DE3147763A1 - Nachweisverfahren zur in vitro-bestimmung des bei einer allergie korrespondierenden allergens - Google Patents

Description

• NACHWEISVERFAHREN ZUR IN VITRO-BESTIMMUNG DES BEI
• EINER ALLERGIE KORRESPONDIERENDEN ALLERGENS. In den vergangenen Jahrzehnten haben allergische Erkrankungen allgemein sehr zugenommen. Eine Allergie bedeutet, daß der gesamte menschliche Organismus auf bestimmte Substanzen, die mit ihm zusammenkommen, in außergewöhnlicher Art und Weise reagiert. Es können hierbei Allergien vom Soforttyp, vom Arthus-Typ, Kontaktallergien und Allergien vom verzögerten Typ unterschieden werden (Allergien I bis IV nach Coombs).
• Für die Bestimmung der für Allergien kausativen Allergene gibt es unterschiedliche Nachweismethoden, wie beispielsweise die Intrakutanteste und Epikutanteste, bei denen das korrespondierende Allergen in die Haut eingebracht wird.
• Diese Tests belasten den Patienten und können ihn sogar gefährden.
• Es gibt ferner Labormethoden, die jedoch den Nachteil haben, daß sie umständlich und teuer sind- und daß vielfach radioaktives Material zur Ablesung verwendet werden muß.
• Es fehlt jedoch bislang noch immer ein Nachweisverfahren, das es gestattet, ein weites Feld von Allergenen außerhalb des Körpers zu erfassen, ohne das Individuum durch mehr als eine Blutentnahme zu belasten und es durch Schockgefährliche Allergene zu gefährden. Ein solches Nachweisverfahren soll einfach durchzuführen und möglichst ohne Verwendung radioaktiver Substanzen ablesbar sein.
• Alle vier Allergie-Typen haben eines gemeinsam, nämlich die Reaktion jeder Zelle bzw. Zelloberfläche des gesamten Organismus auf ein Allergen. Kommen besonders Lymphocyten eines Spenders, der an einer allergischen Erkrankung leidet, mit dem der Allergie korrespondierenden Allergen zusammen, so war es bekannt, daß sich zuerst die elektronegative Oberflächenladung der Zelle erniedrigt und es dann sehr schnell zu einer Transmineralisation von Kaliumionen und Natriumionen kommt, was mit der Veränderung der Oberflächenladung der Zelle zusammenhängt.
• Es wurde nunmehr überraschend gefunden, daß die Zellen eines Allergikers bestimmte Substanzen, vor allem Enzyme und Heparin freisetzen, wenn sie mit dem korrespondierenden Allergen in Kontakt gebracht werden. Während bisher leciglich bekannt war, daß hierbei Histamin und andere allergische Mediatorsubstanzen zu Körperreaktionen führen können, wurde nunmehr gefunden, daß in einem geschlossenen System durch Zugabe bestimmter Indikatoren eine Allergie bzw.
• das die Allergie erzeugende Allergen als Ursache der Allergie erkannt werden kann. Das erfolgt durch die Spaltung zugesetzter Indikatoren durch aus der Zelle freigesetzte Enzyme oder durch die Gerinnungshemmung von Blut als Indikatorsystem für freigesetzte Gerinnungshemmsubstanzen wie z.B. Heparin (im- folgenden Gerinnungshemmfaktor genannt).
• Der vorliegenden Erfindung liegt demnach folgendes Prinzip zugrunde: Isolierte Zellen des peripheren Blutes verändern sich, wenn sie von einem Allergiker stammen und mit demjenigen Allergen, durch das der Allergiker krank wird, in vitro in Kontakt gebracht werden: Die Zelloberfläche wird undicht und es werden bei den Allergie-Typen I bis IV bestimmte Substanzen in aie Umgebung abgegeben, die ihrerseits bestimmte zugesetzte Indikatoren spalten, deren Spaltproduktegemessen werden können.
• Bei den aus der Zelle freigesetzten und für den vorliegenden Nachweis verwendbaren Substanzen handelt es sich vor allem um Proteasen sowie um Phosphatase und Gerinnungshemmfaktoren Das Freiwerden von Proteasen aus der Zelle läßt sich mit einem geeigneten Indikator feststellen, dessen Spaltprodukte dann photometrisch mit einer Farbreaktion gemessen werden können. Ungeeignet als Indikatoren sind solche Substanzen, gegen die der Patient allergisch ist. Geeignete Indikatoren.
• hierfür sind beispielsweise: l-Leucin-p-nitroanilid, l-Leucin-B-naphthylamid, Leucinhydrazin, l-Leucinamid, l-Leucylglycin, l-Leucylalanin, Haemoglobin, Serumproteine, Rinderalbumin, Casein, Sulfanililamidcasein, Edestin, radioaktiv markiertes Albumin und Haemoglobin. Bevorzugt wird l-Leucin-p-nitranilid.
• Die Freisetzung von Proteasen als Erkennungszeichen einer Allergie läßt sich dort nutzbar machen, wo Allergene verwendet werden, die- selbst nicht durch Proteasen zerstört werden und die selbst keine Fermenthemmer sind. Allergene, die aus sehr enzymanfälligen, labilen Proteinen bestehen, z.B. einige Virusproteine und durch diese Proteasen selbst zerstört werden, können daher in dem erfingungsgemäßen Proteasen-Freisetzungstest nicht eingesetzt werden.
• Das Freiwerden von Phosphatase aus dem Zellinnern läßt sich mit solchen Substanzen als hierfür geeignete Indikatoren feststellen, die durchPhosphatase. gespalten werden und deren Spaltprodukte sich photometrisch nachweisen lassen. Beispiele hierfür sind: Phenolphthalein-monophosphat, Phenolphthalein-di-phosphat, p-Nitrophenylphosphat, 2, 6-Dibromchinochloridphosphat, B-Glycerophosphat, 8-Naphthylphosphat, Phenylphosphate (besonders für die saure Phosphatase) , Phosphorsäureester von Florescin, Eosin, 4-Methol-7-oxy-cumarin und 3-Hydroxy-2-naphthanilid, weiter 4-Methylumbelliferyl-phosphat. Bevorzugt wird hierfür Phenolphthalein-mönophosphat verwendet.
• Auch hier sind wiederum Substanzen ungeeignet, gegen die der Patient allergisch ist.
• Im Phosphatase-Freisetzungstest können keine Allergene verwendet werden die selbst Phosphatase enthalten, weil diese den Test verfälschen würden. So enthalten z.B. Rohpollen-Suspensionen bzw. deren Rohextrakte selbst Phosphatase. Die Phosphatase hat den Vorteil, daß sie hitzestabil ist, daß dieser Test relativ robust ist und außerdem nicht durch Fermentgifte gehemmt wird. So können hiermit beispielsweise Antibiotika-Allergien nachgewiesen werden.
• Neben den obengenannten Enzymen gibt die Zelle - und hierzu gehören in erster Linie Makrophagen und große Lymphocyten -Gerinnungshemmfaktoren wie z.B. Heparin, frei. Als Indikatorsystem für den Nachweis dieser Hemmfaktoren dient die Verzögerung der Gerinnungszeit von Blut.
• Im Gerinnungstest können keine Allergene verwendet werden, die selbst gerinnungshemmend wirken. So ist z.B. im Gerinnungshemmtest kein Bienengift als Test-Allergen anwendbar, da Bienengift selbst, das ein sehr starkes Allergen sein kann, die Gerinnung hemmt. Gleiches gilt für bestimmte Insektengifte und für Schlangengifte, wie sie als Bestandteile in einigen Arzneimitteln enthalten sind. Ebenso lassen sich keine Allergene verwenden, die selbst Eiweifällungsmittel sind, da hierdurch ein Gerinnungsvorgang vorgetäuscht wird; Eiweißfällungsmittel sind beispielsweise Quecksilberverbindungen.
• Damit freigesetzte Gerinnungshemmfaktoren nachgewiesen werden können, muß das Blut durch usatz von Natriumcitrat ungerinnbar gemacht werden. In dieser Phase können die Zellen mit dem Allergen reagieren, wodurch zelleigene Gerinnungshemmfaktoren freigesetzt werden. Die Zeit der Gerinnungshemmung wird dadurch gemessen, daß die Gerinnungshemmung durch Natriumcitrat durch Zusatz eines überschusses an Calciumionen(Fällung) rückgängig gemacht wird. Die jetzt sichtbare Gerinnungshemmung geht nur noch auf zelleigene Hemmfaktoren zurück.
• Eine praktische Art der Durchführung dieser Bestimmungsmethode ist folgende: (1) Blut des Patienten wird mit Natriumcitrat ungerinnbar gemacht.
• (2) Durch Zusatz des Allergens werden aus den Leukozyten Gerinnungshemmfaktoren freigesetzt.
• (3) Das gleiche Blut wird durch Zusatz eines Überschusses von Calciumionen, vorzugsweise Calciumglukonat oder CaC12, und Inaktivierung des Natriumcitrates wieder gerinnbar gemacht, so daß sich jetzt nur noch die Gerinnungshemmung durch diese Faktoren auswirkt. Die Bildung von Fibrinfäden (Blutgerinnung) wird sichtbar, wenn in kurzzeitigen Abständen Glaskapillaren durch das Blut hindurchgezogen werden.
• Normalerweise kommt es beim Blut eines Gesunden bzw. bei einem Nichtallergiker ohne Zusatz eines Allergens innerhalb von 3-4 Minuten zur Blutgerinnung, d.h. zur Ausfällung von Fibrinfäden im Blut. Wurden jedoch durch Wirkung des Allergens aus den Leucozyten Gerinnungshemmfaktoren freigesetzt, so kann diese Blutgerinnung bis zu 28 min. verzögert werden.
• Dieser Vorgang läßt sich sehr leicht auf folgende Weise verfolgen und messen: Solange das Blut noch nicht geronnen ist, schreibt die Glasnadel durch das Blut hindurch; bei beginnender Blutgerinnung lagern sich die Fibrinfäden um die Glasnadel und nehmen den Blutkuchen, der sich inzwischen gebildet hat, mit.
• Zusammenfassend ergibt sich somit, daß durch ein Allergen aus den weißen Blutkörperchen in jedem Falle bestimmte Substanzen freigesetzt werden, Fermente und Gerinnungshemmfaktoren; die Fermente lassen sich mit entsprechenden Indikatoren, mit denen man Farbreaktionen erzeugen kann, nachweisen, bei gerinnungshemmenden Zellsubstanzen wie z.B.
• Heparin, wird das Gerinnungssystem des Blutes als Indikator verwendet.
• Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren wird für freigesetzte Fermente, beispielsweise auf die Weise durchgeführt, daß vom Patienten 4 bis 12 cm3 Blut abgenommen werden, das auf bekannte Weise z.B. durch Citratzusatz ungerinnbar gemacht und 1 Stunde, z.B. in langen Senkungsröhrchen, ruhig stehengelassen wird; hierdurch setzen sich die Blutbestandteile in verschiedenen Schichten ab. Die Schicht mit den roten Blutkörperchen wird verworfen. Die Plasmaschicht mit den weißen Blutkörperchen wird für die weitere Untersuchung verwendet, wobei einzelne untergemischte Erythrozyten nicht stören.
• Die Plasmaschicht wird auf die Versuchsansätze verteilt.
• Hinzu werden die Indikatorlösung und das zu testende Allergen zugesetzt. Einem Vergleichsansatz (Kontrolle) wird kein Allergen beigegeben. Dieser Vergleichsansatz soll Auskunft über die Fermentfreigabe nicht Allergen-provozierter Leukozyten geben und dient beim späteren photometrischen Vergleich als Nullwert. Alle Allergenansätze und der Ansatz ohne Allergen werden in gleicher Zusammensetzung doppelt angelegt und jeweils einer davon sofort, eventuell nach Zugabe von Ableselösungen, photometrisch ausgewertet.
• Dies dient zur Bestimmung des Leerwertes (Eo) Die restlichen Ansätze läßt man eine halbe bis drei Stunden reagieren, der normierten Verhältnisse wegen am besten luftdicht verpackt im Brutschrank.
• Für jede einzelne Allergiebestimmung werden ein geringe Menge, d.h. 0,1 bis 0,2 ml Plasma mit dem zu prüfenden Allergen vermischt. Die Menge des zu prüfenden Allergens steht mit der Temperatur sowie der Zeitdauer der Inkubation in Beziehung. So wird z.B. bei dreistündioer Inkubation (370C) im Falle einer Neuroallergie bereits mit 10-20 g encephalitogenem Protein eine Allergiereaktion nachgewiesen. Bei Penicillin sind 1 mg Penicillin G pro ml Plasma ausreichend.
• Bei korpuskularen Antigenen, z.B. Pollen, geht man von 1-10 mg/ml Plasma aus. Bei proteinhaltigen Pollenextrakten von 60-200 mo/ml Plasma. Verringert man die Temperatur auf +100 bis +15"C, so muß eine Inkubationszeit von 8 bis 10 h gewährleistet sein, ehe sich spezifische Unterschiede zwischen dem Vergleichs- und dem Prüfungsansatz abzeichnen. Dabei ist darauf zu achten, daß die Ansätze nicht ausflocken (feuchte Kammer), weil sonst hypertone Lösungsbedingungen entstehen, die die Freigabe von Fermenten behindern.
• Bei der photometrischen Auswertung findet ein einfaches Eppendorf-Photometer Verwendung. Vergleichsansätze (Kontrollen) werden in ihrer Extinktion mit den Versuchsansätzen verglichen. -Bei der Phosphatasereaktion, bei der Phenolphthalein freigesetzt wird, gibt man auf bekannte Weise Alkali im Überschuß zu. Hierdurch kommt es zu einer Rotfärbung des Phenolphthaleins. Diese Rotfärbung des Phenolphthaleins wird photometrisch vorzugsweise im Grünbereich des Photometers bei 550 bis 555 nm gemessen.
• Wenn die von der Zelle freigesetzten Proteasen mit den Indikatoren reagiert haben, können diese Reaktionsprodukte bei entsprechender Wellenlänge direkt photometrisch gemessen werden. Auch hier erfolgt die Messung im Grünbereich des Photometers, und die photometrische Extinktion der Prüfansätze wird mit dem Kontrollansatz verglichen.
• Für alle Allergene sollten die optimalen Konzentrationen im Test ermittelt werden.
• Bei allen drei Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens (Protease-Test, Phosphatase-Test und Gerinnungshemmtest) sollte der Patient in seinem Blut nicht weniger als 3.000 und nicht mehr als 10.000 Leukozyten haben. In diesem Bereich ergibt der Prüfansatz zum Vergleichsansatz auswertbare und testspezifische Unterschiede.
• Beispiele für auszutestende Allergien sind diejenigen auf Pollen von Gräsern, Bäumen und Blüten. Test-Allergene stehen in hoher Reinheit als proteinhaltige Extrakte der genannten Pollen im Handel zur Verfügung. Bei dieser Bestimmung kann der Protease-Test sowie der Gerinnungstest eingesetzt werden, Pollenextrakte enthalten Phosphatase, weshalb der Phosphatase-Test verfälscht.
• Große klinische Bedeutung besitzen Allergien auf verschiedene Antibiotika. Bei der häufigsten Antibiotika-Allergie, der Penicillin-Allergie, sind alle drei Testsysteme geeignet.
• Bei der Allergie gegen Tetracycline sollte jedoch der Gerinnungstest nicht verwendet werden, da Tetracycline selbst Calcium fällen und damit beim Zusatz von Calciumüberschuß zum System eventuelle Verfälschungen eintreten können. Bei der Ermittlung von Antibiotika-Allergien, die einen schnelleren zeitlichen Ablauf bei entsprechender Konzentration und Einhaltung der Temperatur von 370C im Inkubator aufweisen, kann der Gerinnungstest, der einfach und arbeitssparend ist, als Suchtest angewendet werden, wenn die Austestung auf viele' Antibiotika- bzw. Stoffgruppen angesetzt wird.
• Weitere Bedeutung haben für das allergische Asthma Allergien auf bakterielle Spaltprodukte. Diese sind leicht zu isolieren. Sie enthalten jedoch Proteasen. Aus diesem Grunde ist der Protease-Test für die Ermittlung einer bakteriellen Allergie beim Asthma weniger gut geeignet als der Gerinnungs-und der Phosphatase-Test.
• Weitere große Bedeutung haben bestimmte Nahrungsmittel- Allergien, wie z.B. Allergien auf bestimmte Proteine von Krustentieren. Entsprechende Allergen-Lösungen sind im Handel erhältlich. Mit diesen Allergen-Lösungen kann am besten der Phosphatase-Test oder der Gerinnungstest durchgeführt werden. Da bei diesen proteinhaltigen Allergen-Lösungen die Freisetzung von Proteasen aus den Zellen zur Zerstörung des Allergens und damit zur Limitierung des Tests führen könnte, sollte der Proteasetest in diesen speziellen Fällen nicht zur Anwendung kommen. Gleiches gilt, wenn eine Allergie auf heterologe Eiweißstoffe, beispielsweise gegen Kuhprotein (Kuhmilch-Allergie) vorgenommen werden soll. Bei der ebenfalls nicht seltenen Formol-Allergie können entsprechende Verdünnungen dieser Lösungen den Leukozyten direkt zugesetzt werden. Eine Allergie gegen diese Substanz läßt sich mit allen drei Testvarianten ermitteln.
• Der Gerinnungshemmtest als weitere Verfahrensvariante eignet sich zur Ermittlung sämtlicher Allergien mit Ausnahme derjenigen, in denen das Allergen selbst die Gerinnungsfähigkeit des Blutes beeinflußt. Hierzu gehören gerinnungshemmende Substanzen, wie z.B. proteolytische und fibrinolytische Enzyme (z.B. Schlangengifte, wie sie in Salben und Medikamenten zur Behandlung von Thrombosen enthalten sind), heparinhaltige Medikamente und Calciumfällungsmittel. Der Gerinnungstest eignet sich zur Ermittlung von Pollen-Allergien, zur Ermittlung einiger Kontaktallergien, wie z.B. die Chromallergie, die Nickelallergie, die Allergie gegen Silber, Bleisalze und Gold.
• Zur Ermittlung der geeigneten Verfahrensvariante: Werden bei einer Allergie mehrere Allergene als Ursache verdächtigt, so muß zuerst festgestellt werden, welche der genannten Test-Varianten die günstigste ist, um das verantwortliche Allergen zu ermitteln.
• Die primär günstigste Test-Variante ist der Gerinnungshemmtest: Er erfaßt praktisch alle Allergene, mit Ausnahme derjenigen, die das Gerinnungssystem selbst direkt beeinflussen.
• Hierzu gehören Arzneimittel, die selbst gerinnungshemmend wirken. Alle anderen Allergene (z.B. Blütenpollen, EiweiB-extrakte, Antibiotika, Hausstaub-Milben, u.a.) lassen sich mit diesem Test ermitteln. Als nächster, robuster Test mit guter Reproduzierfähigkeit ist der Phosphatase-Test anzusehen. Hier können mit Ausnahme der Blütenpollen, die selbst Phosphatase enthalten, praktisch alle übrigen Allergene gemessen werden. Der Protease-Test steht dann immer noch als Kontrolltest und als Test für bestimmte, besondere Aufgaben zur Verfügung.
• Beispiel 1: Bestimmung der freigesetzten Proteasen Man entnimmt einem Individuum eine Blutprobe und versetzt diese mit Heparin zur Gerinnungshemmung. Nachdem diese Probe eine bis eineinhalb Stunden bei Zimmertemperatur oder bei 37"C im Brutschrank ruhig gestanden hat, kann man eine ausreichende Menge an in Plasma suspendierten Leukozyten im Überstand abheben.
• Eine geringe Menge, d.h. 0,1 bis 0,2 ml Plasma (Überstand) und 0,2 ml isotoner Allergenlösung, z.B. Bakterienlysat, Virus, Antibiotikalösungen usw. werden in ein Reagensglas gegeben, dieses wird luftdicht verschlossen und während vier Stunden in einem 37"C-warmen Brutschrank gestellt. Danach schüttelt man die Probe auf, zentrifugiert und entnimmt 0,1 ml des überstandes und gibt diesen in drei ml einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung, die auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt ist und Leucin-p-nitroanilid in einer Konzentration von 0,7 mM/l enthält. Anstelle des Leucin-p-nitroanilids kann auch jedes andere Substrat, das von mehr oder weniger unspezifischen Proteasen oder Peptidasen gespalten wird, und dessen Spaltprodukte photometrisch erfaßbar sind, für diesen Zweck verwendet werden.
• Anschließend wird der in der Pufferlösung aufgenommene Indikator (0,05 ml) und dem vom Patienten stammenden Probeanteil (0,05 ml) mit dem Allergen. (0,1 ml) durchgemischt und ein ausreichender Teil hiervon in eine Meßküvette gegeben, 3 - 4 h inkubiert und im Falle des Leucin-p-nitroanilids die Extinktion bei 405 nm Lichtwellenlänge bei 250C bestimmt.
• Besteht eine Allergie gegen das Test-Allergen, so ist die Aktivität, gemessen gegenüber der Differenz der Kontrollprobe ohne Test-Allergen erhöht.
• Mit der vorstehend beschriebenen Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens können z.B. Antibiotika-Allergien, Infektions-Allergien, Blütenpollen-Allergien, Bienengift- und Wespengift-Allergien erkannt werden.
• Beispiel 2: Bestimmung der freigesetzten alkalischen Phosphatase Der Versuchsaufbau ist bis zu dem 3- bis 4-stündigem Inkubieren mit dem des Beispiels 1 identisch.
• Es werden 0,2 ml des überstandes entnommen und in 0,6 ml einer molaren Diäthanolamin-Pufferlösung (pH 9,0 - 12,0) eingegeben. Es sind auch alle anderen Phosphatasesubstrate geeignet, deren Spaltung photometrisch erfaßbar ist, wie z.B. Monophosphophenolphthalein. Die Extinktion wird bei 555 nm Lichtwellenlänge gemessen (Ependorf-Photometer; Filter Hg).
• Besteht eine Allergie gegen das verwendete Test-Allergen, so ist die Extinktion gegenüber den Kontrollansatz erhöht.
• Das Verfahren des Beispiels 2 ist ungeeignet für Allergene mit hohen Aktivitäten an Phosphatase, sowie Patienten mit hohen Serumaktivitäten an alkalischer Phosphatase.
• Diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich zur Ermittlung von Allergien, die durch proteinhaltige Allergene hervorgerufen werden, wie z.B. Fischeiweiß, Krebseiweiß, Kuhprotein (Milchallergie) sowie zur Ermittlung von Antibiotika-Allergien, Bienengift- und Wespengift-Allergien. Lediglich der Heuschnupfen eignet sich nicht zur Allergentestung mit dieser Verfahrensvariante.
• Beispiel 3: Bestimmung der freigesetzten Gerinnungshemmfaktoren Bei diesem Test werden 0,1 ml mit Citrat ungerinnbar gemachtes Blut mit physiologischer, isotoner Kochsalzlösung auf das doppelte Volumen verdünnt. Das Allergen wird bei einem Testvolumen von 0,2 ml in isotoner Lösung zugesetzt, so daß sich insgesamt in den dickwandigen gedellten Objektträgern ein Volumen von 0,3 ml der verdünnten Blutsuspension befinden. Bei zahlreichen Testen auf viele unterschiedliche Allergene kann das Testvolumen auch auf die Hälfte reduziert werden, wobei dann 0,05 ml Blut mit 0,1 ml der Allergen- Lösung versetzt werden. Das Gesamtvolumen dieses Testansatzes ist dann 0,15 ml. Die Inkubation erfolgt über 3 h in der feuchten Kammer bei 370C. Zusatz von 0,1 ml einer Calciumlösung (0,045 molar), wie beschrieben. Mit dünnen Glasnadeln wird dann in kurzen Abständen durch-diese Blutsuspension hindurchgekämmt. Nach 3 1/2 bis 4 min. zeigt sich in der Kontrolle eine normale Blutgerinnung daran, daß um die Glasnadeln sich die Fibrinfäden des geronnenen Blutes wickeln, bis schließlichdie Glasnadel den gesamten Blutkuchen mitnimmt. In den noch nicht geronnenen Proben bzw. in den Proben, wo durch Allergeneinwirkung eine Gerinnungshemmung eintritt, kämmt die Glasnadel durch das Erythrozyten- und Leukozyten-Gemisch hindurch und hinterläßt allenfalls für kurze Zeit eine sich rasch verwaschende Spur. Mit einer Stoppuhr wird der Verlauf der Gerinnungsprozesse gemessen.
• Damit in mehreren Gerinnungsproben die Glas nadel gleichzeitig durchgeführt werden kann, wurde ein Kamm mit vorstehenden Zähnen, die den etwa geschilderten Glasnadeln entsprechen, (technisch hergestellt aus Glaskapillaren, wie zur Haematokritbestimmung) verwendet, jedoch am unteren Ende zugeschmolzen).
• Der Gerinnungstest ist die technisch einfachste Verfahrensvariante, umfaßt ein sehr breites Spektrum der unterschiedlichsten Allergene und benötigt vor allem keine aufwendigen Apparaturen, wie z.B. Photometer.

Claims (7)

1. Patent ansprüche 1. Nachweisverfahren zur in vitro-Bestimmung des bei einer Allergie korrespondierenden Allergens, zu dessen Durchführung man die einem Individuum entnommene Blutprobe zuerst ungerinnbar macht, dann verschiedene Schichten sich ausbilden läßt und den überstand, doh. die Serumschicht mit den weißen ~Blutkörperchen zum Nachweis verwendet, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man eine geringe Menge, vorzugsweise 0,1 ml des überstandes mit einer geringen Menge, vorzugsweise etwa 0,2 ml einer Lösung des zu prüfenden Test-Allergens versetzt, das Gefäß verschließt, die Probe eine ausreichende Zeit inkubieren läßt, anschließend vorzugsweise zentrifugiert, etwa 0,1 ml entnimmt und die Freisetzungsprodukte der Zelle mißt und sie mit einer Kontrolle vergleicht.
2. 2. Nachweisverfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man zum Nachweis der aus der Zelle freigesetzten Proteasen oder Peptidasen eine geringe Menge, vorzugsweise 0,1 - 0,5 ml des Zentrifugatüberstandes mit vorzugsweise 3 ml einer 0,1 molaren Pufferlösung, die auf einen schwach sauren pH eingestellt ist und einen durch Proteasen oder Peptidasen spaltbaren Indikator enthält, versetzt und die erhaltene, mit Uberstand und Indikator gut durchmischte Pufferlösung in eine Meßküvette eingibt, die durch die Indikatorspaltprodukte verursachte Extinktionsänderung pro Zeiteinheit photometrisch mißt und mit einer.Kontrollprobe ohne das zu prüfende Test-Allergen vergleicht.
3. 3. Nachweisverfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man zum Nachweis der aus der Zelle freigesetzten alkalischen Phosphatase eine geringe Menge, vorzugsweise 0,05 ml des Zentrifugatüberstandes mit vorzugsweise 3 ml einer alkalischen Pufferlösung, die einen durch alkalische Phosphatase spaltbaren Indikator enthält, versetzt und die erhaltene, mit Überstand und Indikator gut durchmischte Pufferlösung in eine Meßküvette eingibt, etwa während 3 bis 5 min. die Extinktiohsänderung photometrisch mißt und mit einer Kontrollprobe ohne das zu prüfende Test-Allergen vergleicht.
4. 4. Nachweisverfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man zum Nachweis gerinnungshemmender Spaltprodukte, vor allem des Heparins, eine geringe Menge, vorzugsweise etwa 0,05 ml menschliches Blut durch Natriumcitrat ungerinnbar macht, die Zeit der Gerinnungshemmung durch die genannten Substanzen dadurch mißt, daß die durch Natriumcitrat bewirkte Gerinnungshemmung durch Zusatz eines überschusses an Calciumionen rückgängig gemacht wird und die durch die gerinnungshemmenden Spaltprodukte bewirkte Gerinnungshemmung dadurch gemessen wird, daß man die Zeit bis zum ersten Auftreten eines Gerinsels mißt und mit einer Kontrollprobe ohne das zu prüfende Test-Allergen vergleicht.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 und Anspruch 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man zum Nachweis von Proteasen als Indikatoren l-Leucin-p-nitroanilid, l-Leucin-B-naphthylamid, Leucin-hydrazin, l-Leucin-amid, l-Leucylglycin, l-Leucylalanin, Haemoglobin, Serumproteine, Rinderalbumin, Casein, Sulfanilamidcasein, Edestin, radioaktiv markiertes Albumin und Haemoglobin verwendet und jeweils bei entsprechender Wellenlänge photometrisch mißt.
6. 6. Nachweisverfahren nach Anspruch 1 und 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man zum Nachweis von Phosphatase Phenolphthalein-monophosphat, Phenolphthaleindiphosphat, 4-Nitrophenylphosphat, p-Nitrophenylphosphat, 2, 6-Dibromchinonchloridphosphat, B-Glycerophosphat, B-Naphthylphosphat, Phenolphosphat, Phosphorsäureester von Flures- -cin, Eosin, 4-Methol-7-oxy-cumarin und 3-Hydroxy-2-naphthanilid und 4-Methylbelliferylphosphat als Indikator verwendet und jeweils bei entsprechender Wellenlänge die freigesetzten Spaltprodukte photometrisch mißt.
7. 7. Nachweisverfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e'k e n n z e i c h n e t , daß man eine geringe Menge, vorzugsweise 0,05 ml des Uberstandes mit einer geringen Menge, vorzugsweise 0,1 ml einer isotonen Penicillinlösung (104 - 107 JE/ml) und gleichzeitig mit einer geringen Menge, vorzugsweise 0,05 ml einer isotonen 4 - 40 millimolaren Phenolphthaleinmonophosphatlösung versetzt, 1/4 bis 2 h inkubiert, mit Alkali, vorzugsweise einer Mischung aus Diäthanolamin und Alkohol auf einen pH von etwa 10 - 12 einstellt und die Extinktion nach etwa 15 min. photometrisch bestimmt.