DE3022063C2

DE3022063C2 - Verfahren zur Herstellung von Äthanol

Info

Publication number: DE3022063C2
Application number: DE3022063A
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita Osaka Chibata; Jyoji Yawata Kyoto Kato; Mitsuru Nara Wada
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1979-06-13
Filing date: 1980-06-12
Publication date: 1984-01-12
Also published as: FI71949C; IT8022740A0; ES8104407A1; FR2458586B1; DE3022063A1; BR8003540A; AU531176B2; FI71949B; GB2055121A; CA1143307A; SE450131B; FI801829A7; ES492372A0; FR2458586A1; US4350765A; AU5918180A; PH16533A; GB2055121B; SE8004386L; IT1132101B

Description

Aus Biotechnology and Bioengineering, Band 19, Seiten 387 bis 397 (ι ^77) ist es bekannt, daß man aus einem komplexen Enzymsystem von immobilisierter Hefe, die durch Immobilisierung von Hefezel.^n in Calciumalginatgelen erhallen wurde, Äthanol ai- Glukose herstellen kann.

Nach dem bekannten Verfahren wird die Umwandlungsreaktion von Glukose zu Äthanol durchgeführt, indem man immobilisierte Hefe mit einer Glukose- und -Calciumchlorid-haltigen Lösung behandelt. Die Produktivität dieses Verfahrens ist jedoch niedrig, weil die Äthanol bildende Aktivität der immobilisierten Hefe, niedrig ist und die Konzentratfon an gebildetem Äthanol liegt Im äußersten Fall bei etwa 50 mg pro ml der ReaktionsniSschung. selbst *enn man sehr lange Umwandlungen anwendet. Diese Verfahrensweise hat außerdem auch den Nachteil, daß sich mit Ablauf der Zeit die Enzymaktivität sehr schnei! verringert, weil andere Nährmittel als Glukose, wie sie für das Wachstum der Hefe erforderlich sind, bei der Umsetzung nicht verwendet werden.

Gemäß der Japanischen Patentveröffentlichung 135 295/1979 wird für die Äthanolherstellung eine dichte Schicht von Mikrobenzellen auf einem Trägergel gebildet, wobei die dichte Schicht der nach diesem Verfahren erhai!?n?n H^fPZ?!!?" ?lnp iSlhnnnlhllripndp Aktivität entwickeln, die mehr als lOmal so groß ist wie die einer durch übliche Hefefermentation erhaltene Kulturbrühe. So werden z. B. 50 mg/ml Äthanol gebildet, wenn man 100 mg'ml eines vergärbaren Zuckers mit der immobilisierten Hefe (1 m) des Gels) während einer Stunde in Berührung bringt. Die äthanolbildende Hefe oder der äthanolbildende Anaerobier, der nach diesem Verfahren Immobilisiert wurde, ist jedoch Immer noch nicht ausreichend für eine wirtschaftliche Herstellung von Äthanol, weil die äthanolbildende Aktivität der Immobilisierten Mikroorganismen merklich abnimmt, wenn ein vergärbarer Zucker In einer Konzentration von mehr als 150 mg/ml verwendet wird. Wird z. B. der immobilisierte Mikroorganismus mit 200 mg/ml des vergärbaren Zuckers in Berührung gebracht, so zeigt er nur 30% seiner Eigenaktivität, wogegen der immobilisierte Mikroorganismus im allgemeinen eine volle äthanolbildende Aktivität in Gegenwart von weniger als 100 mg/ml an vergärbarem Zucker zeigt. Wenn man somit die Umwandlungsreaktion eines vergärbaren Zuckers in Äthanol nach dem bekannten Verfahren ίο unter Verwendung von immobilisierten Mikroorganismen durchführt, so muß der vergärbare Zucker in einer Konzentration von weniger als 100 mg/ml eingesetzt werden und die Konzentration an gebildetem Zucker darf nicht mehr als 50 mg/m¹ betragen, weil anderenfalls der Zucker die Äthanolproduktivität des immobilisierten Mikroorganismus erheblich vermindert.

Aufgabe der Erfindung ist es. ein Verfahren zur Herstellung von Äthanol durch fermentative Umwandlung von Zucker in Äth;inol unter Verwendung einer auf einen Trägergel immobilisierten Hefe der Gattung Saccharomyces oder eines auf einem Trägergel immobilisierten anaeroben Bakteriums der Gattung Zymomonas und Abtrennen der gebildetes Äthanol enthaltenden Brühe zeigen, bei dem man Äthanol in hoher Konzentration gewinnt.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst.

Fig. 1 äst ein schematisches Fließbild gemäß einer Ausführungsform der Erfindung und zeigt eine Reihe von zylindrischen säulenartigen Reaktionsgefäßen;

Fig. 2 ist ein schematisches Fließbild und zeigt eine andere Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung einer umgekehrten konischen Säule, und

Fig. 3 ist ein schematisches Hießbild und zeigt eine '5 weitere Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung einer zylindrischen Säule mit einem Umlaufrohr.

Als Mikroorganismen werden eine Hefe oder ein Anaerobier verwendet, die in der Lage sind. Äthanol zu prodzleren. wobei die Mikroorganismen aus der Gruppe der Genera Saccharomyces und Zymonomas ausgewählt sind. Entsprechende Mikroorganismen sind bekannt und sind frei und ohne Vorbehalte erhältlich.

Jede der erwähnten Hefen oder Anaerobier, immobilisiert auf einem Trägergel, kann erfindungsgemäß verü/endet werden, wobei man die Immobilisierung der Mikroorganismen in bekannter Weise durchführen kann, z. B. nach dem Verfahren unter Verwendung von sulfatisiertem Polysaccharidgel (US-PS 4138 292). nach der Polyacrylamldgei-Melhode (Advances in Applied Microbiology. Band 22. Seite 1 (1977) und dergleichen. Gemäß der Erfindung kann man die Immobilisierung auch nach der «n der japanischen Veröffentlichung 135 295/1979 beschriebenen Weise durchführen Zum Beispiel kann man eine geringe Menge der Mikrobenzellen mit einer ein Gelmaterial enthaltenden Lösung vermischen und die erh'i!?e^np Mischung dann 7u Granulaten oder Folien durch bekannte Gellermethoden gelatisieren. ζ. Β indem man die Mischung tropfenweise zu einer Lösung eines Geliermittels gibt, wobei man Granulate oder Filme von 2 mm bis 5 cm Dicke mit einem Gehalt von 0.01 bis 10 Löffe/spftzen von MikrobenzelJen pro 100 g (Feuchfgewicht) des Gels erhält. Diese Gele werden dann in einer für das Wachstum der Mikroorganismen geeigneten Nährkulturbrühe bei 15 bis 45° C inkubiert, wobei man den gewünschten 'mmobilisierten Mikroorganismus erhält, der eine dünne Schicht der Mikrobenzellen in dem Trägergel enthält. Als Ausgangsgelmaterial kann man bekannte Gelmaterialien, wie sulfatlerte Polysaccha-

ride. Polyacrylamid (ζ. B. 2-Methyl-5-vinylpyridin-Methylmethacrylat-Methacrylatsäure-Copolymer), Natriumalginat. Polyvinylalkohol, Zeilulosesuccinat, Kaseinsuccinat und dergleichen verwenden. Jedes sulfatisierte Polysaccharid. das nicht weniger als 10 G/G %, vorzugsweise 12 bis 62 G/G %, Sulfat (-SOiH)-Gruppen im Molekül enthält, kann als eines der obenerwähnten sulfatisierten Polysaccharide verwendet werden und Beispiele für solche sulfatisierten Polysaccharide sind Carrageenan, Furcelleran und Zellulosesulfat. Carrageenan enthält etwa 20 bis 30 G/G % Sulfat (SOjH)-Gruppen im Molekül. Furcelleran enthält etwa 12 bis 16 G/G % Sulfatgruppen im Molekül. Zellulosesulfat mit einem Gehalt von 12 bis 62 G/G % an Sulfatgruppen .ill Molekül ist auf dem Markt erhältlich und kann sffordcsi :^h-r»falls auch durch übliche Veresterung von ZeIi ' -se mit Schwefelsäure hergestellt werden

Bei der Durchführung des erfindung';,.. :;oen Verfahrens stellt man zunächst eine N3hrb> ..c her. indem man Jn Wasser eine Quelle für SticS- .uIi, die ein Hefeextrakl, Maismaische, ein Pepton und <·<.-_!eichen löst, und ein oder mehrere andere Nährmittel, wie sie für das Wachstum eines Mikroorganismus benötigt werden. Solche anderen Nährmutel sind z. B. Vitamine, wie Tl.iamin. Biotin, Pantothensäure. Inosit und dergleichen. Minerale, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Natriumsalze, Kaliumsalze und dergleichen; Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid und Mischungen davon. Die Menge an diesen zugegebenen Nährmitteln ist für den Fachmann geläufig und liegt z. B. bei 0,05 bis 1,0 G/V % für die Stickstoffquelle. 0,0001 bis 0,1 G/V % an Mineral. 0.01 bis 1.0 G/V % an Ammoniumsalz, wobei die Vitamine zu der Nährbrühe in Spurenmengen zugegeben werden. Dann gibt man einen vergärbaren Zucker, wie Glukose. Fruktose, Saccharose oder Maltose zu der so hergestellten Nährbrühs und zwar in einer Konzentration von 5 bis 10 G/V ».. (d. h. 50 bis 100 mg/ml) bezogen auf die Nährbrühe, wobei man dann eine Kulturbrühe erhält. Melasse enthält sowohl vergärbaren Zucker, als auch die anderen für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Nährmittel. Deshalb kann man wäßrige Melasselösnngen per se als Kulturbrühe verwenden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann entweder diskontinuierlich oder kontinuierlich unter Anwendung von Säulenvorrichtungen bei einer Temperatur von 15 bis 45^C C. wie sie für das Wachstum von immobilisierten Mikroorganismen geeignet ist, angewendet werden. Bei einem aosatzweisen Verfahren bringt man den immobilisierten Mikroorganismus zunächst mit einer Kulturbrühe in Berührung, urn den vergärbaren Zucker in der Brühe in Äthanol umzuwandeln. Wenn dann die Konzentration in Zucker auf nicht mehr als etwa 20% der Ausgangskonzentralion und vorzugsweise nicht mehr als etwa 10 mg/ml erniedrigt ist. gibt man weitere frische Kulturbrühe, die den Zucker enthält, zu dem Umwandlungsreaktionssvstem. Ebenso wie vorher wird der neuzugegebene Zucker in Äthanol umgewandelt und die Konzentration in der Brühe nimmt wiederum ab. Man nimmt die Zugabe an frischer, den Zucker enthaltender Kullurbrühe vor, bis Äthanol in einer Konzentration von 100 mg/ml bis 400 mg/ml gebildet wurde. Die zusätzliche frische Kulturbrühe, die man zu dem Umwandlungsreaktionssystem gibt, enthält den vergärbaren Zucker In einer Konzentration, von nicht weniger als 100 mg/ml, vorzugsweise zusammen mit anderen Nährmitteln, wie sie für das Wachstum an immobilisierten Mikroorganismen erforderlich sind. Jedesmal, wenn man zusätzlich Brühe hinzufügt, kann man die Konzentration des Zuckers in der zuzugebenden Brühe allmählich auf 250 bis 400 mg/ml erhöhen.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren kontinuierlich durchgeführt, so wendet man eine Säulenvorrichtung an. "> in welcher die Säule mit einem immobilisierten Mikroorganismus gepackt ist. Zunächst wird die Kulturbrühe mit einem Gehalt von 50 bis 100 mg/ml eines vergärbaren Zuckers zusammen mit den Nährstoffen (die unterschiedlich sind von dem vergärbaren Zucker) und die υ erforderlich sind für das Wachstum der Mikroorganismen, in das eine Ende der Säule eingeführt, um den Zucker :n Äthanol zu überführen und die Brühe, die nun gebildetes Äthanol enthält, fließt am anderen Ende der Säule heraus. Die Zuführgeschwindigkeit der vorenvähnten Kulturbrühe wird so eingestellt, daß die Konzentration an Zucker in dem Abfluß der Säule nicht mehr als 20% der Anfangskonzentration und vorzugsweise nicht mehr als etwa 10 mg/ml ausmacht. Anschließend gibt man weitere Kulturbrühe, die nicn'. weniger als 2u 100 mg/ml an Zucker enlhält. in die Kolonne, wobei die Zuführgeschwindigkeit an der erwähnten frischen Kulturbrühe so eingestellt wird, daß die Konzentration des Zuckers in dem Abfluß nicht mehr als 2m- der Anfangskonzentration beträgt. Dann wird die Konzentration des Zuckers in der Kulturbrühe, die kontinuierlich in die Kolonne eingeführt wird, allmählich bis auf etwa 250 bis 400 mg/ml im Laufe der Zeit erhöht. Wenn dieses Verfahren durchgeführt wird, dann behält der immobilisierte Mikroorganismus über einen langen Zeitraum eine sehr gute Äthanolproduktivität bei und man kann Äthanol in hoher Konzentration, bis zu etwa 200 mg/ml, erzeugen.· Wendet man bei dem kontinuierlichen Verfahren eine Reihe von Kolonnen an, so kann man die Zuführgeschwindigkeit in der Eingangskulturbrühe so einstellen, daß die Konzentration des Zuckers in dem Abfluß aus der ersten Kolonne auf nicht mehr als 20% der Anfangskonzeniration, vorzugsweise nicht mehr als etwa 10 mg/ml erniedrigt wird, worauf man dann zusätzliche Kulturbrühe, die den Zucker enthält, in die zweite Kolonne zusammen mit dem Abfluß aus der ersten Kolonne einleitet, und dann wiederholt man diese ZufCiirmethode bei den folgenden Kolonnen. Man kann eine lange Kolonne verwenden, indem man die Zuführmeüge der Anfangskulturbrühe so einstellt, daß die Konzentration des Zuckers in einem bestimmten Teil der Kolonne auf nicht mehr als 20% der Ausgangskonzenlration erniedrigt wird, worauf man dann weitere, den Zukker enthaltende Kultuibrühe in den Teil der Kolonne einführt, in dem die Zuckerkonzentration erniedrigt ist. worauf man dann dieses Zuführverfahren in den nachfolgenden Teilen der Kolonne wiederholt. Dieses letztere Verfahren kann die Produktivität an Äthanoi pro Zeiteinheit und Äthanol außerordentlich wirksam erhöhen und c;möglicht die kontinuierliche Herstellung von Äthanol i.i hohen Konzentrationen.

Die Abtrennung der Brühe nach Beendigung der Umwandlungsreaktion kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z. B. durch Destillieren, Zentrifugleren und Dekantieren. Wendet man eine Säule an, so kann w man die Brühe eini.-ch als Abfluß aus der Säule abtrennen.

Γη den folgenden Beispielen wird die Erfindung Im einzelnen erläutert. Die Äthanol bildende Aktivität der immobilisierten Mikroorganismen wird a^Jiand der b5 Menge des gebildeten Äthanols bestimmt. Weiterhin ist festzuhalten, daß die Konzentration eines vergärbaren Zuckers In der Beschreibung, den Beispielen und den Ansprüchen so ausgedrückt Ist, daß sie sich jeweils auf

Glukose bezieht. Beispiel t

Eine Löffelspilze Sacch. sake IFO 2347 (Japan Stamm Kyokal 7) wurde m't einer sterilisierten 4,5 G/VMgert wäßrigen Lösung von Carrageenan (20 mi) bei 37° C vermischt. Die ivllschung wurde aifs einer Düse tropfen' weise zu einer 2 G/VWgen wäßrigen Lösung von Kaliumchlorid (200 ml) eingetropft, wobei man Gelkügelchen mit einem Durchmesser von 4 mm erhielt.

Eine Nährbrühe wurde hergestellt. Indem man ein Hefeexirakt (0.15 G/V %) Ammoniumchlorid (0.25 G/V ·.). Üikallumhydrogenphosphat (0.55 G/V %). Magnesiumsulfathepiahydrui (O.U25 G/V ¹V). Calciumchlorid (0.00! G/V %). Zitronensäure (0.1 G/V %) und Natriumchlorid (0.25 G/V %) in Wasser mischte und den pH auf *.Ο einstellte

7..\x dem oben erwähnten Gel wurde Glukose In einer Menge von 10 G/V ·ι, zugegeben und der oben erwähnte Gel wurde in der glukoschaltigen Brühe (500 ml) unter schwachem Schütteln 60 Stunden bei 30 C inkubiert, um die Hefe In dem Gel wachsen zu lassen. Die so erhaltene immobilisierte Hefe halte eine äthanolbildende Aktivität von 50 mg Äthanol/ml Gel/h

Die immobilisierte Hefe (20 ml) wurde mit der Nährbrühc. enthallend 10 G/V «,, Glukose (20 ml) eine Stunde bei 30° C in Berührung gebracht. Nachdem sich die Konzeption der verbleibenden Glukose in der Brühe auf 2 mg/ml erniedrig! hatte, wurde irische NShrbrühe mit einem Gehalt von 40 G/V % Glukose (10 ml) zugegeben Und die Umwandlungsreakllon von Glukose in Älhanol wurde unter den gleichen Bedingungen weitergeführt. Als Ergebnis erhielt man eine Äthano' in einer Konzentration von 100 mg/ml (30 ml) enthaltende Brühe nach einer Umwandlungsreaktion von 5 Stunden.

Beispiel 2

Nach dem im Beispiel I beschriebenen Verfahren wurde immobilisierte Hefe hergestellt. Die immobilisierte Hefe (20 ml) wurde mit einer Nährbrühe (der gleichen wie im Beispiel 1) enthaltend 10 G/V % Glukose (20 ml) während einer Stunde bei 30" C in Berührung gebracht. Nachdem sich die Konzentration der in der Brühe verbleibenden Glukose auf 2 mg/ml erniedrigt hatte, wurde zusätzlich frische Nährbrühe mil einem Gehall von 40 G/V -. Glukose (5 ml) zugegeben und die Umwandlungsreaktion von Glukose in Äthanol unter den gleichen Bedingungen eine Stunde weiter durchgeführt Anschließend wi-rde die Zugabe der 40 G/V -\, Glukose (5 ml) enthaltenden Nährbrühe noch dreimal in Abständen von einer Stunde wiederholt. Die immobilisierte Hefe behielt ihre Äthanol bildende Aktivität in einer Menge von 50 mg/ml Gel/h während der Reaktionszeit bei und man erhielt eine Äthanol in einer Konzentration von !25 mg/ml (40 ml) enthaltende Brühe nach einer Umwandlungsreaktionszeit von 5 Stunden. die Äthanol In einer Konzentration von 125 mg/ml (40 ml) nach jeder Umwandlungsreaktion nach 5 Stunden enthielt.

Beispiel 4

Eine Immobilisierte Hefe (20 ml), hergestellt nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, wurde In eine zylindrische SUuIe (Volumen: 30 ml) gepackt. Eine Nährbrühe (die gleiche wie im Beispiel I). enthaltend 10

m G/V % Glukose Wurde an einem Ende der SSuIe In einer Menge von 20 ml/h bet 30* C elngegebenrund floß über die immobilisierte Hefe und am anderen Ende der Kolonne mit der gleichen Geschwindigkeit ab. Nach oOstündlger Inkublerung bei 30 C. während der die Brühe in der vorerwähnten Zuführgeschwindigkeit eingeleitet wurde, wurde die Zufuhrmenge auf 7 ml/h reguliert, so daß de' AbIIuIi die Glukose In einer Konzentration von nicht mehr als 10 mg/ml enthielt. Unter diesen Bedingungen wurde die Glukosekonzentralion in der in die Kolonne eingeführten Nährbrühe allmählich so erhöht, daß die Glukosekonzentration 30 G/V %, bezogen auf die Brühe, nach 120 Stunden erreichte Während dieser Zeit erniedrigte sich die Äthanolbildungsaktivität der Immobilisierten Hefe nicht und man erhielt in dem Abfluß Äthanol In einer Konzentration von 150 mg/ml Wenn die 30 G/V % Glukose enthaltende Nährbrühe kontinuierlich in die Kolonne In einer Menge von 1 ml/h eingeleitet wurde, dann blieb die Immobilisierte Hefe in der Kob'ine für mehr als 1 Monat unverändert aktiv und

JO man konnte konstant in den Abfluß Äthanol in einer Konzentration von 146 mg/ml durchschnittlich erhalten

Beispiel 5

Die Bildung von Äthanol wurde durchgeführt unter

J5 Verwendung einer zylindrischen Kolonneneinrichtung, wie sie in Fig. I gezeigt wird, und die aus einer Reihe von 3 Kolonnen 1. 2 und 3 bestand. Jede Kolonne (Volumen: 30 ml) wurde nach dem Im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren zubereitet und mit immobilisierter Hefe

•40 (der gleichen wie Im Beispiel 1) in einer Menge von 20 ml gefüllt und die Zufuhrmenge der Nährbrühe (der gleichen wie im Beispiel 1). enthaltend 10 G/V % Glukose, betrug 20 ml/h bei 30° C während 60 Stunden. Die Kolonnen waren In Serie geschaltet. DIf Nährbrühe mit

■*5 einem Gehalt von 10 G/V % Glukose wurde in den Boden der Kolonne 1 durch die Zuführleitung 4 in einer Menge von 20 ml/h bei 30° C eingeleitet. Der Abfluß aus Kolonne I wurde In die Kolonne 2 zusammen mit einer Nährbrühe. die 40 G/V % Glukose enthielt und die p

so durcii eine Brühezuführungsleltung 5 in einer Menge von φ 5 ml/h eingeleitet wurde, eingeleitet. Ebenso w ,rde der fe Abfluß aus der Kolonne 2 zur Kolonne 3 geführt und ΰ, zwar zusammen mft einer 40 G/V % glukosehalifgen j| Nährbrühe, die durch eine Brühezuführungsleitung 6 in ||

einer Menge von 5 ml/h zugeleitet wurde- Auf diese g' Weise wurde konstant in einer Menge von 30 ml/h hin- ψ ter der Kolonne 7 an dem Auslaßrohr 7 ein Abfluß erhal- g ten, der Äthanol in einer Konzentration von 1 mg/ml fe enthielt. fs

Beispiel 3

Nach Durchführung des gleichen Verfahrens wie im Beispiel 2 wurde die immobilisierte Hefe durch Dekantieren gewonnen. Das im Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung der so gewonnenen immobilisierten Hefe und unter Bildung von Äthanol.

Die Äthanol bildende Aktivität der wiedergewonnenen 65 nährbrühe (100 mg/ml als Glukose) verwendete und die immobilisierten Hefe erniedrigte sich auch nicht nach der Wiedergewinnung und die BHdung von Äthanol wurde zehnmal wiederholt und man erhielt eine Brühe,

Beispiel 6

Das im Beispiel 4 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei man eine 20 G/Vtige wäßrige Melasse- ■ lösung anstelle der 10 G/V % Glukose in der Eingangs- j

Konzentration an wäßriger Melasse in der zusätzlichen Nährbrühe allmählich auf 60 G/V % erhöhte und wobei man kontinuierlich einen Abfluß enthielt, der Alkohol in ■

einer Konzentration von 142 mg/ml In einer Menge von 5 ml/h enthielt.

Beispiel 7

Die ÄthanolhersCJIung wurde durchgeführt mit einer umgekehrten konischen Säulenanordnung, wie sie In Flg. 2 gezeigt wird. Eine umgekehrte konische Säule I (Volumen: 30 ml) wurde zubereitet. Indem man In die Säule eJ"s Immobilisierte Hefe (20 ml), die in gleicher Welse, wi3 Im Beispiel 1, beschrieben wiirde, erhalten worden war, packte und dann die Nährbrühe (die gleiche wie tm Beispiel 1). enthaltend 10 G/V % ClukosC lri den Boden der Kolonne I durch eine Brühezuführungsleitung 4 in einer Menge von 20 ml bei 30° C einleitete und die Brühe am Kopf der Kolonne 1 durch ein Auslaßrohr 7 In der gleichen Menge entnahm. Nach 4OstündIger Inkublerung bei 30° C und Zuführung der Brühe In der vorerwähnten Zufuhrungsmenge wurde die Zufuhrungsmenge auf 6 ml/h eingestellt, damit In dem Abfluß Glukose in einer Konzentration von nicht mehr als 10 mg/ml enthalten war. Unter diesen Bedingungen wurde die Glukosekonzentration In der Nährbrühe, die In die Kolonne eingeleitet wurde, allmählich erhöht, so daß die Glukosekonzentration auf 35 G/V %, bezogen auf die Brühe, nach 72 Stunden anstieg. Während dieser Zelt erniedrigte sich die Äthanolbildungsaktivität der immobilisierten Hefe nicht und man erhielt konstant in dem Abfluß einen Äthanolgehall In einer Menge von 175 mg/ml. Wenn man die umgekehrte konische Kolonne verwendete, kann man Äthanol sehr wirksam herstellen, well COi-Gas. das sich bei der Umwandlungsreaktion des fermeruatlven Zuckers In Äthanol bildet, sehr wirksam entfernt wird.

Beispiel 9 Beispiel 8

35

Die Äthanolherstellung wurde durchgeführt unter Verwendung einer zylindrischen Säulenanordnung mit einem Zirkulationsrohr wie In Flg. 3 gezeigt. Eine Kolonne I mit einem Zirkulationsrohr 8, durch welches ein Teil der durch die Kolonne 1 fließenden Brühe In den Boden der Kolonne zirkuliert wurde, wurde mit einer immobilisierten Hefe (25 ml), die In gleicher Welse wie Im Beispiel 1 hergestellt worden war, gepackt, worauf dann 20 G/V % einer wäßrigen Melasselösung (100 mg/ml als Glukose) In den Boden der Kolonne 1 durch die Brühezufuhrleitung 5 In einer Menge von 25 ml/h bei 30° C eingeleitet wurden und durch die Immobilisierte Hefe in der Kolonne strömte und am Kopf der Kolonne In der gleichen Menge wie der Zufuhr- so menge durch ein Auslaßrohr 7 ausströmte. Nach 40stündlger Inkublerung bei 30° C. während der die Brühe In der vorerwähnten Zufuhrmenge zugegeben wurde, wurde eine 50 G/Vsige wäßrige Melasselösung (250 mg/ml als Glukose) In die Kolonne I In einer Menge von 10 ml/h eingeleitet, während ein Teil der durch die Kolonne fließenden Brühe vom Boden der Kolonne durch die Leitung 8 in einer Menge von 100 ml/h Im Kreislauf geführt wurde. Die Konzentration der durch die Leitung 8 zirkulierenden wäßrigen Melasse erniedrigte sich auf nicht mehr als 10 mg/ml Glukose. Unter diesen Bedingungen erniedrigte sich die Äthanolbildungsaktivität der Immobilisierten Hefe nicht und aus dem Rohr 7 konnte kont'-nulerllch ein Abfluß mit einer Äthanolkonzentratlon von 125 mg/ml abgezogen werden, well die Konzentration der wäßrigen Melasse in der der Kolonne zugeführten Brühe mit der umlaufenden Brühe durch die Leitung 8 verdünnt wurde.

Eine Löffelspitze Zymomonas moblls IFO 13 756 wurde mit einer sterilisierten 4,5 G/V^lgen wäßrigen Carageenanlösung (20 ml) bei 37⁰C vermischt. Die Mischung wurde tropfenweise aus einem Gel zu einer 2 G/Vibfgen wäßrigen Kaliumchloridlösung (200 ml) gegeben, wobei man kugelförmige Gelperlchen mit 4 mm Durchmesser erhielt.

Eine NährbrUhe wurde hergestellt, Indem man Hefeexjräkt (0J5 G/V ski), Ammohlurrichlorld: (0,25 p/V %), Dlkaliümnyärogeriphosphat (0.55 G/V ¹V). Magheslumsulfat-Heptahydrat (0,025 G/V %), Calciumchlorid (0.001 G/V \), Zitronensäure (0,1 G/V %) und Natriumchlorid (0,25 G/V %) in Wasser vermischte und den pH auf 6,8 einstellte.

Zu der Nährbrühe wurde Glukose In einer Konzentration von 10 G/V % gegeben und das vorerwähnte GeJ wurde in der glukosehaltlgen Brühe (500 ml) 90 Stunden bei 30" C unter Stickstoff und unter Wachsen des Anaeroblers In dem yel inkubieri. Der Immobilisierte Anaerobler hatte eine Äthanol prodzlerende Aktivität von 77 mg Äthanol/ml Gel/h.

Der Immobilisierte Anaerobier (20 ml) wurde mit der 10 G/V <v, Glukose (20 ml) enthaltenden Nährbrühe 45 Minuten bei 30^J C in Berührung gebracht. Nachdem sich die Konzentration der verbleibenden Glukose In der Brühe auf 2 mg/ml erniedrigt hatte, wurde zusätzliche frische Nährbrühe mit einem Gehalt von 40 G/V % Glukose (10 ml) zugegeben und die Umwandlungsreaktlon von Glukose In Äthanol wurde unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt. Man erhielt eine Brühe, die Äthanol In einer Konzentration von 100 mg/ml (30 ml) enthielt nach einer Umwandlungsreaktionszeit von 2 Stunden, ohne daß sich die Aktivität des immobilisierten Anaerobiers erniedrigte.

Beispiel 10

Wie In Beispiel 9 wurde ein Immobilisierter Anaerobier hergestellt. Der Immobilisierte Anerobler (20 ml) wurde mit der gleichen Nährbrühe, wie Im Beispiel 3, enthal tend 10 G/V % Glukose (20 ml) 40 Minuten bei 30° C In Berührung gebracht. Nachdem die Konzentration der zurückbleibenden Glukose In der Brühe sich auf 2 mg/ml erniedrigt hatte, wurde zusätzliche frische Nährbrühe mit einem Gehalt von 40 G/V % Glukose (5 ml) zugegeben und die Umwandlungsreaktlon von Glukose in Äthanol wurde weitere 40 Minuten unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt. Anschließend wurde die Zugabe der Nährbrühe mit einem Gehalt von 40 G/V % Glukose (5 ml) noch dreimal In 40mlnütlgen Anständen wiederholt. Der Immobilisierte Anaerobier hielt seine Äthanolproduktionsaktivität auf einem Niveau von 77 mg Äthanol/ml Gel/h und die Äthanolkonzentratlon In der Brühe betrug nach einer Umwandlungsreaktlonszeli von 200 Minuten 125 mg/ml (40 ml).

Beispiel Π

Man arbeitet in gleicher Welse wie Im Beispiel 10; wobei der Immobilisierte Anerobler durch Dekantieren gewonnen wurde. Das Im Beispiel 10 beschriebene Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung des wiedergewonnenen immobilisierten Aneroblers und unter Bildung von Äthanol. Die Äthanolproduktionsaktivität des wiedergewonnenen immobilisierten Anaerobiers erniedrigte sich auch nach der Wiedergewinnung nicht und die Herstellung von Äthanol wurde zehnmal wiederholt, wobei man eine Brühe erhielt, die Äthanol In einer Kon-

zentratlon von 125 mg/ml (40 ml) am Ende einer jeden Umwandlungsreaktion von jeweils 200 Minuten enthielt.

Beispiel 12

Nach dem im Beispiel 5 beschriebenen Verfahren wurde Äthanol hergestellt unter Verwendung einer zylindrischen Säulefanordnung, wie sie in Flg. 1 gezeigt wurde. Jede Kclonne (Volumen: 30 ml) wurde zubereitet, indem man den In Beispiel 9 hergestellten Immobilisierten Anaerobier (20 ml) In die Kolonne packte Und dann in einer Menge von 30 ml/h während 90 Minuten bei 30⁰C Nährbrühe (die gleiche wie Im Beispiel 9) mit einem Gehalt von 10 G/V % Glukose einleitete. Dann wurden die Säulen 1, 2 und 3 In Serie geschaltet. Die 10 G/V % Glukose haltige NShrbrühe wurde durch die Brühezufuhrleitung 4 In einer Menge von 30 ml/h bei 30° C In den Boden der Kolonne 1 eingeleitet. Der Abfluß aus der Kolonne 1 wurde dann zusammen mit einer 40 G/V°k,lgen Glukose, die durch die Leitung 5 In einer Menge von 7 ml/h eingeleitet wurde. In die Kolonne 2 eingeleitet. Ebenso wurde der Abfluß aus Kolonne 2 in die Kolonne 3 eingeleitet, und zwar zusammen mit einer Nährbrühe, die durch die Leitung 6 In einer Menge von 7 ml/h und mit einem Gehalt von 40 G/V % Glukose In die Kolonne 3 eingeleitet wurde. Durch das Auslaßrohr 7 der Kolonne 3 erhielt man kontinuierlich einen Äthanol in einer Konzentration von 100 mg/ml enthaltenden Abfluß in einer Menge von 44 ml/h.

Beispiel 13

Bei dem In Beispiel 10 beschriebenen Verfahren wurden 20 G/V % einer wäßrigen Melasselösung anstelle der Glukose in der eingangs Nährbrühe (100 mg/ml als Glukose) verwendet und die Konzentration der wäßrigen Melasse wurde s'lmähllch auf 60 G/V * erhöht, wobei man sine Äthanol In einer Konzentration von 125 mg/m) (40 ml) enthaltenden Brühe nach einer Umwandlungszelt der wäßrigen Melasse In Äthanol von 3 Stunden erhielt.

Beispiel 14

Nach dem Im Beispiel 8 beschriebenen Verfahren wird Äthanol hergestellt unter Verwendung einer zyllndrlsehen Säulenanordnung mit einer Zirkulationsleitung, wie In Flg. 3 gezeigt. Eine Kolonne 1 wurde zubereitet, indem man in diese einen Immobilisierten Anaerobier (25 ml), der nach dem Verfahren gemäß Beispiel 9 erhalten worden war, packte, und dann 20 G/V % einer wSßrigen Melasselösung (100 mg/ml als Glukose) In den Boden der Kolonne I durch die Leitung 5 in einer Menge von 40 mg/h bei 30° C während 90 Stunden einleitete, und In der gleichen Menge am Kopf der Kolonne durch die Auslaßleitung 7 den Abfluß entnahm. Dann wurden 50 G/V % der Melasseiösung (250 mg/ml als Glukose) In die Kolonne I In einer Menge von 15 ml/h eingeleitet, wahrend ein Teil der durch die Kolonne fließenden Brühe zu dem Boden der Kolonne durch die Zirkulationsleitung 8 In einer Menge von 100 ml/h zirkuliert wurde. Die Konzentration der wäßrigen Melasse, die durch dte Leitung 8 zirkulierte, erniedrigte sich auf nicht weniger als 10 mg/m! als Glukose. Unter diesen Bedingungen wurde die Äthanolproduktionsaktlvltäl des Immobilisierten Anaeroblers nicht erniedrigt und aus der

ω Leitung 7 floß kontinuierlich ein Abfluß, der Äthanol In einer Konzentration von 125nig/ml enthielt, weil die Konzentration der In die Kolonne eingeleiteten wäßrigen Melasse durch die durch die Leitung 8 zirkulierende Brühe verdünnt war.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

30 22 06?

Verfahren zur Herstellung von Äthanol durch fermentative Umwandlung von Zucker In Äthanol unter Verwendung einer auf einem Trägergel immobilisierten Hefe der Gattung Saccharomyces oder eines auf einem Trägergel immobilisierten anaeroben Bakteriums der Gattung Zyrriomonas. und Abtrennen der gebildetes Äthanol enthaltenden Brühe, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwandlung durch folgende Schritte vorgenommen wird:

(1) in-Berührung-bringen des immobilisierten Mikroorganismus mit einer 50 bis 100 mg/ml einer vergärbaren Zucker enthaltenden Nährkulturbrühe;

O) mikrobiologische Umwandlung des Zuckers in Äthanol, bis die Konzentration des Zuckers auf nicht mehr als 20<v. der Ausgangskonzentiv.lon erniedrigt Ist;

(3) Zugabe zu der Umwandlungsreaktion von zusätzlicher frisc^r Kulturbrühe. die nicht weniger als 100 mg des Zuckers pro ml enthält, bis Äthanol in einer Konzentration von 100 bis 400 mg pro ml Brühe gebildet ist;

(4) Abtrennen der gebildetes Äthanol enthaltenden Brühe.