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DE3202289A1 - C1-Esterase inhibitor activity determn. e.g. in plasma - by spectrophotometric analysis of chromogenic peptide substrate cleavage prods. (AT 15.04.82) - Google Patents

C1-Esterase inhibitor activity determn. e.g. in plasma - by spectrophotometric analysis of chromogenic peptide substrate cleavage prods. (AT 15.04.82)

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DE3202289A1
DE3202289A1 DE19823202289 DE3202289A DE3202289A1 DE 3202289 A1 DE3202289 A1 DE 3202289A1 DE 19823202289 DE19823202289 DE 19823202289 DE 3202289 A DE3202289 A DE 3202289A DE 3202289 A1 DE3202289 A1 DE 3202289A1
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DE
Germany
Prior art keywords
esterase
arg
activity
pna
leu
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE19823202289
Other languages
German (de)
Inventor
Hartmut Dipl.-Chem. 7750 Konstanz Echner
Anton 2490 Ebenfurt Philapitsch
Wolfgang Prof. Dr. 7401 Tübingen Voelter
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Original Assignee
Immuno AG
Immuno AG fuer Chemisch Medizinische Produkte
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immuno AG, Immuno AG fuer Chemisch Medizinische Produkte filed Critical Immuno AG
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

In a new procedure for the determn. of the C1-esterase inhibitor (CEI) activity of CEI-contg. specimens by comparison of the C1-esterase activity of a standardised C1-esterase prepn. with that of the same standardised prepn. in the presence of the CEI-contg. specimen, the C1-esterase activity is determined by spectrophotometric examination of cleavage prods. of chromogenic peptide derivs. R1-A-B-NH-R (I) (where R1 is H, alkyl, a sulphonyl residue (esp. benzenesulphonyl or p-methoxy-benzenesulphonyl) or acyl (esp. alkoxycarbonyl or formyl); A is an amino acid component or di- or tripeptide residue; B is D-Arg, L-Arg, D-Lys, L-Lys, D-Orn, L-Orn, D-Tyr, L-Tyr, D-Ala or L-Ala; and NH-R is a chromophoric or fluorescent gp.). Used for determin. of C1-esterase inhibitor activity in human and animal body fluids.

Description

Verfahren zur Bestimmung der C1-Esterase-Inhibitor-Procedure for the determination of the C1 esterase inhibitor

Aktivität von C1-Esterase-Inhibitor-hältigen Proben Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der C1-Esterase-Inhibitor-Aktivität von C1 -Esterase-Inhibitorhältigen Proben durch Vergleich der C1-Esterase-Aktivität einer standardisierten C1-Esterase-Präparation mit der Aktivität der gleichen standardisierten Präparation in Gegenwart der zu untersuchenden C1-Esterase-Inhibitorhältigen Probe, wobei die Differenz der erhaltenen Werte ein Maß für die Inhibitor-Aktivität der Probe darstellt.Activity of samples containing C1 esterase inhibitor The invention relates to a method for determining the C1 esterase inhibitor activity of C1 - Samples containing esterase inhibitor by comparing the C1 esterase activity of a standardized C1 esterase preparation with the activity of the same standardized Preparation in the presence of the C1 esterase inhibitor-containing sample to be examined, wherein the difference between the values obtained is a measure of the inhibitor activity of the Sample represents.

In menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten ist ein mit C1-Esterase~bezeichnetes Enzym vorhanden, welches mit einem ebenfalls vorhandenen Inhibitor bzw. Inaktivator einen inaktiven Komplex bildet. Bei verschiedenen Untersuchungen bzw. Behandlungen ist es von Bedeutung, den C1-Esterase-Inhibitor-Gehalt quantitativ zu bestimmen.In human and animal body fluids there is a C1-Esterase ~ Enzyme present, which with an also present inhibitor or inactivator forms an inactive complex. During various examinations or treatments it is important to quantitatively determine the C1 esterase inhibitor content.

Die chemische Struktur der C1-Esterase ist unbekannt, jedoch weiß man aus "Thrombosis Research" 18, No. 6,847-859 (1980), daß im C1-Esterase-Molekül verschiedene aktive Zentren vorhanden sind, von denen eines durch den C1-Esterase-Inhibitor blockierbar ist.The chemical structure of C1 esterase is unknown, but it is white from "Thrombosis Research" 18, no. 6,847-859 (1980) that in the C1 esterase molecule different active centers are present, one of which is through the C1 esterase inhibitor can be blocked.

Eine bekannte Methode zur Bestimmung der Aktivität des C1-Esterase-Inhibitors beruht auf der esterspaltenden Wirkung von C1-Esterase. Als Substrat wird ein Ester einer aromatischen Aminosäure (z.B.N-Acetyl-L-Tyrosinäthylester ) verwendet, wobei der Ester gespalten und die freigesetzte Säure bestimmt wird (Proc. Soc. Exp.A well-known method for determining the activity of the C1 esterase inhibitor is based on the ester-splitting effect of C1-esterase. An ester is used as the substrate an aromatic amino acid (e.g. N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester ) used, whereby the ester is cleaved and the acid released is determined (Proc. Soc. Exp.

Biol.Med. 101, 608-611 (1959), J. Clin. Pathol. 1980; 33, 167-170). Diese esterolytische Bestimmungsmethode ist ungenau und aufwendig und sie wird den tatsächlichen in vivo-Reaktionen des Enzyms nicht gerecht.Biol.Med. 101: 608-611 (1959) J. Clin. Pathol. 1980; 33, 167-170). This esterolytic determination method is imprecise and expensive and it is the does not do justice to actual in vivo reactions of the enzyme.

Weiters ist eine Bestimmungsmethode aufgrund der amidolytischen Wirkung der C1-Esterase bekannt, u.zw. aus "Thrombosis Research", Vol. 18, No. 6, 847-859 (1980).Another method of determination is based on the amidolytic effect the C1 esterase known, u.zw. from "Thrombosis Research", Vol. 18, No. 6, 847-859 (1980).

Bei dieser Methode wird die C1-Esterase-hältige Probe mit einem chromogenen Substrat auf Tripeptid-Basis umgesetzt und die Extinktion des abgespaltenen Chromophors (p-Nitroanilin) auf spektrophotometrischem Weg bestimmt.In this method, the C1-esterase-containing sample is mixed with a chromogenic The tripeptide-based substrate is converted and the extinction of the cleaved chromophore (p-nitroaniline) determined by spectrophotometric means.

Mit dieser Methode läßt sich jedoch der klinisch relevante C1-Esterase-Inhibitor-Gehalt nicht erfassen, weil mit und ohne Inhibitor-Zusatz das gleiche Meßergebnis gefunden wird. Dies ist auf die Sequenz und Raumstruktur des dort eingesetzten chromogenen Substrates zurückzuführen.With this method, however, the clinically relevant C1 esterase inhibitor content can be determined do not record because the same measurement result was found with and without the addition of an inhibitor will. This is due to the sequence and spatial structure of the chromogenic used there Substrate.

Die Erfindung bezweckt die Vermeidung dieser Nachteile und Schwierigkeiten der bisherigen Bestimmungsmethoden und stellt sich die Aufgabe, die Aktivität bzw. den Gehalt von C1-Esterase-Inhibitor in menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten zuverlässig festzustellen.The invention aims to avoid these disadvantages and difficulties the previous determination methods and the task is to determine the activity or the level of C1 esterase inhibitor in human or animal body fluids reliable to determine.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Einsatz von Substraten gelöst, welche bestimmte chromogene Verbindungen auf Basis von Di-, Tri- oder Tetrapeptiden mit chromophoren oder fluoreszierenden Gruppen enthalten.This object is achieved according to the invention by using substrates which specific chromogenic compounds based on di-, tri- or tetrapeptides with chromophoric or fluorescent groups.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der C1 Esterase-Inhibitor-AktiviSt ist dadurch gekennzeichnet, daß die C1-Esterase-Aktivität der zu vergleichenden Präparat ionen durch spektrophotometrische Untersuchung von Spaltprodukten chromogener Verbindungen der allgemeinen Formel R1 - A - B - NH - R oder deren Säureadditionssalzen festgestellt wird, in welcher Formel R1 für Wasserstoff, Alkyl, einen Sulfonylrest, insbesondere Benzolsulfonyl oder p-Methoxybenzolsulfonyl (Mbs) oder einen Acylrest, insbesondere Alkoxycarbonyl, wie tert. Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl oder Formyl, A für eine Aminosäurekomponente, einen Di- oder einen Tripeptidrest, B für eine der folgenden Aminosäurekomponenten: D-Arg, L-Arg, D-Lys, L-Lys, D-Orn, L-Orn, D-Tyr oder L-Tyr, D-Ala oder L-Ala,und -NH-R für eine chromophore oder fluoreszierende Gruppe stehen.The method according to the invention for determining the C1 esterase inhibitor activity is characterized in that the C1 esterase activity to be compared Preparations by spectrophotometric analysis of chromogenic cleavage products Connections of general Formula R1 - A - B - NH - R or their Acid addition salts, in which formula R1 for hydrogen, alkyl, a sulfonyl radical, in particular benzenesulfonyl or p-methoxybenzenesulfonyl (Mbs) or an acyl radical, especially alkoxycarbonyl, such as tert. Butyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl or formyl, A for an amino acid component, a di- or a tripeptide residue, B for one of the following amino acid components: D-Arg, L-Arg, D-Lys, L-Lys, D-Orn, L-Orn, D-Tyr or L-Tyr, D-Ala or L-Ala, and -NH-R for a chromophoric or fluorescent Standing group.

Vorteilhaft werden neue chromogene Verbindungen verwendet, worin R1 für Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder für p-Methoxybenzolsulfonyl (Mbs) steht.New chromogenic compounds are advantageously used in which R1 represents alkyl having 1 to 4 carbon atoms or represents p-methoxybenzenesulfonyl (Mbs).

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden neue chromogene Verbindungen verwendet, in denen A für eine Aminosäurekomponente A1 mit der folgenden Bedeutung: Sar, L-(Me)Val, D-Leu, L-(Me)Phe, D-Val, D-Phe, L-Phe, L-(Me)Leu, Gly, L-Igln, L-Ala, ß-Ala oder Gaba, oder für ein Dipeptid A1-A2, worin A1 die vorgenannte BedeutunghatufA2 Gly, L-Pro, L-Leu, L-Val, L-Ile oder eine Einfachbindung bedeutet, oder für ein Tripeptid A1-A2-A3,-worin A1 und A2 vorstehende Bedeutung haben und A3 L-Pro oder eine Einfachbindung bedeutet, steht.According to a further preferred embodiment, new chromogenic Compounds used in which A represents an amino acid component A1 with the following Meaning: Sar, L- (Me) Val, D-Leu, L- (Me) Phe, D-Val, D-Phe, L-Phe, L- (Me) Leu, Gly, L-Igln, L-Ala, β-Ala or Gaba, or for a dipeptide A1-A2, wherein A1 is the aforementioned MeaninghatufA2 means Gly, L-Pro, L-Leu, L-Val, L-Ile or a single bond, or for a tripeptide A1-A2-A3, -wherein A1 and A2 have the above meaning and A3 L-Pro or a single bond means stands.

Zweckmäßig werden chromogene Verbindungen verwendet, in denen -NH-R durch Halogen substituiertes p-Nitroanilid bedeutet.Chromogenic compounds are expediently used in which -NH-R means p-nitroanilide substituted by halogen.

Die Bestimmung des Inhibitor-Gehaltes auf diesem amidolytischen Weg entspricht weitgehend in vivo-Verhältnissen von Patienten.The determination of the inhibitor content in this amidolytic way largely corresponds to in vivo patient conditions.

Bevorzugte Verbindungen, die sich zur Anwendung bei den erfindungsgemäßen Arbeitsweisen eignen, sind die folgenden: Mbs-Gly-Gly-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA Z-Sar-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA Z-L-(Me)Val-L-Leu-L-Arg-pNA H-D-Leu-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA Z-L-(Me)Phe-L-Val-L-Arg-pNA Z-D-Val-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA Z-D-Leu-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA Z-D-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA -H-D-Val-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA Z-D-Phe-L-Leu-L'Arg-o-C1-pNA Z-L-(Me)Leu-L-Leu-L-Arg-pNA Z-L-Phe-L-Val-L-Arg-o-Cl-pNA (Me)2-Gly-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA Z-L-(Me)Phe-L-Ile-L-Arg-pNA Z-D-Tyr-L-Val-L-Arg-pNA Z-D-Tyr-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA Z-'1-Igln-Gly-'1-Arg-pNA Z-g-Ala-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA Mbs-L-Ala-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA Mbs-Gaba-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA Mbs-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA Mbs-Gly-L-Pro-L-Lys-o-Cl-pNA Mbs-p-Ala-L-Pro-L-Lys-o-Cl-pNA Mbs-Gaba-L-Pro-L-Arg-pNA Die im vorstehenden und in der weiteren Beschreibung verwendeten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung: Aminosäuren H-Aib-OH Aminoisobuttersäure H-Ala-OH Alanin H-P-Ala-OH p-Alanin H-Arg-OH Arginin H-Gaba-OH γ-Aminobuttersäure H-Glu-OH Glutaminsäure H-Iglu-OH Isoglutaminsäure H-Igln-OH Isoglutamin H-Gly-OH Glycin H-Ile-OH Isoleucin H-Leu-OH Leucin H-Lys-OH Lysin H-Orn-OH Ornithin H-Phe-OH Phenylalanin H-Pro-OH Prolin H-Sar-OH Sarkosin H-Tyr-OH Tyrosin H-Val-OH Valin H-(Me)Val-OH N-Methylvalin H-(Me)Phe-OH N-Methylphenylalanin H-(Me)Leu-OH N-Methylleucin (Me)2Gly-oH N,N-Dimethylglycin Sonstiges Adoc Adamantyloxycarbonyl Aoc tert. Amyloxycarbonyl Bpoc Z-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl Boc tert. Butyloxycarbonyl -o-Cl-pNA o-Chlor-p-nitroanilid DCCI Dicyclohexylcarbodiimid Ddz o(,-Dimethyl-3 , 5-dimethoxybenzyloxycarbonyl DMF Dimethylformamid EE Essigsäureäthylester Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Foc Furfuryloxycarbonyl HAc CH3-COOH HMPT Hexamethylphosphorsäuretriamid HOBt 1-Hydroxybenzotriazol Iboc Isobornyloxycarbonyl Mbs p-Methoxybenzolsulfonyl MG Molekulargewicht MeOH Methanol pNA p-Nitroanilid Nvoc 6-Nitroveratryloxycarbonyl PÄ Petroläther Pipoc Piperidinooxycarbonyl Pz p-Phenylazobenzyloxycarbonyl TFA Trifluoressigsäure -ONP p-Nitrophenylester -OPCP Pentachlorphenylester -OTCP Trichlorphenylester -OSu Hydroxysuccinimidester Z Benzyloxycarbonyl Z(p-Br)- p-Brombenzyloxycarbonyl Z(p-Cl)- p-Chlorbenzyloxycarbonyl Z(OMe)- p-Methoxybenzyloxycarbonyl Z(p-NO2)- p-Nitrobenzyloxycarbonyl Z(o-N02)- o-Nitrobenzyloxycarbonyl Z(OMe) 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl Bei der Herstellung der chromogenen Verbindungen müssen die Aminofunktionen der Zwischenstufen durch Schutzgruppen,-welche in der Peptidchemie üblich sind, blockiert werden.Preferred compounds that can be used in the inventive Suitable working methods are the following: Mbs-Gly-Gly-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA Z-Sar-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA Z-L- (Me) Val-L-Leu-L-Arg-pNA H-D-Leu-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA Z-L- (Me) Phe-L-Val-L-Arg-pNA Z-D-Val-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA Z-D-Leu-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA Z-D-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA -HD-Val-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA ZD-Phe-L-Leu-L'Arg-o-C1-pNA ZL- (Me) Leu-L-Leu-L-Arg- pNA ZL-Phe-L-Val-L-Arg-o-Cl-pNA (Me) 2-Gly-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA ZL- (Me) Phe-L-Ile-L- Arg-pNA ZD-Tyr-L-Val-L-Arg-pNA ZD-Tyr-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA Z-'1-Igln-Gly-'1-Arg-pNA Zg-Ala-L -Pro-L-Arg-o-Cl-pNA Mbs-L-Ala-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA Mbs-Gaba-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA Mbs-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA Mbs-Gly-L-Pro-L-Lys-o-Cl-pNA Mbs-p-Ala-L-Pro-L-Lys-o-Cl-pNA Mbs-Gaba-L-Pro-L-Arg-pNA Have the abbreviations used in the above and in the further description the following meaning: amino acids H-Aib-OH aminoisobutyric acid H-Ala-OH alanine H-P-Ala-OH p-alanine H-Arg-OH arginine H-Gaba-OH γ-aminobutyric acid H-Glu-OH glutamic acid H-Iglu-OH Isoglutamic Acid H-Igln-OH Isoglutamine H-Gly-OH Glycine H-Ile-OH Isoleucine H-Leu-OH Leucine H-Lys-OH Lysine H-Orn-OH Ornithine H-Phe-OH Phenylalanine H-Pro-OH Proline H-Sar-OH Sarcosine H-Tyr-OH Tyrosine H-Val-OH Valine H- (Me) Val-OH N-methylvaline H- (Me) Phe-OH N-methylphenylalanine H- (Me) Leu-OH N-methylleucine (Me) 2Gly-oH N, N-dimethylglycine Other Adoc Adamantyloxycarbonyl Aoc tert. Amyloxycarbonyl Bpoc Z- (p-biphenylyl) isopropyloxycarbonyl Boc tert. Butyloxycarbonyl -o-Cl-pNA o-chloro-p-nitroanilide DCCI dicyclohexylcarbodiimide Ddz o (, - dimethyl-3, 5-dimethoxybenzyloxycarbonyl DMF dimethylformamide EE ethyl acetate Fmoc 9-fluorenylmethoxycarbonyl Foc furfuryloxycarbonyl HAc CH3-COOH HMPT hexamethylphosphoric acid triamide HOBt 1-Hydroxybenzotriazole Iboc Isobornyloxycarbonyl Mbs p-Methoxybenzenesulfonyl MG Molecular weight MeOH methanol pNA p-nitroanilide Nvoc 6-nitroveratryloxycarbonyl PÄ petroleum ether Pipoc Piperidinooxycarbonyl Pz p-Phenylazobenzyloxycarbonyl TFA Trifluoroacetic acid -ONP p-nitrophenyl ester -OPCP pentachlorophenyl ester -OTCP trichlorophenyl ester -OSu hydroxysuccinimide ester Z benzyloxycarbonyl Z (p-Br) - p-bromobenzyloxycarbonyl Z (p-Cl) - p-chlorobenzyloxycarbonyl Z (OMe) - p-Methoxybenzyloxycarbonyl Z (p-NO2) - p-Nitrobenzyloxycarbonyl Z (o-N02) - o-Nitrobenzyloxycarbonyl Z (OMe) 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl During manufacture of the chromogenic compounds must pass through the amino functions of the intermediate stages Protecting groups, which are common in peptide chemistry, are blocked.

Als Schutzgruppen kommen in Frage: Boc, Z, Z(OMe), Z(p-Br), Z(p-Cl), Z(p-N02), Z(o-N02), Z(OMe)2, Ddz, Nvoc, Bpoc, Aoc, Adoc, Iboc, Fmoc, Foc, Pipoc, Pz, 4$«-Dimethylbenzyloxycarbonyl, 2-Jod-äthoxycarbonyl, 2-(p-Tosyl)-äthoxycarbonyl, 1-(1-Adamantyl)-1-methyläthoxycarbonyl (Adpoc), p-Toluolsulfonyl, Phthalyl, Trifluoracetyl, Triphenylmethyl, o-Nitrophenylthio, Formyl, Benzylsulfonyl, o-Hydroxyaryliden, Acetoacetyl, 5,5-Dimethylcyclohexadion, Benzyl, o-Nitrophenoxyacetyl und insbesondere Mbs. Die Mbs-Gruppe erweist sich gegenüber vielen anderen Schutzgruppen speziell für erfindungsgemäß einsetzbare chromogene Substrate als vorteilhaft.Possible protective groups are: Boc, Z, Z (OMe), Z (p-Br), Z (p-Cl), Z (p-N02), Z (o-N02), Z (OMe) 2, Ddz, Nvoc, Bpoc, Aoc, Adoc, Iboc, Fmoc, Foc, Pipoc, Pz, 4 $ «- dimethylbenzyloxycarbonyl, 2-iodo-ethoxycarbonyl, 2- (p-tosyl) -ethoxycarbonyl, 1- (1-Adamantyl) -1-methylethoxycarbonyl (Adpoc), p-toluenesulfonyl, phthalyl, trifluoroacetyl, Triphenylmethyl, o-nitrophenylthio, formyl, benzylsulfonyl, o-hydroxyarylidene, acetoacetyl, 5,5-dimethylcyclohexadione, benzyl, o-nitrophenoxyacetyl and especially Mbs. the Mbs group proves to be specific to many other protective groups according to the invention usable chromogenic substrates as advantageous.

Eine endständige Carboxylgruppe kann entweder durch den Rest des Chromophors (-NH-R) oder durch Methyl-, Äthyl-, Benzyl-, p-Nitrobenzyl-, Benzhydryl-, Isopropyl-, t.Butyl-, p-Methoxybenzyl-, Alkylbenzyl-, Phenacyl-, Phenyl-, 4-Picolyl-, p-Methylthioäthyl-, 4-(Methylthio)-phenyl-, Trimethylsilyl- und Phthalimidomethylgruppen geschützt werden. A terminal carboxyl group can either be replaced by the remainder of the Chromophore (-NH-R) or by methyl, ethyl, benzyl, p-nitrobenzyl, benzhydryl, Isopropyl, t-butyl, p-methoxybenzyl, alkylbenzyl, phenacyl, phenyl, 4-picolyl, p-methylthioethyl, 4- (methylthio) phenyl, trimethylsilyl and phthalimidomethyl groups to be protected.

Falls Arginin eingesetzt wird, kann die Seitenkette des Arginins, der Guanidinorest, durch N -Tosyl-, N -Boc-, N"-Adpoc-, N2-Nitro- und N-Z(p-N02)-, N-Z-, N-Adamantyloxycarbonyl-, N»-Isobornyloxycarbonylaruppen oder durch Protonierung geschützt werden.If arginine is used, the side chain of arginine, the guanidino radical, through N -Tosyl-, N -Boc-, N "-Adpoc-, N2-Nitro- and N-Z (p-N02) -, N-Z, N-adamantyloxycarbonyl, N »-isobornyloxycarbonylar groups or by protonation to be protected.

Die erfindungsgemäß eingesetzten chromogenen Verbindungen werden gemäß den in der Peptidchemie üblichen Methoden zur Knüpfung von Peptidbindungen hergestellt. Es können die Carbodiimid-, die Azid-, die Anhydrid-, die Isocyanat-, die Inamin-, die Phosphorazo-, die Säurechlorid-Methode oder die Methoden der aktivierten Amide oder aktivierten Ester (Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, p-Nitrophenylester, Thiophenylester, Selenophenylester, N-Hydroxypperidylester) angewendet werden.The chromogenic compounds used according to the invention are according to using the methods commonly used in peptide chemistry for making peptide bonds. The carbodiimide, azide, anhydride, isocyanate, ynamine, the phosphorazo, acid chloride or activated amide methods or activated esters (trichlorophenyl ester, pentachlorophenyl ester, p-nitrophenyl ester, Thiophenyl ester, selenophenyl ester, N-hydroxypperidyl ester).

Für die Dünnschichtchromatographie wurden durchwegs Kieselgelplatten (DC-Fertigplatten, Kieselgel 60 F 254 und Kieselgel 60 ohne Fluoreszenzindikator) der Firma E. Merck AG., Darmstadt, verwendet Folgende Laufmittelgemische werden eingesetzt: A - Butanol/Eisessig/Wasser (3:1:1) B - Chloroform/Methanol/Ammoniaklösung (25 %ig) (60:45:20) C - Methanol/Chloroform (2:1) D - Chloroform/Methanol/Benzol/Wasser (40:40:40:5).Silica gel plates were used throughout for thin-layer chromatography (TLC prefabricated plates, silica gel 60 F 254 and silica gel 60 without fluorescence indicator) from E. Merck AG., Darmstadt, the following solvent mixtures are used used: A - butanol / glacial acetic acid / water (3: 1: 1) B - chloroform / methanol / ammonia solution (25%) (60:45:20) C - methanol / chloroform (2: 1) D - chloroform / methanol / benzene / water (40: 40: 40: 5).

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Arbeitsvorschriften und Beispiele näher erläutert: Arbeitvorschriften zur Herstellung der chromogenen Verbindungen bzw. von deren Vorprodukten: Arbeitsvorschrift 1-: p-Methoxy-benzolsulfonylchlorid (Mbs-Cl): 80 g Anisol werden in 300 ml absolutem Chloroform gelöst, die Lösung auf -100C gekühlt und tropfenweise so mit insgesamt 172,4 g Chlorsulfonsäure versetzt, daß die Temperatur nicht über OOC ansteigt. Nach beendeter Reaktion wird das Kältebad entfernt und die Reaktionslösung auf Raumtemperatur erwärmt.The method according to the invention is carried out by the following working instructions and examples explained in more detail: Work regulations for production of the chromogenic compounds or their precursors: Working instruction 1-: p-Methoxy-benzenesulfonyl chloride (Mbs-Cl): 80 g of anisole are in 300 ml of absolute Dissolved chloroform, the solution cooled to -100C and dropwise so with a total 172.4 g of chlorosulfonic acid are added so that the temperature does not rise above OOC. To When the reaction has ended, the cold bath is removed and the reaction solution is brought to room temperature warmed up.

Die Lösung wird nach beendeter Gasentwicklung auf Eis gegossen. Die wässerige Phase wird im Scheidetrichter abgetrennt und noch zweimal mit Chloroform ausgeschüttelt.After the evolution of gas has ceased, the solution is poured onto ice. the The aqueous phase is separated off in a separating funnel and twice with chloroform shaken out.

Die vereinigten Chloroformphasen werden mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abziehen des Chloroforms wird das erhaltene öl im Vakuum destilliert.The combined chloroform phases are washed with water and washed over Dried sodium sulfate. After stripping off the chloroform, the oil obtained is im Vacuum distilled.

Das erhaltene Öl kristallisiert beim Reiben mit einem Glasstab.The oil obtained crystallizes on rubbing with a glass rod.

Ausbeute: 93,3 g (61 % d.Th.) Summenformel: C 7H703 SCl MG: 206,65 Elementaranalyse: C H S Cl ber.: 40,69 % 3,41 % 15,52 % 17,16 % gef.: 40,32 % 3,68 % 15,74 % 17,01 % Fp.: 430C, Rf : 0,76 D Arbeitsvorschrift 2: Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanin (Z-D-Phe-OH): 5 g H-D-Phe--OH werden in 20 ml 2N Natriumhydroxidlösung gelöst und tropfenweise bei OOC mit 7 ml Chlorameisensäurebenzylester versetzt. Man versetzt die so erhaltene Reaktionsmischung zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von 9,5 mit 2N Natriumhydroxidlösung unter Verwendung eines Autotitrators (Zeitbedarf etwa 2 Stunden). Die Reaktionslösung wird mit Äther ausgeschüttelt, um überschüssigen Chlorameisensäurebenzylester zu entfernen. Dann überschichtet man die wässerige Phase mit Essigsäureäthylester, kühlt auf 5 0C und säuert mit 3N HCl auf pH 2,5 an. Die Phasen werden im Scheidetrichter getrennt, die wässerige Phase noch zweimal mit Essigester ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Phasen werden dann mit gesättigter Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wird die Verbindung in Äther aufgenommen und mit Petroläther zur Ausscheidung gebracht.Yield: 93.3 g (61% of theory) Molecular formula: C 7H703 SCl MW: 206.65 Elemental analysis: C H S Cl calc .: 40.69% 3.41% 15.52% 17.16% found: 40.32% 3.68 % 15.74% 17.01% M.p .: 430C, Rf: 0.76 D Working instruction 2: Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanine (Z-D-Phe-OH): 5 g of H-D-Phe-OH are dissolved in 20 ml of 2N sodium hydroxide solution and 7 ml of benzyl chloroformate are added dropwise at OOC. One relocates the reaction mixture thus obtained to maintain a pH of 9.5 with 2N sodium hydroxide solution using an autotitrator (time required approx 2 hours). The reaction solution is extracted with ether to remove excess To remove benzyl chloroformate. Then you overlay them watery Phase with ethyl acetate, cools to 5 ° C. and acidifies to pH 2.5 with 3N HCl at. The phases are separated in a separating funnel, the aqueous phase two more times shaken out with ethyl acetate. The combined organic phases are then with saturated sodium chloride solution and water and dried over sodium sulfate. After removing the solvent in vacuo, the compound is taken up in ether and excreted with petroleum ether.

Ausbeute: 7,3 g (80,6 % d.Th.) Summenformel: C1 7H1 7N04 MG: 299,33 Elementaranalyse: C H N ber.: 68,21 % 5,72 % 4,68 % gef.: 68,34 % 5,75 % 4,73 % Fp.: 63°C, Rf : 0,31, [α]D20: +6,98° (c=1, Methanol) D Arbeitsvorschrift 3: BenzylOxyCarbonyl-N-methyl-L-phenylalanyl-pentachlorphenylester (Z-L-(Me)-Phe-OPCP): 1,56 g Z-L-(Me)-Phe-OH werden zusammen mit 1,48 g Pentachlorphenol in 50 ml absolutem Methylenchlorid gelöst und auf 0°C abgekühlt, dann versetzt man die Lösung mit 1,14 g Dicyclohexylcarbodiimid, rührt zwei Stunden lang bei dieser Temperatur und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Dicyclohexylharnstoffes erfolgt auf Zugabe von Petroläther (Siedetemperatur 30 bis 500C) Kristallisation. Die Kristalle werden abgesaugt, mit Petroläther gewaschen und im Exsikkator über Calciumchlorid getrocknet. Umkristallisation erfolgt aus Methylenchlorid/n-Hexan.Yield: 7.3 g (80.6% of theory) Molecular formula: C1 7H1 7N04 MW: 299.33 Elemental analysis: C H N calc .: 68.21% 5.72% 4.68% found: 68.34% 5.75% 4.73% Melting point: 63 ° C, Rf: 0.31, [α] D20: + 6.98 ° (c = 1, methanol) D Working instruction 3: BenzylOxyCarbonyl-N-methyl-L-phenylalanyl-pentachlorophenyl ester (Z-L- (Me) -Phe-OPCP): 1.56 g of Z-L- (Me) -Phe-OH are combined with 1.48 g of pentachlorophenol in 50 ml of absolute Dissolved methylene chloride and cooled to 0 ° C., then 1.14 is added to the solution g dicyclohexylcarbodiimide, stirred for two hours at this temperature and then overnight at room temperature. After filtering off the precipitated dicyclohexylurea crystallization takes place upon addition of petroleum ether (boiling temperature 30 to 50 ° C.). The crystals are suctioned off, washed with petroleum ether and placed in a desiccator Calcium chloride dried. Recrystallization takes place from methylene chloride / n-hexane.

Ausbeute: 1,5 g (53,6 % d.Th.) Summenformel: C24H18N04Cl5 MG: 561,68 Elementaranalyse: C H N ber.: 51,32 % 3,23 % 2,49 % gef.: 51,22 % 3,14 % 2,18 % Fp.: 149°C, Rf: 0,89, [α]D20: -51,5° (c=1,03, DMF) In analoger Weise können die folgenden Verbindungen hergestellt werden: Benzyloxycarbonyl-p-alanyl-pentachlorphenylester (Z-p-Ala--OPCP); Fp.: 1160C, Rf : 0,77 N-Benzyloxycarbonyl-N-methyl-L-leucyl-pentachlorphenylester (Z-L-(Me)-Phe-OPCP); Fp.: 65°C, [α]D20: -24,2° (c=1; MeOH) Benzyloxycarbonyl-D-leucyl-pentachlorphenylester (Z-D-Leu--OPCP); Fp.: 122 bis 123°C, [α]D20: +23° (c=1; DMF), RfD: 0,79 Benzyloxycarbonyl-D-valyl-pentachlorphenylester (Z-D--Val-OPCP); Fp.: 139°C, [α]D20: +20,9° (c=1, DMF) Kupplungsfähiges H-Arg(NO2)-o-Cl-pNA Arbeitsvorschrift 4a: o-Chlor-p-nitrophenylisocyanat: In eine Lösung von 20 g o-Chlor-p-nitroanilin in absolutem Dioxan wird trockenes Chlorwasserstoffgas bis zur Sättigung eingeleitet. Dann leitet man für eine Stunde Phosgen bei 50°C durch die Lösung, bis eine klare Lösung entstanden ist. Das überschüssige Phosgen wird durch einen trockenen Stickstoffstrom entfernt. Die erhaltene Lösung wird am Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wir.d aus Petroläther umkristallisiert.Yield: 1.5 g (53.6% of theory) Molecular formula: C24H18N04Cl5 MW: 561.68 Elemental analysis: C H N calc .: 51.32% 3.23% 2.49% found: 51.22% 3.14% 2.18% Fp .: 149 ° C, Rf: 0.89, [α] D20: -51.5 ° (c = 1.03, DMF) In an analogous manner, the the following compounds are produced: Benzyloxycarbonyl-p-alanyl-pentachlorophenyl ester (Z-p-Ala - OPCP); M.p .: 1160C, Rf: 0.77 N-Benzyloxycarbonyl-N-methyl-L-leucyl-pentachlorophenyl ester (Z-L- (Me) -Phe-OPCP); M.p .: 65 ° C, [α] D20: -24.2 ° (c = 1; MeOH) benzyloxycarbonyl-D-leucyl-pentachlorophenyl ester (Z-D-Leu - OPCP); Mp .: 122 to 123 ° C, [α] D20: + 23 ° (c = 1; DMF), RfD: 0.79 benzyloxycarbonyl-D-valyl-pentachlorophenyl ester (Z-D - Val-OPCP); M.p .: 139 ° C, [α] D20: + 20.9 ° (c = 1, DMF) Couplable H-Arg (NO2) -o-Cl-pNA Working instruction 4a: o-chloro-p-nitrophenyl isocyanate: In a solution of 20 g o-chloro-p-nitroaniline in absolute dioxane, dry hydrogen chloride gas is passed in until it is saturated. Phosgene is then passed through the solution at 50 ° C. for one hour until it is clear Solution has arisen. The excess phosgene is removed by a stream of dry nitrogen removed. The solution obtained is evaporated to dryness on a rotary evaporator. The residue is recrystallized from petroleum ether.

Ausbeute: 20,8 g (90,1 % d.Th.) Summenformel: C 7H3N203Cl MG: 198,57 Elementaranalyse: C H N Cl ber.: 42,34 % 1,52 % 14,11 % 17,85 % gef.: 42,52 % 1,74 % 14,33 % 17,74 % Fp.: 62 C, Rf : 0,77 D Arbeitsvorschrift 4b: N#-Nitro-L-arginin: Zu Nitriersäure, bestehend aus 40 ml Salpetersäure, 25 ml rauchender Schwefelsäure und 15 ml konzentrierter Schwefelsäure, gibt man innerhalb von 4 Stunden 30,9 g L-Arginin. Man rührt dieses Gemisch bis zur vollständigen Lösung und gießt diese auf zerstoßenes Eis. Dann wird mit konzentrierter Ammoniaklösung auf pH 6,8 eingestellt. Nach Stehen über Nacht bei 40C erhält man das gewünschte Produkt. Nach Absaugen und Waschen mit Eiswasser und Äther trocknet man im Vakuum über P205.Yield: 20.8 g (90.1% of theory) Molecular formula: C 7H3N203Cl MW: 198.57 Elemental analysis: C H N Cl calc .: 42.34% 1.52% 14.11% 17.85% found: 42.52% 1.74 % 14.33% 17.74% Mp .: 62 C, Rf: 0.77 D Working instruction 4b: N # -nitro-L-arginine: To nitrating acid, consisting of 40 ml Nitric acid, 25 ml of fuming Sulfuric acid and 15 ml of concentrated sulfuric acid are added within 4 hours 30.9 grams of L-arginine. This mixture is stirred until it is completely dissolved and poured these on crushed ice. Then with concentrated ammonia solution to pH 6.8 set. After standing overnight at 40 ° C., the desired product is obtained. To Suction and washing with ice water and ether are dried in a vacuum over P205.

Ausbeute: 30,8 g (81,5 % d.Th.) Summenformel: C6H1 3N504 MG: 219,20 Elementaranalyse: C H N ber.: 32,88 % 5,98 % 31,95 % gef.: 32,76 9s 5,74 % 31,77 % Fp.: 251 C, Rf : 0,26, [α]D20: +24,30 (c=1, 2N HCl) A Arbeitsvorschrift 4c: N#-Benzyloxycarbonyl-N#-nitro-L-arginin (Z-Arg(NO2)-OH): 32,8 g -Nitroarginin werden in 150 ml 1N NaOH gelöst und anschließend auf 0°C gekühlt. Unter simultanem Zutropfen werden der Lösung 26,8 ml Carbobenzyloxychlorid und 158 ml 1N Natronlauge zugefügt. Man rührt 2 Stunden bei 5 0C und 2 Stunden bei Raumtemperatur. Nach Ansäuern der Reaktionsmischung auf pH=2 scheidet sich die Benzyloxycarbonylverbindung zunächst als Öl ab, das alsbald durchkristallisiert. Das ausgefallene Produkt wird in Kaliumhydrogencarbonatlösung (4 %ig) aufgenommen; diese Lösung wird dreimal mit Äther ausgeschüttelt und anschließend mit 4N Salzsäure auf pH=2 angesäuert. Das kristalline Produkt wird abfiltriert und im Vakuum bei 35 0C über Phosphorpentoxid getrocknet. Umkristallisation erfolgt aus Athanol/Wasser.Yield: 30.8 g (81.5% of theory) Molecular formula: C6H1 3N504 MW: 219.20 Elemental analysis: C H N calc .: 32.88% 5.98% 31.95% found: 32.76 9s 5.74% 31.77 % M.p .: 251 C, Rf: 0.26, [α] D20: +24.30 (c = 1.2N HCl) A working instruction 4c: N # -Benzyloxycarbonyl-N # -nitro-L-arginine (Z-Arg (NO2) -OH): 32.8 g -nitroarginine are dissolved in 150 ml of 1N NaOH and then cooled to 0 ° C. Under simultaneous 26.8 ml of carbobenzyloxy chloride and 158 ml of 1N sodium hydroxide solution are added dropwise to the solution added. The mixture is stirred for 2 hours at 5 ° C. and for 2 hours at room temperature. After acidification the reaction mixture at pH = 2 separates the benzyloxycarbonyl compound first as oil, which soon crystallizes through. The precipitated product is dissolved in potassium hydrogen carbonate (4%) added; this solution is extracted three times with ether and then acidified to pH = 2 with 4N hydrochloric acid. The crystalline product is filtered off and dried in vacuo at 35 ° C. over phosphorus pentoxide. Recrystallization takes place from ethanol / water.

Ausbeute: 48 g (90,8 % d.Th.) Summenformel: C14H19N506 MG: 353,34 Elementaranalyse: C H N ber.: 47,59 % .5,42 % 19,82 % gef.: 47,39 % 5,64 % 19,66 % Fp.: 134 bis 136°C, Rf: 0,38, [α]D20: -3° (c=1, MeOH) D Arbeitsvorschrift 4d: Ne-Benzyloxycarbonyl-N-nitro-L-arginyl-o-chlor-p-nitroanilid (Z-Arg(N02)-o-Cl-pNA): 10,6 g Z-Arg(N02)-OH werden in 70 ml Hexamethylphosphorsäuretriamid (HMPT) gelöst und mit 3,04 g (4,22 ml) Triäthylamin versetzt. Dann wird auf 50C gekühlt und portionsweise mit 5,96 g o-Chlor-p--nitrophenylisocyanat versetzt und 1 Stunde bei 5 0C und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird danntropfenweise unter starkem Rühren in 750 ml 2,5 %ige NaHC03-Lösung getropft, das abgeschiedene Produkt wird abgesaugt und mit 2 %iger NaHC03-Lösung, 0,5N Salzsäure und Wasser gewaschen und anschließend über Phosphorpentoxid getrocknet. Umkristallisation erfolgt aus Methanol/Äther.Yield: 48 g (90.8% of theory) Molecular formula: C14H19N506 MW: 353.34 Elemental analysis: C H N calc .: 47.59% .5.42% 19.82% found: 47.39% 5.64% 19.66% mp .: 134 to 136 ° C, Rf: 0.38, [α] D20: -3 ° (c = 1, MeOH) D Working instruction 4d: Ne-benzyloxycarbonyl-N-nitro-L-arginyl-o-chloro-p-nitroanilide (Z-Arg (NO2) -o-Cl-pNA): 10.6 g of Z-Arg (NO2) -OH are dissolved in 70 ml of hexamethylphosphoric acid triamide (HMPT) dissolved and treated with 3.04 g (4.22 ml) of triethylamine. Then it goes to 50C cooled and added in portions with 5.96 g of o-chloro-p-nitrophenyl isocyanate and Stirred for 1 hour at 5 ° C. and overnight at room temperature. The reaction solution is then added drop by drop with vigorous stirring into 750 ml of 2.5% NaHCO3 solution, the deposited product is filtered off and with 2% NaHCO3 solution, 0.5N hydrochloric acid and water and then dried over phosphorus pentoxide. Recrystallization takes place from methanol / ether.

Ausbeute: 12,5 g (82,02 % d.Th.) Summenformel: C20H22N7O7Cl MG: 507,89 Elementaranalyse: C H N Cl ber.: 47,30 % 4,37 % 19,31 % 6,98 % gef. : 47,28 % 4,24 % 19,25 % 6,77 z Fp.: 142 bis 1450C, Rf : 0,78, - 20: -5,2° (c=1, DMF) A Arbeitsvorschrift 4e: No-Nitro-L-arginyl-o-chlor-p-nitroanilidhydrobromid (H-Arg(NO2)-o-Cl-pNA.HBr): 11 g N#-Benzyloxycarbonyl-N#--nitro-L-arginyl-o-chlor-p-nitroanilid werden mit 50 ml Bromwasserstoff/Eisessig übergossen und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach erfolgter Abspaltung der Benzyloxycarbonylgruppe wird das Produkt mit absolutem Äther ausgefällt. Nach einstündigem Stehen der Lösung bei OOC wird das Produkt abgesaugt und mit Äther gewaschen.Yield: 12.5 g (82.02% of theory) Molecular formula: C20H22N7O7Cl MW: 507.89 Elemental analysis: C H N Cl calc .: 47.30% 4.37% 19.31% 6.98% found. : 47.28% 4.24 % 19.25% 6.77 z Fp .: 142 to 1450C, Rf: 0.78, - 20: -5.2 ° (c = 1, DMF) A working instruction 4e: No-Nitro-L-arginyl-o-chloro-p-nitroanilide hydrobromide (H-Arg (NO2) -o-Cl-pNA.HBr): 11 g of N # -Benzyloxycarbonyl-N # - nitro-L-arginyl-o-chloro-p-nitroanilide with 50 Poured ml of hydrogen bromide / glacial acetic acid and stir for 3 hours at room temperature. After the benzyloxycarbonyl group has been split off, the product is with absolute Ether failed. After the solution has stood at OOC for one hour, the product is filtered off with suction and washed with ether.

Umkristallisation erfolgt aus Methanol/Äther.Recrystallization takes place from methanol / ether.

Ausbeute: 8 g (80,8 % d.Th.).Yield: 8 g (80.8% of theory).

Summenformel: C12H17N7O5ClBr MG: 454,67 Elementaranalyse: C H N Cl Br ber.: 31,67 % 3,77 % 21,56 % 7,80 % 17,58 % gef.: 31,32 * 3,52 % 21,71 % 7,98 % 17,34 % Fp.: 2000C, [α]D20: +17,850 (c=1, DMF) Arbeitsvorschrift 5: BenzylOxyzarbonyl-N-methyl-L-valyl-L-leucyl-L-arginyl-p--nitroanilid-hydroacetat (Z(Me)-Val-Leu-Arg-pNA#HAc): 514 mg Z(Me)Val-OPCP werden zusammen mit 481 mg H-Leu-Arg--pNA#2HCl in 35 ml absolutem Dimethylformamid gelöst. Nach Zusatz von 0,12 ml N-Methylmorpholin und einer Spatelspitze Hydroxybenzotriazol als Katalysator rührt man den Ansatz 28 Stunden lang bei Raumtemperatur. Das Lösung mittel wird im Ölpumpenvakuum entfernt. Der Rückstand wird in Methylenchlorid aufgenommen, die Substanz fällt nach Zugabe von Äther aus. Um letzte Verunreinigungen zu entfernen, wird mit 20 %iger Essigsäure an einer Sephadex G 15-Säule chromatographiert und anschließend gefriergetrocknet.Molecular Formula: C12H17N7O5ClBr MW: 454.67 Elemental Analysis: C H N Cl Br calc .: 31.67% 3.77% 21.56% 7.80% 17.58% found: 31.32 * 3.52% 21.71% 7.98 % 17.34% m.p .: 2000C, [α] D20: +17.850 (c = 1, DMF) Working instruction 5: BenzylOxycarbonyl-N-methyl-L-valyl-L-leucyl-L-arginyl-p - nitroanilide- hydroacetate (Z (Me) -Val-Leu-Arg-pNA # HAc): 514 mg of Z (Me) Val-OPCP are added together with 481 mg of H-Leu-Arg - pNA # 2HCl dissolved in 35 ml of absolute dimethylformamide. After adding 0.12 ml of N-methylmorpholine and a spatula tip of hydroxybenzotriazole as a catalyst, the batch is stirred For 28 hours at room temperature. The solution medium is removed in an oil pump vacuum. The residue is taken up in methylene chloride, the substance falls after addition from ether. To remove any remaining impurities, 20% acetic acid is used chromatographed on a Sephadex G 15 column and then freeze-dried.

Ausbeute: 0,65 g (90,9 % d.Th.) Summenformel: C34H50N8 0 9 MG: 714,82 Elementaranalyse: C H N ber.: 57,13 % 7,05 % 15,68 % gef.: 57,12 % 6,89 % 15,42 % Fp.: 138°C, [α]54620: -6.4° (c=1, DMF), R : 0,70 In analoger Weise können hergestellt werden: Benzyloxycarbonyl-sarcosyl-l-alanyl-Nc-benzyloxycarbonyl--L-lysyl-o-chlor-p-nitroanilid (Z-Sar-L-Ala-L-Lys(Z)-o--Cl-pNA; Fp.: 145°C, [α]D20: -57.3° (c=1, MeOH) BenzylOxyCarbonyl-sarcosyl-L-prolyl-L-arginyl-o-chlor-p--nitroanilidhydroacetat (Z-Sar-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA.HAc); Fp.: 96 bis 98°C, [α]D20: -1,6° (c=1,03; DMF), RfA: 0,50 Benzyloxycarbonyl-L-isoglutamyl-glycyl-L-arginyl-ß-nitroanilid-hydroacetat (Z-L-Igln-Gly-Arg-pNA.HAc); Fp.: 60 bis 63°C, [α]D20: -17°C (c=1, DMF), RfA: 0,49 BenzylOxyCarbonyl-P-alanyl-L-prolyl-L-arginyl-o-chlor-p--nitroanilid-hydroacetat (Z-P-Ala-L-Pro-L-Arg-o-C1-pNA.HAc); Fp.: 55 bis 580C, [α]D20: 440 (c=1, DMF) BenzylOxyCarbonyl-D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-o-chlor-p--nitroanilid-hydroacetat (Z-D-Val-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA.HAc), [α]54620: -6,80 (c=0,5, DMF) Benzyloxycarbonyl-N-methyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginyl-p-nitroanilid-hydroacetat (Z-L-(Me)-Phe-L-Val-L-Arg--pNA.HAc); Fp.: 85 bis 900C, [α]D20: -21,3° (c=1, DMF), RfA: 0,69 BenzylOxyCarbonyl-N-methyl-L-valyl-L-leucyl-L-arginyl-p--nitroanilid-hydroacetat (Z-L-(Me)-Val-L-Leu-L-Arg-pNA.HAc); Fp.: 1380C, [α]54620: -6,4° (c=l, DMF), RfA: 0,70 BenzylOxyCarbonyl-N-methyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-L--arginyl-p-nitroanilid-hydroacetat (Z-L-(Me)-Phe-L-Ile-L--Arg-pNA.HAc); LoC725046: -10,1° (c=l, DMF), RfA: 0,71 Benzyloxycarbonyl-N-methyl-L-leucyl-L-leucyl-L-arginyl--p-nitroanilid-hydroacetat (Z-L-(Me)-Leu-L-Leu-L-Arg--pNA.HAc); Fp.: 115 bis 1200C, [α]D20: +28,10 (C=1, DMF) Arbeitsvorschrift 6: D-Leucyl-L-leucyl-L-arginyl-o-chlor-p-nitroanilid-dihydrobromid (H-D-Leu-Leu-Arg-o-Cl-pNA.2HBr): 630 mg Z-D-Leu--Leu-Arg-o-Cl-pNA.HAc werden mit 30 ml 3N Bromwasserstoff/ Eisessig übergossen und bei Raumtemperatur 1,5 Stunden lang gerührt. Der Abspaltungsverlauf der Schutzgruppe wird dünnschichtchromatographisch verfolgt. Die so erhaltene Lösung wird unter Rühren 250 ml absolutem Äther zugetropft. Das ausgefallene Produkt wird abgesaugt und im Ölpumpenvakuum über festem Kaliumhydroxid getrocknet.Yield: 0.65 g (90.9% of theory) Molecular formula: C34H50N8 0 9 MW: 714.82 Elemental analysis: C H N calc .: 57.13% 7.05% 15.68% found: 57.12% 6.89% 15.42 % M.p .: 138 ° C, [α] 54620: -6.4 ° (c = 1, DMF), R: 0.70 In an analogous manner are produced: Benzyloxycarbonyl-sarcosyl-l-alanyl-Nc-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-o-chloro-p-nitroanilide (Z-Sar-L-Ala-L-Lys (Z) -o-Cl-pNA; m.p .: 145 ° C, [α] D20: -57.3 ° (c = 1, MeOH) benzyl-oxy-carbonyl-sarcosyl-L -prolyl-L-arginyl-o-chloro-p - nitroanilide hydroacetate (Z-Sar-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA.HAc); Mp .: 96 to 98 ° C, [α] D20: -1.6 ° (c = 1.03; DMF), RfA: 0.50 benzyloxycarbonyl-L-isoglutamyl-glycyl-L-arginyl-β-nitroanilide hydroacetate (Z-L-Igln-Gly-Arg-pNA.HAc); Mp .: 60 to 63 ° C, [α] D20: -17 ° C (c = 1, DMF), RfA: 0.49 BenzylOxyCarbonyl-P-alanyl-L-prolyl-L-arginyl-o-chloro-p-nitroanilide hydroacetate (Z-P-Ala-L-Pro-L-Arg-o-C1-pNA.HAc); Fp .: 55 to 580C, [α] D20: 440 (c = 1, DMF) BenzylOxyCarbonyl-D-valyl-L-leucyl-L-arginyl-o-chloro-p-nitroanilide-hydroacetate (ZD-Val-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA.HAc), [α] 54620: -6.80 (c = 0.5, DMF) benzyloxycarbonyl-N-methyl-L-phenylalanyl- L-valyl-L-arginyl-p-nitroanilide hydroacetate (Z-L- (Me) -Phe-L-Val-L-Arg - pNA.HAc); Fp .: 85 to 900C, [α] D20: -21.3 ° (c = 1, DMF), RfA: 0.69 BenzylOxyCarbonyl-N-methyl-L-valyl-L-leucyl-L-arginyl-p-nitroanilide-hydroacetate (Z-L- (Me) -Val-L-Leu-L-Arg-pNA.HAc); Mp .: 1380C, [α] 54620: -6.4 ° (c = 1, DMF), RfA: 0.70 BenzylOxyCarbonyl-N-methyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-L-arginyl-p-nitroanilide-hydroacetate (Z-L- (Me) -Phe-L-Ile-L-Arg-pNA.HAc); LoC725046: -10.1 ° (c = 1, DMF), RfA: 0.71 benzyloxycarbonyl-N-methyl-L-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-p-nitroanilide hydroacetate (Z-L- (Me) -Leu-L-Leu-L-Arg - pNA.HAc); Mp .: 115 to 1200C, [α] D20: +28.10 (C = 1, DMF) Working instruction 6: D-Leucyl-L-leucyl-L-arginyl-o-chloro-p-nitroanilide-dihydrobromide (H-D-Leu-Leu-Arg-o-Cl-pNA.2HBr): 630 mg Z-D-Leu - Leu-Arg-o-Cl-pNA.HAc are with Pour 30 ml of 3N hydrogen bromide / glacial acetic acid over it and leave it at room temperature for 1.5 hours long stirred. The process of splitting off the protective group is determined by thin-layer chromatography tracked. The solution thus obtained is added dropwise with stirring to 250 ml of absolute ether. The precipitated product is filtered off with suction and over solid potassium hydroxide in an oil pump vacuum dried.

Umkristallisiert wird aus Methanol/Äther. Die Substanz wird durch Säulenchromatographie an Sephadex G 15 (Elu- tionsmittel: 20 %ige Essigsäure) analysenrein erhalten.It is recrystallized from methanol / ether. The substance is through Column chromatography on Sephadex G 15 (Elu- tion agent: 20% Acetic acid) obtained analytically pure.

Ausbeute: 550 mg (91,2 % d.Th.) Summenformel: C24H41N805ClBr2 MG: 716,91 Elementaranalyse: C H N ber.: 40,21 % 5,76 * 15,63 % gef.: 40,18 % 5,50 % 15,80 % [α]D20: -62° (c=1, H2O) In analoger Weise kann hergestellt werden: D-Valyl-L-leucyl-L-arginyl-o-chlor-p-nitroanilid-dihydrobromid (H-D-Val-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA.2HBr); [alpha;]D20: -5.9° (c=1, DMF), RfA: 0,52 Beim erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren wurden die folgenden Reagenzien verwendet: Pufferlösung: 6,06 g tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan der Fa. Merck Art.Yield: 550 mg (91.2% of theory) Molecular formula: C24H41N805ClBr2 MG: 716.91 Elemental analysis: C H N calc .: 40.21% 5.76 * 15.63% found: 40.18% 5.50% 15.80% [α] D20: -62 ° (c = 1, H2O) The following can be produced in an analogous manner: D-Valyl-L-leucyl-L-arginyl-o-chloro-p-nitroanilide-dihydrobromide (H-D-Val-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA.2HBr); [alpha;] D20: -5.9 ° (c = 1, DMF), RfA: 0.52 in the determination method according to the invention the following reagents were used: Buffer solution: 6.06 g tris (hydroxymethyl) aminomethane from Merck Art.

8382, 10,6 g NaCl Fa. Merck Art. 6404, werden in etwa 900 ml destilliertem Wasser gelöst und mit etwa 5-molarer Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 bis 9,0 gestellt, vorzugsweise 8,3. Anschließend wird das Volumen der Lösung auf 1000 ml mit destilliertem Wasser ergänzt.8382, 10.6 g NaCl from Merck Art. 6404, are distilled in about 900 ml Dissolved water and with about 5 molar hydrochloric acid to a pH value of 6.0 to 9.0 posed, preferably 8.3. Then the volume of the solution is increased to 1000 ml supplemented with distilled water.

Chromogene Verbindungen werden zunächst in einer Konzentration von 1 mMol/l in destilliertem Wasser gelöst.Chromogenic compounds are initially used in a concentration of 1 mmol / l dissolved in distilled water.

Präparation einer C1-Esterase Die Präparation erfolgt nach den aus der Literatur (Journ.Preparation of a C1 esterase The preparation is carried out according to the of literature (Journ.

Immunol. 110 p 1010 (1973); Journ. Immunol. 113 p 225 (1974); Protides of Biölog. Fluids 23rd Collog. 1975 Edit. H. Peeters, Vol 23, p 551 (1975); Biochim. Biophys. Acta 485 p 215 (1977); Proc. Soc. Exp. Biol. Med.Immunol. 110 p 1010 (1973); Journ. Immunol. 113 p 225 (1974); Protides of biology. Fluids 23rd Collog. 1975 Edit. H. Peeters, Vol 23, p 551 (1975); Biochim. Biophys. Acta 485 p 215 (1977); Proc. Soc. Exp. Biol. Med.

101 p 608 (1959)) bekannten Vorschriften und wird auf eine Konzentration von etwa 500 Esterase-Einheiten pro ml analog der letztgenannten Veröffentlichung eingestellt.101 p 608 (1959)) known regulations and is based on a concentration of about 500 esterase units per ml analogous to the last-mentioned publication set.

Präparation eines C1-Esterase-Inhibitors (Inaktivators): Die Präparation erfolgt nach den aus der Literatur (Eur.Preparation of a C1 esterase inhibitor (inactivator): The preparation takes place according to the literature (Eur.

J. Biochem. 17 p 254-261 (1970); Vox. Sang. 26 p 118-127 (1974); J. Clin. Invest. 55 p 593 (1975); FEBS-Lett. 79 p 45 (1977)) bekannten Vorschriften und wird auf eine Wirksamkeit, welche der Wirksamkeit eines Frischplasmapools entspricht, eingestellt.J. Biochem. 17 p 254-261 (1970); Vox. Sang. 26 p 118-127 (1974); J. Clin. Invest. 55 p 593 (1975); FEBS-Lett. 79 p 45 (1977)) known regulations and is based on an effectiveness that corresponds to the effectiveness of a fresh plasma pool, set.

Die Aktivität der C1-Esterase-Präparation wurde in folgender Weise bestimmt: In ein Plastikröhrchen werden in einem Wasserbad von 370C 1,0 ml Puffer pipettiert. Nach einer Anwärmzeit von etwa 5 Minuten werden dazu 0,1 ml der C1-Esterase-Präparation zugesetzt und gemischt. Dann erfolgt die Zugabe von 0,1 ml 0,001 M Lösung der chromogenen Verbindung. Die Lösungen werden gemischt und nach einer Latenzzeit von etwa 10 Sekunden wird die Lösung in ein Photometer gebracht.The activity of the C1 esterase preparation was determined in the following manner Determined: 1.0 ml of buffer are placed in a plastic tube in a water bath at 370C pipetted. After a warm-up time of about 5 minutes, 0.1 ml of the C1-esterase preparation is added added and mixed. Then 0.1 ml of 0.001 M chromogenic solution is added Link. The solutions are mixed and after a latency of about 10 seconds the solution is placed in a photometer.

Die Messung erfolgt in Plastik-Einweg-Küvetten mit einer Schichtdicke von 10 mm bei einer Wellenlänge von 405 nm und bei einer Temperatur von 37°C. Als Photometer dient ein Beckman-Zweistrahlphotometer Nr. 25 mit einem Wellenlängenbereich von 190 bis 700 nm und einer Genauigkeit von + 0,5 %. Die Extinktionszunahme 4 OD/min wird gemessen.The measurement is carried out in single-use plastic cuvettes with one path length of 10 mm at a wavelength of 405 nm and at a temperature of 37 ° C. as The photometer is a Beckman two-beam photometer No. 25 with a wavelength range from 190 to 700 nm and an accuracy of + 0.5%. The increase in absorbance 4 OD / min is being measured.

Die C1 -Esterase-Aktivität einer C1 -Esterase-Inhibitor (Inaktivator)-hältigen Probe wurde in folgender Weise bestimmt: In Parallelversuchen wurden 0,1 ml C1-Esterase-Präparation mit jeweils 0,5 ml der Inhibitor enthaltenden Probe versetzt. Die Probe kann eine C1-Esterase-Inhibitor-Präparation, hergestellt wie oben beschrieben, oder gepooltes Plasma sein. Nach einer Einwirkungsdauer von etwa 5 Minuten werden 0,5 ml Pufferlösung und 0,1 ml chromogene Verbindung zugefügt und die0D/min gemessen.The C1 esterase activity of a C1 esterase inhibitor (inactivator) -containing Sample was determined in the following way: In parallel tests were 0.1 ml C1 esterase preparation with 0.5 ml each of the sample containing the inhibitor offset. The sample can be a C1 esterase inhibitor preparation prepared like described above, or pooled plasma. After an exposure time of approx 5 minutes 0.5 ml of buffer solution and 0.1 ml of chromogenic compound are added and the0D / min measured.

Zum Vergleich werden 0,1 ml C1-Esterase-Präparation mit 0,5 ml Pufferlösung statt mit einer C1-Esterase-Inhibitor enthaltenden Probe versetzt und die Enzymaktivität dieser verdünnten C1-Esterase-Präparation wie oben beschrieben bestimmt. Durch Zugabe von Inaktivator bzw. Inhibitor als Humanplasma oder als daraus gewonnene C1-Esterase-Inhibitor-Präparation zum Enzym kommt es zu einer Veränderung der C1-Esterase-Aktivität. Dieser Aktivitätsverlust wird in direkte Beziehung zur Aktivität des in der untersuchten Probe enthaltenen Inaktivators bzw. Inhibitors gebracht, wie aus der Tabelle I ersichtlich ist.For comparison, 0.1 ml C1-esterase preparation with 0.5 ml buffer solution instead of a sample containing C1 esterase inhibitor and the enzyme activity of this diluted C1-esterase preparation is determined as described above. By adding of inactivator or inhibitor as human plasma or as a C1 esterase inhibitor preparation obtained therefrom In addition to the enzyme, there is a change in C1-esterase activity. This loss of activity is in direct relation to the activity of the contained in the examined sample Brought inactivator or inhibitor, as can be seen from Table I.

Tabelle I Chromogene Verbindung Aktivität der C1-Esterase-Präpara- Humanplasma C1-Esterase Inhibition tor-Präparation [(#OD/min)#1000] [(#OD/min)#1000] [(#OD/min)#1000] Mbs-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA 59 6 7 Z-L-(Me)Phe-L-Val-L-Arg--pNA 55 5 5 Z-D-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA 43 5 4 Z-D-Leu-L-Leu-L-Arg-o--Cl-pNA 41 6 4 Z-L-(Me)Val-L-Leu-L-Arg--pNA 108 10 10 Z-D-Phe-L-Leu-L-Arg-o--Cl-pNA 27 2 1 Z-L-Igln-Gly-L-Arg-pNA 70 8 7 Z-D-Val-L-Leu-L-Arg-o--Cl-pNA 44 4 5 H-D-Leu-L-Leu-L-Arg-o--Cl-pNA 56 5 6 Mbs-Gly-Gly-L-Pro-L--Arg-o-Cl-pNA 27 3 3 H-D-Val-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA 35 3 4 Z-D-Tyr-L-Val-L-Arg-pNA 40 1 0 Z-D-Tyr-L-Leu-L-Arg-o--Cl-pNA 36 2 2 Weitere bevorzugte, durch C1-Esterase spaltbare Substrate, welche die durch Inhibitor-Zusatz veränderte C1-Esterase-Aktivität erfassen können, sind in Tabelle II aufgeführt. Table I Chromogenic Compound Activity of C1 Esterase Preparations Human plasma C1 esterase inhibition tor preparation [(# OD / min) # 1000] [(# OD / min) # 1000] [(# OD / min) # 1000] Mbs-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA 59 6 7 Z-L- (Me) Phe-L-Val-L-Arg - pNA 55 5 5 ZD-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA 43 5 4 ZD-Leu-L-Leu-L-Arg-o - Cl-pNA 41 6 4 ZL- (Me) Val-L-Leu- L-Arg - pNA 108 10 10 ZD-Phe-L-Leu-L-Arg-o - Cl-pNA 27 2 1 ZL-Igln-Gly-L-Arg-pNA 70 8 7 ZD-Val-L-Leu-L-Arg- o - Cl-pNA 44 4 5 H-D-Leu-L-Leu-L-Arg-o - Cl-pNA 56 5 6 Mbs-Gly-Gly-L-Pro-L - Arg-o-Cl-pNA 27 3 3 HD-Val-L-Leu-L-Arg-o-Cl-pNA 35 3 4 ZD-Tyr-L-Val-L-Arg-pNA 40 1 0 ZD-Tyr-L-Leu-L-Arg- o - Cl-pNA 36 2 2 Other preferred substrates cleavable by C1 esterase, which can detect the C1 esterase activity changed by the addition of inhibitors, are listed in Table II.

Tabelle II Chromogene Verbindung Aktivität der C1- Aktivität nach Esterase-Prä- Zusatz von C1 parat in Esterase-In-[#OD#1000/min] hibitor-Präparation [(#OD/min)#100g] Z-Sar-L-Pro-L-Arg-o-CI-pNA 10 1 Z-L-(Me)Leu-L-Leu-L-Arg-pNA 26 0 Z-L-Phe-L-Val-L-Arg-o-Cl-pNA 24 1 (Me)2Gly-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA 21 2 Z-L-(Me)Phe-L-Ile-L-Arg-pNA 20 2 Z-p-Ala-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA 22 1 Mbs-L-Ala-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA 37 1 Mbs-Gaba-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA 37 0 Mbs-Gly-L-Pro-L-Lys-o-Cl-pNA 17 0 Mbs-P-Ala-L-Pro-L-Lys-o-C1-pNA 11 0 Mbs-Gaba-L-Pro-L-Arg-pNA 44 3 Table II Chromogenic compound activity according to C1 activity Esterase pre-addition of C1 ready in Esterase-In - [# OD # 1000 / min] hibitor preparation [(# OD / min) # 100g] Z-Sar-L-Pro-L-Arg-o-CI-pNA 10 1 Z-L- (Me) Leu-L-Leu-L-Arg-pNA 26 0 ZL-Phe-L-Val-L-Arg-o-Cl-pNA 24 1 (Me) 2Gly-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA 21 2 ZL- (Me) Phe-L-Ile -L-Arg-pNA 20 2 Zp-Ala-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA 22 1 Mbs-L-Ala-L-Pro-L-Arg-o-Cl-pNA 37 1 Mbs-Gaba-L-Pro- L-Arg-o-Cl-pNA 37 0 Mbs-Gly-L-Pro-L-Lys-o-Cl-pNA 17 0 Mbs-P-Ala-L-Pro-L-Lys-o-C1-pNA 11 0 Mbs-Gaba-L-Pro- L-Arg-pNA 44 3

Claims (4)

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Bestimmung der C1-Esterase-Inhibitor-Aktivität von C C1-Esterase-Inhibitor-hältigen Proben durch Vergleich der C1-Esterase-Aktivität einer standardisierten C1-Esterase-Präparation mit der Aktivität der gleichen standardisierten Präparation in Gegenwart der zu untersuchenden C1-Esterase-Inhibitorhältigen Probe, wobei die Differenz der erhaltenen Werte ein Maß für die Inhibitor-Aktivität der Probe darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß die C1-Esterase-Aktivität der zu vergleichenden Präparationen durch spektrophotometrische Untersuchung von Spaltprodukten chromogener Verbindungen der allgemeinen Formel R1 - A - B - NH - R oder deren Säureadditionssalzen festgestellt wird, in welcher Formel R1 für Wasserstoff, Alkyl, einen Sulfonylrest, insbesondere Benzolsulfonyl oder p-Methoxybenzolsulfonyl (Mbs) oder einen Acylrest, insbesondere Alkoxycarbonyl, wie tert. Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl oder Formyl, A für eine Aminosäurekomponente, einen Di- oder einen Tripeptidrest, B für eine der folgenden Aminosäurekomponenten: D-Arg, L-Arg, D-Lys, L-Lys, D-Orn, L-Orn, D-Tyr oder L-Tyr, D-Ala oder L-Ala, und -NH-R für eine chromophore oder fluoreszierende Gruppe stehen.Claims: 1. Method for determining the C1 esterase inhibitor activity of samples containing C C1 esterase inhibitor by comparing the C1 esterase activity a standardized C1-esterase preparation with the activity of the same standardized Preparation in the presence of the C1 esterase inhibitor-containing sample to be examined, wherein the difference between the values obtained is a measure of the inhibitor activity of the Sample represents, characterized in that the C1-esterase activity to be compared Preparations by spectrophotometric analysis of chromogenic cleavage products Compounds of the general formula R1 - A - B - NH - R or their acid addition salts it is determined in which formula R1 for hydrogen, alkyl, a sulfonyl radical, in particular benzenesulfonyl or p-methoxybenzenesulfonyl (Mbs) or an acyl radical, especially alkoxycarbonyl, such as tert. Butyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl or Formyl, A for an amino acid component, a di- or a tripeptide residue, B for one of the following amino acid components: D-Arg, L-Arg, D-Lys, L-Lys, D-Orn, L-Orn, D-Tyr or L-Tyr, D-Ala or L-Ala, and -NH-R for a chromophoric or fluorescent Standing group. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß neue chromogene Verbindungen verwendet werden, worin R1 für Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder für p-Methoxybenzolsulfonyl (Mbs) steht.2. The method according to claim 1, characterized in that new chromogenic Compounds can be used where R1 is alkyl of 1 to 4 carbon atoms or is p-methoxybenzenesulfonyl (Mbs). 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß neue chromogene Verbindungen verwendet werden, in denen A für eine Aminosäurekomponente A1 mit der folgenden Bedeutung: Sar, L-(Me)Val, D-Leu, L-(Me)Phe, D-Val, D-Phe, L-Phe, L-(Me)Leu, Gly, L-Igln, L-Ala, ß-Ala oder Gaba, oder für ein Dipeptid A1-A2, worin A1 die vorgenannte Bedeutung hat und A2 Gly, L-Pro, L-Leu, L-Val, L-Ile oder eine Einfachbindung bedeutet, oder für ein Tripeptid A1-A2-A3, worin A1 und A2 vorstehende Bedeutung haben und A3 L-Pro oder eine Einfachbindung bedeutet, steht.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that new chromogenic compounds can be used in which A is an amino acid component A1 with the following meaning: Sar, L- (Me) Val, D-Leu, L- (Me) Phe, D-Val, D-Phe, L-Phe, L- (Me) Leu, Gly, L-Igln, L-Ala, ß-Ala or Gaba, or for a dipeptide A1-A2, where A1 has the aforementioned meaning and A2 Gly, L-Pro, L-Leu, L-Val, L-Ile or means a single bond, or for a tripeptide A1-A2-A3, wherein A1 and A2 above Have meaning and A3 means L-Pro or a single bond, is. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß chromogene Verbindungen verwendet werden, in denen -NH-R durch Halogen substituiertes p-Nitroanilid bedeutet.4. The method according to claims 1 to 3, characterized in that that chromogenic compounds are used in which -NH-R substituted by halogen means p-nitroanilide.
DE19823202289 1981-02-02 1982-01-26 C1-Esterase inhibitor activity determn. e.g. in plasma - by spectrophotometric analysis of chromogenic peptide substrate cleavage prods. (AT 15.04.82) Withdrawn DE3202289A1 (en)

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