DE3245269A1 - N-(vinblastinoyl-23)-derivate von aminosaeuren, ihre herstellung und therapeutische anwendung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Bisindol-Alkaloide. Im einzelnen betrifft die Erfindung die Kombinationsprodukte einer Aminosäure mit Derivaten von Vinblastin, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung als antitumorale Mittel und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten.

Diese neuen Derivate von Vinblastin können bei der Behandlung von Leukämie und bösartigen Tumoren beim Menschen verwendet werden.

Bisindol-Alkaloide des Vinblastintyps sind gut bekannte Verbindungen, die das Kohlenstoffskelett der allgemeinen Formel

(D

besitzen.

Als Beispiele dieser Verbindungen kann man zitieren: Vxncaleukoblastin (US-PS 3 097 137), Leurocristin oder Vincristin und Leurosidin (US-PS 3 205 220) , Vinglycinat (BE-PS 65 9 112) und Vindesin (BE-PS 813 168).

Die letztere Verbindung wird durch chemische Modifizierung von

natürlichem Vinblastin (I,

= OCH

= COCH₃)/ das durch

Extraktion aus Catharanthus roseus-Blättern zu erhalten ist, erhalten.

Vinblastin, Vincristin und Vindesin sind im Handel zur Verwendung in der Humantherapie erhältlich, im einzelnen für die Behandlung von Leukämie und einigen festen Tumoren.

Jedoch hat es sich ergeben, daß diese Medikamente ungünstige Nebeneffekte aufweisen. Vincristin zeigt neurotoxische Wirkungen und Vinblastin eine hohe Toxizität, soweit hämatopoetisehe Gewebe betroffen sind.

Ihr Wirkungsmechanismus ist ähnlich dem Mechanismus, der für die antimitotische Wirkung von Colchicin aufgestellt wurde. Diese Medikamente dürften durch Inhibierung der Polymerisation von

BADORIQfNAL

3245289

Tubulin zu Mikrotubula wirken und daher Zellteilung in der Metaphase hemmen.

Die Verwendung von 1:1 Komplexen von antitumoralen Tubilin-Bisindol-Alkaloiden wurde·in der BE-PS 854 05 3 beschrieben.

In einigen Fällen wird eine niedrigere Toxizität und stärkere chemotherapeutische Aktivität als für die entsprechenden freien Alkaloide beschrieben.

Andere chemische Modifikationen von Vinblastin wurden getestet. So wurde auch das Vinglycinatsulfat (I, Sulfat, R^ = OCH₃? R₂ = COCH₂N(CH₃)₂ - Cancer Research 1967, 27_, 221-227) in klinischen Experimenten getestet, aber es ergab sich, daß es im allgemeinen nicht dem Vinblastin oder Vincristin überlegen war.

Die BE-PS 813 168 offenbart Vindesin (I, R₁ = NH₂, R₂ = H) und andere Vinblastin-C^-Carboxamidderivate. Naehfolgende Berichte bestätigten das therapeutische Interesse von Vincjle~ sin oder 3-Carboxamid-4-0-deacetyl-vinblastin, aber diese Verbindung ist anscheinend inaktiv für die Behandlung von Murine 1210 Leukämie an der Maus <C.J.Barnett et al., J. Med. Chem. 7A_, 88, 1978) .

Die neuen, in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen sind geeignet, wesentlich den Tod von Mäusen, die intravenös mit P 388 und L 1210 Leukämie inokuliert sind, aufzuschieben.

Die Aktivitäten auf experimentelle P 388 Tumore sind anscheinend überraschenderweise überlegen den betreffenden Vincä-Alkaloiden. Zahlreiche vollständige Abnahmen wurden beobachtet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen weiter andere wichtige und unerwartete Vorteile im Vergleich mit Vinblastin und bekannten Analogen, insbesondere Vindesin.

O ■£. H U L· U vJ

Im einzelnen ist im allgemeinen die Toxizität, die beobachtet wurde/ geringer als die entsprechende Toxizität von Vindesin oder Vincristin.

Die neuen Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung entsprechen im einzelnen der allgemeinen Formel II

CH₃O

(II)

worin R ein Ester einer gegebenenfalls geschützten <X-Aminos äur eist ,gebunden an den Vinblastin-23-oyl-Teil durch eine Amidbindung, wobei die Estergruppe, die geradkettig oder verzweigt sein kann, 2 bis 9 Kohlenstoffatome enthält und R-ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe ist, R₂ ein Wasserstoffatom, eine Formylgruppe oder eine C₂-Cg-ACylgruppe ist, Rr ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe oder eine Formylgruppe ist, unter der Voraussetzung, daß Verbindungen, in denen Rc Methyl und R₁ eine ß-Hydroxygruppe ist, ausgeschlossen sind; oder ihre Additionssalze mit Mineral- oder organischen Säuren.

BAD ORIGINAL

32A5269

Die folgenden Verbindungen werden insbesondere bevorzugt:

CO₂CH₃

(III)

worin R- eine Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom ist, B- ^eiⁿ Wasserstoffatom, eine Formylgruppe oder eine ^C2~^C9~ Acy!gruppe ist, R, jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, geradkettiges oder verzweigtes Cj-Cg-Alkyl, Hydroxy-Cj-Cgalkyl, Aminohydroxy-C^-Cg-alkyl, Carboxy-C^-Cg-alkyl, Amido-C|-Cg-alkyl, Guanadino-C--Cg-alkyl, Amino-C--Cg-alkyl, Thiol-Cj-Cg-alkyl, Cysteinyl-methyl, Methylthio-äthyl, Benzyl-, Hydroxy-benzyl, oder eine Gruppeϊ

(IV )

oder

(V)

ist, oder R₃ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das es gebunden ist, und dem Stickstoff der Amidogruppe einen Azol- oder einen Hydroxy-azolring bildet; R_ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe oder eine Formylgruppe ist, und R^ eine geradkettige oder verzweigte C.-Cg-Alky!gruppe oder eine Benzylgruppe ist, mit der Maßgabe, daß Verbindungen, worin

gleichzeitig R₁ ß - OH und R₅ -CH₃ sind, ausgeschlossen sind, -COOR₄ vorzugsweise die Carboäthoxy-oder die Carbomethoxygruppe ist; oder ihre Additionssalze mit einer Mineraloder organischen Säure.

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt das strukturelle

Segment

R₀ 0 1 3 n

-NH-GH-COR₄

in der allgemeinen Formel III einen Ester dar, der abgeleitet ist von irgendeiner der natürlich vorkommenden Aminosäuren und ihrer optischen Isomeren der D-Konfiguration, nämlich Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Asparaginsäure i Glutaminsäure,Asparagin, Glutamin, Arginin, Lysin, Cystein, Cystin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Prolin, Histidin, Hydroxy-lysin oder Hydroxy-prolin.

Die Verbindungen können als S-Decarbomethöxy-O-'i-deacetylvinblastin-3-carboxamid bezeichnet werden. Sie werden jedoch vorzugsweise bezeichnet als N-(Vinblastin-23-oyl)-oder N-(Vincristinoyl-23)-derivate der nachfolgenden Aminosäuren.

Insbesondere bevorzugte Verbindungen gemäß der Erfindung der allgemeinen Formel II sind diejenigen, in denen R- Wasserstoff und die Aminosäureteile abgeleitet sind von einer der folgenden Aminosäuren: L- oder D-Tryptophan,-Leucin,»-Isoleucin, -Valin,-Alanin oder-Phenylalanin. Unter diesen sind L-Tryptophan, L-Isoleucin und L-Alanin von besonderem Interesse.

Die vorliegende Erfindung beschreibt einzelne Reaktionsprodukte von Aminosäuren mit Vincristin, 0-4-Deacetyl-vincristin, Deformyl-O-4-deacetyl-vincristin und Deoxy-vinblästin B.

Die letztere Verbindung kann durch Hydrierung von Anhydrovinblastin erhalten werden, das wiederum durch Dehydratation von Vinblastin oder durch Kuppeln von Vindolin mit Catharantin

BAD ORIGINAL

66*

- 11 erhalten wird (Potier et al., JACS 9^,7017, (1976)).

Die besonders bevorzugte Verbindung nach der vorliegenden Erfindung ist Äthyl-N-(0-4-deacetyl-4'-deoxyvinblastin-23-oyl)-tryptophanat.

Wenn die Aminosäure funktionelle Gruppen in der Seitenkette R₃ (Formel III) enthält, wie Lysin oder Cystein, kann es notwendig werden, die funktionellen Gruppen gemäß der dem Faqhraann gut bekannten Methoden zu schützen.

Ein Schutz kann erreicht werden in Abhängigkeit von der Natur der zu schützenden Gruppe durch Kondensation eines Benzyl-^ t-Butyl-, Benzyloxycarbonyl-^ t-Butoxy-trifluoracetyl-carbonyl- oder Tritylrests. Andere gut bekannte Schutzgruppen, die in der Peptid-Chemie verwendet werden, können auch vorteilhaft eingesetzt werden.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in üblicher Weise ausgehend von den entsprechenden Vinblastin-Derivaten durch Hydrazlnolyse, gefolgt durch Nitrosierung und Reaktion mit dem Aminosäureester gemäß der Reaktionsfolge I, erhalten werden.

NaNO

CH OH <-> I HCl OCOCH „ ^J ^^^"V 0°C

OH COOCH₃ HO'*' C-NH-IJH₂

O Aminosäureester

CH₂Cl₂

HO C-N-&-CO-OR-

ο ^H

Reaktionsfolge I

Die erste Stufe dieses Verfahrens besteht darin/ wasserfreies Hydrazin im Überschuß zu einer Lösung von Vinblastin-Base in wasserfreiem Methanol zuzugeben. Die Lösung wird in einer inerten Atmosphäre 12 Stunden lang bis 12 Tage lang bei einer Temperatur zwischen etwa 30°C und 70^eC erhitzt. Besonders bevorzugt wird die Temperatur bei etwa 60⁰C gehalten.

Das Hydrazid des Bisindol-Derivats wird dann durch Addition von Wasser, Extraktion mit Dichlormethan und Konzentrieren isoliert. Die Verbindung kann weiter durch präparative Chromatographie (neutrales Siliciumdioxid) gereinigt werden; Im Fall von Vincristin ist das erhaltene Produkt das 0,4-Deacetyl-deformyl-vincristin-carboxhydrazid.

Während der zweiten Stufe wird die Hydrazidfunktion des modifizierten Vinblastins in ein Acylazid überführt. Diese überführung wird in bekannter Weise durch Zugabe von Natriumnitrit zu dem gelösten Hydrazid in einer Wasser-Methanol-Säuremischung erreicht.

Die Säure, die verwendet wird, kann Chlorwasserstoffsäure sein,

Die Reaktionstemperatur wird zwischen 0⁰C und 5⁰C gehalten. Nach Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren aprotischen Lösungsmittel, vorzugsweise Methylenchlorid, wird die organische Phase teilweise konzentriert.

Das geeignete Acylazid wird vorzugsweise nicht isoliert, sondern direkt zu dem Aminosäureester oder gegebenenfalls einem geschützten Derivat desselben gelöst in Methylenchlorid zugegeben.

BAD ORIGINAL

Die zu verwendende Menge Aminosäure beträgt etwa 1 bis 5 Äquivalente des modifizierten Vinblastin-carboxazids.

Die Reaktionsmischung wird zwischen etwa -3°C und +10⁰C für 8 bis 72 Stunden und im allgemeinen für etwa 15 Stunden gehalten. Eine überwachung der Reaktion wird leicht durch Dünnschichtchromatographie erreicht. Nach Konzentrieren kann die erfindungsgemäße Verbindung der Formel II in ein Sulfatsais oder ein anderes Salz, abgeleitet von einer Mineral- oder organischen Säure, durch Kristallisieren aus einer methanolischen Lösung der entsprechenden Säure übergeführt werden=

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch übliche Chromatographie- und ümkristallisierungstechniken gereinigt werden.

Gewünschtenfalls kann das so erhaltene 4-O-Deacetyl-vinblastinderivat reacyliert werden, entweder direkt zum Erhalt des Vinblastin-Derivats III, worin R₂ COCH-- ist (J. Med. Chem« 22, 391, 1979), oder durch vorläufige Bildung des 3,4-Diacetoxy-Derivats, gefolgt durch eine selektive Hydrolyse der 3-Acetoxygruppe in 3-Stellung. Die Hydroxygruppe in C₄ kann üblicherweise durch andere aktivierte Säurederivate, die 2-9-C-Atome enthalten, verestert werden. Die O-4-Formyl-Derivate werden durch Formylierung (Ameisensäure-Essigsäureanhydrid) der entsprechenden O-4-Deacety!verbindungen erhalten (siehe BE-PS 660 843).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die industriellen und insbesondere pharmazeutischen Anwendungen der neuen Bisindol-Alkaloide.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen üben insbesondere sehr wertvolle antitumorale Eigenschaften aus, die in der Humantherapie angewandt werden können.

O L· H yJ £. U

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Diese Aminosäurederivate können für die Behandlung einer Leukämie vom L 1210, P 388-Typ, Gliomen, Lymphosarcomen und anderen Leukämien oder bösartigen Tumoren verwendet werden. In der Humanmedizin können sie zur Behandlung der Hodgkin¹sehen Krankheit und für andere feste Tumore eingesetzt werden, die mit Vinblastin, Vincristin oder Vindesin behandelbar sind. Diese Verbindungen sind auch wertvoll in der Veterinärmedizin zur Behandlung von Tumoren der Tiere.

Andere interessierende therapeutische Verwendungszwecke können auch für die neuen Derivate der Bisindol-Alkaloide ^&ngegeben werden. Es wurde beschrieben, daß Vinblastin für die Behandlung gewisser Formen von Arthritis eingesetzt werden kann (US-PS 4 208 411), und daß Vincristin zur Behandlung von Psoriasis verwendet werden kann (US-PS 3 749 784).

Für ihre therapeutische Verwendung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen gegebenenfalls in lyophilisierter Form vorzugsweise über den parenteralen Weg verabreicht, gelöst in einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel in Form einer Base oder eines pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes. Unter den Säureadditionssalzen sind die nicht toxischen und pharmazeutisch verträglichen Salze, wie anorganische Säuresalze, wie Chlorwasserstoffsäure-, Phosphorsäure- und Schwefelsäur es al ze, oder organische Säuresalze, wie Essigsäure-, Propionsäure-, Bernsteinsäure-, Weinsäure-, Oxalsäure-, Methansulfonsäure- und Benzol-sulfonsäuresalze bevorzugt.

Physiologisches Wasser (physiologische Kochsalzlösung) und andere Salzlösungen, die gepuffert sind, z.B. mit einem Phosphat, sind geeignete Lösungsmittel. Im allgemeinen können die Verbindungen in der Humantherapie in analoger Weise zu dex" Technik und den Beschränkungen bei der Verwendung anderer Alkaloide des Vinca-Typs verwendet werden.

BAD ORIGINAL

*« β * t> ty

Die aktive Substanz wird im allgemeinen eingesetzt bei einer Posologie, schwankend zwischen 0,01 mg bis etwa 5 mg/kg in Abhängigkeit von dem Derivat und dem therapeutischen Schema, das angewandt wird. Die gesamtwöchentlichen Dosen werden im allgemeinen zwischen 0,1 und etwa 35 mg/kg schwanken.

Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung werden als Einheitsdosen von 2 bis 900 mg hergestellt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder in Kombination mit anderen karzinostatischen Mitteln verwendet werden, unter Einschluß, z.B., der Alkylierungsmittel, der Antimetaboliten, wie Methotrexat, 5-Fluoro-uracil, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, den Cystosin-arabinosiden, und Antibiotika, wie Actinomycin D, Daunorubicin, Adriamycin und cis-Diamino-dichlor-platin. Insbesondere können die neuen Vinblastinderivate in Kombination miteinander eingesetzt werden.

Die folgenden speziellen Beispiele erläutern in nicht beschränkender Weiss das Verfahren zum Erhalt der erfindungsgemäßen Verbindungen.

BEISPIEL 1

1. Herstellung von 0-4-Deacetyl-N-deformyl-vincristin-mono~ hydrazid A.

958 mg Vincristinbase werden in einer Mischung von 10 ml wasserfreiem Hydrazin und 10 ml Methanol gelöst. Die Reaktionsmischung wird bei 60⁰C unter Rühren für 22 Stunden gehalten. Die Reaktionsmischung wird dann mit Wasser und danach mit mit NaCl gesättigtem Wasser behandelt.

O £. H U L· U O

Die wäßrige Lösung wird achtmal mit 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen werden mit 20 ml Wasser, danach 75 ml mit NaCl gesättigtem Wasser behandelt, und schließlich über Na₂ SO₄ getrocknet. Nach Filtrieren und Vakuum-Konzentration wurden 900 mg 0-4-Deacetyl-vincristin-monohydrazid (Reinheit über 90%) erhalten.

NMR-Spektrum (CDCl₅, 36O MHz)

9_T76 (s,IH), 8,37 (s,lH), 8_f06 (-5,1H), 7_f53 (d,lH), 7_;24 und7,07 (n,3H), 6,82 (s,lH), 6,22 (s,l)_f 5_f87 (dd,lh), 5,67 (d,lH), 5_f43 (s,lH, 4_f03 (s,lH), 3,94 (s,3H), 3,86 (s,IH), 3,73 (s,3H), 3,52 (s,3H), 2,82 (s,2H), 2,51 (S,IK),

0,93 (2t, 2 χ 3H)

Massenspektrum (elektronischer Ionisations-Beschuß)

154, 294, 355, 413, 524, 555, 695, 710, 723, 736, 739, 755 (M + 1) - 768, 769, 782 berechnet für

^C42^H54^N6°7 ⁷⁵-'942
2. Herstellung des Säureacids von modifiziertem Vincristin.

Eine Lösung von 850 mg Vincristin-monohydrazid A in 20 ml Methanol wird mit 63 ml HCl 1 N und 175,5 mg Natriumnitrit 15 Minuten bei 0⁰C behandelt.

Die bei 0 ⁰C gehaltene Lösung wird dann mit NaHCO-z bei 0 ⁰C neutralisiert und danach dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen werden über Na_pS0|i getrocknet, filtriert und vakuumkonzentriert ohne Erhitzen, bis eine Lösung von etwa 10 ml erhalten wird.

^. Reaktion mit Äthyltryptophanat.

500 mg Äthyltryptophanat werden dann unter Rühren bei etwa 4 ⁰C zugegeben und die Reaktion durch TLC geprüft. Nach 10 Tagen wird das Reaktionsprodukt durch chromatographische Trennung (40 g Silicagel 60, Elutionslösungs-

■> BAD ORIGINAL

111 ·.♦··.

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mittel Äther/NH,-gesättigtes Methanol 96:4 Volumen/Volumen). Fraktionen von 15 ml werden gesammelt, die durch TLC geprüft werden (Dünnschichtchromatographie). Nicht-umgesetzte Aminosäure wird zuerst gesammelt (Fraktion 30 bis 4o). Das Eluierungsmittel wird gewechselt (Äther/NH-z-gesättigtes Methanol 86:14),und die umgesetzten Derivate werden als 3 Fraktionen gesammelt; Fraktionen 44 und 45:30 mg; Fraktionen 46 - 53:257 mg; Fraktionen 54 - 60:115 mg).

Der zweite Teil war Äthyl-N-(0,4-deacetyl-deformyl-vincristin-2j5-oyl)-tryptophanat Ia, das nach TLC homogen war.

Massenspektrum : 984, 970, 956 (M⁺ + 1) 913, 912, 899 (DCJ Isobutan ), berechnet für C55H66N609 : 955,181.

UV-Spektrum (CH₃OH) :

max : 282 (4^0) - 290 (4,18) - 322 (3,96) min : 254 - 287 - 305

IR-Spektrum _: (cm"¹) _v

3400 - 2920 - 1720 - 1660 - 1610 - 1485 - 1450 - 1370 - 1345

1330 - 1290 - 1220 - 1165- 1130 - 1025 - 1005 - 920 - 885 830 - 740

NMR-Spektrum (CDCl,) 3 60 MH (ppm)

8,50 (s, IH)

8, 03 (s, 2H)

7_r77 (d, IH)

7,60 (d, IH)

7_f57 (d, IH)

6j95 (s, IH)

6,35 (s, IH)

5,89 (d.d., IH)

5, 78 (d, IH)

4_r75 (q, IH)

3,88 (s, 3H)

3, 67 (s, 3H)

l_f 23 (t, 3H)

O, 98 (t, 3H)

O, 89 (t, 3H)

fithyl-N-(0,4-deacetyl-vincristin-25-oy-l)-tryptophanat IB. Das deformylierte Derivat I a (257 mg) wird reformyliert durch Anwendung der in BE-PS 811,110 beschriebenen Methode.

Das so erhaltene Rohprodukt wird durch chromatographische Trennung unter Verwendung einer 20 cm-Kolonne (Silicagel, 30 g) und nacheinander 3 Eluierungsmittel.: Äther/NEU-gesättigtes MeOH 92:8; 88 : 12, 86 : l4 gereinigt. Der Ausfluß wird als 15 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 44 - 54 (^4,1 mg) enthielten das N-reformylierte Derivat Ib.

Massenspektrum(isobutan DCI) : lOlL 997, 983 (M⁺ + 1), 970,

982, 996, 998, 999, 1012 berechnet für C56H66N601.Q = 983,192

UV-Spektrum (CH₃OH) max : 270 (4 _f18) - 290 (4_fll) Platte 280 (4 ^ 12) Schulter (4.03)

BAD ORIGINAL

IR-Spektrun (KEr)

Banden bei 3400 - 3040 - 2960 - 2920 - 2880 - 2850 - 1735 -

1725 - 1680 "- 1670 - 1665 - 1610 - 1490 - 1450 - 1225 - 745.

Beispiel ₂

Äthyl-N - (0-4 deacetyl-deoxy - 4¹ - vinblastin-25-oyl-B) tryphtophanat Ic.

Das 0-4-Deacetyl-deoxy-vinblastinhydrazid wird durch die in US-PS 4 205 898, Spalte 24 Zeile 51 ff beschriebene Methode hergestellt.

500 mg des Hydrazids in 12 ml Methanol werden danach mit 57 ml HCl IN und 104 mg NaNO₂ 15 Minuten lang bei O⁰C behandelt.

Die Lösung wird danach mit NaHCO-* neutralisiert und 6mal mit 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen werden über Na₂SOh getrocknet und konzentriert, bis ein Volumen von etwa 10 ml erhalten wird.

Das Azid in Lösung wird dann in Berührung mit Äthyltryptophanat (500 mg) bei 4 ⁰C unter Rühren gebracht. Die Reaktion wird durch TLC (Äther, MeOH) überprüft. Nach 6 Tagen ist die Reaktion vollständig, und das Reaktionsprodukt wird durch Kolonnenchromatographie über Silicagel (l8 cm, 50 g), EIuierung durch 15 ml-Fraktionen gereinigt.

Die folgenden Eluierungsmittel wurden nacheinander verwendet: Äther 96 NH, ges., MeOH 4 Fraktionen 1-49 92 & Fraktionen 50-57

86 14 Fraktionen 71-90

Die Fraktionen 50 - 57 enthalten das gewünschte Reaktionsprodukt Ic (I08 mg).

BAD ORiGJNAL

- 20 -

Das Sulfat wird durch Ätherausfällung hergestellt (2 # H₂SO^/Äthanol).

UV-Spektrum des Sulfats (CH,0H)

max : 224 (4,63) - 272 (4,32)
min : 247 (4 ,03)
Schulter : 286 (4,22) - 312 (3,72)

IR-Soektrum (KBr) des Sulfats .

342Ö - 3060 - 2960 - 2930 - 2880 - 2600 (schwach) - 1725

1660 - 1615 - 1500 -- 1455 - 1430 - 1375 - 1230 - 1105 -

1060 - 1015 - 920 - 745 cm"¹.

NMR-3pektrum (CDCl₃) 3 60 MHz der Base in ppm,

9,46 SlH 7,53 d 1 H 4,34 g IH

8,34 SlH 7,30 d 1 H 4_; 18 d IH

7,92 SlH 6,51 s 1 H 4_; 05 q 2H

7,67 d 1 H 6._f.04 s 1 H 3,77 s 3H

7,59 d 1 H m. um s. zentriert auf 5 81

BAD ORiGINAL

- 21 -

3,58 SRH

3,47 S IH

2,82 S 2Η

2,77 β 3Η

2γ59 S IH

1,14 t 3H

0,95 t 3H

0,87 t 3H

Massenspektruin der Base

DCI Isobutan

M '+ 1 ⁺beL954 M + 14 + l⁺tei 968 M + 28 + I ⁺bei 982

Ionen bei 153 - 155 - 157 - 171 —172 - 185 - 186-199

213 - 223 - 227 - 255 -. 257 - 279 - 281 - 2S3

285 - 349 - 398 - 459 - 516 - 569 - 952 - 953

955 - 967 - 969 - 981 -

berechnet für C₅₆ H₅₈ N₆ O₈ : 953,208

BAD ORaGfNAL

Beispiel 3 Äthyl-N-(O-4-deacetyl-4'-deoxy-vinblastin-23-oyl-B)-

isoleucinat

Eine Lösung von O-4-Deacetyl-4'-deoxyvinblastin-ß-hydrazld (0,6 g, 0,79 mM - siehe US-PS 4 203 898, Spalte 24, Zeile 51) in einer Mischung von 15 ml CH^OH und 45 ml HCl 1 N wurden auf -7 ⁰C gekühlt. NaNOp wurde zu der Lösung (0,15 ß) zugegeben, und das Rühren wurde IJ Minuten bei -7 ⁰C fortgesetzt. Nach Zugabe einer wäßrigen gesättigten Lösung von NaHCO,, bis ein pH-Wert von 9 erreicht ist, wird die entstehende Lösung viermal mit CHoCl₂ extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO^ getrocknet.

Die Lösung wurde auf ein Volumen von 15 ml konzentriert, und Äthylisoleucinat (1,25 mM) wurde zugegeben. Die Reaktionsmischung ließ man 4 Tage in einem Kühlschrank stehen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde durch Kolonnenchromatographie (SiOo, 60 g) gereinigt und mit Äther/CHgOH/NH^ (96:4) eluiert. 0,25 g amorphes Produkt (Ausbeute 35 %) wurden so erhalten.

Massenspektrum : (Molec.Ionisation Isobutan)

880(M⁺), 894, 836, 849, 832, 445; 391, 355 era"¹

^C51^H69^N5°8 = ^⁸⁰'¹ Schmelzpunkt 180-19O⁰C

a_D = 104° Cc=O _T154)

IR (CHCl₃) 3470, 2970,1728, 1655_r 1612, 1502 cm"¹

UV

(CH₃OH) 289, 268, 216 nra

BAD ORIGINAL

NMR (CDCL₅) 7_r9 (NH) , 654 and 6,06 H₉, H₁₂, 5,81 (H₁₄-H₁₅) 4^0 (CHCO₂(NH)) 3,76 CO₂CH₃ , 3,58 CH₃-O , 3,33 Und 2_f85 (H₃A and H₃B) , 2,73 (N-CH₃) , 0,69 (H-15'J.

Akute Toxizitätsbestimmung von

Die akute Toxizität der Verbindung von Beispiel 2: Kthyl-N-(0-4-deacetyl-deoxy-^Jf^l-vinblastin-25-oyl-B)-tryptophanat wurde an weiblichen NMRI-Mäusen bestimmt. Steigende Dosen des Medikaments wurden intravenös in einer einzigen Injektion injiziert. Der Mortalitätsprozentsatz wird als Funktion der Zeit bestimmt. Die LDr-„~Werte für die voraus-

50

gehend angegebene Verbindung (Deoxy-VTrpE) und ein Bezugsprodukt: Deoxy-vinblastin (Deoxy-VBL) sind im folgenden angegeben.

Medikament LDr-,-Deoxy-VBL 20 Deoxy-VTrpE

(nämlich Ver- .

bindung Ic) 91,5

Die Verbindung Deoxy-VTrpE ist so wenig toxisch wie die Bezugsverbindung.

Antitumorale Aktivität

Die chemotherapeutische Aktivität des Sulfatsalzes von Deoxy-VTrpE wurde an der Lymphoblastenleukärcne L 1210 und P 388 studiert.

1. L 1210

Weibliche DBAp-Mäuse wurden mit 10 leukämischen Zellen beimpft. Das Produkt wurde auf intravenöse V/eise verabreicht, und zwar am Tag nach der Impfung zu einer 50 mg/kg-Dosis. Die Mortalität der Tiere-wird als Funktion der Zeit angegeben. Die nachfolgende Tabelle gibt die erhaltenen Resul-

täte mit der Verbindung des Beispiels 2 (Ic) an. Bei der getesteten Dosis ist die Verbindung aktiver als Vinblastin. Diese Überlegenheit wurde im Vergleich mit Deoxy-vinblastin bestätigt.

Weibliche DBA^-Mäuse wurden intravenös mit 10 Leukämie-Zellen inokuliert. Die Produkte wurden i.v. verabreicht und zwar am Tag nach der Inokulierung. Die Mortalität der Tiere wird als eine Funktion der Zeit angegeben. Die Resultate sind in der Tabelle aufgeführt. Deoxy-VTrpE ist klar aktiver als die Bezugsverbindung und zeigt einen höheren Prozentsatz an überlebenden Tieren auf lange Zeit an.

BAD ORIGINAL

TABELLE

Tumor Produkt	Dosis	Zahl der Tiere	MST 20 Tage	ILS	Prozentsatz der überle benden Tiere bei Tag 30	Prozentsatz der überle benden Tie re bei Tag 6o	0 · * * A f
L 1210 VBL	8	• ίο	10,4	57,6	0	O	* ♦ · · * · · · * i
VBL	19	10	5,8	- 21f6	0	0	* β f « FO >
Deoxy VTrpE	50	10	11,2	70	0	0	I .' * * » ta* * ♦ ·
P 388 VBL	4	5	15,6	56 '	0	0	u ΰ 4
Deoxy VBL	8	5.	5,8	- 42	0	0	fr St. * * BV *
Deoxt VTrpE	30	ίο	16,5	58,7	0	0
	40	15	30	191	67	53
	50	15	30	191	87	73?3
	55	10	30	212	80	60
	60	10	30	212	90	90

-4
Weibliche D3Ap-Mäuse werden über den i.v.-V/eg mit 10 -Leukämiezellen inokuliert. Die Medikamente

wurden über den i.v.-Weg zu .den angegebenen Bösen indiziert«

MST = mittlere Überlebenszeit ILS % - 'ρ an Zunahme der Lebensdauer

NJ CO CD

Claims (14)

Dr. F. ZumsteJn sen. - Dr. E. Assmann - Dr. R. Koenigsberger Dipl.-Ing. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun. PATENTANWÄLTE ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT REPRESENTATIVES BEFORETHE EUROPEAN PATENT OFFICE 20/Ob PATENTANSPRÜCHE

1. Vinblastin-Derivate der allgemeinen Formel

Γ~\

CO₂CH₃

CH₃O

worin

R ein Ester einer gegebenenfalls geschützten Aminosäure ist, gebunden an den Vinblastin-23-oyl-Teil durch eine Amidbindung/ wobei die Estergruppe, die geradkettig oder verzweigt sein kann, 2 bis 9 Kohlenstoffatome enthält und R^ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe ist, Ry ein Wasserstoffatom, eine Formylgruppe oder eine C₂ ^-Cg-Acy!gruppe ist, Rr ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe oder eine Formylgruppe ist, unter der Voraussetzung, daß Verbindungen/ worin gleichzeitig R₅ Methyl und R| eine ß-Hydroxygruppe ist, ausgeschlossen sind,· oder ihre Säureadditionssalze mit Mineral- oder organischen Säuren.

2. Vinblastin-Derivate der allgemeinen Formel

CO₂CH₃

(III)

5 OH

?3

- C—- NH -CH- C

OR;

worin R₁ eine Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom ist, R₂ ein Wasserstoffatom, eine Formylgruppe oder eine C~-C_Q-Acylgruppe, R-, jeweils unabhängig ein Wasserstoff atom, geradkettiges oder verzweigtes C₁-Cg-Alkyl, Hydroxy-Cj-Cgalkyl, Aminohydroxy-Cj-Cg-alkyl, Carboxy-C^-Cg-alkyl, Amido-Cj-Cg-alkyl, Guanidino-Cj-Cg-alkyl, AmInO-C₁-Cg-alkyl, ThIoI-C₁-Cg-alkyl, Cysteinyl-methyl, Methylthio-äthyl, Benzyl, Hydroxy-benzyl, oder eine Gruppe:

oder

(IV )

CH —

(V)

ist, oder R₃ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das es gebunden ist, und dem Stickstoff der Amidogruppe einen Azol- oder einen Hydroxy-azolring bildet; R₅ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe oder eine Formylgruppe ist, und R₄ ein geradkettiges oder verzweigtes C₁-Cg-Alkyl oder eine Benzy!gruppe ist, wobei die gleichzeitigen Bedeutungen von

BAD ORIGINAL

β ■ ft

„ 3 -

R₁ ist ß-OH land R₅ ist -CH₃ ausgeschlossen sind; oder ihre Säureadditionssalze mit Mineral- oder organischen Säuren-

3. Äthyl- oder Methyl-N-(0-4-deacetyl-vincristin-23-oyl)-L-.tryptophanat oder ihre Additionssalze mit pharmazeutisch

annehmbaren Säuren.

4. Äthyl- oder Methyl-N- (O^-deacetyl-deformyl-vincristin^S-oyl)-L-tryptophanat oder ihre Additionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren.

5. Äthyl-N-(O^-deacetyl-deoxyvinblastin-aa-ß-oyl)-L-tryptophanat oder seine Additionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren.

6. Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Additionssalz das 1:1 Additionssalz mit Schwefelsäure ist.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Humanoder Veterinärmedizin zur Behandlung von neoplastischen Krankheiten, enthaltend eine oder mehrere Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 7 in einer Verabreichungsform, dadurch gekennzeichnet, daß die aktive Verbindung in einer Menge von etwa 2 bis 900 mg für eine Einheitsdosis enthalten ist.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die aktive Verbindung Äthyl-N-(0-4-deacetyl-vincristin-23-oyl)-L-tryptophanat oder sein Additionssalz mit einem pharmazeutisch annehmbaren Salz ist.

J ϊί, H J 4. ü J

— 4 —

10. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die aktive Verbindung Äthyl-N-(O^- deacetyl-deformyl-vincristin-^S-oyl) -L-tryptophanat oder sein Additionssalz mit einem pharmazeutisch verträglichen Salz ist.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die aktive Verbindung A"thyl-N-(0-4-deacetyl-deoxyvinblastin-23ß-oyl)-L-tryptpphanat oder sein

Additionssalz mit einem pharmazeutisch verträglichen Salz ist.

12. Vinblastin-Derivate, im wesentlichen wie beschrieben in bezug auf irgendeines der Beispiele.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Humanoder Veterinärmedizin, im wesentlichen wie beschrieben in bezug auf irgendeines der Beispiele.

14. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch oder 2, im wesentlichen wie beschrieben in bezug auf irgendeines der Beispiele.

BAD ORIGfNAL