DE3028165A1

DE3028165A1 - Verfahren zur herstellung eines kalorienarmen bieres

Info

Publication number: DE3028165A1
Application number: DE19803028165
Authority: DE
Inventors: Vinod K. Manhatten Kan. Chaudhary; Etzer Milwaukee Wiss. Chicoye; William F. Greenfield Wis. Line; Robert J. Waukesha Wiss. Mizerak
Original assignee: Miller Brewing Co
Current assignee: Miller Brewing Co
Priority date: 1980-07-25
Filing date: 1980-07-25
Publication date: 1982-03-04
Also published as: DE3028165C2

Description

Verfahren zur Herstellung eines kalorienarmen Bieres
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein gesagt ein Verfahren zur Herstellung eines Bieres. Genauer gesagt bezieht sie sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Bieres mit wenig Kalorien, bei dem ein aus Reis, einem traditionellen Braugrundstoff, extrahiertes Enzym in den Brauvorgang eingeführt wird. Die Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zum Extrahieren des Enzyms aus ganzem oder poliertem Reis sowie eine speicherbeständige Form des Enzymes.
Bei der Herstellung von Bier wird Hefe dazu verwendet, um ein Substrat aus einem Gemisch von gärbaren Kohlehydraten in Äthylalkohol zu vergären. Derartige Kohlehydrate, die durch Bierhefe vergärt werden können, sind in erster Linie Maltose, Glucose, Maltotriose und Spuren von Saccharose und Fructose. Diese Substanzen werden erhalten, indem man Malzenzyme (Alpha- und Beta-Amylase) Jtärkemoleküle aus Malz und anderen usätzen in die vorstehend genannten gärbaren Zucker umwandeln läßt. Dies geschieht während des Maischen5. Nach dem Maischen werden die löslichen Materialien während des Läuterns extrahiert, wobei das verbrauchte Korn zurückbleibt. Eine klare Flüssigkeit (Würze) wird erhalten, die in einen Braukessel überführt und über eine Zeitspanne gekocht wird (Kesselsieden), um alle Malzenzyme zu inaktivieren. 8eim Kesselsieden wird normalerweise Hopfen zugesetzt, wonach die Würze gekühlt, belüftet und mit Hefe versehen wird, wonach man sie gären läßt. Die Zusammensetzungen der Würze hängen von der Art der verwendeten Materialien, dem Maischzyklus etc. ab. Eine typische Würze besteht jedoch aus etwa 65 - 80 * gärbaren Kohlehydraten der vorstehend genannten Art und aus etwa 20 - 35 $ nichtgärbaren Kohlehydraten. Nach dem Gärvorgang wird ein Getränk erhalten, das normalerweise 3 - 5 qd Alkohol mit etwa gleichen Mengen an Restdextrin enthält, das den Hauptteil der gelösten Feststoffe bildet und üblicherweise als Wirkextrakt bezeichnet wird. Dieser Rest verbleibt infolge der Unfähigkeit der Malzamylasen, die Alpha 1-6-Bindungen der Stärke zu hydrolysieren. Wenn die vorstehend baschriebene Würze vergärt wird, wird ein Produkt erhalten, das etwa 110 Kalorien pro 12 Unzen-Flasche mit 3,3 g/100 Äthanol abgefüllt enthält.
Bei der Herstellung von hochvergärten Bieren mit wenig Kalorien wurde bereits versucht, einen höheren Anteil an Alkohol und einen sehr viel geringeren Anteil an Restdextrin zu erreichen. Dadurch erhält man ein Bier, das bei der Endgärung ein geringeres spezifisches Gewicht besitzt als im Normalfall. Die ersten hochvergärten Produkte wurden durch ein Verfahren gewonnen, das darin bestand, daß man ein externes Enzym im Fermenter zusetzte. Dieses spezielle Enzym, eine Glucoamylase, besitzt die Fähigkeit, sowohl Alpha 1-4- als auch Alpha 1-6-Bindungen der Stärke zu hydrolysieren und wird normalerweise aus dem Schimmelpilz Aspergillusniger gewonnen. Die Verwendung von Glucoamylase ist jedoch mit bestimmten Nachteilen verbunden. Diese Nachteile können folgendermaßen zusammengefaßt werden: (a) Bei der Hydrolyse der Alpha 1-6-Pindungen durch das Enzym treten einige Schwierigkeiten auf. Das Enzym ist viel wirksamer bei der Hydrolyse der Alpha 1-4-Uindungen; und (b) das Enzym kann in bezug auf den Brauvorgang als exogen angesehen werden. Mit anderen Worten, es ist nicht in den traditionellen Brausubstanzen Malz, Reis, Getreide oder Hefe vorhanden und es wird daraus auch nicht isoliert.
Eine andere Vorgehensweise, die bereits vorgeschlagen wurde, besteht darin, daß man eine Alpha 1-6-Carbohydrase oder Pullulanase kombiniert mit einer Beta-Amylase mikrobiologischen Ursprungs einsetzt.
Es gibt drei Grundklassen von stärkeabbauenden Enzymen. Dabei handelt es sich um die Glucoamylasen, die Isoamylasen und die Pullulanasen. Die Unterschiede zwischen diesen Klassen sind dem Fachmann wohl bekannt. Grundsätzlich spalten die Pullulanasen die Alpha 1,6-Bindungen von Pullulan (einem Alpha 1,6-Polymer von Maltotriose, das aus einer Schimmelzellenwand isoliert ist) auf, so daß Maltotriose erhalten wird. Pullulanasen sind speziel geeignet für Alpha 1,6-Bindungen und können die Grenzdextrine der Würze abbauen, wodurch Alpha 1,4-Polysaccharide erzeugt werden, die durch verschiedenartige Alpha 1,4-Carbohydrasen in Zucker umgewandelt werden können, welche durch Bierhefe vergärbar sind.
In der Vergangenheit sind Versuche angestellt worden, um ein derartiges Enzym aus zur Bierherstellung gehörenden Subetanzen, wie beispielsweise Malz, zu isolieren. Das sogenannte WR-EnzymH ist in der Literatur genannt worden.
Es scheint Jedoch der Fall zu sein, daß bis zum heutigen Datum kein wirksamer Weg zur Isolierung des "R-Enzyms" aufgefunden worden ist.
Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Entdeckung nutzbar zu machen, daß eine bekannte, traditionell eingesetzte Brausubstanz als Quelle für ein stärkabbauendes Enzym eingesetzt werden kann, um dadurch ein hochvergärtes Bier herzustellen.
Allgemein gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Reis als quelle des stärkeabbauenden Enzyms bei der Herstellung eines Bieres- mit wenig Kalorien. Die Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zum Isolieren des Enzyms aus Reis.
Reis ist ein in der Brauindustrie traditionell eingesetzter Grundstoff. Normalerweise wird er als Zusatz verwendet oder als zusätzliche Quelle von Kohlhydraten eingesetzt, wis Getreidekleie oder Getreidesirup. Der zu diesem Zweck verwendete Reis hat normalerweise Nahrungsmittelqualität, d.h.
es handelt sich hierbsi um Reis, der einem üblichen Trockenvorgang unterzogen und danach trocken gemahlen wurde. In der Brauindustrie finden normalerweise die zerbrochenen Ksrne aus diesem Poliervorgang Verwendung. Das traditionelle Verfahren besteht darin, daß man Reis im Getreidekocher einsetzt. Normalerweise wird etwas Malz zugegeben zusammen mit genug Wasser, so daß eine gewisse Umwandlung der Reisstärke im Kocher erreicht wird. Dieses Gemisch wird über eine Zeitspanne gekocht und der Maische zugegeben, wobei Malzenzyme die Stärke aus dem Malz und dem Reis in gärbare e Kohlhydrate umwandeln. Der auf diese Weise verwendete Reiszusatz besitzt keine Enzymaktivität, da diese im Getreidekocher vollständig inaktiviert worden ist. Bei dem traditionellen Verfahren wird daher Reis nicht als Enzymquelle eingesetzt.
Es wurde nunmehr festgestellt, daß durch die Verwendung eines stärkeabbauenden Enzymes, das auf natürliche Weise im Reis vorhanden ist, in einem Brauvorgang gute Ergebnisse in bezug auf die Herstellung eines Tieres mit wenig Kalorien erzielt werden können.
Das suf dem Reis basierende Enzym stammt somit aus einer traditionellen Brausubstxnz und scheint eins größere Wirksamkeit in bezug auf die Reduktion der stark verzweigten Dextrinfraktion mit hohem Molekulargewicht zu besitzen als 6lucoamylaso.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung stellt eine Verbesserung des Verfahrens zur Herstellung eines hochvergarten Bieres durch Vergären von Würze mit Hefe dar und umfaßt die Zugabe einer Reispullalanase in einer zur Reduzierung der Menge der Restdextrine im Wirkextrakt durch Aufspalten der Alpha 1,6-Bindungen der Grenzdextrine zur Bildung von Alpha 1,4-Dsxtrinen, die durch 1,4-Carbohydrasen in vergärbare Zucker umgewandelt werden, die durch die Hefe zu Alkohol vergärt werden, wirksamen Menge.
Das Enzym kann in verschiedenen Stadien eingeführt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird entweder Reis oder das aus dem Reis extrahierte Enzym der Würze zugesetzt, die Kornamylase aus einer geeigneten Quelle enthält, d.h.
Malz am Fermenter. Das Enzym aus dem Reis hydrolysiert die restlichen 1-6-8indungen der Grenzdextrine, und die Kornamylase spaltet die resultierenden linearen Alpha 1-4-Polysaccharide in vergärbare Zucker auf, die dann durch die Hefe in Äthanol umgewandelt werden.
Bei einer anderen Ausführungaform des Verfahrens wird das aus dem Reis extrahierte Enzym der Maische zugesetzt, um zur Aufspaltung der 1-6-Bindungen der Grenzdextrine beizutragen, die sonst gebildet werden würden. Die natürlichen Malzenzyme hydrolysieren die 1 4-Oindungen und erzeugen somit ein höheres Niveau an vergärbaren Zuckern.
8ier wohlschmeckender qualität kann durch Jedes der vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Es wurde festgestellt, daß das Endprodukt in Jedem Falle einen größeren Alkoholanteil in bezug auf den Wirkextrakt und weniger Kalorien pro Volumeneinheit bei Ab füllung mit konstantem Alkoholgehalt besaß als ein Vergleichabier, das ohne Enzymzusatz hergestellt worden war.
Bei dem Enzym, das für die Herstellung eines hochvergärten Bieres mit wenig Kalorien geeignet gefunden wurde, handelt es sich um ein stärkeabbauendes Enzym, das in natürlicher Weise im Reis vorkommt. Das Enzym nach der vorliegenden Erfindung wird als Pullulanase klassifiziert, da es die Alpha 1-6-Oindungen des diagnostischen Substrates Pullulan hydrolysiert.
Bei dem erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren wird das Enzym aus ganzem oder in handelsüblicher Weise poliertem Reis mit einem wässrigen Puffersystem extrahiert, das einen pH-Wert von etwa 6 bei Temperaturen von 0-600C aufweist.
Es wird bevorzugt, eine Aufechlämmung aus dem polierten Reis in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer-0,2 M NaCl bei pH 6,0 und etwa 50 ob über etwa drei Stunden herzustellen.
Die Pullulanase-enthaltende Aufschwemmung aus der Extraktion kann durch folgende Schritte weiter gereinigt werden: (1) Ansäuern des Rohextraktes; und (2) Ausfällen des Reisenzymens mit (NH4)2SO4. Diese Vorgänge werden in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Das Enzym kann in flüssiger Form oder als gefriergetrocknetes oder sprühgetrocknetes Pulver gelagert werden. Das gefriergetrocknete Pulver wird durch Diafiltern des das Enzym enthaltenden gepufferten pH 6-Extraktes gegen 0,1 M Ammoniumbicarbonatlösung erhalten. Amjnoniumbicarbonat ist ein flüchtiges Salz, das beim Gefriertrocknen sublimiert und ein salzfreies Enzympulver ergibt. Andere sublimierbare Salze, die das Verfahren nicht störend beeinflussen oder die enzymatische Aktivität nicht verschlechtern, können ebenfalls zur. Anwendung gelangen, falls diss gewünscht wird.
Die Menge des Reises oder des extrahierten Enzymes, die im Brauvorgang zugesetzt wird, hängt von vielen Faktoren ab, beispielsweise dem enzymatischen Gehalt des Reises, der Aktivität des Enzyms, dem Stadium des Brauvorganges, bei dem die Zugabe stattfindet, und den Bedingungen des 8rauvorganges, d.h. pH, Temperatur und Zeit. Normalerweise wird es sich bei der Menge an zugesetztem Reis oder Extrakt um eine Menge handeln, die zur Reduzierung der Menge der restlichen Grenzdextrine im Wirkextrakt um etwa 30 bis etwa 80 % wirksam ist. Zur Vorumwandlung der Dextrine vor der Vergärung einer Enzymquelle wird normalerweise entweder Extrakt oder Reis, der etwa 100 Einheiten bis etwa 300 Einheiten an Pullulanaseakti-vität pro Liter enthalt, der Würze zugegeben, oder etwa 300 Einheiten bis etwa 700 Einheiten pro Liter der Maische. Geringere Mengen, die etwa zwei Einheiten bis etwa 75 Einheiten an Pullulanaseaktivität pro Liter enthalten, sind wirksam, wenn sie der Würze im Fermenter zugesetzt werden. Größere Mengen als diese normal verwendeten können Anwendung finden, falls dies erwünscht oder erforderlich sein sollte. Um die genauen Mengen zu bestimmen, können einige Versuche erforderlich sein. Die Durchführung derartiger Versuche liegt Jedoch durchaus im Rahmen des Fachkönnens des Brauereifachmannes.
Bei einer Ausführungsform des Verfahrens wird das Enzym dem Fermenter zusammen mit einer Carbohydrase zugesetzt, beispielsweise einer Korndiastase. Diese Kombination ist erforderlich, da das Reisenzym die hochverzweigten Alpha 1,6-Grenzdextrine aufspaltet und die zugesetzte Carbohydrase die resultierenden Alphal,4-Dextrine in Zucker aufspaltet, die durch Hefe weiterbehandelt werden können. Die wirksame Menge eines jeden zu gesetzten Enzymes hängt von dem Gehalt an Grenzdextrinen ab, der normalerweise im Produkt der Gärung vorhanden ist, und von dem Ausmaß der gewünschten Kalorienherabsetzung. Normalerweise liegt das abbauende Enzym in einer Menge von etwa 2 Einheiten bis etwa 60 Einheiten an Pullulanaseaktivität pro Liter Würze und die Carbohydrase oder Korndiastase in einer Menge von etwa 20 Einheiten bis etwa 140 Einheiten an Amylaseaktivität pro Liter Würze vor.
Bei noch einer anderen Ausführungsform wird die Zugabe des Reisabbauenzyms zum Fermenter mit der Zugabe einer Glucoamylase verbunden, beispielsweise einer solchen, die von Aspergillusniger herrührt und sowohl in bezug auf Alpha 1,6- als auch Alpha 1,4-Bindungen aktiv ist.
Durch die Einführung der Kombination dieser beiden Enzyme im Girungsstadium wird die Gärungezeit, die normalerweise zur Herstellung eines hochvergärten Bieres erforderlich ist, in signifikanter Weise reduziert, d.h. von 12 auf 7 Tage.
Obwohl beide Enzyme Abbaufähigkeiten besitzen, ist das Reisenzym wirksamer als Glucoamylase, woraus eine Reduzierung der Gärungszeit resultiert. Die Konzentration des Reisenzymes in einem derartigen Gemisch kann geringer sein als im Normalfall, d.h. 2-4 Einheiten von Pullulanase, und die Glucoamylase kann in etwa 2 Einheiten bis etwa 10 Einheiten an Glucoamylaseaktivität pro Liter vorliegen.
Die folgenden analytischen Verfahren kamen in den nachfolgend beschriebenen Beispielen zur Anwendung. Protein wurde durch das von Miller (1) modifizierte Lowry-Verfahren bestimmt. Die Pullulanaseaktivität wurde durch Hydrolyse von 0,5 46 w/v Pullulan bei pH 5,0 und 500C bestimmt. Die Amylaseaktivität wurde durch Hydrolyse von 0,5 $ w/v Linter lösliche Stärke bei pH 5,0 und 500C ermittelt. Das Auftreten von reduzierenden Zuckern wurde durch das Dinitrosalizylsäure-Verfahren von Bernfield (2) überwacht. Eine Aktivitätseinheit wurde bei beiden Prüfungen als das Auftreten von 1 mg reduzierendem Zucker (als Maltose)/Minute definiert. Spezifische Aktivitäten wurden als Einheiten/mg Protein ausgedrückt.
Die Glucoamylaseaktivität wurde durch eine Modifizierung des Verfahrens von Pazur (3) bestimmt, wobei Maltose als Substrat bei pH 5,0 und 250C eingesetzt wurde. Das Auftreten von Glucose wurde unter Einsatz der gekoppelten Glucose Oxidase-Peroxidase-Reaktion mit o-Dansidin als Indikatorfärbstoff überwacht (3). Eine Aktivitätseinheit wurde als Hydrolyse von einem Mikromo»«altose/Minute unter diesen Bedingungen definiert.
Die Gärprozesse wurden über die Abnahme des spezifischen Gewichtes unter Verwendung des Mettler DMA-45 Rechendensitometere überwacht.Wenn man zu der Annahme gelangte, da13 der Gärprozess der Biere beendet war, wurden die Brechungsindizes an einem Zeiss Immersionsrefraktometer gemessen. Diese Messungen wurden zur Bestimmung des Alkoholgehaltes (4,5,6) und des Wirkextraktgehaltes (5,6) der Biere durchgeführt.
Der Wärmeinhalt eines Standard-l2Unzen-Behälters wurde bei 3,3 g/100 Äthanol nach dem Verfahren von Helbert (7) bestimmt.
Kohlenwasserstoffprofile wurden durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie auf Bio Rad Q 158 Harz erhalten, wie vom ASBC Subcommittse on brewery sugars and syrups (8) und von Scobell et al (9) beschrieben. Wenn nicht anders beschrieben,wurden alle Diafiltrationen auf einem Amicon M;-2 Apparat durchgeführt, der mit einer H-1P-10 Patrone (m.w.
cutoff 1 10000) (Amicon Corporation, Lexington, Mass.).
ausgerüstet war.
In den Beispielen 1 - 5 werden die Isolation und einige Eigenschaften von Reispullulanase verdeutlicht.
Beispiel 1 Isolation von Pullulanase aus ganzem Reis 500 g LaBelle-Reis (Saatgutqualität) wurden in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer-0,2 M Nah1, pH 6,0, unter Verwendung eines Waring-Mischers vermischt. Das vermischte Korn wurde in ein Gefäß in einem Bad überführt, das bei So0C gehalten und unter zwei Litern Puffer drei Stunden lang gerührt wurde.
Das verbrauchte Korn wurde durch Mullfiltration entfernt, und das Filtrat wurde durch Zentrifugieren geklärt.
Eine weitere Klärung kann dadurch erreicht werden, daß man den pH-Wert des Extraktes auf 5,0 absenkt. Die resultierende Ausfällung wurde durch Zentrifugieren entfernt, und der pH-Wert der Aufachwemrung wurde wieder auf 6,0 eingestellt.
Der Extrakt kann durch (NH4)zS04 Fraktionierung gereinigt und konzentriert werden. Dieses Salz wurde der pH-sinyestellten Aufschwemmung mit einer Menge von 40 g festem (NH4)2S04 pro 100 ml Lösung zugegeben. Die Suspension wurde eine Stnde lang bei Raumtemperatur gerührt, und die Ausfällung wurde durch Zentrifugieren entfernt. Der Niederschlag wurde im Extraktionspuffer gelöst und gegen diesen diaflitriert.
Beispiel 2 Bestimmung von Pullulanase innerhalb des Reiskernes LaDelle-Reis aus Beispiel 1 wurde geperlt, und es wurden die folgenden Fraktionen isoliert:(1) Schalen; (2) brauner oder entschalter Reis; (3) Reiskleie; und (4) polierter weißer Reis. Jede Fraktion wurde wie im Beispiel 1 für ganzen Reis beschrieben extrahiert und geklärt. Die Analyse dieser Extrakte ergab, daß der größte Anteil der Pullulanaseaktivitat im Endosperm (polierter Reis) aufgefunden wurde.
Hinzu kam, daß diese Zubereitung eine viel größere spezifische Aktivität besaß als die von ganzem oder braunem Reis hergestellten Präparate. Folglich ist polierter Reis die bevorzugte Enzymquelle.
Beispiel 3 Extraktion von Pullulanas. aus polierte. Reis 2 kg handeslüblichen polierten Reises wurden in einer Barley-Mühle zu 0,02 Zoll gemahlen. Der gemahlene Reis wurde in vier Liter Extraktionspuffer pH 6 eingemischt, und die Suspension wurde 3 Stunden lang bei 500C gerührt.
Der pH-Wert des Extraktes wurde auf 5,0 eingestellt, und die resultierende Aufschwemmung wurde durch Zentrifugieren geklärt. Der pH-Wert der Aufschwemmung wurde wieder auf 6,0 eingestellt.
Für eine Langzeitspeicherung war es wünschenswert, das Präparat als salzfreies Pulver zu erhalten. Dies wurde durchgeführt, indem die Aufschwemmung aus dem pH-Einstellungsschritt gegen 0,1 M NH4HC03 diafiltriert wurde. Dieses Salz wurde deswegen ausgewählt, weil (1) das Präparat Salz benötigt, um in Lösung zu verbleiben; und (2) NH4HC03 sublimiert und durch nachfolgendes Gefriertrocknen entfernt wird.
Nach der Diafiltration gegen 4 Volumeneinheiten von 0,1 M NH4HC03 wurde das Retentat gefriergetrocknet.
Beispiel 4 pH-Optimum von Reispullulanase Der optimale pH-Bereich wurde für Reispullulanase bestimmt, die nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren isoliert worden war. Die nachfolgenden Puffersystems fanden dabei Verwendung: (1) pH 4,0 - 5,5-o,1 M Essigsäure eingestellt auf den richtigen pH-Wert mit NaOH; (2) pH 6-7 0,1 M KH2P04 eingestellt auf den richtigen pH-Wert mit NaOH. Gelagertes Pullulan (10 % w/v in H20) wurde im geeigneten Puffer auf 1 % w/v verdünnt. Reispullulanase wurde dann über den pH-Bereich 4-7 unter Standardbedingungen geprüft. Die Ergebnisse zeigten an, daß eine optimale Aktivität im pH-Bereich von 5-6,5 erhalten wird.
Beispiel 5 Temperaturoptimum von Reispullulanase (A) In Abwesenheit von Substrat Reispullulanase, die nach Beispiel 3 hergestellt worden war, wurdenauf eine Endkonzentration von 2 mg/ml im 0,1 M Azetatpuffer, pH 5,0 eingestellt. Stichproben dieses Gemisches wurde über Zeitspannen von 10-60 min auf einen Temperaturbereich von 40-70 0c erhitzt. Stichproben der erhitzten Proben wurden abgezogen, gekühlt und dem Standardpullulanasetest unterzogen. Die Ergebnisse zeigten an, daß das Enzym bei Temperaturen oberhalb von 40 C schnell inaktiviert wurde. Vollständige Inaktivierung trat nach 10 Minuten bei 60 C auf.
(B) In Anwesenheit von Substrat Wie in Beispiel 3 hergestellte Reispullulanase wurde auf eine Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Azetat, pH 5,0, eingestellt. Stichproben dieses Präparates (ausreichend für eine Endkonzentration von 0,2 mg/ml Inkubat) wurden in Röhren eingeführt, die Pullulan und 0,1 M Azetatpuffer (ph 5,0) enthielten und die auf die gewünschte Temperatur ausgeglichen worden waren. Bei Jeder Temperatur (von 400C bis 7000) wurden Stichproben von 1 ml nach 10, 20 und 30 Minuten Erhitzen abgezogen und inaktiviert, indem sie in die für Farbentwicklung verwendete Dinitrosalizylsäurelösung eingeführt wurden. Die reduzierenden Zucker wurden nach der Standardmethode bestimmt.
Aus den Ergebnissen dieser Versuche geht hervor, daß das Enzym bei Vorhandensein von Substrat bis auf 60 0C über 30 Minuten bestä-ndig ist. Dies steht im Gegensatz zu der Temperaturbeständigkeit des Enzyms allein, wie im Bespiel 5(A) beschrieben.
In den Beispielen 6 - 15 wird nachfolgend die Anwendung des Reisenzymes (Pullulanase) in Verbindung mit dem Brauverfahren beschrieben. Die Beispiele 7 - 12 verdeutlichen die Verwendung des Enzymes in Verbindung mit verschiedenartigen Alpha 1,4-Garbohydrasen bei im Gärprozess befindlichem Bier, während die Beispiele 13 und 14 dessen Verwendung vor dem Gärprozess verdeutlichen. In allen Fällen war die Würze als nur aus Malz bestehende Würze gemaischt und vor dem Gärprozess mit einem handelsüblichen umgewändelten Getreidesirup auf etwa 120 bis etwa 150 P eingestellt. In den nachfolgenden Beispielen war das ursprüngliche spezifische Gewicht konstant. Die Würzen wurden mit einer Braukultur von S. Uvarum auf eine Endkonzentration von 1 x 10 Zellen/ml gsbracht und bei 150C vergärt.
Beispiel 6 Herstellung von Korndiastasen zur Verwendung mit Reispullulanase (A) Mdzdiastase High-gib distiller's Malz wurde in einer Standerd Barley-Mühle gemahlsn. Das Pulver (150 g) wurde in 1,5 Liter 0,1 U Azetatpuffer (pH 5,0) singegeben. Die Aufschlammung wurde zwei Stunden lang bei 50 0C gerührt, und die Aufschwemmung wurde in der für den Reisrohextrakt (Beispiel 1) beschriebenen Weise gewonnen.
Das Enzym wurde weiter gereinigt, indem (NH4)2504 bis auf eine Endkonzentration von 40 g/100 ml zugesetzt wurde. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in 0,1 M Azetatpuffer (pH 5,0) wieder suspendiert. Die Suspension wurde durch Diafiltration gegen den gleichen Puffer geklärt, konzentriert und bei 40C gelagert.
L8) Herstellung von Malz Beta-Aiylase Die gemäß Beispiel 6 (A) hergestellte Malzdiastase enthält sowohl Alpha- als auch Beta-Amylase, wobei Alpha-Amylase in der größten Konzentration vorliegt. Malz Alpha-Amylase kann bei saurem pH-Wert (9) selektiv inaktiviert werden.
Der pH-Wert eines Anteils der Malzdiastase, die wie in Beispiel 6 (A) beschrieben hergestellt worden war, wurde auf 3,6 eingestellt und zwei Stunden lang auf 350C erhitzt.
Die Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, und der pH-Wert der Aufschwemmung wurde wieder auf 4,0 eingestellt.
(c) Herstellung von SoSabohnendiastase Ganze Sojabohnen wurde in einer Wiley-Mühle unter Verwendung eines Siebes von 20 mesh gemahlen. 10 gm Pulver wurden in 100 ml 0,01 M Azetatpuffer (pH 5,2) bei 550C eine Stunde lang gerührt. Die Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, wonach unter Verwendung einer Filterhilfe filtriert wurde.
Die Aufschwemmung wurde vierfach verdünnt, gegen H20 diafiltriert und auf das ursprüngliche Volumen konzentriert.
Das Konzentrat wurde bei 40C gelagert.
(D) Isolation von Weizendiastase Wiezendiastase wurde aus geperltem harten Winterweizen isoliert, der wie in Beispiel 6 (B) für Sojabohnendiastase gemahlen worden war. Das Pulver (50 g) wurde in 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer-0,1 M NaCl (pH 6,0) eingegeben, und die Suspension wurde drei Stunden lang bei 500C gerührt. Danach wurde sie wie in Beispiel 1 für das Reisenzym beschrieben geklärt.
Die Aufschwemmung wurde gegen 0,02 M Phosphatpuffer-O,2 M NaCl und danach Wasser dialysiert.
Bei der in den nachfolgenden Versuchen verwendeten Glucoamylase handelte es sich um Novo 150 (Herstellers Novo Industries, Wilton, Connecticut).
Beispiel 7 Hochvergärung von Bier unter Verwendung von Reispullulanase-Malzdiastate Die in der vorstehenden Weise hergestellte Würze wurde vergärt: (1) ohne Enzymzusatz (Bier +1), um die Gärungsgrenze festzustellen; (2) mit Zusatz von Glucoamylase (8,1 U/l Bier +2), um die Gärungsgrenze festzustellen; und (3) unter Zusatz von Reispullulanase (15,3 Null) und Malzdiastase (140 U/l Bier +3).
In allen Fällen wurden die Würzen wie vorstehend beschrieben mit Hefe versetzt und belüftet, wonach die geeigneten Enzyme zugesetzt wurden. Die Biere wurden bei 150C vergärt.
Das enzymfreie Vergleichsbier enthielt 0,5 - 0,6 g/ioo weniger Alkohol als Bier +2 oder Bier +3, die aweils mit Glucoamylase und Reispullulanase/Malzdiastase hochvergärt wurden. Bei 3,3 * Äthanol abgefüllt war der Wirkextrakt im Bier +3 um etwa 1,0 g/ioo gegenüber dem von Bier +1 abgesenkt und entsprach nahezu dem bei der Verwendung von Glucoamylase erhaltenen Wert (Bier +2). Bei dieser Alkoholkonzentration würdendie Biere +2 und +3 92-93 cal/12 Unzen im Vergleich zu den 108 cal/12 Unzen für Bier +1 enthalten.
Die Kohlehydratprofile zeigten, daß die Biere +2 und +3 nahezu identische Kohlehydratzusammensetzungen bei der Endgärung aufweisen und daß in beiden Bieren +2 und +3 die nicht vergärbaren Zucker (größer als DP-3) gegenüber den von Bier +1 beträchtlich herabgesetzt waren.
Beispiel 8 Hochvergärung von Bier unter Verwendung von Reispullulanase-Sojabohnendiastase Die Würze wurde wie in Beispiel 7 beschrieben belüftet und mit Hefe versehen. Reispullulanase (15,3 Null) und SoJabohnendiastase (140 Null) wurden zugegeben. Das Bier wurde wie in Beispiel 7 beschrieben vergärt.
Das vollständig vergärte Bier, das 5,3 Ull Reispullulanase und 140 U/l Bojabohnendiastase (Bier +4) enthielt, war etwa auf den gleichen Wert wie das Glucoamylase-Vergleichsbier (Bier +2) hochgegärt, was ein Bier von 93,4 cal/12 Unzen bei Abfüllung mit 3,3 g/100 Äthanol ergab. Das Kohlehydratprofil nach 12 Tagen Gärung zeigte, daß die nicht vergärbare Fraktion nahezu der des Glucoamylasevergleich sbiere s (Bier +2) entsprach.
Beispiel 9 Hochvergärung von Bier unter Verwendung von Reispullulanase-Weizendiastase Die Würze wurde wie in Beispiel 7 beschrieben belüftet und mit Hefe versehen. Reispullulanase (15,3 U/l) und Weizendiastase (140 Null) wurden wie gezeigt zugesetzt. Das Bier wurde wie in Beispiel 7 beschrieben bei 150C vergärt.
Dieses Bier (Bier +5) wurde auf die gleiche Stufe hochvergärt wie das Glucoamylasevergleichsbier (Bier +2). Bei einer Abfüllung mit einer Alkoholkonzentration von 3,3 g/ioo Äthanol würde das Bier 29,5 cal/12 Unzen enthalten. Die Kohlehydratzusammensetzung zeigte an, daß die nicht vergärbare Fraktion nahezu der von Bier +2 entsprach.
Beispiel 10 Hochvergärung von Bier mit Reispullulanase-Malz Beta-Amylase Die Würze wurde wie bei Beispiel 7 belüftet und mit Hefe versehen. Reispullulanase (15,3 Null) und Malz Beta-Amylase (140 U/l) wurden zugegeben, und das Bier wurde bei 150C in üblicher Weise vergärt.
Die Ergebnisse zeigten an, daß bei diesem Bier (+6) der Gärprozess in 8 Tagen beendet war, d.h. eher als bei dem Glucoamylasevergleichsbier (Bier +2) oder irgendeinem der mit Reispullulanase in Verbindung mit den anderen Korndiastasen hergestellten Biere. Wiederum war die Kohlehydratzusammensetzung der des Glucoamylaievergleichsbieres ähnlich. Folglich scheint eine Beta-Amylase den in den vorstehenden Beispielen eingesetzten Diastasen (die sowohl Alpha- als auch Beta-Amylase enthalten) überlegen zu sein.
Beispiel 11 Hachvergärung von Bier mit Reizung Malzuehlen Polierter +4 Braureis und high-gib distiller's Malz wurden auf eine Korngröße von 20 mesh in einer Wiley-Mühle gemahlen.
Das erhaltene Mehl wurde der wie vorstehend beschriebenen belüfteten und beladenen Würze zugesetzt. Eine Würze (8ier +7) enthielt 5,2 g Reismehl und 0,12 g Malzmehl/Liter,während die andere Würze (Bier +8) doppelt so viel von Jedem Mehl enthielt. Die Würzen wurden wie vorstehend beschrieben vergärt. Die Kornzusätze zu Bier +7 wurden so berechnet, daß sich 15,4 Einheiten Pullulanase pro Liter und 140 Einheiten Malzdiastase pro Liter auf der Grundlage der in den Beispielen 3 und 6 (A) verdeutlichten Extraktion ergaben.
Die für die Biere +7 und +8 erhaltenen Ergebnisse zeigten an, daß beide Biere auf das gleiche Niveau vergärten wie das Glucoamylasevergleichsbier (Bier +2) und die in den Bsispielen 7 - 11 aufgeführten Biere, bei denen Enzymextrakte Anwendung fanden.
Beispiel 12 Verwendung von Reispullulanase in Verbindung mit Glucoamylase zum Verkürzen der Girungszeit Die Würze wurde eingesetzt, um fünf verschiedene Gärprozesse durchzuführen. Alle Würzen wurden belüftet und beladen, wonach Reispullulanase (2,0 Null; 4,o U/l oder 8,1 U/l) und Glucoamylase (3,8 Ull oder 15,3 Null) zugesetzt wurden. Die Ergebnisse zeigten an, daß durch den Zusatz von Reispullulanase die Gärungszeit sogar bei reduzierter Glucoamylase-(Biere +11 und +12) oder Pullulanasekonzentration (Bier +13) gegenüber dem Glucoamylasevergleichsbier beträchtlich verkürzt wurde.
Beispiel 13 Umwandlung von nur aus Malz bestehender Würze vor der Gärung mit Reispullulanase-Malz Beta-Amylase Nach dem Kesselsieden wurde eine nur aus Malz bestehende Würze erhalten. Drei Proben der Würze wurden mit Malz Beta-Amylase (1450 Null) in Verbindung mit abnehmenden Konzentrationen von Reis-Pullulanase (150 Null; 75 U/l und 38 Null) umgewandelt. Eine andere Probe der Würze wurde umgewandelt, indem Reispullulanase in Verbindung mit Glucoamylase eingesetzt wurde.
In allen Fällen war das Verfahren das gleiche. Die Würzen wurden bei 60 0C unter Rühren in einem Wasserbad ins Gleichgewicht gebracht. Die Würzen wurden 30 Minuten lang erhitzt, wonach sie in einen Glaskolben gegeben wurden, der in einem heftig siedenden Wasserbad enthalten war. Man ließ die Würzen darin zwei Stunden lang stehen, um die Enzyme zu inaktivieren.
Danach wurden die Würzen gekühlt, und die resultierende Trübe wurde durch Zentrifugieren entfernt.
Das Malz/Sirup-Zusatzverhältnis wurde auf den gleichen Wert eingestellt wie bei der in den Beispielen 7 - 12 beschriebenen Würze. Die Würzen wurden dann beladen, belüftet und wie in Beispiel 7 beschrieben vergärt.
Die Biere waren im Vergleich zu dem enzymfreien Vergleichebier (Bier +1) hochvergärt, Bei einer Abfüllung mit 3,3 g/loo Äthanol würde der Wärmeinhalt dieser Biere etwa bei 98 Kalorien liegen, d.h. etwa 10 Kalorien weniger als bei Bier +1, das ohne Enzymzusatz hergestellt wurde.
Beipiel 14 Zugabe von Kornamylasen zu voruigewandelten Bieren die Da/in Beispiel 13 genannten Biere nicht auf das gleiche die Niveau hochgärten wie/in den Beispielen 7 - 12 beschriebenen Biere wurden verschiedenartige Enzyme zugesetzt, um festzustellen, ob die Hochgärungsgrenze abgesenkt werden kann.
Die Hefe wurde von Bier +14 durch Zentrifugieren entfernt, und das geklärte Bier wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt, die mit 14A und 148 bezeichnet wurden. Beide Biere wurden wieder mit Hefe versehen. Bier +14A wurden 140 U/l Malz Beta-Amylase und Bier +148 15,3 U/l Reispullulanase und 140 U/1 Malz Beta-Amylase zugesetzt. Der Gärprozess wurde dann bei 150C fortgesetzt.
Die Siere+15A und +16A wurden nicht wieder mit Hefe versehen.
Statt dessen wurden die Enzyme direkt in die gärenden Biere eingegeben. Bier +15A wurden 15,3 U/l Reispullulanase und Bier +16A 15,3 U/l Reispullulanase und 140 U/l Malz Beta-Amylase zugesetzt.
Durch Zusatz der Alpha 1,4-Carbohydrase, Malz Beta-Amylase, wurde das spezifische Gewicht (Bier +14A) nicht merklich reduziert, da der größte Teil der nicht vergärbaren Zucker Alpha 1,6-Bindungen enthielt. Im Gegensatz dazu vergärten Malz Beta-Amylase in Verbindung mit Reispullulanase (Biere +148 und +16A) oder Reispullulanase allein (Bier +15A) die Biere auf das gleiche Niveau wie Glucoamylase (Bier +2) oder bei den in den Beispielen 7 - 12 beschriebenen Bieren.
Beispiel 15 Zugabe von Reispullulanase zur Würze beim Maischen Gemäß Beispiel 3 hergestellter Reispullulanase wurden 400 Sl Grundwasser zugesetzt, so daß eine Endkonzentration von 520 U/l bei 460C erhalten wurde. Danach wurden 129,6 g helles Malz eingeführt, und die Maische wurde dem nachfolgenden Maischzyklus unterzogen: (1) 450C über 30 min; und (2) 600C über 120 min. Das Gebräu wurde bei 7? C abgemaischt, wonach das verbrauchte Korn durch Mullfiltration entfernt wurde. Die erste Würze wurde durch Zentrifugieren geklärt, verdünnt und zwei Stunden lang in einem kochenden Wasserbad gehalten. Alle nachfolgenden Schritte wurden wie in Beipiel 11 beschrieben durchgeführt.
Dieses Bier vergärte zu einem endgültigen spezifischen Gewicht von 1,0019 (0,490 P) gegenüber 1,0029 (0,750 P) für Bier +1, dem ohne Enzymzusatz hergestellten Verglsichsbier des Beispiels 7. Folglich wurde durch die Einarbeitung von Reispullulanase in die Maische die Gärungsgrenze um 0,260 P herabgesetzt.
In der vorstehenden Beschreibung wurde auf die nachfolgenden Veröffentlichungen bezug genommen: 1. Miller, G., Anal. Chem. 31, 964,1959 2. Bernfield, P., Advances in Enzymology XII (Nord, F., ed.) 379, Interschiences Publishers, New York, 1951 3. Pazur, J., Methode in Enzymology XXVIII, Ginsberg, V. (ed.) 931, Academic Press, 1975 4. Kneen, E., (ed.)., Alkohol Determined Refractometrically" in Methods of Analysis of the American Society of Brewing Chemists, 7th revised edition, published by the Society, 1976 5. Olshausen, J., Brewern Digest 27, 45, 1952 6. Olshausen, J., Brewers Digest 27, 53, 1952 7. Helbert, J.R., J. Amer. Soc. Brew. Chem. 36, 66, 1978 8. Martinelli, L. (Chairman), ASBC Journal 35, S. 104, 1978 9. Scobell, H., Brobst, K. und Steele, F., Cereal Chem. 54, S. 905, 1975 10. Greenwood, C. und A. MacGregor, J. Inst. Brew. 71, 408, 1965 Bei dem Reis, der in erfindungsgemäßer Weise als Enzymquelle eingesetzt werden kann, handelt es sich um Reis mit Nahrungsmittelqualität, der zur Erhaltung der enzymatischen Aktivität unter ausreichend milden Bedingungen behandelt wurde. Es kann entweder Saatreis oder polierter trocken gemahlener Reis Anwendung finden. Das Enzym kann aus einer großen Vielzahl von Reisarten extrahiert werden, beispielsweise LaBelle, LeBonnet, Nato, Starbonnet oder Brazos. Es wird jedoch handelsüblicher polierter trocken gemahlener Reis für Brauereizwecke bevorzugt.
Wenn das Enzym vor der Verwendung in diesem Verfahren von dem Reis extrahiert worden ist, kann der verbrauchte Reis, von dem das Enzym extrahiert wurde, als Stärkequelle beim Maischen oder für eine Zusatzsirupformulierung eingesetzt werden, um die Verwendung des Reisenzymes wirtschaftlicher zu machen.
Obgleich das Reisenzym, wie vorstehend beschrieben, zur Herstellung eines Bieres mit wenig Kalorien oder eines hochvergärten Bieres verwendet wird, kann es möglicherweise auch andere Anwendungsgebiete aufweisen. Beispielsweise kann ein Gemisch aus dem Reisenzym und einer Korndiastase in vorteilhafter Weise zur Herstellung eines Stärkeumwandlungsproduktes, das einen hohen Maltosegehalt aufweist, verwendet werden. Aufgrund seines natürlichen Ursprunges dürften der Verwendung des aus Reis gewonnenen Enzymes in Nahrungsmitteln zweifelsohne keine Bedenken entgegenstehen.

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines hochvergärten Bieres durch Vergären von Brauwürze mit Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß eine Reispullulanase in einer zur Reduzierung der Menge der Restdextrine im Wirkextrakt wirkasmenMenge zugesetzt wird, um die Alpha 1,6-Bindungen der Grenzdextrine aufzuspalten und Alpha 1,4-Dextrine zu bilden, die durch 1,4-Garbohydrasen zu vergärbaren Zuckern umgewandelt werden, welche durch die Hefe zu Alkohol vergärt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die s Reipullilanase in einer wirksamen Menge der Würze zugesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daB die Reispullulanase der Würze vor der Gärung zugesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reispullulanase der Würze während der Gärung zugesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reispullulanase der Würze zugesetzt wird, indem der Würze Reis zugesetzt wird, der die Pullulanase enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reispullulanase der Wurze als gereinigtes Enzym zugesetzt wird, das aus Reis extrahiert worden ist.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der zugesetzten Reispullulanase etwa 15 bis etwa 60 Einheiten Pullulanase pro Liter Würze beträgt.
8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reispullulanase in einer zur Reduzierung der Menge der Restdextrine im Wirkextrakt um etwa 30 % bis etwa 80 qd wirksamen Menge zugesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reispullulanase in einer Menge von etwa 2 Einheiten bis etwa 60 Einheiten Pullulanaseaktivität pro Liter Würze zugesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der WUrze eine 1,4~Carbohydrase zugesetzt wird, um die durch die Reispullulanase gebildeten Alpha 1,4-Dextrine in vergärbare Zucker umzuwandeln, die durch Hefe in Alkohol vergärt werden können.
11. Verfahren zum Extrahieren einer Pullulanase aus Reis, der enzymatisch aktiv ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Reis mit einem wässrigen Puffer von pH 6 bei einer Temperatur von etwa OOC bis etwa 600C behandelt wird, um einen Extrakt zu gewinnen, der die Pullulanase enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß ganzer Reis extrahiert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß in handelsüblicher Weise polierter Reis extrahiert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß entweder ganzer Reis oder in handelsüblicher Weise polierter Reis bei pH 6,0 in 0,1 M Kaliumphosphat-O,2 M NaCl bei 500C drei Stunden lang extrahiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Pullulanase-enthaltende Extrakt gegen eine Lösung aus einem sublimierbaren Salz dialysiert und gefriergetrocknet wird, um ein salzfreies Enzympulver zu erhalten, das lagerbeständig ist.
16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das sublimierbare Salz NH4HC03 ist.
17. Pullulanase, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Reis durch das Verfahren nach Anspruch 11 gewonnen worden ist.