DE3033869C2 - Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion - Google Patents
Verfahren zum Nachweis einer immunologischen AgglutinationsreaktionInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion gemäß
dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Als Beispiel für ein bekanntes Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion
wird im folgenden kurz auf die US-PS 38 83 3C8 eingegangen. Dieses Verfahren besteht darin, daß man
bestimmte Mengen einer zentrifugierten Suspension einer zu untersuchenden Blutprobe, enthaltend 2 bis 5%
Blutkörperchen und ein spezifisches Antiserum in ein Reaktionsgefäß mit einem runden Boden gibt, die
Suspension und das Antiserum bewegt, das Reaktionsgefäß stehen läßt, eine Zentrifugal-Präzipitation durchführt,
das Reaktionsgefäß in bestimmte schneie Schüttelbewegungen versetzt, um die präzipierten bzw.
ausgefällten Blutkörperchen wieder zu dispergieren, das Reaktionsgefäß verhältnismäßig langsam bewegt, um
die Agglutinate im Mittelteil des Bodens des Reaktionsgefäßes zu sammeln, um ein Agglutinationsmuster am
Boden des Reaktionsgefäßes zu erhalten, und das Agglutinationsmuster fotometrisch nachweist. Das
Verfahren beruht auf dem Phänomen, daß nach dem oben erwähnten Aufschütteln und verhältnismäßig
langsamen Bewegen Teilchen, die durch Agglutination miteinander verbunden sind, sich schnell im Mittelteil
des Reaktionsgefäßes ansammeln, während nicht agglutinierte Teilchen wieder in Form einer Suspension
dispergiert werden und sich nicht im Mittelteil des Reaktionsgefäßes ansammeln. Um das Agglutinationsmuster
im Mittelteil des Bodens des Reaktiongefäßes nachzuweisen, werden Nephelometrie oder Opazitätsbzw. Transmissionsmessungen angewandt. Wenn der
Lichtstrahl nämlich durch die Suspension hindurchgeht, variiert der Grad der Lichtabsorption in Abhängigkeit
von der Dichte der Blulkötperchen, die zwischen der Oberfläche der Suspension und dem Boden des
Reaktiongefäßes suspendiert sind, wobei diese Änderung der Lichtabsorption fotoelektrisch gemessen wird
als unterschiedlicher Trübungsgrad. Insbesondere ist nach dem Beispiel der Fig. 33 der US-PS 38 83 308 der
Lichtstrahl von oben auf das Reaklionsgefäß gerichtet, to das einen durchsichtigen bzw. transparenten runden
Boden besitzt, und eine Maske oder Bodenplatte mit einer mittleren öffnung und einer ringförmigen öffnung
um die mittlere Öffnung herum ist so unterhalb des Reaktionsgefässes angeordnet, daß Licht, das durch die
mittlere öffnung hindurchtritt auf ein erstes lichtaufnehmendes (lichtempfindliches) Element auftrifft, während
Licht, das durch die kreisförmige öffnung kommt, durch eine Linse auf ein zweites lichtaufnehmendes Element
auftritt So gibt die Lichtmenge, die auf das erste lichtaufnehmende Element auftrifft nach Durchgang
durch den Mittelteil des Reaktionsgefäßes, die Trübung im Mittelteil der zu analysierenden Suspension an,
während die Lichtmenge, die auf das zweite lichtaufnehmende Element nach Durchgang durch den peripheren
Teil des Reaktionsgefäßes auftrifft, die Trübung im peripheren bzw. Randteil der zu untersuchenden
Suspension angibt. Wenn infolgedessen die Lichtmenge, die durch den Mittelteil der zu untersuchenden
Suspension hindurchgeht, abnimmt gegenüber dem Vergleichswert und gleichzeitig die Lichtmenge, die
durch den peripheren Teil der Suspension hindurchgeht, zunimmt gegenüber dem Vergleichswert, stellt man ein
»Vorliegen von Agglutination« fest. Wenn andererseits die Lichtmengen, die durch den Mittelteil und den
Randteil der zu untersuchenden Suspension hindurchgehen, gegenüber dem Verglcichswert unverändert
bleiben wird »Abwesenheit von Agglutination« festgestellt.
Das übliche Verfahren zum s^achweis und zur
Bestimmung eines Agglutinationsmusters, wie es beispielhaft in der US-PS 38 83 308 angegeben ist, besitzt
verschiedene Nachteile: Die Vergleichsv/erte für die Lichtmengen die auf das erste und zweite lichtempfindliche
Element auftreffen, müssen geeicht und eingestellt werden mit Hilfe geeigneter Vergleichs-Agglutinationsmuster.
Durch diese Eichung und Einstellung wird das Bestimmungsverfahren mühsam. Außerdem ist das
Vergleichs-Agglutinationsmuster nicht notwendigerweise identisch mit den tatsächlichen Agglutinationsmustern
der zu untersuchenden Suspensionen, so daß die Abweichung der Vergleichs-Agglutinationsmuster von
den tatsächlichen Agglutinationsmustern zu Fehlern bei der Bestimmung des Auftretens oder nicht-Auftretens
von Agglutination führen können. Darüber hinaus muß nach dem bekannten Verfahren vermieden werden, daß
ein Teil des Lichtes, das auf den Randteil der Suspension auftrifft und das durch darin enthaltene Teilchen
gestreut wird, das erste lichtempfindliche Element durch die mittlere Öffnung der Maske oder der Bodenplatte
erreicht und außerdem muß vermieden werden, daß ein Teil des Lichtes, das auf den Mittelteil der Suspension
auftifft und von darin enthaltenen Teilchen gestreut wird, das zweite lichtempfindliche Element durch die
kreisförmige Öffnung der Maske oder der Bodenplatte erreicht. Folglich müssen die Maske oder Bodenplatte
und das erste und zweite lichtempfindliche Element so konstruiert und angeordnet sein, daß die oben
erwähnten Anforderungen erfüllt sind. Dadurch wird
die Konstruktion und Anordnung des optische Systems zum Nachweis der Lichtabsorption kompliziert und
schwierig herzustellen.
Ein weiteres Verfahren zum Nachweis einer immunologischen
Agglutinationsreaktion ist in der DE-AS 15 23 058 beschrieben. Bei diesem Verfahren, bei der"
rote Blutkörperchen mit einem Antiseram agglutiniert
werden, wird nach Hämolyse der nicht agglutinierten roten Blutkörperchen eine Lichtabsorptionsmessung an
der überstehenden Flüssigkeit durchgeführt.
Es isi Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum
Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion zur Verfügung zu stellen, daß den leichten und
genauen Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion mit Hilfe einer auf einfache Weise
arbeitenden Vorrichtung mit einfacher Konstruktion ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch das im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen
dieser Lösung ergeben sich aus den Ansprüchen 2—5.
Bei immunologischen, insbesondere serologischen
Agglutinationsreaktionen sind Antikörper, die an den Reaktionen teilnehmen, im allgemeinen Immungiobuline
wie IgG, IgM und IgA, die Proteine sind. Es ist
bekannt, daß Proteine eine starke Lichtabsorptionsfähigkeit für Licht mit Wellenlängen von 190 und 280 nm
besitzen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Lichtabsorptionen sowohl von dem flüssigen
Medium, das den zu messenden Antikörper enthält, als auch der überstehenden Flüssigkeit, nach dem die
Antigen-Antikörperreaktion stattgefunden hat, gemessen mit Hilfe von Licht, das aufgrund seiner Wellenlänge
von dem Antikörper selektiv absorbiert wird, so daß die Agglutinationsreaktion nachgewiesen wird aufgrund
des Unterschieds zwischen den beiden Absorptionen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nicht
direkt das Agglutinationsmuster nachgewiesen, wie bei dem bekannten Verfahren nach der US 38 83 308, so
daß das optische System für die Fotometriemessung vereinfacht wird und kein Vergleichs-Agglutinationsmuster
erforderlich ist.
Ferner kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Antigen-Antikörper-Reaktion einfach mit Hilfe
einer üblichen Zentrifuge durchgeführt werden oder sogar in einem stillstehenden Reaktion!;s;efäß. Dadurch
wird das Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion wesentlich vereinfacht.
Die Erfindung wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele anhand der Zeichnungen näher erläutert, dabei
ist
Fig. 1 eine schematische Darstellung der einzelnen
Stufen, die bei einem Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion durchgeführt
werden,
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten
Vorrichtung und
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer anderen
geeigneten Vorrichtung.
In Fig. 1, die die einzelnen Stufen des Verfahrens
zeigt, ist 1 eine Spritze, die mit einem Serumbehälter 2 verbunden ist und mit deren Hilfe eine bestimmte
Menge Serum 3 aus dem Behälter 2 entnommen und in das Reaktionsgefäß 4 übergeführt werden kann. Bei dor
im Bild gezeigten Vorrichtung ist das Reaktionsgefäß 4 ein durchsichtiges Reagenzglas. Die Lichtabsorption
(OD\) dieses Serums 3 wird durch die Wand des
Reaktionsgefäßes 4 gemessen z. B, bei einer Weiienlänge
von 280 nm.
;~· s Reak;ionsgefäß 4 ist aus einem rvirftena!
hei jt-äteiii das für die angewandte Wellenlänge eine
hohe Transparenz besitzt bei Anwendung von Licht mit eu,£i V.'ellen'Snge .On 280 nm, vorzugsweise aus Qu&n.
Nachdem die Lichtabsorption des Serums gemessen
worden ist, wird mit einer anderen Spritze 5 die Lösung 6, die Antigenteilchen wie Erythrozyten enthäit (im
ίο folgenden als »Antigenlösung« bezeichnet), aus dem
Behälter >' entnommen und eine bestimmte Menge dieser Antigenlösung 6 in das Reaktionsgefäß 4, das das
Serum 3 enthält, gegeben. Dabei tritt die Agglutinationsreaktion zwischen Antigen und Antikörper und
is eine Präzipitation bzw. Ausfällung von Antigenteilchen
oder Agglutinaten ein. Die Agglutinationsreaktion kann entweder mit Hilfe einer Zentrifuge 8 durchgeführt
werden oder indem man das Reaktionsgefäß 4 stillstehen läßt, wie oben angegeben. Nach voilständigern
Ablauf der Antigen-Antikörper-Reaktion wird die Absorption (OD2) der überstehenden <
iüssigkeit des Serums nach der Reaktion mit Hilfe von Liciit mit einer
Wellenlänge von 280 nm wie bei der Messung der Lichtabsorption OD\ gemessen. Dann wird der Unterschied
zwischen den Werten für die Lichtabsorptionen ODi und erzürn Nachweis der Agglutinationsreaktion
bestimmt.
In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, daß sich die Antigenteilchen am Boden des Reaktionsgefäßes
4 absetzen, da die Antigenteilchen eine größere spezifische Dichte besitzen als die anderen Bestandteile
des Serums unabhängig davon, ob die Antigen-Antikörper-Reaktionen eine Agglutinations- oder nicht-Agglutinationsreaktion
ist. Im Falle einer Agglutinations-Reaktion werden die Immungiobuline ais Antikörper von
den Antigenteilchen absorbiert und setzen sich zusammen mit den Antigenteilchen ab, so daß die Konzentration
an Protein in dem Serum, das die überstehende Flüssigkeit bildet, entsprechend abnimmt. Dadurch tritt
ein Unterschied zwischen den Lichtabsorptionen ODi
und OD2 ein, der es erlaubt, das »Auftreten von
Agglutination« zu bestimmen. Bei einer nicht-Agglutinationsreaktion werden die Immungiobuline nicht von
den sedimentierenden bzw. sich absetzenden Artigenteilchen
adsorbiert, so daß die Konzentration an Pro'ein in dem die überstehende Flüssigkeit bildenden Serum
sich nicht ändert. Infolgedessen sind die Absorptionswerte für ODi und OD2 gleich und es kann festgestellt
werden, daß keine Agglutination eingetreten ist.
Die Menge an Antikörpern, die von den Antigenteilchen adsorbiert werden, variiert je nach der Menge der
Antigenteilchen und der Stärke des Antikörpers, so daß die Menge an Rest-Immungiobulinen im Serum, das die
überstehende Flüssigkeit bildet, entsprechend variiert.
Im Hinblick auf diese Variation der Adsorption de.' Antikörper erlaubt die Berechnung der Differenz
zwischen den beiden Lichtabsorptionen ODi und OD2 die Bestimmung des Grads der Agglutination und damit
eine qus^titativs Analvse, d h. eine quantitative Analyse
co des Antigens und von dem Antigen adsorbierten Antikörpers.
In F i g. 2 is: pine zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens geeignete Vorrichtung dargestellt. Eine Vielzahl voi v. i'.ntersuchenden Serumproben
h) werde·.! /.1 enio!>iechen';e Probenbehälter !1 geg-.V.n
die sich intermittierend nacheinander in Richtung d-.'f
Pfeiles A dci Figur bewegen. Eine Reihe von RcaktionsrefKßcn 12 bewegen sich ebenfalls intermit-
tierend in Richtung des Pfeiles B der Figur mit der
gleichen Geschwindigkeit bzw. Periode wie die Probenbehälter 11. Eine Spritze 13 zieht eine vorbestimmte
Menge des zu untersuchenden Serums aus dem Probenbehälter It in der Einsaugstellung und entleert -,
die aufgesaugten S.erumproben in die Reaktionsgefäße 12 in Einfüllstellung. So werden die Serumproben von
den Probenbehältern 11 in die entsprechenden Reaktionsgefäße
12 nacheinander eingefüllt. Nach Aufnahme der Serumprobe kommt das Reaktionsgefäß 12 in eine m
erste Meßstellung, wo die Lichtabsorption ODi der
Serumprobe in dem Reaktionsgefäß 12 gemessen und in einen entsprechenden Speicher (nicht gezeigt) eingegeben
wird. Bei der Vorrichtung der F i g. 2 umfaßt die fotometrische Vorrichtung zur Messung der ersten r,
Lichtabsorption OD\ eine mehrfarbige Lichtquelle 14, ein Interferenz-Filter 15, das Licht mit der Wellenlänge
280 nm aus dem von der Lichtquelle 14 emittierten Licht ausfiltert. Das Licht von dem Interferenz-Filter 15 wird
auf die Serumprobe in dem Reaktionsgefäß 12 in der ersten Meßstellung; gerichtet, und ein Prisma 16 bricht
das aus dem Reaktionsgefäß 12 austretende Licht und lenkt den Strahl auf ein lichtempfindliches Element 17.
Die Lichtabsorption ODi der Se-umprobe wird aufgrund
der von dem lichtempfindlichen Element 17 >> ablesbaren Werte bestimmt und in einen (nicht
gezeigten) Speicher eingegeben.
Nach Messung der Lichtabsorption in der ersten Meßsteüung kommt das Reaktionsgefäß 12 in eine
Reagenzaufnahmestellung, wo eine vorbestimmte Men- jo
ge einer Antigenlösung 18 (z. B. einer Suspension von Blutkörperchen) aus einem Reagenzbehälter 19 mit
Hilfe einer Spritze 20 in das Reaktionsgefäß 12 eingebracht wird. Die Antigenlösung ist ein Reagenz,
um die Antigen-Antikörper-Reaktion herbeizuführen. Wenn sich das Reaktionsgefäß 12 eine vorbestimmte
Anzahl von Einzelschritten von der Reagenzaufnahmestellung entfernt hat. wird ein Rührer 21 in das
Reaktiongefäß 12 geführt, der die Serumprobe und das Reagenz in dem Reaktionsgefäß 12 bewegt und
vermischt. Die Antigen-Antikörper-Reaktion findet während der Zeit si alt. bis das Reaktionsgefäß 12 eine
zweite Meßstellung- erreicht, wo die Lichtabsorption OD2 der überstehenden Flüssigkeit nach Ablauf der
Antigen-Antikörper-Reak'ion gemessen wird. Bei der Vorrichtung der F i g. 2 ist die foiometrische Meßvorrichtung
an der zweiten Meßstelle ähnlich bzw. gleich wie diejenige an der ersten Meßstelle und die
mehrfarbige Lichtquelle 14 wird für die erste und die zweite Messung angewandt. In der zweiten Meßstellung
trifft das von der Lichtquelle 14 kommende Licht auf ein Interferenz-Filter 22 und das ausgefilterte Licht mit
einer Wellenlänge von 280 nm trifft durch die Wand des Reaktionsgefäßes 12 auf die überstehende Flüssigkeit
und das lichtempfindliche Element 23 empfängt das Licht von dem Reaktionsgefäß 12 zur Bestimmung der
Lichtabsorption OD2 der überstehenden Flüssigkeit.
Die so bestimmte Lichtabsorption OCh der überstehenden Flüssigkeit wird in einen (nicht gezeigten)
Differentialverstärker eingegeben, in den an einer anderen Stelle die Lichtabsorption ODi der entsprechenden
Serumprobe, wie sie an der ersten Meßstelle gemessen und in dem Speicher festgehalten wurde,
eingegeben wird, so daß der DifferntialverstSrker ein
Signal aussendet, daß die Differenz /wischen den beiden Lichtabsorptionen ODi und ODt angibt, wodurch die
Bestimmung, ob Agglutination vorliegt oder nicht, möglich wird. Wenn Agglutination eingetreten ist, ist es
auch möglich, den Grad der Agglutination zu bestimmen und dadurch eine quantitative Analyse für Antigen
und Antikörper durchzuführen.
Nach der zweiten Meßstellung, in der die Lichtabsorption der überstehenden Flüssigkeit gemessen
worden ist, kommt das Reaktionsgefäß 12 in eine Entleerungsstellung, wo die Flüssigkeit aus dem
Reaktionsgefäß 12 mit Hilfe einer Absaugpumpe 24 abgezogen und verworfen wird. In der nächsten
Stellung wird mit Hilfe einer Spülpumpe 25 Spülflüssigkeit 27 Iz. B. physiologische Kochsalzlösung) aus einem
Behältei 26 in das Reaktionsgefäß gegeben, die in der nächsten Stellung des Reaktionsgefässes 12 durch eine
weitere ,A osaugpumpe 28 abgezogen wird. Dadurch
wird das Reaktionsgefäß 12 gereinigt und für den nächsten ,--nalysezyklus vorbereitet.
In Fig. 3 ist eine andere zur Durchführung des erfindiingsgemäßen Verfahrens geei<?"rie Vorrii htung
angegeben. Diese Vor/ichtiPv " :üi Falle geeignet, bei
denen die Proben Antigenlösungen (z. B. Suspensionen von Blutkörperchen) sind. Bei dieser Vorrichtung wird
eine bestimmte Menge Reagenz in Form eines Serums. das Antikörper enthält, 29 (Serumreagenz) in ein
Reaktionsgefäß 12 aus einem Reagenzbehälter 19 mit Hilfe einer Reagenzspritze 20 gegeben. Wenn das
Reaktionsgefäß 12 die erste Meßstellung erreicht, wird die Absorption OD\ des Serumreagenzes gemessen.
Anschließend, wcnr das Reaktionsgefäß 12 die Probenaufnahmesteilung
erreichi hat, wird mit Hilfe einer Probenspritze 13 eine vorbestimmte Menge der Probe
in das Reaktionsgefäß 12 gegeben. Die Teile der Vorrichtung »jet Fig,3, die der Probenaufnu'^iestellung
folgen, sind ebenso ausgebildet und arbeiten auf die gleiche Weise wie die entsprechenden Teile der F;g. 2,
so daß die Einzelheiten hier nicht mehr näher erläutert werden.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
1. Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion, bei dem man ein
Antikörperhaltiges flüssiges Medium mit einem Antigen zusammenbringt und eine Lichtabsorptionsessung
an der überstehenden Flüssigkeit durchführt, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antikörperhaltige flüssige Medium in ein
Reaktionsgefäß gibt, die Lichtabsorption dieses Mediums mit Licht einer solchen Wellenlänge, daß
es von dem Antikörper selektiv absorbiert wird, mißt, das Antigen in das Reaktionsgefäß gibt, nach
Ablauf der Antigen-Antikörper-Reaktion eine zweite Absorptionsmessung an der überstehenden
Flüssigkeit mit Hilfe von Licht der gleichen Wellenlänge durchführt und den Unterschied zwischen
der ersten und zweiten Absorption bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man aus dem Unterschied der Lichtabsorptionen das Vorhandensein oder nicht-Vorhandensein
bzw. den Grad der Agglutinierung bestimmt
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antikörper-haltiges
Medium Serum verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antigen eine Suspension
von Blutkörperchen verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lichtabsorption bei
280 nm oder 190 nm mißt
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