DE3038368C2

DE3038368C2 -

Info

Publication number: DE3038368C2
Application number: DE19803038368
Authority: DE
Inventors: Kunihiko Saga Kanagawa Jp Akashi; Yayoi Ayase Kanagawa Jp Nakamura; Takayasu Kawasaki Kanagawa Jp Tsuchida; Hiroe Yoshii; Shigeho Yokohama Kanagawa Jp Ikeda
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1980-10-10
Filing date: 1980-10-10
Publication date: 1988-11-17
Also published as: DE3038368A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L- Arginin durch Fermentation.

Es ist bekannt, daß L-Arginin mit Hilfe eines Fermentations verfahrens hergestellt wird, bei dem Mutanten des Genus Brevibacterium und Corynebacterium verwendet werden, die resistent gegen Sulfa-Drogen oder Arginin-Antagonisten sind (JA-OS 48 189/1975).

Es konnte nun gefunden werden, daß die Produktivität für L-Arginin wesentlich erhöht wird, wenn den bekannten Mutanten, die dem Genus Brevibacterium oder Corynebacterium angehören und zur Bildung von L-Arginin befähigt sind, Resistenz gegen Ketomalonsäure, Fluormalonsäure, Monofluoressigsäure oder Aspartat-Antagonisten verliehen wird.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur fermen tativen Herstellung von L-Arginin, bei dem

a) in einem Kulturmedium eine zur Bildung von L-Arginin be fähigte Mutante des Genus Brevibacterium oder Corynebac terium aerob gezüchtet wird und
b) das im Kulturmedium angereicherte L-Arginin gewonnen wird,

das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Mutante aus der Grupe der in Anspruch 1 genannten Mutante der Spezies Brevibacterium flavum oder Corynebacterium aceto acidophilum verwendet, die resistent gegen Ketomalonsäure, Fluormalonsäure, Mo nofluoressigsäure oder Aspartat- Antagonisten sind.

Die vorstehend angegebenen Mutanten können durch Induktion aus Elternstämmen der Spezies Brevibacterium flavum oder Corynebacterium acetoacidophilum unter Anwendung üblicher Mutationsmethoden erhalten werden, wie Bestrahlung mit UV-Strahlung oder Kontakt mit N- Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin, und anschließendes Isolieren der Kolonien, die auf einem Nähragarmedium gebildet worden sind, welches die ausreichende Menge der chemischen Agenzien enthält, die das Wachstum des Elternstammes inhibieren.

Als Elternstämme werden zur Bildung von L-Arginin befähigte Mutanten oder Wildstämme der Spezies Brevibacterium flavum oder Corynebacterium acetoacidophilum verwendet. Wenn Wildstämme als Elternstämme verwendet werden, wird den Wildstämmen zuerst die Fähigkeit zur Bildung von L-Arginin verliehen, bevor ihnen die Resi stenz gegen die erfindungsgemäß definierten Chemikalien ver liehen wird, oder umgekehrt wird den Wildstämmen die Fähigkeit zur Bildung von L-Arginin verliehen, nachdem ihnen die angegebene Resistenz verliehen wurde.

Um den Mikroorganismen der Spezies Brevibacterium flavum oder Corynebacterium acetoacidophilum Produktivität für L-Arginin zu verleihen, wird den Mikroorganismen bekanntlich Resistenz gegen Arginin-Antago nisten verliehen, wie 2-Thiazolalanin und Arginin-hydroxamat oder gegen Sulfadrogen. Die Arginin-Antagonisten sind Chemi kalien, welche das Wachstum der Mikroorganismen des Genus Brevibacterium und Corynebacterium inhibieren und diese In hibierung wird unterdrückt, wenn in dem Medium gleichzeitig L-Arginin vorhanden ist.

Die bevorzugten Wildstämme der Spezies Brevibacterium flavum oder Corynebacterium acetoacidophilum sind coryneforme L-Glutaminsäure bildende Bakterien. Beispiele für diese Bakterien sind:

Brevibacterium flavum ATCC 14067 und
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870.

Die erfindungsgemäß definierten Aspartat-Antagonisten in hibieren das Wachstum der Mikroorganismen der Spezies Brevi bacterium flavum und Corynebacterium acetoacidophilum, und die Inhibierung wird teil weise oder vollständig unterdrückt, wenn in dem Medium gleich zeitig L-Aspartat vorliegt. Beispiele für diese Verbindungen sind β-Aspartylhydrazid, Diaminobernsteinsäure und Hadacidin.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten sind:

Brevibacterium flavumAJ 11337,
NRRL B-12235 (SD^γ, AspHd^γ) Brevibacterium flavumAJ 11338,
NRRL B-12236 (SD^γ, AS^γ) Brevibacterium flavumAJ 11339,
NRRL B-12237 (SD^γ, HD^γ) Corynebacterium acetoacidophilumAJ 11341,
NRRL B-12238 (SD^γ, AspHd^γ) Corynebacterium acetoacidophilumAJ 11342,
NRRL B-12239 (SD^γ, AS^γ) Brevibacterium flavumAJ 11343,
NRRL B-12240 (2TA^γ, SG^γ, His^-, HD^γ) Brevibacterium flavumAJ 11595,
NRRL B-12242 (SD^γ, KM^q) Brevibacterium flavumAJ 11595,
NRRL B-12243 (SD^γ, FM^γ) Brevibacterium flavumAJ 11597,
NRRL B-12244 (SD^γ, FA^γ) Corynebacterium acetoacidophilumAJ 11598,
NRRL B-12245 (SD^γ, KM^q) Brevibacterium flavumAJ 11344,
NRRL B-12241 (2TA^γ, SG^γ, His^-, HD^γ) Corynebacterium acetoacidophilumAJ 11599,
NRRL B-12246 (SD^γ, FA^γ) Brevibacterium flavumAJ 11600,
NRRL B-12247 (2TA^γ, SG^γ, His^-, FA^γ)

SD^γ:Resistenz gegen Sulfadiazin 2TA^γ:Resistenz gegen 2-Thiazolalanin SG^γ:Resistenz gegen Sulfaguanidin His^-:erfordert Histidin zum Wachstum Asp Hd^γ:Resistenz gegen Aspartylhydrazid AS^γ:Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure HD^q:Resistenz gegen Hadacidin KM^γ:Resistenz gegen Ketomalonsäure FM^γ:Resistenz gegen Fluormalonsäure FA^γ:Resistenz gegen Monofluoressigsäure

Nachstehend wird die Methode beschrieben, mit deren Hilfe die erfindungsgemäßen Mutanten induziert wurden:

Versuch 1

Brevibacterium flavum AJ 3277 (SD^γ), das von ATCC 14067 ab geleitet worden war, wurde mit 250 µm/ml N-Methyl-N′-nitro- N-Nitrosoguanidin bei 30°C 30 Minuten behandelt. Dann wurden die Mikrobenzellen auf einem Agarmedium ausgestrichen, das die Menge an Ketomalonsäure enthielt, welche das Wachstum des Elternstammes hemmt.

Nach der Züchtung wurden die auf dem Agarmedium erschienen Kolonien aufgenommen und ihre Produktionsleistung für die Bildung von L-Arginin wurde geprüft.

Unter den so erhaltenen Mutanten wurde B. flavum AJ 11595 selektiert, der höhere Mengen an L-Arginin bildet, als jede der anderen Mutanten.

Die anderen erfindungsgemäßen Mutanten wurden in gleicher Weise erhalten. Der Grad der Resistenz der Mutanten gemäß der Erfindung gegen chemische Agenzien wurde mit Hilfe des nachstehenden Versuches bestimmt.

Versuch 2

Jeder Teststamm wurde mit dem in Tabelle 1 gezeigten wäßrigen Kulturmedium gewaschen, die Zellen wurden in dem gleichen Medium suspendiert (die optische Dichte bei 562 µm der 26 fachen Verdünnung der Suspension betrug 0,3 bis 0,33) und 0,1 ml der Suspension wurde in 40 ml des gleichen Mediums gegeben, welches außerdem die in Tabelle 2 und 3 gezeigten Mengen an chemischen Agenzien enthielt, und wurde dann in ein kleines Reagenzglas gegeben.

Tabelle 1

Zusammensetzung des Mediums (pH: 7,2)

Die Züchtung erfolgte 48 Stunden lang unter Schütteln bei 31,5°C. Dann wurde das Wachstum jedes Stammes durch Messen der optischen Dichte bei 562 µm der erhaltenen Brühe be stimmt.

Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Tabellen 2 und 3 gezeigt.

In Tabellen 2 und 3 wird der Grad der Resistenz durch die relativen Wachstumswerte im Vergleich mit dem Kontroll versuch angegeben.

Tabelle 2

Grad der Resistenz

Tabelle 3

Grad der Resistenz

Die Mutanten werden aerob in einem üblichen Kulturmedium gezüchtet, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Ionen sowie erforderlichenfalls Spurennähr stoffe enthält.

Als Kohlenstoffquellen können vorzugsweise Saccharide, wie Glucose, Fructose und Saccharose, und Melassen und Stärke hydrolysate, welche diese Saccharide enthalten, organische Säuren, wie Essigsäure und Propionsäure, und Alkohole ver wendet werden. Geeignete Stickstoffquellen sind beispiels weise Ammoniumsulfat, gasförmiges Ammoniak und Harnstoff.

Die Züchtung erfolgt vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während 2 bis 7 Tagen und die Temperatur des Kulturmediums wird im Bereich von 24° bis 37°C gehalten, wobei vorzugs weise der pH-Wert des Mediums mit einer organischen oder an organischen Säure oder mit Alkali auf 5,0 bis 9,0 einge stellt wird. Zu diesem Zweck können auch Harnstoff, CaCO₃ oder gasförmiges Ammoniak verwendet werden.

Das in der Kulturbrühe angereicherte L-Arginin kann mit Hilfe einer völlig üblichen Gewinnungsmethode, wie unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes, gewonnen werden.

Die Erfindung wird nun durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

20 5ml-Anteile des Kulturmediums (A), dessen Zusammensetzung in Tabelle 4 angegeben ist, wurden in 500-ml-Kolben gegeben und zur Sterilisation 5 Minuten auf 110°C erhitzt. Dann wurde in jeden Kolben zusätzlich 1,0 g gesondert sterilisiertes CaCO₃ gegeben.

Tabelle 4

Zusammensetzung des Kulturmediums

Brevibacterium flavum AJ 11600 und AJ 11343, die vorher auf Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden waren, wurden in jeden Ansatz des Kulturmediums eingeimpft und dann 72 Stunden un ter Schütteln bei 31°C gezüchtet. Nach 72stündigem Züchten wurde das in der erhaltenen Kulturbrühe angereicherte L- Arginin colorimetrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Stammangereichertes L-Arginin

AJ 116003,6/dl AJ 113433,5/dl

Ein Liter Kulturbrühe von AJ 11600, die in gleicher Weise wie vorstehend erhalten worden war, wurde gewonnen und zentri fugiert, um die Mikrobenzellen und festes CaCO₃ zu entfernen. Ein Liter der so erhaltenen überstehenden Lösung wurde durch eine mit Amberlite®C-50 in der NH₄⁺-Form gefüllte Kolonne geleitet, wobei L-Arginin an dem Harz adsorbiert wurde. Die Kolonne wurde dann mit 2n-Ammoniakwasser eluiert. Das Eluat wurde einge dampft und die konzentrierte Lösung wurde auf eine ausreichend niedere Temperatur abgekühlt, um L-Arginin auszukristal lisieren. Nach Beendigung der Kristallisation wurden 23,3 g kristallines L-Arginin aus der Mutterlauge abgetrennt.

In gleicher Weise wie vorstehend erläutert wurden 22,7 g kristallines L-Arginin aus der Kulturbrühe von AJ 11343 erhalten.

Beispiel 2

Jeder der in Tabelle 5 angegebenen Stämme, der vorher auf Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden war, wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet und die Menge des in der Kulturbrühe angereicherten L-Arginins wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
Stammangereichertes L-Arginin (g/dl)

AJ 32771,80 AJ 115951,92 AJ 115961,84 AJ 115971,90 AJ 113372,00 AJ 113381,90 AJ 113391,85 AJ 115981,86 AJ 115991,91 AJ 113411,90 AJ 113421,85 AJ 111933,30 AJ 116003,60 AJ 113443,45

Beispiel 3

300 ml des in Tabelle 4 angegebenen Mediums C wurden in ein 1,0-Liter-Fermentationsgefäß gegeben und zur Sterilisation 5 Minuten lang auf 110°C erhitzt. Dann wurde das Medium mit 15 ml einer Impfkulturbrühe von Brevibacterium flavum AJ 11599 angeimpft, die vorher in Medium D aerob bei 31°C unter Rühren und Belüften gezüchtet worden war.

Während der Züchtung wurde der pH-Wert des Mediums durch Zu gabe von Essigsäure und Essigsäurelösung im Bereich von 7,2 bis 8,0 gehalten.

Nach 55stündiger Züchtung waren in der Kulturbrühe 4,24 g/dl L-Arginin angereichert. Das Volumen der während der Züchtung verbrauchten Essigsäure-Lösung betrug 20%, bezogen auf das Anfangsvolumen des Kulturmediums. Aus 300 ml der so herge stellten Kulturbrühe wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 9,20 g kristallines L-Arginin erhalten.

Beispiel 4

Brevibacterium flavum AJ 11343 wurde 18 Stunden lang unter Rühren und Belüften in dem in Tabelle 4 gezeigten Medium D bei 31°C gezüchtet, wobei eine Impfkulturbrühe hergestellt wurde.

Danach wurden 300 ml Medium C in ein 1-Liter-Fermentations gefäß gegeben, 5 Minuten bei 110°C sterilisiert und mit 15 ml der Impfkulturbrühe inokuliert und dann unter Rühren und Be lüften bei einer Temperatur von 31°C gehalten. Während der Züchtung wurde der pH-Wert des Mediums mit Hilfe von gasför migem Ammoniak in einem pH-Bereich von 7,2 bis 7,8 gehalten. Die Konzentration an Äthanol in dem Medium wurde durch Gas chromatographie bestimmt und kleine Anteile an Äthanol wurden zu dem Medium zugesetzt, wenn die Äthanolkonzentration einen Wert von etwa 0,3% annahm. Nach 48stündiger Züchtung waren 48 g Äthanol verbraucht und in der Kulturbrühe wurden 2,57 g/dl L-Arginin aufgefunden. In der in Beispiel 1 gezeigten Weise wurden 4,75 g L-Arginin gewonnen.

Claims

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Arginin, bei dem

a) in einem Kulturmedium eine zur Bildung von L-Arginin be fähigte Mutante des Genus Brevibacterium oder Coryne bacterium aerob gezüchtet wird und
b) das im Kulturmedium angereicherte L-Arginin gewonnen wird,

dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante der Spezies Brevibacterium flavum oder Corynebacterium acetoacidophilum aus der nachfolgend aufgeführten Gruppe von Stämmen verwendet, die resistent gegen Ketomalonsäure, Fluormalonsäure, Monofluoressigsäure oder Aspartat-Antago nisten sind: Brevibacterium flavum AJ 11337, NRRL B-12235;
Brevibacterium flavum AJ 11338, NRRL B-12236;
Brevibacterium flavum AJ 11339, NRRL B-12237;
Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11341, NRRL B-12238;
Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11342, NRRL B-12239;
Brevibacterium flavum AJ 11343, NRRL B-12240;
Brevibacterium flavum AJ 11344, NRRL B-12241;
Brevibacterium flavum AJ 11595, NRRL B-12242;
Brevibacterium flavum AJ 11596, NRRL B-12243;
Brevibacterium flavum AJ 11597, NRRL B-12244;
Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11598, NRRL B-12245;
Corynebacterium acetoacidophilum AJ 11599, NRRL B-12246;
Brevibacterium flavum AJ 11600, NRRL B-12247;

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß man eine Mutante verwendet, die resi stent gegen β-Aspartylhydrazid, Diaminobernsteinsäure oder Hadacidin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante verwendet, die resistent gegen Sulfa-Drogen oder Arginin-Antagonisten ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß man eine Mutante verwendet, die resi stent gegen Sulfadiadiazin, Sulfaguanidin oder 2-Thiazol alanin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß man eine Mutante verwendet, die resi stent gegen 2-Thiazolalanin und Sulfaguanidin ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß man eine Mutante verwendet, die resi stent gegen Sulfadiazin und β-Aspartylhydrazid, gegen Sulfa diazin und Diaminobernsteinsäure, gegen Sulfadiazin und Ha dacidin, gegen 2-Thiazolalanin und Sulfaguanidin sowie β-Aspartylhydrazid oder gegen 2-Thiazolalanin und Sulfaguanidin sowie Hadacidin ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante verwendet, die resistent gegen Sulfadiazin und Ketomalonsäure, Sulfadiazin und Fluormalon säure, Sulfadiazin und Monofluoressigsäure oder gegen 2-Thiazolalanin und Sulfaguanidin sowie Monofluoressig säure ist.