extinktionsmeßwerte EX-, EX„, deren zeitliche Lage entsprechend der Meßwerte PM ebenfalls dargestellt ist, werden einem
Ji
Decoder 26 zugeführt, der mit der Recheneinheit 2 3 über den At-Computer 27 (Start-Stop) in Verbindung steht.
Die jeweiligen Signale an den Schranken S1, S~ (siehe Fig. 3 u. 4)sowie die Signale TLL und TVL,die lurch Vergleich des aktuellen Zählerstandes At mit den von 23 und 27 übermittelten Werten (1 - a)ilt und (1 + a)Atin 27 entstehen,werden der Impulsanalyseeinheit nach Figur 4 zugeführt.
- 10 -
Für TLL und TUL gilt:
1, wenn 4 t<(1-a) t
TLL = \
TUL = ( 1'
I 0
0 sonst
3nn4 t> (1+a) t
0 sonst
Die weitere logische Verrechnung von S , S„, TUL, TLL zur Bildung der Steuersignale für die Maximumsdekoder in 20 ist in Figur 4 gezeigt. 28 sperrt die Einheit für jeweils ein einstellbares Zeitintervall (z.B. 40 ,usec) nach jedem Teilchen durch S1. 29 kombiniert die möglichen Fehlerbedingungen und setzt gegebenenfalls das Error-Flipflop 30, das von 23 über ERRORFLAG abgefragt werden kann. Flipflop 31 und 32 dienen zur Speicherung des Impulsmaximums im Maximumdekoder und können VIA(RSTI) durch 2 3 zurückgesetzt, werden. Für jedes Teilchen wird die Verrechnung in 23 über (INTERRUPT) gestartet. Über Monoflop 33 wird Flipflop 34 gesetzt, um die Aussteuerung der Maximumdekoder durch ein weiteres Teilchen, das innerhalb der Verrechungszeit in 23 den 1. Fokus 11 passiert, zu verhindern. Gleichzeitig bestimmt 33 die Länge des INTERRUPT-Signales.
- 11 -
At<(1-t
0 O (1-
0 1 ti
1 0 Il
1 1 ■ Il
0 O At
0 1 At
1 0 At
1 1 At
0 O (1 +
0 1 U
1 O Il
1 1 Il
ja
Hierbei ist α eine frei wählbare Größe für die Breite des Zeitfensters (z.B. =0.1) <3t: Flugzeit At: mittlere Flugzeit (nach Verrechnung)
Erläuterungen:
Spalte (1): Flugzeit At zwischen den Schranken S1 und S2
Spalte (2): Gleichzeitige Unterbrechung der Foci Sl und S2 (Bereiche 11, 12) entweder durch zu lange Teilchen oder durch ein zweites Teilchen
Spalte (3): Teilchen in Ξ1 (Bereich 1 1 )■ innerhalb
eines Zeitintervalls (beliebig wählbar) nach einer Unterbrechung der Schranke S1
- 12 -
il
Saplte (4): Für die Zeitmittelung zur Verrechnung kommende Flugzeit
Spalte (5): Messung der Fluroeszenzpolarisation.
Zusätzliche Bedingung hierfür ist, daß die Fluoreszenzintensität aller vier Meßkanäle oberhalb eines wählbaren■Levels ist.
Leerseite

Claims (4)

  1. GESELLSCHAFT FÜR STRAHLEN- Neuherberg, 9.03.1982 UND UMWELTFORSCHUNG MBH, PLA 8218 Ga/hr MÜNCHEN
    Patentansprüche:. ·
    ( !.^Anordnung zur Messung der Fluoreszenzpolarisation von Zellen, welche, vereinzelt längs eines Fadens -- ■ ausgerichtet, mittels eines Beleuchtungsfeldes bestrahlt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen (2, 2') zwei Lichtstrahlen (5, 6) zur Anregung der Fluoreszenz nacheinander passieren, daß die Polarisationsrichtungen der Anregungsstrahlen (5, 6) senkrecht zueinander stehen, daß ein Paar von Detektorkanälen (15, 16) die beiden Polarisationskomponenten der Fluoreszenz an beiden Anregungs- ■■ stellen (11, 12) nacheinander registriert, und daß \ ein Analysesystem (20 - 27) vorgesehen ist, das aus den Meßwerten den korrigierten Fluoreszenzpolarisationsgrad für die einzelne Zelle (2, 2') berechnet.
  2. 2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Lichtstrahlen (5, 6) durch Aufspaltung eines unpolarisierten Anregungsstrahles (3) oder eines polarisierten Anregungsstrahles (3) bei- Einstellung der Polarisationsrichtung im Winkel von 45 zu den Polarisationsrichtungen nach Aufspaltung erzeugbar sind.
  3. 3. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregung mittels eines Lichtstrahls erfolgt, dessen Polarisationsrichtung um 90° während der Anregung der Fluoreszenz gedreht wird.
  4. 4. Anordnung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß in beiden Anregungsbebereichen (1 1, 12) die Extinktion meßbar ist.
    -X-
DE19823208919 1982-03-12 1982-03-12 Anordnung zur messung der fluoreszenzpolarisation Granted DE3208919A1 (de)

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