-
MESSGEFÄSSE FOR DIE PHOTOMETRIE
-
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit Meßgefäßen für die Photometrie,
und zwar mit Meßgefäßen, die extrem wenig Meßlösung beanspruchen.
-
Es ist ein weitverbreitetes Verfahren, die Konzentration absorbierender
Substanzen in Flüssigkeiten photometrisch zu bestimmen. Dazu füllt man die Meßlösungen
in Meßgefäße, bringt diese in den Strahlengang eines Photometers und mißt die durch
die absorbierenden Substanzen verursachte Schwächung des Strahlungsflusses. Unter
geeigneten Bedingungen gilt das LAMBERT-BEER'sche Gesetz, nach dem sich die Konzentration
C der absorbierenden Substanz in der Meßlösung errechnet aus der gemessenen Extinktion
E, aus der für die Schwächung des Strahlungsflusses zur Verfügung stehenden Meßstrecke
S (Schichtlänge) und aus einem die Substanz kennzeichnenden Extinktionskoeffizienten
e: C = Es.
-
Im Jahre 1941 wurde von der Firma Beckman (Fullerton, Kalifornien,
USA) eine Standardküvette in den Handel gebracht, die auch heute noch häufig als
Meßgefäß verwendet wird (quadratischer Innenquerschnitt, Schichtlänge 10 mm, Außenabmessungen
12,5 x 12,5 x 45 mm, Füllvolumen 1 - 4 ml).
-
Um den Bedarf an Meßlösung zu verringern, hat man viele verschiedene
Meßgefäße mit einem kleineren Füllvolumen konstruiert. Für die Photometrie stark
absorbierender Substanzen kann man zu diesem Zweck die Meßstrecke S verkürzen -
bei bestimmten Untersuchungen in der Mikroskop-Photometrie reichen wenige Mikrometer
(vergleiche KORTÜM, G., Kolorimetrie, Photometrie und Spektrometrie; in: MAYER-KAUPP,
H., Anleitungen für die chemische Laboratoriumspraxis, Springer-Verlag Berlin, 1962).
-
In der Regel hat man es aber mit schwach absorbierenden Meßlösungen
zu tun. Hier muß die Meßstrecke genügend groß sein, weil sich die Empfindlichkeit
der photoelektrischen Einrichtung nicht beliebig steigern läßt. Dementsprechend
versucht
man, den Innenquerschnitt der Meßgefäße möglichst weit zu reduzieren, um mit weniger
Meßlösung auszukommen.
-
Die lichte Breite der Beckman'schen Standardküvette wurde verringert,
z. B. auf 4 mm (Halbmikroküvette, Mindestfüllvolumen etwa 0,4 ml).
-
LOWRY, O. H. und BESSEY, O. A. (J. Biol. Chem. 163, 633 - 639, 1946)
verkleinerten den Innenquerschnitt der Standardküvette auf 2 x 2,5 mm2 (Füllvolumen
50 /ul).
-
SIPPEL, T. O. (Exptl. Cell Research 7, 281 - 283, 1954) brachte eine
Meßkapillare von 1 mm oder 2 mm Innendurchmesser in den Strahlengang des Photometers
(Füllvolumen 8 /ul oder 31 /ul bei einer Schichtlänge von 10 mm).
-
KIRK, P. L. und andere (Anal. Chem. 19, 355 ff, 1947) beschrieben
ein Meßgefäß aus einem Rohr von 2 mm oder 4 mm Innendurchmesser und 50 mm Länge,
das von KILZER, F. J.
-
und MARTIN, S. B. (J. Chromatog. 31, 204 - 208, 1967) zu einer Meßzelle
für die Durchflußphotometrie umgebaut wurde.
-
Ein von ULLRICH, K. J. und HAMPEL, A. (Pflügers Arch. 268, 177 - 180,
1959) angegebenes Meßgefäß besteht aus einem Block mit einer Bohrung von 0,5 mm
Durchmesser und 6 mm Länge, für dessen Füllung (die Füllstutzen einbegriffen) 5
/ul Meßlösung ausreichen. Als Fenster dieses Meßgefäßes werden mit Vorteil plankonvexe
Sammellinsen verwendet (vermerkt bei NETHELER, H.: Absorptionsphotometrie, in: BERGMEYER,
H. U.: Grundlagen der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim/New York, 1977).
Dadurch wird der für die Photometrie zur Verfügung stehende Strahlungsfluß im Meßgefäß
erhöht.
-
Das gleiche erreicht man mit Mikroskop-Photometern, für die auch Mikroküvetten
großer Schichtlängen beschrieben wurden (HOLTER, H. und LOVTRUP, S.: Compt. Rend.
Carlsberg, Ser.
-
Chim. 27, 27 ff, 1949; KRUGELIS, E. J.: ebenda 27, 273 ff, 1950; FISCHER,
W.: Acta histochem. 24, 285 - 289, 1966; Schichtlängen von 5 bis 10 mm, Füllvolumina
unter 10 lul).
-
Von der Fachwelt wird die Meinun vertreten, das Strahlenbündel
dürfe
bei der Messung die Seitenwände der Meßgefäße oder den SPiegel der Meßlösung nicht
berühren (LOWRY und BESSEY; SIPPEL; FISCHER; KORTÜM S. 134 ff; NETHELER).
-
Je kleiner der Innenquerschnitt der Meßgefäße ist, und je größer ihre
Schichtlänge, umso eher und umso stärker tritt das Strahlenbündel mit den seitlichen
Grenzflächen der Meßgefäße in Wechselwirkung, wenn die Strahlen nicht genau parallel
zur optischen Achse durch die Meßgefäße verlaufen. Dabei kommt es an den seitlichen
Grenzflächen zu folgenden physikalischen Vorgängen, die das Meßergebnis verfälschen
können: 1. Strahlung wird absorbiert.
-
2. Strahlung wird einmal oder mehrmals reflektiert, ein Teil der reflektierten
Strahlung erreicht die Photozelle nicht.
-
3. Strahlung wird gestreut, nur ein Teil der Streustrahlung gelangt
durch die Meßlösung zur Photozelle, die übrige Strahlung wird von den Seitenwänden
absorbiert, zurückgeworfen, oder sie verläßt den Ausgang der Meßzelle unter einem
solchen Winkel, daß sie nicht auf die Photozelle trifft.
-
4. Strahlung wird zur Wand hin gebrochen. Ein Teil davon geht für
die Messung verloren, ein anderer Teil könnte in der Wand durch Totalreflexion weitergeleitet
werden und - ungeschwächt durch die Meßlösung - auf die Photozelle treffen.
-
Bei entsprechender Beschaffenheit der Meßgefäße ist es auch möglich,
daß Strahlung von der Strahlungsquelle aus durch die eine Stirnseite des Meßgefäßes
in dessen strahlungsdurchlässige Wand gelangt, und von dort aus durch die andere
Stirnseite zur Photozelle.
-
Diese Störungen werden bei den meisten Meßgefäßen dadurch vermieden,
daß man ihren lichten Querschnitt im gefüllten Bereich größer wählt als den größten
Querschnitt des durch die Meßgefäße geführten Strahlenbündels. Man nimmt dabei in
Kauf, daß ein Teil der Meßlösung nicht unmittelbar zur
Schwächung
des Strahlungsflusses genutzt wird. Um nicht zu viel Meßlösung zu vergeuden, muß
man das Strahlenbündel möglichst parallel halten, wodurch die Meßgefäße weiter ausgeleuchtet
werden können.
-
Verkleinert man den lichten Querschnitt der Meßgefäße, dann sinkt
die. Empfindlichkeit der Meßanordnung. Man kann versuchen, diesen Verlust durch
eine geeignete optische Vorrichtung auszugleichen, mit der man die Strahlungsdichte
in den Meßgefäßen erhöht. Eine für englumige Meßgefäße besonders geeignete Strahlungsquelle
ist ein LASER.
-
Für Untersuchungen, bei denen nur wenige Mikroliter Meßlösung zur
Verfügung stehen, muß der gesamte Innenquerschnitt der Meßgefäße ausgeleuchtet werden,
damit genügend große Extinktionsunterschiede gemessen werden können: SIPPEL führt
das Strahlenbündel durch ein in eine schwarze Membran eingelassenes Fenster in das
Meßgefäß. Der Querschnitt des Fensters deckt sich mit dem lichten Querschnitt des
Meßgefäßes und ist kleiner als der des Strahlenbündels. Wegen der oben genannten
Störeinflüsse ist hier parallelisierte Strahlung Voraussetzung.
-
Die Seitenwände der engen Meßgefäße können schwarz ausgekleidet werden
(KORTUM, Baly-Rohr, S. 127), aber dadurch lassen sich die Störungen nicht völlig
ausschalten (ULLRICH und HAMPEL).
-
Die Lichtungen der Meßgefäße müssen reproduzierbar exakt im Strahlengang
positioniert werden, besonders dann, wenn der Strahlungsfluß im Strahlenbündel nicht
isotrop ist.
-
Das läßt sich beispielsweise durch Führungsnuten erreichen, in denen
der Küvettenhalter gleitet (ULLRICH und HAMPEL), oder durch ein mit einem Gleitmechanismus
kombiniertes Rastwerk (JONES, R. T. und WEISS, G.: Anal. Biochem. 9, 377 - 382,
1964), oder auch durch eine geeignete Regelvorrichtung, die die Position der Meßgefäße
im Strahlengang so einstellt, daß der Photostrom einen Maximalwert annimmt.
-
In der vorliegenden Erfindung darf das Strahlenbundel die seitlichen
Grenzflächen der Meßgefäße berühren.
-
Die Richtungen der Meßgefäße können voll ausgeleuchtet werden. Die
Meß2zefaße können viel lkngerX und ihr Innenquerschnitt viel kleiner sein, als es
bisher für möiich Rehalten wurde, soweit, bis der Strömungswiderstand, den das Meßgefäß
der Flüssigkeit entgegenstellt, eine für die praktische Durchführung der Messung
vertretbare Grenze erreicht. Dadurch wird die Photometrie schwach absorbierender
Neßlösungen um ein Vielfaches empfindlicher, und man kann Probenmaterial und Reagenzien
einsparen, weil man mit einem extrem geringen Volumen an Meßlösung auskommt, Die
Erfindung benutzt das Prinzip der Totalreflexion; das seit 1927 für Lichtleiter
aus Glasstaben oder Glasfasern angewendet wird (3WIRD, England): Ein Lichtbündel,
das in eine Glasfaser durch die eine Stirnfläche eintritt, wird durch Totalreflexion
daran gehindert, die Glasfaser zu verlassen. Es tritt erst an der gegenüberliegenden
Stirnfläche wieder aus, Voraussetzung dafür ist, daß der Brechungsindex des Glases
größer ist als der Brechungsindex der Umgebung. Solche Lichtleiter werden beispielsweise
in der medizinischen Endoskopie und zunehmend in der Nachrichtentechnik eingesetzt.
Sie bestehen meistens aus einem das Licht leitenden Kernglas, das von einem Mantelglas
niedrigeren Brechungsindicis umhüllt ist (z. B. Endoskope der Firma Wolf, Knittlingen,
Deutschland). Es gibt auch Flüssigkeitslichtleiter, die aus einem mit einer Flüssigkeit
gefüllten Rohr bestehen, dessen Material einen niedrigeren Brechungsindex aufweist
als die Flüssigkeit (Firma Lumatec, München, Deutschland).
-
Lichtleiter werden auch schon seit lkngerer Zeit in der Photometrie
verwendet. aber immer nurO um das Licht zur Meßstrecke zu fuhren oder von ihr weg.
-
POLANYI, M. L. und HEHIR, R. M. (Rev. Sci. Instr. 93, 1050 - 1054,
1962) haben als erste Glasfasern für die
Photometrie im zirkulierenden
Blut eingesetzt, um Strahlung an sonst schwer zugängliche zentrale Stellen des menschlichen
Blutkreislaufes und von dort wieder weg zu leiten.
-
Die optische Anordnung wurde von KELLER, H. (Z. klin. Chem.
-
u. klin. Biochem. 7, 501 - 504, 1969) für seine "Photosonde" übernommen,
mit dem Unterschied, daß die Messung hier in einem mit Meßlösung gefüllten Gefäß
stattfindet, und nicht im strömenden Blut.
-
Die DE-OS 28 33 044 beschreibt eine Analysenanordnung, in der die
Strahlung für die Photometrie strömender Flüssigkeiten über Glasfasern an die Meßgefäße
und von diesen weg zur Photozelle geführt wird. Dieses Prinzip ist auch in der Analysenmaschine
"SMAC" der Firma Technicon, Tarrytown, New York, USA, verwirklicht.
-
Die Meßgefäße der vorliegenden Erfindung sind aber so beschaffen.
daß die zu photometrierende Meßlösung selbst als flüssiger Lichtleiter wirkt. Voraussetzung
dafür ist4 daß die Meßgefäße in der Umgebung der Meßlösung aus einem Material bestehen
dessen Brechungsindex n2 kleiner ist als der Brechungsindex n1 der zu photometrierenden
Meßlösung.
-
Die Meßlösung wird von einem Ansatzstutzen 102a aus in einen Hohlraum
101 gefüllt, der in der Regel als zylindrisch geformte glattwandige Kapillare ausgebildet
ist. Über einen zweiten Ansatzstutzen 102b wird dabei die Kapillare entlüftet. Die
Anordnung eignet sich sowohl für Einzelmessungen, als auch für die Photometrie im
Durchfluß.
-
Die Strahlung fällt durch ein Fenster 103a auf der einen Stirnseite
in die Kapillare. Parallel zur optischen Achse verlaufende Strahlung 104 gelangt
ohne Wechselwirkung mit den seitlichen Grenzflächen zum Fenster 103b der gegenüberliegenden
Stirnseite und zur Photozelle 106.
-
Nichtparallele Anteile 105 des Strahlenbündels gehen für die Messung
nicht verloren, sondern werden an den seitlichen Grenzflächen totalreflektiert.
Auch sie können die
Photozelle erreichen. Bei der Totalreflexion
kommt es nicht zu den oben beschriebenen Störungen. Infolgedessen kann der Durchmesser
B der Kapillare sehr stark reduziert werden.
-
Entsprechend verkleinert sich das für eine Einzelmessung erforderliche
Mindestvolumen V - für eine 10 mm lange Kapillare beispielsweise auf folgende Werte:
B (mm): 5,00 2,50 1.00 0,50 0,25 0,10 V (mm3): 19,63 4,91 0,79 0,20 0,05 0,01 Zwischen
dem Grenzwinkel iT und den Brechungsindices n1 (Meßlösung) und n2 (Wand des Meßgefäßes)
besteht folgende Beziehung: sin dT = n2/n1 (Brechungsgesetz, vergleiche Abb. 2).
Auf die Wand des Meßgefäßes treffende Strahlen, die zum Einfallslot einen Winkel
oL größer als der Grenzwinkel * bilden, werden im wesentlichen verlustfrei totalreflektiert.
Der Grenzwinkel iT darf nicht unterschritten werden (d'), weil dann die Strahlung
zur Wand des Meßgefäßes hin gebrochen würde.
-
Beeinflussung des Grenzwinkels αT: Je größer der Brechungsindex
n1 der Meßlösung ist und je kleiner der Brechungsindex n2 des die Meßlösung umgebenden
Mediums, umso kleiner ist der Grenzwinkel iTS und umso weniger parallel braucht
das Strahlenbündel zu sein. Ist die photometrisch nachzuweisende Substanz beispielsweise
in Benzol gelöst (n1 = 1,501) und besteht die Wand des Meßgefäßes aus fluoriertem
Polyäthylen-propylen (FEP, einem Copolymer des Polytetrafluoroäthylens, n2= 1,338),
dann ergibt sich bei 200 C ein Grenzwinkel MT von nur 63,1O (als Brechungsindex
n1 der Meßlösung wird hier vereinfachend der Brechungsindex des Lösungsmittels angenommen).
-
Häufig sind aber die zu photometrierenden Substanzen in Wasser gelöst
(n1 = 1,330 bei 200 C, > = 589 nm), und Wasser wirkt nicht als Lichtleiter, wenn
es von FEP umgeben ist. Um die Erfindung auch für wäßrige Meßlösungen nutzbar zu
machen, kann man ihnen Stoffe zusetzen, die den
Brechungsindex
n1 erhöhen. Der Brechungsindex des Wassers bei 200 C wird beispielsweise durch Zusatz
von 10 % Sucrose von 1,330 auf 1,348 gesteigert (iT in einem Meßgefäß aus FEP 83,00),
durch Zusatz von 20 % Sucrose auf 1,364 (9 = 78,80).
-
In Abb. 3 wird für verschiedene Brechungsindices n2 der Meßgefäßwand
dargestellt, wie der Grenzwinkel iT vom Brechungsindex n1 der Meßlösung abhängt.
-
Wenn man ein Material mit einem sehr niedrigen Brechungsindex n2 findet,
das sich als Meßgefäßwand eignet, dann ist es nicht mehr nötig, den Brechungsindex
der Meßlösung durch Zusätze zu erhöhen, vergleiche Abb. 4.
-
Anzahl der Reflexionen im Meßgefäß: Die Abb. 5 zeigt den Verlauf eines
zur optischen Achse des Meßgefäßes nicht parallelen Strahls. In den folgenden einfachen
Berechnungen bedeuten D die lichte Länge des Meßgefäßes, d die Länge eines Teilstückes
des Meßgefäßes, die durch zwei einander benachbarte Reflexionspunkte des Strahls
bestimmt ist, S den Weg des Strahls im Meßgefäß (wirksame Schichtlänge), s den Weg
des Strahls zwischen zwei einander benachbarten Reflexionspunkten, B die lichte
Breite des Meßgefäßes (Innendurchmesser der Kapillare), x die Anzahl der Reflexionen
des Strahls im Meßgefäß und M den zum Einfallslot gebildeten Reflexionswinkel.
-
Zunächst wird berechnet, wie häufig (x) der Strahl auf seinem Weg
durch die Meßlösung reflektiert wird: D D x = dz = 7 Dementsprechend treten umso
mehr Reflexionen auf, äe enger und je länger das Meßgefäß ist und je weniger parallel
die Strahlen durch das Meßgefäß verlaufen. Dieser Zusammenhang ist in Abb. 6 für
vier 10 mm lange Kapillaren unterschiedlicher Innendurchmesser dargestellt. In der
0,1 mm weiten Kapillare werden beispielsweise Strahlen, die um 50 zur
optischen
Achse geneigt sind (oC= 850), neunmal reflektiert.
-
In diesem Falle reicht eine im Prinzip auch mögliche einfache Verspiegelung
der Wand nicht aus, weil bei jeder Reflexion an verspiegelten Flächen große Verluste
auftreten.
-
Folglich lassen sich keine extrem engen Meßgefäße bauen, deren Wände
nur verspiegelt sind. Im Gegensatz dazu sind die Totalreflexionen in den Meßgefäßen
der vorliegenden Erfindung im wesentlichen verlustfrei.
-
Wirksame Schichtlänge S: Aus der Abb. 5 läßt sich schließen, welchen
Weg ein schräg einfallender Strahl im (nicht gebogenen) Meßgefäß zurücklegt: S=
D . s = D . 1.
-
d sinsα Die wirksame Schichtlänge S wird also durch die lichte
Länge D des Meßgefäßes bestimmt und durch den Winkel i.
-
In Abb. 7 wird gezeigt, um welchen Faktor S die wirksame Schichtlänge
größer ist als die lichte Länge D des Meßgefäßes. Es wird deutlich, daß für Reflexionswinkel
s zwischen 850 und 900 (etwa parallel zur optischen Achse in das Meßgefäß fallende
Strahlen) beide Strecken annähernd gleich sind. Für stärker divergierende Strahlenbündel
kann die mittlere wirksame Schichtlänge S empirisch durch Photometrie einer Eichlösung
bekannter Farbstoffkonzen-E tration C ermittelt werden (S = #. C, LAMBERT-BEER'rsches
Gesetz, vergleiche oben).
-
Bei großen Unterschieden der Brechungsindices n1 - n2 bietet die Erfindung
die Möglichkeit, die wirksame Schichtlänge im selben Meßgefäß zu variieren.
-
Es sind bereits Meßgefäße bekannt, deren wirksame Schichtlängen bei
der Messung verändert werden können: Meßgefäße mit stufen- oder keilförmigen Wänden,
Balgenkonstruktionen, Meßgefäße mit eintauchenden stufen- oder keilförmigen strahlungsdurchlässigen
Körpern (THEILACKER, W.
-
und andere: Chem. Ber. 83, 508 - 519, 1950; LONGHURST, R. S.: Geometrical
and Physical Optics, Verlag Longman Groep Ltd-., London, England, 1967; DT-AS 22
58 094; SPAAN, J. A. E. und andere, Pflügers Arch. 372, 279 - 283, 1977).
-
Für die Photometrie kann das abwechselnde Messen bei mehreren Schichtlängen
nützlich sein: 1. Man kann in einem Extinktionsbereich messen, bei dem die photoelektrische
Einrichtung am empfindlichsten ist.
-
2. Die in der Absorptionsphotometrie sonst notwendige Leerwertmessung
wird überflüssig.
-
3. Wenn die wirksame Schichtlänge genügend schnell periodisch um einen
bestimmten Betrag geändert wird (Schichtlängenmodulation), können störende Einflüsse
auf die Messung, z. B. eine schwankende Strahlungsleistung der Photometerlampe,
durch eine Quotientenrechnung kompensiert werden.
-
4. Man kann leicht feststellen, ob das LAMBERT-BEER'sche Gesetz für
eine Messung außer Kraft gesetzt ist - wenn sich beispielsweise Luftblasen im Lichtweg
befinden.
-
In der vorliegenden Erfindung kann die wirksame Schichtlänge in der
Regel nur um kleine Beträge dadurch verstellt werden, daß man den Winkel ändert,
unter dem das Strahlenbündel ins Meßgefäß fällt.
-
Besondere Ausführunsformen der Erfindung: Es gibt für die vorliegende
Erfindung auch andere Methoden, mit denen Luftblasen im Lichtweg nachgewiesen werden
können. Dazu kann man die elektrische Leitfähigkeit des Kapillärinhalts messen.
Oder man erzeugt während der Messung von den Ansatzstutzen 102a und 102b aus einen
genügend großen Überdruck im mit Meßlösung gefüllten Meßgefäß. Luftblasen werden
dabei kleiner, und es kommt zu einer Änderung des Meßsignals.
-
Die Meßlösung-kann winzige Luftbläschen enthalten, die das Meßergebnis
umso mehr verfälschen können, je dünner das Meßgefäß ist. Ihr Störeinfluß kann ebenfalls
durch eine Kompression der Meßlösung für die Dauer der Messung verringert werden.
-
Die Temperatur in den Meßgefäßen der Erfindung kann ähnlich wie bei
den bisher bekannten Meßgefäßen eingestellt werden, z. B. durch Peltier-Elemente
in ihrer Wandung.
-
Falls die Temperatur wegen einer zu hohen Dichte des Strahlungsflusses
in den Meßgefäßen zu stark ansteigen sollte, oder falls sich die absorbierenden
Substanzen während einer länger dauernden Bestrahlung zersetzen, kann es erforderlich
werden, daß die Meßstrahlung nicht kontinuierlich, sondern intermittierend, in kurzen
Blitzen, durch das Meßgefäß geleitet wird.
-
Um einen möglichst hohen Strahlungsfluß im Meßgefäß zu erhalten, kann
der optische Kanal des Meßgefäßes an seiner der Photometerlampe zugewandten Stirnseite
trichterartig erweitert sein, wodurch gegebenenfalls mehr Strahlung aufgefangen
wird.
-
Die Strahlung kann auch über Lichtleiter 803a zum Meßgefäß 801 und
von ihm weg 803b zur Photozelle 806 geleitet werden, dargestellt in Abb. 8.
-
Im übrigen beschränkt sich die Erfindung nicht auf Meßgefäße für die
Absorptionsphotometrie. Die Meßgefäße können auch für Trübungsmessungen, fluoreszenzphotometrische
oder andere Untersuchungen benutzt werden.
-
Die Fluoreszenzphotometrie wird durch die vorliegende Erfindung um
ein Vielfaches empfindlicher. Das erreicht man dadurch, daß man die Primärstrahlung
durch dasselbe Fenster in das Meßgefäß fallen läßt, durch das die Sekundärstrahlung
zur Photozelle gelangt. Von den divergierenden Anteilen der Primärstrahlung und
der in Richtung Photozelle verlaufenden Sekundärstrahlung wird mehr für die Messung
ausgenutzt als bei den bisher bekannten Meßgefäßen.