DE3032606A1

DE3032606A1 - Polysaccharidderivat der streptokinase, verfahren zu dessen herstellung und anwendung

Info

Publication number: DE3032606A1
Application number: DE19803032606
Authority: DE
Inventors: Jevgenij Ivanovi&ccaron; &Ccaron;azov; Boris Vasilevi&ccaron; Leningrad Moskvi&ccaron;; Vladimir Nikolaevi&ccaron; Smirnov; Igor Michajlovi&ccaron; Tere&scaron;ilin; Vladimir Petrovi&scaron; Moskva Tor&Ccaron;ilin
Original assignee: KARDIOLOG N TS AKAD MED V
Current assignee: KARDIOLOG N TS AKAD MED V
Priority date: 1979-08-30
Filing date: 1980-08-29
Publication date: 1981-03-19
Also published as: SU822551A1; DE3032606C2; SE449621B; SE8005990L

Description

Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die chemischpharmazeutische Industrie, insbesondere auf ein neues Poly saccharidderivat der Streptokinase, ein Verfahren zu dessen Herstellung und Anwendung. Das genannte neue Polysaccharidderitat der Streptokinase findet Verwendung als Wirkstoff eines Arzneimittels das eine thrombolytische Wirksamkeit besitzt, sowie für biologische Untersuchungen.
Zur Zeit ist eine Streptokinase bekannt, die in der Medizin als thrombolytisches Arzneimittel bei der Behandlung solcher Erkrankungen wie Myokardinfark, Thrombosen und Thromboembolien der Sungenarterien breit verwendet wird. Das Präparat wird intravenös währen einiger Tage eingeführt. Jedoch wird die Therapie mit Streptokinase durch zwei Umstände erschwert.
Erstens wird Streptokinase, ebenso wie alle Fermentpräparate, unter physiologischen Bedingungen unter Einwirkungen von pH, Temperatur endogenen Proteasen und Naturinhibitoren schnell inaktiviert und aus dem Blutstrom schnell entfernt, was zur Notwendigkeit fiihrt, hohe Fermentdosen während einer längeren Frist einzuführen. Zweitens stellt Streptokinase ein artfremdes Protein dar, das eine starke immunologische Reaktion des Organismus hervorruft. Ausserdem kann eine häufige oder wiederhoLte Anwendung der Streptokinase unerwünschte Nebenreaktionen bis an den anaphylaktischen Schock sogar bei deren ersten Anwendung auslösen.
Zur Zeit ist es bekannt, dass die Bindung der Fermente mit löslichen bioverträglichen Polymeren in vielen Fellen gestattet, Arzneimittel zu erhalten, die im Vergleich zu nativen Fermenten eine recht erhöhte Stabilität inbezug auf verschiedene inaktivierende Einwirkungen, eine verlangsamte Elimination aus dem Organismus und herabgesetzte antigene Eigenschaften besitzen.
Es sind Polysaccharidderivate der Streptokinase, insbesondere Streptokinasederivat mit dem mit Bromcyan aktivierten löslichen Dextran bekannt (US-PS Nr. 3639213, 1972).
Das Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen sieht die Aktivierung von Dextran mit einer hochtoxischen Verbindung, Bromzyan, vor. Deswegen ist die Verwendung der genannten Verbindungen zu medizinischen Zwecken unmöglich.
Ausserdem ist die Bioverträglichkeit solch eines Trägers problematisch, weil die dort vorhandenen Äktivgruppen der cycli schen Iminokarbonate durch eine hohe Reaktionsfähigkeit gekennzeichnet werden und mit anderen Proteinen des Organismus reagieren können.
Das erfindungsgemässe Polysaccharidderivat der Strepto kinase ist neu und wurde in der Literatur nicht beschrieben.
Der Erfindung wurde die Aufgabe zugrundegelegt, ein neues Polysaccharidderivat der Streptokinase, dRs zu medizinischen Zwecken verwendet werden kann, das eine thrombolytische Wirksamkeit, erhöhte Stabilität, herabgesetzte antigene Rigenschaften und erhöhte Zirkulationsdauer im Blutstrom besitzt, unter Verwendung eines Trägers zu entwickeln, der den medizinischen Forderungen entspricht und nach der Immobilisierung keine freien reaktionsfähigen Gruppen enthält, sowie ein Verfahren zur Herstellung von genanntem Streptokinasederivat mit einer einfacheren Technologie auszuarbeiten, die den Einsatz toxischer Reagentien ausschliesst.
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass das erfindungs gemässe Polysaccharidderivat der Streptokinase die folgende Formel atifweist: worin NH-Streptokinase native Streptokinase, X von 100 bis 1000 bedeuten, und das Protein in einer Menge von IO bis 20 Gew.% enthält.
Erfindungsgemäss besteht das Verfahren zur Herstellung des genannten Polysaccharidderivats der Streptokinase darin, duss man Streptokinase mit dem vorher oxydierten wasserlöslichen Dextran der allgemeinen Formel (C6H10O5) X, worin X von 100 bis 1000 bedeutet, bei einer Temperatur von 8 bis 30°C tind einem pH-Wert von 6,0 bis 10,5 umsetzt, anschliessend das erhaltene Produkt mit Natriumborhydrid reduziert und das Endprodukt isoliert. Das erhaltene Endprodukt stellt die mit dem oxydierten Dextran gebundene Streptokinase, dar. Der Oxyda tionsgrand von Dextran betragt von 5 bis 35 %. Die Bindung des Ferments mit dem oxydierten Dextran geht nach dem Bildungsmechanismus der Schiffschen Basen zwischen den Aldehydgruppen von Dextran und Aminogruppen des Ferments vor sich. Die Bindungsreaktion verläuft in der Lösung während 30 bis 120 Minu ten. Nach der Bindung mit dem Ferment werden nicht umgesetzte 130012/0788 Aldehydgruppen des Trägers in inerte Oxygruppen unter Binv/irlcung des Reduktionsmittels, Natriumborhydrid, leicht übergeffihrt. Das Endprodukt wird durch die lyophile Trocknung nach der Reduktion mit Natriumborhydrid und nach der Dialyse gegen Wasser während 18 bis 40 stunden bei einer Temperatur von 4 bis 7 °C zwecks der zusätzlichen Reinigung des Präparats isoliert. Das Molekulargewicht des erfindungsgemässen Polysaccharidderivats der Streptokinase beträgt 100000-300000, der Proteingehalt 10 bis 20 %, der Dextrangehalt 60 bis 80 %. Diese Verbindung besitzt eine thrombolytische Wirksamkeit, er höhte Stabilität, herabgesetzte antigene Eingenschaften und eine erhöhte Zirkulationsdauer im Organismus. Die erfindungsgemäse Yerbindung hält vollständig seine biologische Wirksamkeit laut den Angaben der Untersuchungen in vivo und in vitro aufrecht und besitzt eine ganze Reihe von Vorteilen im Vergleich zur nativen Streptokinase Die biologische Wirksamkeit und - die Toxizität der erfindungsgemäsen Verbindung wurden im Tierversuch untersucht. Die Untersuchung wurde an mannlichen Kaninchen der Chinchilla-Rasse von 2,2 bis 2,5 kg Körpergewicht und an nicht reinrassigen Hunden von 12 bis 13 kg KGrpergewicht durchgeführt.
Ausgehend von der vermutlichen prolongierten fibrinolytischein Wirkung des erfindungsgemäßen Streptokinasederivats wurde die zu untersuchende Praparatdosis, 30000 bis 240000 IE/kg Körpergewicht, in der physiologischen Lösung für Kaninchen in 20 bis 30 ml, für Hunde in 50 bis IOO ml gelöst und mit einer Spritze während 20 Minuten intravenös strahlartig eingeführt.
Die Einführung des Versuchs- (und Kontroll-) präparats begann man eine Stunde nach der Thrombendildung. Das Präparat wurde den aninchen in die Vene an der Seite der Thrombenbildung in der Drosselvene, den Hunden - in die Vene der hinteren PBote injiziert.
Die Blutanalyse wurde vor dem Beginn des Versuchs,2 Stunden 3 Stunden und 1, 2, 3 Tage nach der Thrombenbildung unter~ nommen. FSr jede Serie der Blutanalysen des Tiers wurden 10 bis 12 ml Blut aus den unbeschädigten Venen genommen Der Blutverlust wurde durch die Einführung der gleichen Menge der sterilen physiologischen Lösung kompensiert. Die Dynamik der Thrombendildung und Thrombolyse wurde im laufe der ersten 6 Stunden des Versuchs und nach 1, 2 und 3 Tagen visuell und manuell beobachtet. Die Ängiographie und Fluometrie wurden vor dem Beginn des Versuchs, nach 1, 2 und 3 Tagen, durchgeführt. Nach Beendigung des Versuchs wurden die Tiere getötet. Danach wurden für die histologische Untersuchung die Stückchen der Blutgefässe in den Stellen der Thrombenfixation genommen. Die Prüfergebnisse haben ergeben, dass die erfindungsgemässe Verbindung eine prolongierte Wirkung besitzt.
Die thrombolytische Wirksamkeit der erfindungsgemässen Verbindung wurde am Modell der Thromben der Oberschenkelschlagadern und -venen der Hunde und der Drosselvene des Kaninchens untersucht (Tabelle 1).
Tabelle 1 Versuchs Benennung des Prä- Zahl Zahl der Unter- Räufiggruppen parats der Be- suchungsmetho- keit der der obach- der für jedes Anwendung Tiere tungen Tier jeder Untersuch.
methode 1 2 3 4 1. Untersuchung am Modell des Thrombus der Drosselvene eines Kaninchens Kontrolle - 5 2-3 1-3 Versuch I native Streptoki- 3 14-15 4-6 nase Versuch II das erfindungs- IO 14-15 2-6 gemässe Streptokinasederivat 2. Untersuchungen am Modell des Thrombus der Oberschenkelvene eines Hundes Kontrolle - 2 2-3 1-3 Versuch 1 native Streptoki- 1 15 1-6 nase Versuch II das erfindungsge- 2 15 1-6 mässe Streptokinasederivat 3. Untersuchung am Modell des Thrombus der Oberschenkelschlagader eines Hundes Kontrolle - 2 2-3 1-3 Versuch 1 native Streptoki- 1 15 1-6 nase Versuch II das erfindungsge- 2 15 1-6 mässe Streptokinasederivat Die an Stunden erhaltenen Ergebnisse bestätigten die Gesetzmässigkeiten der an Kaninchen festgestellten thrombolytischen Therapie.
Zur Untersuchung der thrombolytischen Wirksamkeit der nativen Streptokinase und des erfindungsgemässen Streptokinasederivats werden die Präparate nach der Methode der einmaligen intravenösen strahlartigen Infusion während 20 Minuten eingeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angeführt.
Tabelle 2 Charakteristik Versuchsprä- Thrombenloka- Präparat- Effektider Tiergruppe parat lisation dosis in vität IE/kg der fib-Körper- rinolytigewicht schen Therapie 1 2 3 4 5 Kontrolle - Drosselvene - keine des Kaninchens -"- - -"--"- - -"-Vene des - -"-Hundes Arterie des Hundes Versuch I native Drosselvene 50.000 keine Strepto- des Eaninkinase chens -"- 50.000 vollständige Lyse -"- 75.000 -"--"- 85.000 -"- (Fortsetzung der Tabelle 2) 1 2 2 3 4 5 Drosselvene 85.000 Volldes Kanin- ständige Lyse chens -"- 100.000 -"- 100.000 Vene des 70.000 voll-Hundes standige Lyse Arterie 70.000 volldes Hundes ständige Lyse Versuch II das erfin- Drosselvene 40.000 keine dungsgemäse des Kanin Streptokina- chens sederivat - T1 - 50,000 vollständige lyse » - 50.000 keine - 50.000 vollständige lyse -"- 100.000 vollständige Lyse r " - 100.000 keine -"- 125.000 vollständige Lyse -"- 210.000 -"--"- 240.000 -"-Vene des 55.000 keine Lyse Hundes -"- 70.000 vollständige Lyse Arterie des 55.000 keine Lyse Hundes -"- 70.000 vollständige lyse Aus den erhaltenen Daten folgt also, dass die minimale therapeutische Dosis des erfindungsgemassen Streptokinasederivats 50.000 IE/kg, die optimale - über 100.000 IE/kg be trägt, und die thrombolythische Wirksamkeit der nativen Streptokinase und des erfindungsgemässen Streptokinasederivats diegleiche ist.
Es wurden die Veränderungen des Blutgerinnungs- und des fibrinolytischen Blutsystems untersucht, Es wurde die Zeit der Plasmarekalzifikation nach der Einführung den Versuchs tieren des erfindungsgemäss vorgeschlagenen Streptokinasederivats oder der nativen Streptokinase gemessen (in sec).
Es wurde festgestellt, dass bei der Einführung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats die Zeit der Plasmarekalzifikation wesentlich erhöht wird.
Ausserdem wurde die Fibrinogenkonzentration bei den Versuchstieren in mg% nach G.A. Ruthberg durch das Wägen des bei der Rekalzifikation des Zitratplasmas gebildeten lufttrockenen Fibrinpfropfens bestimmt.
Es Wurde Sestgestellt, dass die Fibrinogenkonzentration im Blutplasma der Xaninchen in den ersten Stunden nach der Einführung der Streptokinasepräparate stark herabgesetzt wird.
Nach 24 Stunden erreicht die Fibrinogenkonzentration den Ausgangswert oder übersteigt diesen. Bei den Tieren, bei welchen die Thrombolyse nach der Einführung der immobilisierten Streptokinase stattfand, wuchs die Fibrinogenkonzentration nach 24 Stunden in geringerem Masse, als bei den Tieren an,bei denen die Thrombolyse nicht stattfand Bei Hunden sank stark die Fibrinogenkonzentration 2 Stunden nach der Einführung der Ver s1lchspräpatate und erreichte die Norm nach 24 Stunden, nachher stieg diese an.
Neben der Erhöhung der Zeit der Plasmarekalzifikation und der Herabsetzung der Fibrinogenkonzentration 2 bis 3 Stunden nach der Einführung der Praparate wurde auch die Verkürzung der Zeit der Lyse der Euglobulinplasmafraktion nachgewissen, die nach Kovarik bestimmt wird.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angeführt.

Tabelle 3

Menge Vor dem Zeit der Untersuchung

der Tiere Präparat Versuch nach der Präparatein-

fhrung

1<'

N

rd (1>

o r

1 2 3 4 5 6 7

4 Kaninchen das erfindung 4 St. 13 min 4 St.

gemässe Streu"

fokinasederivat

(nrombolyseeS-

fett)

4 Kaninchen das erfindung 4 St. 4 St. 4 St.

gemässe

Streptokinase~

derivat (ohne

Effekt der

Tärombolys e)

2 Hunde das erfindungs- 47-65 50-55, 60-75 85-60 120

gemässe St;repto- mln 35-40 mui min min

krnasederivat min

(Effekt der

Ghrombolyse)

4 Kaninchen native Strepto~ 4 St. 27 min 4 St.

kinase (Effekt

der Thrombolyse)

2 Kaninchen native Strepto 4 St 4 St. 4 St.

kinase (ohne

Effekt der

Thrombolyse) 13001 2/O79

(Fortsetzung der Tabelle 3) 1 2 3 4 5 6 1 Hund native Strepto- 84 min 64 min 90 min - -kinase (Effekt der Thrombolyse) Die erhaltenen Angaben zeugen von der Verstärkung der flbrinoly1;ischen Blutak*ivität.

Die Veränderung der Lyse der Euglobulinplasmafraktion bei Kaninchen nach der Einführung der Versuchs- und Kontrollmuster der Streptokinase wurden so deutlich ausgeprägt, dass der Pfropfen aus der Euglobulinplasmafraktion momentan lysierte. Die Wiederherstellung der thrombolytischen Blutaktivität bis zum Ausgangswert ist nach 24 Stunden nach der Präparateinführung vollendet. Vor dem Versuch ging die Thrombolyse des Euglobulinpfropfens mindestens für 4 Stunden vor sich. Manchmal wurde keine lyse sogar nach 24 Stunden nachgewiesen. Jedoch ging die Lyse im Blutplasma, das 2 Stunden nach der Praparateinführung genommen wurde, sehr schnell vor sich; dabei wurde bei Kaninchen eine deutliche Gesetzmässigkeit beobachtet ~ wenn die Pfropfenlyse nicht beschleunigt wurde, fand die Thrombolyse in der Regel statt-e Die Veränderung der Lyse der Buglabulinblutfraktion ei Hunden ist nicht so wesentlich, wie bei Kani'nchen, und erreicht die Norm in .24 Stunden üm die Veränderungen des fibrinolytischen und des Blutgerinntingssysteas bei Kaninchen je nach der Einführung der native ten Streptokinase und des erfindungsgemässen Streptokinasedervats zu klären, wurden thrombenelastographische Untersuchungen (TEG) an einen Thrombenelastographen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angeführt.

Tabelle 4

Tiergruppen Tier- Untersu- r (in nin)

menge chungszeit Durch- Schwan-

schnitts- kungs-

daten bereich

1 5 Unersuchungs 26 14-15

M beginn

43

5 Q, 5 nar=h 2 Stunden 26 13-61

4r S

4 na' 1 Tage 52

:

0

m k

nah ruf

$

3 v 3 nah 5 Tagen 63 55-68

Q H

m rf

3 3 Untersuchungs~ 24 12-40

ç h S beginn

ka>

a>d n

O CD 3 nach 2 Stunden 27 18-42

r a)

d n ffi« 3 nach 1 Tag 39 20-50

oP

4 Untersuchungs- 21 15-30

beginn

o

4 > 4 nach 2 Stunden 23 10-33

k 0

EI

0

o zu°h 4 nach 1 Tag 36 10-72

>CD

Co

43. 43 3 nach 2 Tagen 20 16-25

Tabelle 4.

k (in mm) ma (in mm) c.i.
Durch- Schwan- Durch- Schwan- Durch- Schwanschnitts- kungs- schnitts- dungs- schnitts- kungsdaten bereich daten bereich daten bereich 27 21-48 47 33-63 1,O 0,5-1,3 35 14-60 im 33 9-48 0,9 0,3-1,7 im 1. Versuch 1. Versuch k=260 0,01 41 36-48 38 29-44 0,4 0,3-0,6 78 45-118 41 28-55 0,3 0,1-0,4 75 59-92 im 40 34-47 0,3 0,2-0,4 im 1.Versuch 1.Versuch k=260 c.i.0,01 17 9-23 57 53-61 1,7 1,0-2,9 41 18-60 36 23-59 0,6 0,3-1,0 22 21-22 56 50-60 1,0 0,8-1,2 39 12-92 50 23-65 1,2 0,3-1,8 50 49-52 in 17 IO-27 0,3 0,7-0,5 in -2 Versuchen 2 Versuch k=260 ci. 0,01 84 40-123 30 22-47 0,2 16 12-20 55 40-62 1,5 0,9-1,7 Anmerkung: wenn "k"=260 ist, so bedeutet es, dass während 30 min die Breite der thromboelastographischen Zweige 20 mm nicht erreicht, d. h. es wird Hypokoaguation beobachtet (die Geschwindigkeit des Bandziehens beträgt 8,7 mm pro 1 min). In diesem Fall betragt c.i weniger als 0,01, d.h. die Gerinnung ist stark verlangsamt.
Die angeführten Daten zeigen, dass bei den Kaninchen, bei denen die Thrombolyse nach der Einführung der erfindungsgemässen Streptokinasederivats stattfand, wesentliche Veränderungen der TEG-Indexe nur nach 24 Stunden nachgewiesen wurden (die Verlängerung von "r", die der unsichtbaren Ge rinnung entspricht, und die Verlangerung von "k", die den Beginn der Bildung des Fibrinpfropfens kennzeichnet). Die Verlängerung der Zeit dieser zwei Werte zeugt von der Hypokoagulation. Es verminderte sich die Amplitude "ma"m die von der Herabsetzung der Viskosität des geronnenen Bluts zeugt. Der Koagulationsindex (c.i) sinkt auch wesentlich nur nach 24 Stunden (um 70 % vom Äusgangswert).
Bei der Einführung der nativen Streptokinase wurden die meisten Veränderungen der TEG-Indexe schon 2 Stunden nach der Einführung des Präparats beobschtet. Der Koaguationsindex sank um 75 % und nach 2 Tagen erreichten die TEG-Indexe die Norm. Bei der Einführung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats blieben die TEG-Indexe bis 5 Tage nach der Präparateinführung stark verandert, d.h. es wurde die Wirkungsprolongation des erfindungsgemässen Streptokinasederivats im Vergleich zur nativen Streptokinase beobachtet. Bei Tieren, bei welchen keine Thrombolyse nach der Einführung des erfindungsgemäßen Streptokinasederivats stattfand, erreichten die TEG-Indexe, die sich 2 Stunden nach der Praparateinf\:ihrung verandert hatten, nach 24 Stunden praktisch die Norm; Nach den Angaben der Koagulographenaufnahme wurde eine scharfe Verlangsamung der Zeit der Gerinnung 2 Stunden und 24 Stunden nach der Einfuhrung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats nachgewiesen. Nach 2 Tagen erreichte die Gerinnungszeit den Normwert. Im Falle der. Einführung den Versuchstieren derselben Dosis der nativen Streptokinase wurde die Gerinnungszeit schon zu Ende der ersten 24 Spunden bis zum Ausgangswert beschleunigt.
In den Versuchen, wo den Kaninchen eine hohe Dosis des erfindungsgemässen Streptokinasederivats (über 100.000 IE/kgg Körpergewicht) eingefiihrt wurde, wurde fast nach allen Testen die Prolongation der Präparatwirkung bis 3 Tage festgestellt.
Dabei wurde am Thromboelastogramm eine scharfe Verlangerung der Gerinnungszeit, eine Verminderung der Fläche der TEG-Zweige und eine Senkung des Gerinnungsindexes bestimmt. Die Prolongation der Wirkung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats im Laufe von 2 bis 3 Tagen wurde auch durch die Angaben des Koagulogramms bestätigt, d.h. die Verlängerung der Zeit der Plasmarekalzifikation und die Senkung der Aktivität des FGF (fibringerinnender Faktor), Plasmatoleranz gegen Heparin.
Bei der Durchführung ähnlicher Untersuchungen an Hunden erreichte der Thrombotest die Norm nach 24 Stunden (Veränderung der TEG-Indexe, Verlangerung von "rtt und "kt', Verminderung der Amplitude "ma", Senkung des Koagulationsindexes "c.i" um 70 % vom Äusgangswert).
Die Toxizität des erfindungsgemässen Streptokinasederivats wurde im akuten Versuch an weissen Mäusen und Kaninchen untersucht. In den Versuchen an Mäusen CWP von 18 bis 20 g Körpergewicht wurden die native Streptokinase, das erfindungsgemässe Streptokinasederivat und das oxydierte Dextran, das die Matrize des erfindungsgemässen Präparats darstellt, intravenös in Form von wässrigen Lösunggen in einer Menge von 0,5 ml eingeführt. Die Tiere wurden während 7 Tage beobachtet.
Es wurde festgestellt, dass die einiallge Einführung der nativen Streptokinase in Dosen von 1 g/kg, des erfindungsgemässen Streptokinasederivats und des oxydierten Dextrans in Dosen bis 2 g/kg kein Sterben der Mäuse hervorruft und deren Verhalten und Aussehen nicht beeinflusst. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Die erhaltenen Ergebnisse gestatten zu behaupten, dass die beiden Präparate bei der einmaligen intravenösen Einfdlirung den Mäusen in Dosen, die die therapeutischen Maximaldosen um 50 bis 100mal übersteigen, von den Tieren gut vertragen werden und dass das erfindungsgemässe Streptokinasederivat keine höhere Toxizität als die native Streptokinase besitzt.
Tabelle 5 Zahl der ein gegangenen (Zähler) und der überlebenden (Nenner) Mäuse bei der intravenösen Einführung der untersuchten Präparate Präparat Aktivi- Dosen (mg/kg) und Ergebnisse Seriennummer tät der Bestimmungen IE/mg 250 500 750 100 2000 native Streptokinase 12500 0,6 0/6 0/6 0/6 0/6 das erfindungsge- 5250 0/6 0/6 0/6 0/6 zu 0/6 mässe Streptokinas ederiv at das erfindungsge- 5000 0,6 0/6 0/6 0/6 0/6 masse Streptokina sederivat das oxydierte Dextran 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 Das erfindungsgemässe Streptokinasederivat wurde auch von Kaninchen gut vertragen. Die intravenöse Einführung des Präparats in Dosen von 50 und 100 Tausend IE/kg wurde durch keine Äusserungen der toxischen Wirkung begleitet, ausgenommen eine unbedeutende Erhöhung der fibrionolytischen Elutaktivität.
Nach der Einführung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats in einer Dosis von 200 Tausend IE/kg wurde eine etwas ausgeprägtere Fibrinolyse beobachtet, aber auch diese Präparatdosis beeinflusste keinesfalls den Zustand der Tiere.
Allergene Eigenschaften des erfindungsgemässen Streptokinasederivate wurden an Meerschweinchen untersucht.
Um die anaphylaktogene Aktivität des erfindungsgemässen Streptokinasederivate zu bestimmen, wurden die Meerschweinchen einmalig mit den Dosen von 0,1, 0,5, o13 und 0,05 und 0,005mg Protein/kg immunisiert, was, bezogen auf die Aktivität, 31000, 15500, 4200, 1700 und 155 IE/kg beträgt, Die Ergebnisse die-.
ser Untersuchungen, sowie deren Vergleich zu den Daten mit der nativen Streptokinase und anderen Fermenten, die die thrombolytische Wirksamkeit besitzen, sind in Tabelle 6 angeführt.
Tabelle 6 Anaphylaktogene Eingeschaften des erfindungsgemässen Streptokinasederivats, der nativen Streptokinase und der thromboiytischen Mikrobenproteinasen Sensibilisierende Anaphylaktische Indexe der Fermente Dosis Streptokinasen ing Protein lE kg kg native Strep- das er- @oly tokinase findungs- tin gemässe Streptokinasederivat 1 2 3 4 5 6 1,0 31000 0,3 0,3 - -0,5 15500 0 0 1,8 2,3 (Fortsetzung der Tabelle 6) 1 2 3 4 5 6 0,13 4200 0 0 - -0,C5 1550 ° ° 1,0 1,4 0,005 155 0 0 1,3 2,0 Anmerkung: "-" wurde nicht bestimmt, 0 - die anaphylaktische Reaktion fehlt. Unterstrichen sind die Dosen, die der maximalen, der therapeutischen (summarisch) = =1,85 Mill. IE entsprechen, 250 Tausend lE und die minimale therapeutische Ausgangsdosis.
Wie die Untersuchungen ergeben haben, besitzt das erfindungsgemässe Streptokinasederivat praktisch keine anaphylaktogene Wirksamkeit besonders im Vergleich zu solchen Fermenten wie Terrilytin und Hygrolytin.
Die hautsensibilisierende Aktivität des erfindungsge mässen Streptokinasederivats wurde an Meerschweinchen und Kaninchen untersucht. Jeder Versuch schloss 3 Tiergruppen zu 5 bis 6 Tiere ein, denen die Präparate einmalig in Dosen von 31000, 4200 und 1700 IE/kgg eingefiihr't wurden. Die Hautreaktionen wurden nach 3 und 24 Stunden geschätzt, In allen Versuchen wurden negative Ergebnisse erzielt.
Die erhaltenen Ergebnisse zeugen davon, dass das erfindungsgemässe Streptokinasederivat im untersuchten Dosisdiapason praktisch keine nautsensibilisierede Aktivität aufweist, was mit den Angaben der systemischen Anaphylaxie (AA) und den Ergebnissen der Durchführung der passiven Hautanaphylaxie (PHa) übereinstimmt.
Somit kann man anhand der Untersuchung der anaphylaktogenen und hautsensibilisierenden Eingenschaften des er9indungsgemässen Streptokinasederivats schliessen, dass das Ferment ein unbedeutendes allergisierendes Potential für Labortiersebesitzt.
Es wurde die Modellierung der Bedingungen der Verwendung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats im sensibilisier ten Organismus durchgeführt.
Es ist gut bekannt, dass im Laufe seines Lebens der Mensch mehrmals mit Erregern der Streptokokkusinfektionen zusammenstößt.Im Ergebnis solch eines Kontaktes wird bei vielen Menschen ein erhöhter Gehalt an Antistreptokinaseantikörpern beobachtet. Im Zusammenhang damit war es notwendig, den Einfluss der vorangegangenen Sensibilisierung gegen das native Ferment auf die immune Antwort gegen die modifizierte Form zu klaren. Die Versuche wurden an Mäusen, Meerschweinchen und Kaninchen vorgenommen. Um den Antistreptokinasehintergrund zu schaffen, wurden die Tiere durch die einmalige intravenöse Einführung der nativen Streptokinase in einer Dosis von 0,77 mg Protein/kg immunisiert. Nach 3 Wochen wurde diesen Tieren das modifizierte Ferment in 3 vermutlichen therapeutischen Dosen eingefiihrt (Tabelle 7).
Tabelle 7 Immune Antwort gegen das erfindungsgemässe Streptokinasederivat bei den mit dem nativen Ferment immunisierten Kaninchen Dosis des erfindungsge- Durchschnittliche geometrische massen Streptokinasederi Antikörpertiter in der Zeit (Tage) vats IE/kg mg Protein/kg 7 15 A. Ohne vorherige Immunisation mit der nativen Streptokinase 1700 0,05 3,2 3,2 4200 0,13 3,0 2,2 33000 1,0 2,6 3,0 Ba Nach der vorherigen Immunisation mit der nativen Streptokinase 1700 0,05 2,0 3,0 4200 0,13 2,0 2,2 33000 1,0 2,8 2,8 Wie aus den dargestellten Daten zu ersehen ist, veränderte die vorherige Immunisation mit dem nativen Ferment die immune Antwort gegen das erfindungsgemässe Streptokinase derviat. Die AntikörpErtiter in beiden Gruppen unterscheiden sich praktisch nicht. Noch mehr, praktisch wird keine Ubersteigung der Antikörpertiter über den Antikörpertiter der normalen Tiere nachgewissen. ähnliche Ergebnisse, die zeigen, dass die vorläufige Immunisation die immune Antwort gegen die modifizierte Form nicht verandert, sondern verstärkt, wurden in den Versuchen an Mäusen erhalten. Es ist wichtig zu betonen, dass bei Kaninchen oder Mäusen keine minimalen Merkmale der anaphylaktischen Reaktion beobachtet werden.
In den versuchen an Meerschweinchen wurde der Einfluss der vorherigen Immunisation nach der Methode der aktiven systemischen Anaphylaxie eingeschätzt. Es wurde festgestellt, das die Durchführung der antigenen Provokation mit dem erfindunggsgemässen Streptokinasederivat bei den Tieren, die früher das Präparat der nativen Streptokinase erhielten, zu keiner merklichen Schockreaktion führte.
Es wurde festgestellt, dass die vorherige Einführung des nativen Ferments bei den Versuchstieren die immune An>-wort gegen das erfindungsgemässe Streptokinasederivat nicht verstärkt.
Das Ausbleiben der ausgeprägten humoralen Antwort gegen das erfindungsgemässe Streptokinasederivat, das volle Ausbleiben oder eine schwache Äusserung der anaphylaktogenen und hautsensibilisierenden Aktivität in den von uns untersuchten Dosen zeugt davon, dass das allergisierende Potential des Präparats nicht hoch ist0 Die Antigeneigenschaften des Streptokinasederivats nach der Erfindung wurden in den Versuchen zur Plasmaerschöpfung untersucht. Dazu wurde in die Glasröhrchen solch eine Menge des Präparates der nativen Streptokinase eingetragen, die die Äntistreptokinaseantikorper vollstandig bindet und deswegen geht keine I«se des kunstlichen Thrombus vor sich. Weiter wurden verschiedene Mengen des erfindungsgemässen Streptokinasederivats und des Thrombins zugegeben.
Es erwies sich, dass zum Erhalten der Pfropfenlyse diegleiche-(nicht abir die gerIngere) Menge des erfindungsgemässen Streptokinasederivats wie in den Proben erforderlich ist, wo das native Ferment vorher nicht zugegeben wurde Wenn anfangs das erfindungsgemässe Streptokinasederivat zugegeben wird, ist es zur Offenbarung der katalytischen Aktivität notwendig, diegleiche Menge des nativen Ferments die in den Versuchen ohne Erschöpfung hinzuzufügen. Somit zeigen die erhaltenen Ergebnisse, dass das erfindungsgemäß Vorgeschlage ne Streptokinasederivat mit den Antikörpern des M£.nschen zusammenwirkt.
Die Untersuchung des Einflusses des Blutplasmas der Kaninchen auf die Aktivität der nativen Streptokinase und des Streptokinasederivats nach der Erfindung zeigte auch keine ausgeprägte Wechselwirkung der Antikörper m:% Enzymen.
Die Plasmaproben erhielt man in den Versuchen von den mit verschiedenen Dosen der Präparate der nativen Streptokinase und des erfindungsgemässen Streptokinasederiv at 5 immur i si ert en Tieren. Die Ergebnisse der Bestimmungen sind iii Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8 Resistenz des Blutplasmas der Kaninchen gegen die native Streptokinase und das erfindungsgemässe Streptokinasederiv at Immunisieren- Fermentmenge (IE), Verhalten der Antikörde Dosis, die mit 1 ml Plasma Mengen des er- pertiter IE/kg gebunden wird findungsgemässen native das erfindungs- Streptokinase-Strep- gemässe derivats zur netiven Streptotokinase Strepto- kinase, die mit kinasederi- 1 1 ml Plasma gevat bunden werden 1 2 3 4 5 1. Immunisation mit dem nativen Ferment 31000 12 192 16 16 4200 6 48 8 8 (Fortsetzung der Tabelle 8) 1 2 3 4 5 4200 3 48 16 16 4200 6 96 16 8 1700 6 144 24 16 1700 12 - 144 12 16 1700 12 192 16 16 2. Immunisation mit dem erfindungsgemässen Streptokinasederiv at 31000 6 96 16 8 31000 3 48 16 2 31000 6 96 16 4 4200 3 48 16 4 4200 9 48 5,3 2 4200 15 240 16 4 4200 6 96 16 4 Die in Tabelle 8 gezeigten Antikörpertiter wurden in der Reaktion der indirekten Hämagglutination bestimmt> Die entsprechen den Maximalverdünnungen der Blutseren, die mit dem homologen Testantikörper reagieren.
Somit zeigten die durchführten Untersuchungen folgendes 1. Die effektive Minimaldosis des erfindungsgemäss vorgeschlagenen streptokinasederivats beträgt 50.000 IE/kg Körpergewicht. Die Thrombolyse beginnt erste anderthalb Stunden nach der Infusion und nach 24 Stunden wird die Durchgängigkeit der Blutgefässe völlig wiederhergestellt.
2. Die Normalisierung der durch die Einführung des erfindungsgemässen Streptokinasederiv at s erzeugten Veränderungen des Butgerinnungssystems tritt bei den Versuchstieren am 2; bis 3. Tag ein, was von der Verlängerung der fibrinolytischein Aktivität des Präparats um das 2 bis 3fache im Vergleich zur nativen Streptokinase zeugt. Die Prolongation des Fibrinolyseeffekts beim erfindungsgemässen Streptokinasederivats erhöht sich mit der Erhöhung der Präparatdosis.
3. Das Streptokinasederivat nach der Erfindung besitzt eine geringe Toxizität. Die intravenöse Einfuhrng des Präparats in Dosen, die die therapeutischen Maximaldo,en um 50 bis 100mal übersteigen, wird von den Tieren gut vertragen.
4. Das allergisierende Potential des erfindungsgemässen Streptokinasederivates ist nicht hoch, weil bei der Untersuchung an Meerschweinchen die anaphylaktogene und hautsensibilisierende Aktivität praktisch ausblieb.
5. Die antigene Aktivität des erfindungsgemäss Streptokinssederivats ist im Vergleich zur nativen Streptokinase herabgesetzt Erfindungsgemäss stellt das erfindungsgemäss vorgeschlagene Polysaccharidderivat der Streptokinase den Wirkstoff -des Präparats dar, das eine thromboiytische Wirksamkeit besitzt. Das erfindungsgemasse ArZneimittel wird in Injektionsform verwendet. Es enthält den Wirkstoff in einer Menge von 150000 IE in 1 ml. Als pharmazeutisches Losungsmittel enthält das Präparat vorzugsweise bidestilliertes Wasser oder eine physiologische Lösung, Das Präparat wird zur Behandlung akuter Thromboembolien und Thrombosen der Lungenartierien, Gehirngefässen, peripheren Arterie (bevor sich Gangrane entwickelt hat), bei Thrombophlebitis, Thrombose der peripheren Venen, beim akuten Myokardinfarkt, bei Thrombose der Zentralvene oder der Arterie der Augennetzhaut verwandt.
Das erfindungsgemässe Präparat wird einmalig in einer Dosis von 3.000.000 IE in 20 ml physiologischer Lösung intravenös während 30 Minuten bis a Stunde verwendet. Die Wirkung des Präparats hält während 2 bis 3 Tage an. Das Praparat hat keine Kontraindikationen und ruft keine Nebenerscheinungen hervor Das Präparat nach der Erfindung ermöglichts die vieltägigen intravenösen Tropfenverfahren zur Einführung durch das einmalige intravenöse strahlartige Verfahren zu ersetzen, die Kurdosis zu reduzieren und dadurch die Komplikationsmenge herabzusetzen und die Effektivität der thrombolytischen Therapie zu erhöhen.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden folgennle Beispiele der Verwirklichung des Verfahrens zur Herstellung des Polysaccharidderivats der Streptokinase angeführt.
Beispiel 1 Man löst 2 g Dextran mit einem Molekulargewicht von 35000 bis 50000 in 40 ml destilliertem Wasser und gibt 1,226 g Kaliumperjodat zu. Man fuhrt die Oxydation bei einer Temperatur von 22-3 °C unter ständigem Rühren während 1 Stunde durch.
Man lässt die erhaltene Lösung des oxydiertes Dextran durch die mit 10 g Anionenaustauscher in Azetatform gefüllte chromatographische Kolonne durch, verwirft ein Eluatvolumen, das dem freien KOlonnenvolumen - 6 ml - gleich ist, und sammelt die übrigen 40 ml.
Man mischt 40 ml oxydiertes und gereinigtes Dextran mit IO ml 0,5 Mol Sodapufferlösung mit einem pH-Wert von 9,25 und gibt unter leichtem Rühren I000 mg native Streptokinase hinzu, Man lässt das Reaktionsgemisch in einem Volumen von 50 ml bei einem pH-Wert von 9,25 einer Temperatur von 200C während 1 Stunde stehen, kühlt dann auf 40C ab und setzt in kleinen Portionen 450 mg Natriumborhydrid hinzu. Die Reduktion ist wahrend 1 Stunde bei einem pH-Wert von 9,25. beendet.
Man verdünnt die Lösung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats mit dem apyrogenen Wasser bis 400 ml und diafiltriert. Danach konzentriert man die Lösung bis 25 ml.
Man lässt die konzentrierte Lösung des erfindungsgemäss vorgeschlagenen Streptokinasederivats durch einen sterilen Filter (Porendurchmesser) beträgt 0,45 #m) durch und trocknet lyophil.
Die Ausbeute an Präparat beträgt 1500 mg mit einer spezifischen Aktivität von 4300 IR/mg Prärparat und der Gesamtaktivität von 6500000 lE, was 50 % vom Ausgangswert beträgt.
Das erhaltene Produkt hat ein Molekulargewicht von etwa I00000 und stellt eine geruch- und geschmacklose poröse Masse von weisser Farbe dar. Das Produkt ist hygroskopisch, leicht wasserlöslich, in isotonischer 0,9'er Natriumchloridlösung leicht löslich* im gegen Alkohols Äther und Chloroform praktisch unlöslich.
Beispiel 2.
Man löst 1 g Dextran mit einem Molekulargewicht von 150000 in 20 ml destilliertem Wasser und gibt 613 mg Kaliumperjodat zu. Man führt die Oxydation bei einer Temperatur von 22+2 °C unter staildigem Rühren während 1 Stunde durch.
Man leitet die erhaltene Lösung des oxydierten Dextrans mit einem Oxydationsgrad von 20-2% durch eine Kolonne mit 5 g Anionenaustauscher in Azetatform durch. Man verwirft am Kolonnenausgang ein Rluatvolumen, das dem freien Kolonnenvolumen gleich ist, und sammelt 20 ml, die das oxydierte und gereinigte Dextran in einer Konzentration von 50 mg/ml enthalten.
Man vermischt 20 ml oxydiertes und gereinigtes Dextran mit 5 ml 0,5 Mol SodapufSerlösung mit einem pH-Wert von 9,4 und gibt unter leichtem Rühren 500 mg native Streptokinase hinzu.
Man Zässt das Reaktionsgemisch in einer Menge von 25 ml bei einem pH-Wert von 9,4, einer Temperatur von 20-2°C während 40 Minuten stehen, kühlt am Eisbad au9 eine Temperatur von 4 oC ab und setzt in kleinen Portionen 224 mg Natriumborhydrid hinzu.
Die Reduktion ist in 30 Minuten beendet.
Nachher dialysiert man die Lösung des erfindungsgemassen Streptokinasederivats gegen destilliertes Wasser während 18 Stunden bei einer Temperatur von 4 bis 7°C und trocknet lyophil.
Die Ausbeute an Präparat beträgt 1100 mg mit einer spezifischen Aktivität von 1700 IE/mg Präparat und einer Gesamtaktivität von 1875000 IE, was 30 % vom Ausgangswert beträgt.
Das erhaltene Produkt Weist ein Molekulargewicht von 200000 bis 250000 auf und stellt eine porose geruchlose und geschmacklose Masse von weisser Farbe dar. Das Produkt ist hygroskopisch, leicht wasserlöslich, in isotonischer unter Natriumchloridlösung leicht löslich, in 95% gem Alkohol, Äther und ChloroSorm praktisch unlöslich.

Claims

POLYCACCHARIDDERIVAT DER STREPTOKINASE, VERFAHREN ZU DESSEN HERSTELLUNG UND ANWENDUNG PATENTANSPRÜCHE 1. Polysaccharidderivat der Streptokinase der allge meinen Formel worin NH-Streptokinase native Streptokinase, X von 100 bis 1000 bedeuten, das das Protein in einer Menge von 10 bis 20 Gew.% enthält.
2. Verfahren zur Rerstellung deg Polysaccharidderivats der Streptokinase nach Anspruch 1, d a d u r c h g ek e n n z e i c h n e t, dass man Streptokinase mit einem vor her oxydierten wasserlöslichen Dextran der allgemeinen Formel (C6H10O5)X worin X von 100 bis 1000 bedeutet, bei einer Temperatur von 8 bis 30>C und einem pH-Wert von 6,0 bis 10,5 umsetzt, anschliessend das erhaltene Produkt mit Watriumborhydrid reduziert und das Endprodukt abtrennt.
3. Arzneimittel mit thrombolytischer Wirksamkeit, das einen Wirkstoff und ein pharmazeutisches Lösungsmittel enthält, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass es als Wirkstoff ein Polysaccharidderivat der Streprokinase nach Anspruch 1 enthält.
4. Arzneimittel nach Anspruch 3 für Injektionen, d ad u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass es den Wirkstoff in einer Menge von 150000 IE in 1 ml Lösung ent hält.
5. Arzneimittel nach Anspruch 3 bis 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass es als pharmazeutisches Lösungsmittel bidestilliertes Wasser oder physiologische Lösung enthält.