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BESCHREIBUNG
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Auf medizinischem, pharmazeutischem und landwirtschaftlichem Gebiet
sind in jüngerer Zeit viele Versuche unternommen worden, lebende Zellen oder deren
Organellen (einzelne kleine Organe in der Zelle) aus dem Organismus zu isolieren,
um mit ihrer Hilfe physiologisch aktive Substanzen herzustellen, die Photosynthese
durchzuführen oder auch eine klinische Diagnose oder Medikation unter Nutzung der
biochemischen Funktion der Zellen auszuführen. Für diese Zwecke verwendete Zellen
sind z.B. Mäuseembryonenzellen, Kälbernierenzellen, Schweinenierenzellen, embryonale
Nierenzellen vom Menschen, Thyreoidzellen vom erwachsenen Menschen, menschliche
Amnionzellen, Hühnerembryonenzellen, Affennierenzellen, Hela-Zellen, Nierenzellen
von neugeborenen Hamstern, menschliche Lymphozyten, Leberzellen vom erwachsenen
Menschen, Bindehautzellen vom erwachsenen Menschen Schimpansenleberzellen, Hundenierenzellen,
Hundeleberzellen, Schimpansennierenzellen, Nierenzellen vom afrikanischen Grünaffen,
Kaninchennierenzellen, Rhesusaffenzellen, embryonale Lungenzellen vom Menschen,
embryonale Darmzellen vom Menschen, menschliche Cervixcarcinomzellen, Mäusesarkomzellen,
Mäusefibrioblasten, Kaninchenhornhautzellen, menschliche Hautzellen, Pferdehautzellen,
embryonale Tracheazellen vom Rind, Schafhirnzellen, embryonale Hautzellen vom Menschen,
embryonale Muskelzellen vom Menschen, embryonale Nierenzellen vom Menschen, embryonale
Hirnzellen vom Menschen, embryonale Milzzellen vom Menschen, embryonale Hypophysenzellen
vom Menschen, Hypophysenzellen vom erwachsenen Menschen,
embryonale
Thyreoidzellen vom Menschen, Katzennierenzellen, Nierenzellen vom krabben fressenden
Affen, embryonale Nierenzellen vom Rind, Katzenlungenzellen, Rhesushodenzellen,
Hodenzellen vom afrikanischen Grünaffen, Hühnernierenzellen, Meerschweinchennierenzellen,
Hamsterembryonenzellen, Mäuseembryonenzellen, Mäusenierenzellen, Mäusehautzellen,
Rattennierenzellen, Rattenembryonenzellen, Affenherzzellen, Hamstertumorzellen,
menschliche Sternalmarkzellen, menschliche Hautzellen, menschliche Lungenzellen,
ösophaguszellen von der Ziege, Büffellungenzellen, Nerzlungenzellen, Delphinnierenzellen,
Zellen von Fischen, Amphibien, Vögeln, Insekten, Reptilien, etc., Zellen von speziellen
Human- und Tierkrankheiten, Korpuskel (d.h. Erythrozyten, Leukozyten und Lymphozyten)
und Sera vom Menschen (mit unterschiedlichen Blutgruppen) von Vieh, Hühnern, Hühnchen,
Gänsen, Meerschweinchen, Pferden, Affen, Kaninchen, Mäusen, Ratten und Schafen,
Spermienund Eier, Hypophysenzellen, Thyreoidzellen, Parathyreoidzellen, Nebennierenmarkzellen,
Nebennierenrindenzellen, Spermazellen, Ovarzellen, Epiphysenzellen und Placentazellen
vom Menschen und von Wirbeltieren, Pflanzenzellen, Algeneinzelzellen und Hefezellen.
Organellen sind einzelne kleine Organe in der Zelle und umfassen z.B.
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Mitochondrien, Ribosomen, Golgi-Körper und Chloroplasten.
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Diese Zellen und Organellen im lebenden Gewebe stehen miteinander
in Wechselwirkung und erfüllen komplexe Funktionen.
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Viele von ihnen sind sehr labil und werden außerhalb des Organismus
schnell desaktiviert. Sie halten auch einer invitro-Anwendung nicht stand, selbst
wenn ihre morphologischen Eigenschaften dieselben wie vorher sind.
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Die Organellen, die erfindungsgemäß von besonderem Interesse sind,
sind Chloroplasten und die Erfindung zielt insbesondere auf deren Verwendung ab.
Chloroplasten sind eine Art von Organellen in Pflanzenzellen, die für die Photosynthese
verantwortlich sind. Die Bedeutung von Chloroplasten hat in letzter Zeit zugenommen,
da sie befähigt sind, Sonnenenergie
zu nutzen und möglicherweise
zur Wasserstoffherstellung, Kohlenstoffixierung und Entwicklung von Photosynthese-Solarzellen
eingesetzt werden können. Isoliert man jedoch Chloroplasten aus dem lebenden Organismus
für diese Zwecke, so verlieren sie ihre Fähigkeit zur Photosynthese; beispielsweise
geht die Aktivität nach 2tägigem Stehen bei 40C vollständig verloren. Außerdem sind
die aus dem lebenden Organismus isolierten Chloroplasten eine wäßrige Suspension,
die für die verfahrenstechnische Anwendung wenig geeignet ist. Der isolierte Chloroplast
muß daher in einem Träger eingeschlossen werden, damit er einer mehrmaligen und
kontinuierlichen Verwendung in der Praxis standhält. Unter diesen Umständen scheint
es notwendig, Zellen oder Organellen so zu modifizieren, daß sie außerhalb des lebenden
Organismus stabil bleiben, und ihnen Dimensionen, Formen sowie chemische und physikalische
Eigenschaften zu verleihen, die eine in vitro-Anwendung ermöglichen.
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Die Terminologie beim "Immobilisieren von biologisch aktiven Substanzen,
wie Enzymen, Zellen und Organellen, ist noch nicht zu einer systematischen Nomenklatur
geordnet. In den meisten Fällen wird jedoch der Ausdruck "Immobilisieren" als allgemeiner
Begriff für drei Konzepte verstanden, nämlich das "Einschließen" (oder Einfangen),
bei dem eine biologisch aktive Substanz physikalisch in einem bestimmten Raum innerhalb
eines Trägers eingeschlossen wird, das "Binden", bei dem eine biologisch aktive
Substanz durch kovalente Bindung, Ionenbindung oder physikalische Adsorption an
einen Träger gebunden wird, und die Adhäsion", bei der eine biologisch aktive Substanz
mit der Polymerkette eines Trägers verflochten wird. Der Mechanismus der "Immobilisierung"
von biologisch aktiven Substanzen ist noch nicht vollständig geklärt, es wurde jedoch
bestätigt, daß die Erscheinungen: Einschließen", "Binden" und "Adhäsion" niemals
unabhängig, sondern in Kombination auftreten. Es versteht sich somit, daß der Ausdruck
"Immobilisierung" die Bedeutung von "Adhäsion" hat, wenn eine Zelle oder Organelle
mit der Polymerkette
eines Trägers verflochten ist, die Bedeutung
von "Einschließen" hat, wenn die Zelle oder Organelle von dem Netzwerk, das durch
die Polymerkette des Trägers gebildet wird, eingeschlossen ist, und die Bedeutung
von Binden" hat, wenn die Zelle oder Organelle an das Trägerpolymer gebunden ist.
Die strukturelle Beziehung zwischen der Zelle oder Organelle und dem Träger ist
noch nicht genau geklärt.
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Für die Zwecke der Erfindung ist eine Zelle oder Organelle "immobilisiert",
wenn sie von dem Träger eingeschlossen, damit verbunden oder verflochten ist, ohne
ihre Funktion zu verringern oder ihre Struktur zu zerstören, so daß sie mit dem
Träger integriert ist und kontinuierlich verwendet oder für andere Anwendungen wiedergewonnen
werden kann. Es versteht sich somit, daß alle Begriffe, die im Zusammenhang mit
"Immobilisieren" verwendet werden, z.B. Fixieren, Verkapseln, Matrix-Einfangen,
Mikroverkapseln, Anhaften, Implantieren, Absorbieren und kovalent Binden mit dem
Begriff Immobilisieren synonym sind und von diesem umfaßt werden.
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In jüngerer Zeit sind mehrere Methoden zum Immobilisieren von biologisch
aktiven Substanzen vorgeschlagen worden. So hat die Anmelderin ein Verfahren entwickelt,
bei dem ein Mikroorganismus oder Enzym in einem Polymer aus glasbildenden Monomeren
mit stabilem Unterkühlungsverhalten, die bei tiefen Temperaturen durch Bestrahlen
mit Licht oder ionisierender Strahlung polymerisiert werden, wirksam immobilisiert
sind. Dieses Verfahren hat folgende Vorteile: Der Mikroorganismus oder die Zelle
können ohne Desaktivierung durch Wärme oder Strahlung immobilisiert werden; das
erhaltene Polymer läßt sich leicht zu der gewünschten Form mit großer Oberfläche
verarbeiten; und die Polymerisation verläuft schnell, so daß eine wirksame Immobilisierung
erreicht wird. Wie bereits erwähnt, haben die Zellen oder Organellen jedoch eine
komplexe Struktur und ergeben im lebenden Organismus komplexe Stoffwechselreaktionen.
Im Vergleich zu
Enzymen und Mikroorganismen sind sie so labil, das
das Verfahren für ihre Immobilisierung nicht angewandt werden kann, ohne irreversible
Änderungen ihrer komplexen Struktur und eine Zerstörung ihrer Funktion in Kauf zu
nehmen.
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Bei Untersuchungen zur Entwicklung eines Verfahrens zum Immobilisieren
von Zellen oder Organellen ohne diese Nachteile wurde nun gefunden, daß eine spezielle
Schutzsubstanz notwendig ist, um die Zelle oder Organelle in ihrem Träger zu immobilisieren,
ohne ihre Funktion zu zerstören oder zu beeinträchtigen. Für Zellen und Organellen
speziell angepaßte Schutzsubstanzen sind bisher dazu verwendet worden, deren Funktion
aufrecht zu halten. Ihr Hauptzweck war es jedoch, die Suspension der Zellen oder
Organellen zu schützen und nicht, sie zu immobilisieren.
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Die erfindungsgemäß verwendete Schutz substanz schützt die Zelle oder
Organelle, während ein glasbildendes Monomer mit stabilem Unterkühlungsverhalten
bei tiefen Temperatur durch Bestrahlen mit Licht oderionisierender Strahlung zu
einem Polymer polymerisiert wird, in dem die Zelle oder Organelle immobilisiert
ist. Die Substanz schützt auch die immobilisierte Zelle oder Organelle während der
Lagerung des Polymers und bei ihrer Anwendung in bestimmten Reaktionen.
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Die Substanz muß so gewählt werden, daß sie beim Kontakt mit dem Monomer
oder Polymer, beim Unterkühlen oder Bestrahlen mit Licht oder ionisierender Strahlung
ihre gewünschte Funktion nicht verliert.
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Die'Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß eine Schutzsubstanz verwendet
werden muß, die diesen Anforderungen genügt.
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Dem Polymer mit der darin immobilisierten Zelle oder Organelle muß
eine Schutzsubstanz einverleibt werden, die selbst unter den erfindungsgemäß angewandten
Bedingungen ihre Funktion beibehält. In diesem Punkt unterscheidet sich die Erfindung
grundlegend von herkömmlichen Methoden zur Immobilisierung von Enzymen oder Mikroorganismen
und von derart immobilisierten Enzymen oder Mikroorganismen.
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Die erfindungsgemäß verwendeten Schutzsubstanzen sind synthetische
Polymere oder natürliche Polymere, die aus Tieren und Pflanzen extrahiert werden.
Der erstgenannte Typ ist eine flüssige oder feste Substanz mit einer Viskosität
von üblicherweise 10 bis 105 cP, die im Molekül zwei oder mehr mit Wasserstoff verbundene
Substituenten oder funktionelle Gruppen aufweist und als Lösung bei tiefen Temperaturen
leicht unterkühlt werden kann. Spezielle synthetische Polymere, die als Schutzsubstanzen
verwendet werden können, sind z.B. Polyäthylenglykol, Glycerin, Glycerinx xx diester,
Glycerinmonoester, Triacetin, Tributyrin, Triäthylenglykol, Diäthylenglykol, Propylenglykol,
Tetraäthylenglykol, Butandiol, Propandiol, Pentandiol, Hexandiol, Heptandiol, Polypropylenglykol,
Methoxypolyäthylenglykol, Äthoxypolyäthylenglykol, Triäthanolamin, Dipropylenglykol,
Äthylenglykolmonomethyläther, -äthyläther oder -n-butyläther und Tripropylenglykol.
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Spezielle Beispiele für natürliche Schutzsubstanzen sind Rinderserumalbumin,
D-Mannit, Gelatine, Agar, L-Ascorbinsäure, Sorbit, Glucose, Fructose, Galactose,
Mannose, Arabinose, Xylose, Raffinose, Stachyose, Dextrin, Inosit, Xylit, Erythrit,
Eieralbumin, L-Glutaminsäure, D-Glutaminsäure, Glutarsäure, DL-Noldrin, L-Glutamin,
L-Asparaginsäure, DL-Äpfelsäure, DL-Thioäpfelsäure, à-Ketoglutarsäure, L-Cysteinsäure,
L-Glutaminsäure-a-benzylester, N-Acetyl-L-glutaminsäure, DL-2-Pyrrolidon-5-carbonsäure,
Glycylglycin, Acetylglycin, L-Arginin, Benzoyl-L-arginin, Benzoyl-L-argininäthylester,
Nitro-L-arginin, L-Homoarginin, L-Alginsäure (a-Hydroxy-6-guanido-N-valeriansäure),
L-Canavanin, L-Lysin, L-Histidin, Guanidoessigsäure, DL-Threonin, L-Threonin, DL-Allothreonin,
L-Cerin, L-Allothreonin, D-Glucosamin, D-Gluconsäure, Methyl-D-glycosid, Saccharose,
Lactose, 6-Aminobuttersäure und L-Prolin.
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xx Glycerintributyrat
Bei Abkühlen auf niedrige Temperatur
zeigen die erfindungsgemäß verwendeten glasbildenden Monomere stabiles Unterkühlungsverhalten,
d.h. sie kristallisieren nicht, sondern bilden eine stabile unterkühlte Substanz,
wobei die Viskosität schnell zunimmt und beim Erreichen der Glasübergangstemperatur
Werte von bis zu 103 cP erreichen kann, so daß der Zustand als glasig oder amorph
bezeichnet werden kann. Diese Eigenschaften der glasbildenden Monomere haben verschiedene
Vorteile, von denen die folgenden drei für die Immobilisierung von Zellen und Organellen
von Bedeutung sind: 1) Da die Monomere bei niedriger Temperatur durch Bestrahlen
mit kleinen Dosen polymerisiert werden, können die Zellen und Organellen ohne größere
Schädigung oder Desaktivierung durch Wärme oder Strahlung immobilisiert werden;
2) Die unterkühlten Monomere stellen ein homogenes Dispersionsmedium dar, das als
Flüssigkeit bezeichnet werden kann, so daß die Zellen und Organellen leicht darin
eingeschlossen werden können. Außerdem haben die Monomere eine ähnliche Viskosität
wie eine Flüssigkeit, so daß die darin immobilisierten Zellen oder Organellen selbst
nach längerer Verwendungsdauer nicht voneinander getrennt sind; 3) Das unterkühlte
Monomer läßt sich durch Gießen oder andere Formverfahren leicht in verschiedene
Form bringen und kann als solche polymerisiert werden. Da das Monomer hochviskos
ist und schnell polymerisiert werden kann, läßt sich z.B.
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ein Polymerfilm mit darin immobilisierten Zellen oder Organellen
auf der Innenwand eines kleinen Kunststoffrohrs ausbilden, ohne daß Verstopfungen
oder Verlaufprobleme auftreten. Auch Polymerkapseln oder Feinteilchen können ausgebildet
werden, ohne daß es zu einer Koaleszenz oder Kohäsion der Einzelteilchen kommt.
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Glasbildende Monomere mit stabilem Unterkühlungsverhalten sind daher
für die Polymerisation bei tiefen Temperaturen am besten geeignet. Hochviskose Monomere
im unterkühlten Zustand
können nur durch Einwirken von Licht oder
ionisierender Strahlung wirksam polymerisiert werden und auch Zellen oder Organellen,
die bei Normaltemperatur sehr instabil sind, müssen durch schnelle Polymerisation
bei niedrigen Temperaturen immobilisiert worden. Die genannten Monomere sind daher
ideale Trägermaterialien zum Immobilisieren von Zellen oder Organellen.
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Erfindungsgemäß wird eine Dispersion der Zelle oder Organelle, des
glasbildenden Monomers oder eines entsprechenden Prepolymers und der Schutzsubstanz
auf niedrige Temperatur abgekühlt, gegebenenfalls in die gewünschte Dimension und
Form gebracht und bei niedrigen Temperaturen mit Licht oder ionisierender Strahlung
bestrahlt, um das Moromer zu einer Zusammensetzung zu polymerisieren, in der die
Zelle oder Organelle immobilisiert ist. Erfindungsgemäß kann die Zelle oder Organelle
in Wasser gelöst oder in Wasser oder einem geeigneten Lösungsmittel dispergiert
werden, bevor man sie mit dem Monomer vermischt. Alternativ kann man auch direkt
mit dem Monomer vermischen. Vorzugsweise verwendet man die Zelle oder Organelle
als Suspension in einem Puffer (pH 7 bis 8), der Saccharose, Trizma-Salz und Natriumchlorid
enthält. Das Abkühlen des Gemisches aus der Zelle oder Organelle und dem glasbildenden
Monomer hat den Zweck, die Viskosität des Monomers zu erhöhen und dadurch die Dispersion
zu stabilisieren. Das Gemisch kann in die gewünschte Form gebracht werden, z.B.
zu einer Folie gegossen, durch Eintropfen in ein geeignetes organisches Lösungsmittel,
in dem das Gemisch unlöslich ist, z.B. Hexanol, zu Feinteilchen verarbeitet oder
auf die Oberfläche eines Filmträgers oder die Innenwand eines Rohrs aus Polyäthylen
oder Polyvinylchlorid aufgetragen werden. Wegen der hohen Viskosität des Monomers
kommt es zu keinem Laufen der gegossenen Folie oder des Monomerüberzugs und auch
bei den Feinteilchen tritt keine Koaleszenz oder Kohäsion auf. Beim Bestrahlen mit
Licht oder ionisierender Strahlung polymerisiert das Monomer
schnell
zu einer festen Form, in der die Zelle oder Organe immobilisiert ist, ohne den Dispersionszustand,
den sie in dem Monomer hatte, zu stören.
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Die Schutzsubstanz kann der wäßrigen Lösung oder Suspension der Zelle
oder Organelle in der Form, in der sie mit dem glasbildenden Monomer vermischt wird,
oder aber auch dem Gemisch aus dem glasbildenden Monomer und der Zelle oder Organelle
unmittelbar vor der Polymerisation zugesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren
wird bei einer Temperatur von 0 bis -1960C, vorzugsweise -20 bis -1000C, durchgeführt.
Als Quellen für Licht und ionisierende Strahlung eignen sich z.B. sichtbare UV-Strahlen
aus Nieder- oder Hochdruck-Quecksilberdampflampen, Sonnenlicht, Licht, Röntgenstrahlen,
Gamma-Strahlen, Beta-Strahlen, Elektronenstrahlen und a-Strahlen, Mischstrahlung
aus chemischen Reaktoren und y-Strahlen aus verbrauchten Brennelementen oder Spaltprodukten.
Die Strahlungsdosis sollte auf einem Minimum gehalten werden, um eine Desaktivierung
der immobilisierten Zellen oder Organellen zu vermeiden. Um jedoch das gesamte Monomer
zu härten, muß die Gesamtstrahlendosis mindestens 5 1 x 10 R betragen. Das Monomer
muß daher mit ionisierender Strahlung in einer Dosis von 1 x 104 bis 1 x 109 R/h
bestrahlt werden, um eine Gesamtdosis von 1 x 104 bis 5 x 106R, vorzugsweise 1 x
105 bis 1 x 106 R, zu ergeben.
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Erfindungsgemäß werden das polymerisierbare glasbildende Monomer in
einer Menge von 5 bis 60 Gewichtsprozent, die Zelle oder Organelle in einer Menge
von 10 bis 60 Gewichtsprozent, die Schutzsubstanz in einer Menge von 1 bis 10 Gewichtsprozent
und der Puffer in einer Menge von 10 bis 60 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtgewicht
des erhaltenen Gemisches, verwendet.
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Das polymerisierbare glasbildende Monomer wird ausgewählt aus mindestens
einem Monomer der folgenden Gruppe (A), das
bei niedriger Temperatur
nicht kristallisiert, sondern eine stabile, unterkühlte Substanz bildet, oder aus
Monomeren der folgenden Gruppe (B), die selbst keine Unterkühlungseigenschaften
zeigen, sondern beim Vermischen mit Monomeren der Gruppe (A) in einer Menge von
5 bis 30 % ein Monomergemisch mit Unterkühlungseigenschaften ergeben.
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Gruppe (A): Hydroxyäthylmethacrylat, Hydroxyäthylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat,
Hydroxypropylacrylat, Hydroxybutylmethacrylat, Hydroxybutylacrylat, Hydroxypentylmethacrylat,
Hydroxypentylacrylat, Hydroxyhexylmethacrylat, Hydroxyhexylacrylat, Hydroxyheptylmethacrylat,
Hydroxyheptylacrylat, Glycidylmethacrylat, Glycidylacrylat, Diäthylenglykoldimethacrylat
(-diacrylat), Tetraäthylenglykoldimethacrylat (-diacrylat) Polyäthylenglykoldimethacrylat
(-diacrylat), Äthylenglykoldimethacrylat (-diacrylat), Propylenglykoldimethacrylat
(-diacrylat), Dipropylenglykoldimethacrylat (-diacrylat), Polypropylenglykoldimethacrylat
(-diacrylat), Butylenglykoldimethacrylat (-diacrylat), Pentandioldimethacrylat (-diacrylat),
Hexandioldimethacrylat (-diacrylat), Heptandioldimethacrylat (-diacrylat), Neopentylglykoldimethacrylat
(-diacrylat), Trimethyloläthantrimethacrylat (-triacrylat), Trimethylolpropantrimethacrylat
(-triacrylat), Glycerinmonomethacrylat (-monoacrylat), Glycerindimethacrylat (-diacrylat),
Glycerintrimethacrylat (-triacrylat), Diäthylaminoäthylmethacrylat, (-acrylat),
Diäthylaminobutylmethacrylat, (-acrylat), Dimethylaminoäthylmethacrylat (-acrylat),
Dimethylaminobutylmethacrylat (-acrylat), Benzylmethacrylat, Methoxypolyäthylenglykolmethacrylat
(-acrylat), Äthoxypolyäthylenglykolmethacrylat (-acrylat), Methoxypropylenglykolmethacrylat
(-acrylat)und Äthoxypropylenglykolmethacrylat (-acrylat) etc.
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Gruppe B: Vinylacetat, Vinylpropionat, Vinylbutyrat, Methylmethacrylat,
Methylacrylat, Äthylmethacrylat, Äthylacrylat, Propylmethacrylat, Propylacrylat,
Butylmethacrylat, Butylacrylat, Pentylmethacrylat, Pentylacrylat, Hexylmethacrylat,
Hexylacrylat, Laurylmethacrylat, Laurylacrylat, Stearylmethacrylat, Stearylacrylat,
Styrol, Vinyltoluol, sulfoniertes Styrol, Acrylsäure, Methacrylsäure, Aminostyrol,
Vinylpyrrolidon, Acrylamid, Methacrylamid, Methylenbisacrylamid, Methylolacrylamid,
Acrylnitril, Methacrylnitril, Diallylphthalat, Itaconsäure, Maleinsäure, Diallylisophthalat,
Diallylsuccinat, Diallylitaconat, Divinylbenzol und Triallylcyanurat etc.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
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In den Beispielen wird die Aktivität der immobilisierten Organellen
folgendermaßen bestimmt: 10 bis 200 ßl einer Zelle oder Organelle (suspendiert in
einem Puffer), die in einer 1 ml Absorptionszelle immobilisiert ist, werden mit
50 bis 20 mg einer frischen Zelle oder Organelle, die der immobilisierten entspricht,
0,2 Mol rotem Kaliumprussiat und 0,1 Mol Ammoniumchlcrid versetzt, worauf man das
Gemisch 3 Minuten Licht aus einem Projektor aussetzt und die Menge des gelösten
Sauerstoffs, der in der Absorptionszelle entsteht, mit einer Sauerstoffelektrode
bestimmt. In den Beispielen beziehen sich alle Prozente auf das Gewicht, sofern
nichts anderes angegeben ist.
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Beispiel 1 Immobilisierung von Leberzellen Leberzellen vom erwachsenen
Menschen (105 lebende Zellen/ml) werden in Eagle-Medium gezüchtet, das 10 % Kälberserum
enthält. 5 ml der Kolonie werden mit einem Gemisch aus 5 ml Polyäthylenglykol und
einer geringen Menge D-Mannit versetzt.
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Hierauf gibt man 5 ml einer einer Hanks'-Lösung zu, die 1 ml
Methoxypolyäthylenglykolmethacrylat
enthält. Das erhaltene Gemisch wird allmählich auf -78 0C abgekühlt und 5 Stunden
mit y-Strahlen von Kobalt 60 in einer Dosis von 1 x 105 R/h bestrahlt. Das feste
polymerisierte Produkt wird langsam auf 40C erwärmt und bei dieser Temperatur gelagert,
um den Effekt der Immobilisierung der Leberzellen zu prüfen. Die immobilisierten
Zellen behalten selbst nach 30tägiger Lagerung ihre Funktion. Lagert man dagegen
eine Lösung, die nicht modifizierte (nicht immobilisierte) Leberzellen enthält,
250 Stunden bei 40C, so verlieren die Zellen ihre Funktion.
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Nach dem vorstehenden Verfahren wird aus denselben Materialien ein
festes polymerisiertes Produkt mit darin immobilisierten Leberzellen hergestellt,
jedoch verwendet man die 5 ml Polyäthylenglykol nicht. Nach 1tägiger Lagerung bei
4 0C haben fast alle immobilisierten Leberzellen ihre Aktivität verloren.
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Beispiel 2 Immobilisierung von Erythrozyten Immobilisiert man Erythrozyten
bei diesen Temperaturen, so erfolgt eine Hämolyse, da das enthaltene Wasser zu Eis
gefriert und die Zellmembranen des Bluts sprengt. Vermischt man dagegen die Erythrozyten
allmählich mit einer gleichen Menge eines Gemisches aus Polyäthylenglykol (unter
Kühlen der Substanz mit relativ hoher Viskosität bei Raumtemperatur) und 5 bis 20
% Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Zuckern, so erhält man eine Mischung, die beim
Abkühlen keine Hämolyse zeigt. Dieses Gemisch wird mit 10 e 2-Hydroxyäthylacrylat
0 versetzt und nach dem Abkühlen auf -24°C mit einer Rate von 0 2 C/min mit 1 x
106 R y-Strahlen von Kobalt 60 bestrahlt.
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Hierbei entsteht ein festes Produkt mit darin immobilisierten Erythrozyten,
das sofort auf Raumtemperatur gebracht wird.
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Nach dem Entfernen von nicht umgesetztem Monomer durch mehrmaliges
Waschen mit Hanks-Lösung wird das Produkt bei 4 0C in
Hanks-Lösung
aufbewahrt. Die Erythrozyten in dem Produkt behalten ihre Aktivität (bestimmt als
Fähigkeit zur Sauerstoffabsorption) mehr als 20 Tage und die Aktivität nimmt auch
bei mehrmaliger Verwendung nicht ab. Eine nicht modifizierte Kontrollprobe verliert
die Fähigkeit zur Sauerstoffadsorption nach 2 oder 3 Tagen. Die immobilisierten
Erythrozyten haben somit eine längere Lebenszeit als die nicht-modtfizieren.
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Beispiel 3 Immobilisierung von Karottenkallus 5 g Karottenkallus
werden in 5 ml einer wäßrigen Lösung suspendiert, die 2,5 ml Diäthylenglykol und
30 % Methoxypolyäthylenglykolmethacrylat enthält. Die Dispersion wird allmählich
auf -5O0C abgekühlt und bei dieser Temperatur mit 5 6 x 10 RStrahlen von Kobalt
60 bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird eine bestimmte Zeit bei 4 0C
gelagert. Eine mehr als 12 Monate aufbewahrte Probe des Produkts wächst in einem
Kulturmedium. Dagegen verliert nicht-modifizierter Karottenkallus nach monatiger
Lagerung bei 4 0C seine Reproduktionsfähigkeit.
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Beispiel 4 Die immobilisierten Leberzellen von Beispiel 1 werden
bei 40C in drei verschiedenen Lösungen aufbewahrt: STN-Puffer, STN-Puffer, der 70
Volumenprozent Glycerin enthält, bzw. STN-Puffer, der 70 Volumenprozent Polyäthylenglykol
enthält. Beim Aufbewahren in einem Puffer, der eine viskose Substanz enthält, verlängert
sich die Lebenszeit der Leberzellen.
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Beispiel 5 5 Hundeleberzellen (105 Zellen/ml) werden in einem Eagle-Medium
gezüchtet, das 10 % Kälberserum und Hanks-Lösung enthält.
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5 ml der Kolonie werden mit einem Gemisch aus 5 ml Hanks-Lösung und
1 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat versetzt, worauf man das erhaltene Gemisch allmählich
auf -78 0C abkühlt und bei
dieser Temperatur 1 Stunde mit 5 x 105
R/h y-Strahlen von Kobalt 60 bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird 0
langsam auf 4 C erwärmt und bei dieser Temperatur gelagert, um den Effekt der Immobilisierung
zu prüfen. Die in dem Produkt immobilisierten Leberzellen behalten ihre Funktion
selbst nach 40tägiger Lagerung. Bewahrt man dagegen eine Lösung, die nicht modifizierte
Leberzellen enthält, 190 Stunden bei 40C auf, so verlieren die Zellen ihre Funktion.
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Beispiel 6 Mikrosomenkörnchen werden aus Rattenleberzellen mit einer
Zentrifuge abgetrennt. Die Körnchen werden mit einer geringen Menge Rinderserumalbumin
und D-Mannit versetzt, worauf man die Mikrosomen mit der gleichen Menge Hanks-Lösung
vermischt, die 20 % 2-Hydroxypropylmethacrylat enthält. Das erhaltene Gemisch wird
allmählich auf -78 0C abgekühlt und bei dieser Temperatur 10 Stunden mit 5 x 104R/h
y-Strahlen von Cäsium 137 bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird langsam
auf 4 0C erwärmt und bei dieser Temperatur gelagert, um den Effekt der Immobilisierung
zu prüfen. Die immobilisierten Mikrosomen behalten ihre Aktivität mehr als 30 Tage
bei. Bewahrt man sie bei Raumtemperatur auf, so bleiben sie mindestens 1 Woche aktiv.
Dagegen verliert eie SuspensIon von nicht modifizierten Mikrosomen ihre Aktivität
bereits nach 15 Stunden bei 40C bzw. nur 4 Stunden bei Raumtemperatur.
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Ein festes polymerisiertes Produkt mit darin immobilisierten Mikrosomen
wird auf die-selbe Weise aus denselben Materialien hergestellt, jedoch verwendet
man weder D-Mannit, noch Albumin. Die Mikrosomen haben nach 1 Stunde ihre Aktivität
vollständig verloren.
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Beispiel 7.
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1 g eines ribosomenhaltigen Niederschlags wird in einer Zentrifuge
(10,5000 x G) von Froschnierenzellen abgetrennt. Der
Niederschlag
wird mit 2 ml Hanks-Lösung versetzt, die eine geringe Menge D-Mannit enthält, worauf
man 0,5 ml Polyäthylenglykoldiacrylat zugibt und gründlich vermischt. Das Gemisch
wird allmählich auf -78 0C abgekühlt und bei dieser Temperatur mit 1 x 106 R Elektronenstrahlen
aus einem Resonanztransformatorbeschleuniger bestrahlt. Das feste polymerisierte
Produkt wird bei 4 0C bzw. Raumtemperatur gelagert, um den Effekt der Immobilisierung
zu prüfen. Nach 50 Tagen bei 40C bzw. 14 Tagen bei Raumtemperatur behält es seine
Aktivität bei. Dagegen verlieren nicht-modifizierGe Ribosomen nach 24 Stunden bei
4 0C bzw. 6 Stunden bei Raumtemperatur ihre Aktivität.
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Ein festes polymerisiertes Produkt mit darin immobilisierten Ribosomen
wird auf dieselbe Weise aus denselben Materialien hergestellt, jedoch verwendet
man keinen D-Mannit. Die immobilisierten Ribosomen verlieren nach 1 Stunde ihre
Aktivität.
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Beispiel 8 5 g Karottenkallus werden in 10 ml einer wäßrigen Lösung
dispergiert, die 2 g Mannit enthält, worauf man 2 ml Hydroxy-0 äthylacrylat zumischt.
Das Gemisch wird auf -30°C abgeschreckt und bei dieser Temperatur 120 Stunden mit
Licht aus einer Hochdruckquecksilberdampflampe bestrahlt. Das feste polymerisierte
Produkt wird mehr als 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert, wobei der immobilisierte
Kallus seine Aktivität beibehält und in einem herkömmlichen Agarmedium gezüchtet
werden kann. Bewahrt man dagegen einen nicht-modifizierten Rarottenkallus bei Raumtemperatur
auf, so verliert er seine Aktivität nach 20 Tagen und kann nicht einfach gezüchtet
werden.
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Beispiel 9 Ein als herkömmlicher Immobilisierungsträger zugesetztes
Monomer führt zu einer Hämolyse von Erythrozyten durch Sprengen der Zellmembran.
Versetzt man jedoch 2,5 ml Erythrozyten bei Raumtemperatur langsam mit einem Gemisch
aus 1,25 g Ascorbinsäure und 1,25 ml Hanks-Lösung und gibt dann zu der Lösung 0,5
ml Methoxypolyäthylenglykolmethacrylat, so erfolgt keine
Hämolyse.
Die Mischung wird mit einer Rate von 2 0C/min auf -24 0C abgekühlt und bei dieser
Temperatur mit 1 x 106 R y-Strahlen bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt
mit darin immobilisierten Erythrozyten wird auf Raumtemperatur gebracht und nach
dem Entfernen von nicht-umgesetztem Monomer durch mehrmaliges Auswaschen mit Hanks-Lösung
bei 4 0C in Hanks-Lösung aufbewahrt. Die Erythrozyten in dem Produkt behalten ihre
Aktivität (bestimmt als Fähigkeit zur Sauerstoffabsorption) mehr als 20 Tage und
die Aktivität nimmt auch bei mehrmaliger Verwendung nicht ab. Eine nicht modifizierte
Kontrollprobe verliert ihre Fähigkeit zur Sauerstoffabsorption nach 2 oder 3 Tagen.
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B e i s p i e 1 10 Zu einem STN-Puffer, der 0,4 Mol Saccharose, 0,01
Mol-Trizma-Base und 0,01 Mol Natriumchlorid enthält, werden 1,0 ml aus Spinat isolierte
Chloroplasten und 0,4 ml der folgenden drei Schutzmittel gegeben: STN-Puffer, der
10 % Rinderserumalbumin enthält, STN-Puffer, der 0,1 % D-Mannit enthält, bzw. STN-Puffer,
der 0,6 % Natrium-L-Ascorbat enthält. Jede der drei Zusammensetzungen wird mit 0,24
ml 0 a-Hydroxyäthylacrylat versetzt, worauf man sie bei -24°C mit 1 x 106 R y-Strahlen
von Kobalt 60 bestrahlt. Das feste polymerisierte Produkt wird gründlich mit STN-Puffer
gewaschen und in kleine Stücke zerbrochen, die bei 4 0C in einem Puffer aufbewahrt
werden, der 2,5 % Rinderserumalbumin und 0,01 % D-Mannit enthält. Die Lebensdauer
der in dem Polymer immobilisierten Chloroplasten ist viel länger als die von nicht
modifizierten, aus Spinat isolierten Chloroplasten, die nach 4 Tagen ihre Aktivität
verlieren. Der Vergleich der Aktivitäten von immobilisierten (Kurve B) bzw.
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nicht modifizierten (Kurve A) Chloroplasten ist in Fig. 1 gezeigt.
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B e i s p i e 1 11 Chloroplasten werden gemäß Beispiel 10 immobilisiert,
jedoch verwendet man Methoxypolyäthylenglykolmethacrylat anstelle von a-Hydroxyäthylacrylat.
Der Vergleich der Aktivitäten der immobilisierten (Kurve B) bzw. nicht modifizierten
(Kurve A) Chloroplasten nach der Aufbewahrung bei 4 0C ist in Fig. 2 gezeigt. Daraus
ist ersichtlich, daß sich die Lebensdauer der Chloroplasten durch die erfindungsgemäße
Immobilisierung verlängern läßt.
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