DE3017152A1

DE3017152A1 - Mittel fuer die herstellung einer blut-vergleichsueberwachung, verfahren zu ihrer herstellung und verduennung hierfuer

Info

Publication number: DE3017152A1
Application number: DE19803017152
Authority: DE
Inventors: Jun David Lee Chastain; Harold Richardson Crews; Stephen Lawrence Ledis
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1979-05-07
Filing date: 1980-05-05
Publication date: 1980-11-27
Also published as: US4299726A; FR2456325A1; JPS6258470B2; DE3017152C2; GB2049929A; FR2456325B1; JPS55151265A; HK10486A; CA1141634A; GB2049929B

Description

Patentanwalt Dipl.-ing. E. Eder

München«, EllsabethatraB·34

COULTER ELECTRONICS, INC. Hialeah, Florida, IT.S.A,

Mittel für die Herstellung einer Blut-Vergleichsüberwachung, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verdünnung hierfür

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Patentanwalt· Dlpl.-lng. E. Eder - 7 -

Dlpl.-Ing. K. Schiesohke München 40, EllsabethetraBe 34

COULTER ELECTRONICS, INC. 3017152

Hialeah, Florida, USA

Mittel für die Herstellung einer Blut-Vergleichsüberwachung. Verfahren zu ihrer Herstellung und Verdünnung hierfür

Die Wichtigkeit von Qualitats-Kontrollsystemen in klinischen hämatologischen Laboratorien wird weitgehend anerkannt. Besonders wichtig ist der Einschluß von vergleichenden Überwachungen von Blutzellen, welche die Genauigkeit und Präzision von elektronischen Blutkörperchen-Zähleinrichtungen auf die Probe stellt. In der Vergangenheit wurden Standard-Suspensionen verwendet, die aus künstlichen Latexpartikeln und Erythrozyten bestanden, und welche in Fixativen, wie z.B. Glutaraldehyd und Formalin aufbereitet waren. Diese Präparate haben jedoch eine Anzahl von Nachteilen,und zwar: 1)stören sie die Form und das Volumen der roten Blutkörperchen, 2)wird die Viskosität der Suspensionsmittel erhöht, 3) kommt es zu einer Agglutination der fixierten Erythrozyten und 4) ist es nicht möglich, gleichzeitig eine Erythrozytenzählung und eine Hämoglobinbestimmung durchzuführen. Eine Reihe von kommerziellen Gesellschaften hat modifizierte, das vollständige Blut umfassende Vergleichsmittel herausgebracht, welche für die überwachung von elektronischen Zählern geeignet sind, aber es ist nach wie vor ein Bedarf nach einer verbesserten Stabilität des Vergleichs- und überwachungs-

um
materials festzustellenT/die Genauigkeit der Zählwerte der roten Blutkörperchen und anderer Parameter einhalten zu können, wenn mittels elektronischer Zählmethoden gearbeitet wird.

Elektronische Zähler nach, diesem Prinzip wurden zuerst in dem US-Patent 2 656 508 von Wallace H. Coulter angegeben, wobei eine genaue Wiedergabe der Teilchenzählung möglich ist. Uberwachungs- und Vergleichsmittel für voll-

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ständiges Blut sollten die Eigenschaften von frischem menschlichen Blut so genau wie möglich wiedergeben. Es wurden Versuche gemacht, um Partikel passender Größe in stabilen Suspensionen zu erhalten, und zwar beispielsweise durch den Gebrauch von Unkrautpollen, Polystyrol, Latex, verschiedener organischer Materialien und gebeizter roter Blutkörperchen. Keine dieser Suspensionen hat sich jedoch als Standard für die Zählung roter Blutkörperchen geeignet erwiesen.

Das der Coulter Electronics, Inc. von Hialeah, Florida erteilte US-Patent 3 5/f9 9$if beschreibt einen Coulter-Zähler des Modells S, welcher ein halbautomatisch arbeitendes analytisches Gerät darstellt, das die Bestimmung von sieben Blutparametem gleichzeitig gestattet,und zwar die Zahl der weißen Blutkörperchen (WBC), die Zahl der roten Blutkörperchen (RBC), das Hämoglobin (Hb), das Hämatokrit (HCT), das mittlere Zellvolumen (MCV), das mittlere Zellhämoglobin (MCH) und die mittlere Zell-Hämoglobin-Konzentration (MCHC). Die Werte für .das (WBC), (RBC), (Hb) und (MCV) werden durch direkte Ablesung erhalten, während die Größen (HCT), (MCH) und(MCHC) elektronisch berechnet werden. Die Messung dieser sieben Parameter kann entweder mit vollständigem Blut oder mit kapillarem Blut durchgeführt werden. Etwa ein Milliliter (ml) von vollständigem Blut wird für eine Makromessung benötigt, während kk>7 Mikroliter von Kapillarblut für eine Mikromessung erforderlich sind, wobei das Blut in 10 ml einer ausgewogenen isotonischen Salzlösung oder anderen passenden Verdünnungen enthalten sind.

Die Qualitätskontrolle des Coulter-Zählers Modell S wird erreicht mit der Coulter-Zähler-Zellkontrolleinrichtung 4C, welche eine modifizierte Vergleichsüberwachung für vollständiges Blut darstellt und auf der Basis von frischem menschlichem Blut arbeitet. Es ist stabil für etwa 30 Tage bei 2⁰C bis 8⁰C, und es ist stabil für 3 Stunden bei Raumtemperatur, und zwar bevor das mittlere Zellvolumen (MCV)

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beeinträchtigt wird. Die Zell-Uberwachungseinrichtung l±C wird nicht als ein Kalibrierungsstandard benutzt. Viele Bedienungspersonen haben frisches Blut von normalen Personen benutzt, um den Coulter-Zähler Modell S zu kalibrieren. Andere geeignete Bezugs- und Vergleichsmittel dürften ebenfalls benutzt worden sein.

Eine Vielzahl von Standard-Suspensionen wurden ebenfalls benutzt, um die Zeil-Zählungen zu überwachen. Ein wesentlicher Nachteil dieser Suspensionen besteht darin, daß sie jeweils nicht eine vollständige menschliche Blutprobe simulieren. Beispielsweise liefert keine die notwendigen Komponenten für die gleichzeitige Messung der sieben Blutparamet.er, welche vorstehend erwähnt v/orden sind.

Die spezifischen Parameter der roten Blutkörperchen, welche man unbedingt messen sollte, bestimmen die notwendigen Charakteristiken eines passenden Rediums für eine Überwachung und für einen Vergleich mit vollständigem menschlichen Blut. Es ist erwünscht, das Volumen der roten Blutkörperchen zu kennen. Wenn diese Messung einmal durchgeführt ist und die roten Zellen gezählt worden sind, dann kann das gepackte (verdichtete) Zellvolumen oder Hämatokrit (HCT) berechnet werden. Das Vergleichs- und Uberwachungsmedium sollte auch in der Lage sein, das Volumen der roten Blutkörperchen in der Probe im Gleichgewicht zu halten und zu stabilisieren, so daß das kubische Volumen (MCV) gemessen werden kann.

Das Medium muß in der Lage sein die chemische und physikalische Unversehrtheit der roten Blutkörperchen vor und während des Meßverfahrens zu gewährleisten. Es wird verlangt, daß die Blutkörperchen die gleichen physikalischen Eigenschaften im Medium beibehalten wie sie sie vorh.er hatten. Ein weiterer Parameter, nämlich die Verteilungs— breite der roten Blutkörperchen (RDW) verlangt auch die Stabilität der Verteillang der roten Blutkörperchen. Für

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diesen Zweck muß das Medium im Bezug auf die Lösungen in den Blutzellen isotonisch sein.

Der Coulter-Zähler Modell S Plus, welcher in der Lage ist, Größe und Zahl von Plättchen aus vollem menschlichen Blut festzustellen, deren Durchmesser nur 1/2 bis 1/3 der Erythrozyten betragen, erfordert eine Überwachung in der Art der Zell-Überwachungseinrichtung ^C und macht es zusätzlich notwendig, eine Überprüfung auf Plättchen oder Materialien durchzufürhen, welche die menschlichen Plättchen in Größe und Verteilung simulieren. Dies ergibt eine Schwierigkeit dahingehend, daß jegliche in dem Volumenbereich und Verteilungsbereich von menschlichen Plättchen liegende Partikel eine Verfälschung des Resultats ergeben, weil das Vorhandensein fremder Partikel ihre Zählung als Blutzellen zur Folge hat. Umfangreiche Hintergrundzählungen auf Grund von irgendwelchen zertrümmerten Teilchen können nicht zugelassen werden Deshalb ist es erforderlich, daß das Bezugs- und Vergleichsmittel für das volle menschliche Blut freigehalten? von irgendwelchen Teilchen, welche möglicherweise Störungen oder Fehler im niedrigen Größenbereich ergeben wurden, deren Schwellen nach Größe Und Verteilungen denen menschlicher Plättchen entsprechen. Zugleich muß das Medium bakteriostatische Eigenschaften aufweisen, um dadurch das Wachsen von Mikroorganismen nach der Zusammenfügung des Mediums zu vermeiden.

Elektronische Zähleinrichtungen, welche sich auf neue diagnostische Parameter beziehen, haben es notwendig gemacht, stabiliere Bezugs- und Vergleichsmedien zu schaffen.'Ein solcher Parameter 'ist die Messung der Breite der Verteilung der roten Blutkörperchen. Normalerweise, d. h. unter bestimmten definierten Bedingungen, beispielsweise bei der Verwendung von Fixativen (Glutaraldhyd-Formaldehyd^Suspensionen)werden zwar stabile Verteilungen von roten Blutkörperchen erhalten. Jedoch haben diese Präparate eine Anzahl von Nach-

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teilen.

Die Erfindung betrifft ein Mittel für die Bereitung von vollständigen Blut-Vergleichs-Uberwachungen mit Langzeitstabilität für Geräte, die mit elektronischen Mitteln vollständige Blutbestimmungen durchführen.

Das Mittel ist dadurch gekennzeichnet, daß eine wässerige Lösung vorgesehen ist, die folgende Komponenten enthält:

a) Laktose

b) mindestens ein Fungizid

c) mindestens ein Antibiotikum

d) mindestens eine chemische Substanz, welche die roten Blutkörperchen-Membranen ändert und welche aus den folgenden Gruppen ausgewählt ist:

1) Gallensalze und Cholsäurederivate

2) Phenothiazin-Verbindungen mit antihistaminen Eigenschaften und

3) 4-Aminobenzoesäureesterderivate und die Salze hiervon, welche lokale anästhetische Eigenschaften aufweisen

e) Rinder-Albumin.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren für die Herstellung einer vollständigen Blut-Vergleichs-Überwachung mit Langzeitstabilität für Geräte, die mit elektronischen Mitteln vollständige Blutbestimmungen durchführen, und zwar insbesondere für die Bestimmung von Parametern, welche die Zählung von Plättchen, das mittlere Zellvolumen und die Verteilungsbreite der roten Blutkörperchen einschließen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist gekennzeichnet durch folgende Schritte:

a) Entfernung des Plasmas aus dem vollständigen Blut, um gepackte rote Blutkörperchen zu erhalten;

b) Verdünnen der gepackten roten Blutkörperchen in einer vorbehandelnden Verdünnung;

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c) Stehenlassen der Verdünnung nach Schritt b) für eine vorbereitende Zeit und Temperatur, welches eine Vorbehandlung der roten Blutkörperchen äquivalent der Korabination von etwa zwei Tagen bei 22⁰C bis 27°C ergibt, um die gewünschte Volumen- und Größenverteilungsbreite zu erhalten;

d) Trennung der vorbehandelten roten Blutkörperchen von der Verdünnung nach Schritt c) und

e) Hinzufügen einer genügenden Menge der vorbehandelten roten Blutkörperchen nach Schritt d) zu dem vorgenannten Mittel, um den gewünschten Zählwert für die vollständige Blut-Vergleichs-Überwachung zu erhalten.

Die Erfindung betrifft auch eine vorbehandelnde Verdünnung für die Steigerung der Trennung roter Blutkörperchen von anderen Komponenten des vollständigen Blutes zur Anwendung bei der Herstellung von vollständigen Blut-Vergleichsüberwachungen, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß die Verdünnung Laktose und einen nicht-ionischen Schaumerzeuger enthält.

Der erfindungsgemäße Prozeß schließt die genannte vorbehandelnde Verdünnung ein, die relativ schnell das Volumen der roten Blutkörperchen reduziert, außerdem die Weite ihrer Größenverteilung stabilisiert und noch andere vorteilhafte Eigenschaften aufweist. Das Medium für den Vergleich und die überwachung von vollständigem Blut ist im wesentlichen frei von Teilchen in der unteren Größenverteilung, welche denen menschlicher Plättchen größenmäßig entsprechen. Das Medium hat auch eine Langzeitstabilität für einen Gebrauch bis zu 6 Monaten und enthält Laktose, eine oder mehrere Fungizide und Antibiotika,und außerdem vorzugsweise Mittel, welche Purin- Nukleotide oder Nukleoside, wie ζ,B. 5'-AMP,Adenine und Inösine;T"A"uch können zweckmäßig Ingredenzien hinzugefügt werden, welche die Membran der roten Blutkörperchen ändern. Diese schließen

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ein Galle-Derivate, wie z.B. Cholsäure, Desoxycholsäure und dgl. Phenothiazin-Verbindungen und die Salze hiervon, welche antihistamine Eigenschaften haben, wie etwa Phenergan, 4-Aminibenzoesäureester-Derivate und ihre Salze, welche lokale Anä£thetika darstellen, wie etwa Procain.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vollständiges menschliches oder tierisches Blut zuerst zentrifugiert, um dicht gepackte rote Blutkörperchen zu erhalten. Dann werden die gepackten roten Blutkörperchen wieder in einer vorbereitenden Verdünnung suspendiert, welche deren Volumen reduziert und die Zellen-Größen-Verteilungsbreite stabilisiert in der Aufbereitung infolge der Behandlung durch das Medium. Ein bevorzugter Ansatz für die vorbereitende Verdünnung ist folgendermaßen gewählt:

Ein Liter: ungefährer Wert: Laktose (Lactose)
Natriumazid (Sodium azide)

Trinatriumzitratdihydrat (Trisodium citrate dihydrate)

Zxtronensäuremonohydrat (Citric acid monohydrate)

Nicht-ionischer Schaumerzeuger

(non-ionic surfactant-Pluronic F68) 1,0 g 0,25-1,5 gms/L

Wasser ' QS bis 350 mOs/kg

pH 6,8-7,0 zugelassener pH-Bereich 6,5-7,5

Osm=35O-36O m0sm/kg

Die Vorbehandlung der Suspension von roten Blutkörpercnen in der Verdünnung wird vozugsweise bei 22⁰C bis 27°C für eine Zeit von 48 Stunden erreicht. Dieser kurze Zeitraum von zwei Tagen der Vorbehandlung ist ein bemerkenswerter Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik, welcher es erforderlich machte, in vitro rote Blutkörperchen 15 bis 21 Tage zu behandeln, um eine Größen- und Verteilungsbreite-Stabilisierung zu erhalten. Wenn die Vorbehandlungs-Verdünnung bei einer geringeren als der Umgebungstemperatur

* gms/L = Gramm pro Liter

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90,0	g	25-1	00	gms/L
1,5	g	0,5-4	,0	gms/L
5,0	g	2,5-5	,0	gms/L·
0,1	g	0,05-0	,2	gms/L

einwirkt, dann sind mehr als zwei Tage notwendig,- wobei Zeit und Temperatur im umgekehrten Verhältnis zueinander stehen. Nach dieser Vorbehandlung kann die Suspension bei Ii- C bis 6 C aufbewahrt werden,bis sie zum Mischen mit dem Medium nach dieser Erfindung fertig ist. Zu dieser Zeit · werden die vorbehandelten roten Blutkörperchen aus der Verdünnung herausgepreßt, beispielsweise durch Zentrifugieren, und mit dem Medium gemischt. Die Menge der roten Blutkörperchen, welche dem Medium hinzugefügt werden, hängt ab von den gewünschten Zählparametern der Zellen, welche für die jeweiligen Überwachungsvorgänge benötigt werden.

Die Vorbehandlungs-Verdünnung hat zwei zusätzliche Eigenschaften: sie erhöht die Geschwindigkeit der Sedimentation der roten Blutkörperchen während des freien Standes und während der Zentrifugierung und es entwickelt an der Übergangsstelle zwischen der (schwimmenden) Verdünnung und den gepackten roten Blutkörperchen eine deckenartige Gruppierung der weißen Blutkörperchen und Plättchen des vollständigen Blutes. Auf diese Weise erhöhen diese Eigenschaften die Trennbarkeit der roten Blutkörperchen von den Rückständen

Blut

der beim vollständigen/vorhandenen Bestandteile:, und vermeiden ein wiederholtes "Auswaschen" der roten Blutkörperchen, um sie abzutrennen. Trennverfahren und Verdünnungen nach dem bekannten Stand der Technik machen wiederholte Waschungen nötig, welche die roten Blutkörperchen schädigen und eine höchst unerwünschte Hämolyse zur Folge haben. Auch treten erhebliche Verluste von roten Blutkörperchen während der Entfernung der unerwünschten Komponenten aus dem vollständigen Blut auf. Dies hat zur Folge, daß bei den Trenn- ■ verfahren nach dem bekannten Stand der Technik ein Kompromiß geschlossen werden muß zwischen der Vollständigkeit auf der einen Seite und der Schädigung auf der anderen Seite.

Die Komponenten der Vorbehandlungs-Verdünnung, welche in erster Linie verantwortlich sind für die Erreichung der gerade beschriebenen Vorteile, sind die Laktose und doer

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nicht-ionische Schaumerzeuger, wobei vorzugsweise Pluronic F68, welches von der Wyandotte Chemicals Corporation, Wyandotte, Michigan hergestellt wird» Laktose, ein polyhydrisches Karbohydrat scheint eine gewisse Polarisation der weißen Blutkörperchen und der Komponenten der Zellwände der Plättchen zu bewirken in polare und nicht-polare Bereiche« Pluronic F68 ist eine Polyoxypropylen-Kette (hydrophob) mit Polyoxyäthylen (hydrophilen) Gruppen an den Enden,, Als solches hat es sowohl hydrophobe(nicht-polare), als auch hydrophile (polare) Eigenschaften«, Offensichtlich ermöglicht diese Eigenschaften daß das Pluronic F68 an entsprechende Bereiche der durch die Laktose modifizierten Zellwände angezogen wird₉ wodurch eine gewisse Adhäsion entsteht» Dieser Vorgang erzeugt die Charakteristik der Bildung von "Matten" von den weißen Blutkörperchen und . Plättchen und ergibt auch eine günstigere Sedimentation der roten Blutkörperchen„

Das neue verbesserte Medium nach dieser Erfindung enthält Laktose, eine oder mehrere Fungizide und Antibiotika oder Mischungen hiervon und auch ergänzende Mittel, welche Purin₉ Nukleotid oder Nukleosid einschließen,wie beispielsweise 5'-AMP, Adenin und Inosin» Es enthält auch zusätzliche Komponenten, welche vorher nicht bei der Überwachung von vollständigem Blut angewandt worden sind, und welche die Membranen der roten Blutkörperchen ändern» Diese neuen Ingredenzien sind 1)'Gallensalze und Cholsäurederivate , 2) Phenothiazin-Verbindungen und die Salze davon, welche antihistamine Eigenschaften haben und 3) if-Aminobenzoesäureesterderivate und die Salze davon_} welche lokale anästhetische Eigenschaften haben» Diese Komponenten tragen nicht nur zu der Langzeitstabilität des Mediums bei, sondern machen sie auch im wesentlichen frei von besonderen Stoffen, vor allem im Bereich von kleineren Teilchengrößen.

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Obwohl natürliche Galle eine Anzahl von Substanzen enthält, sind die für diese Erfindung interessanten Ver-< bindungen die Gallensalze, welche Amide der Cholsäure sind, in der Glyzin oder Taurin mit der Steroidsäure durch eine Peptid-Bindung verbunden ist, was eine Ausbeute von jeweils Glykocholsäure und Taurocholsäure. Cholsäure und Dehydrocholsäure, welche von der Cholsäure durch Oxidation erhalten v/ird, sind ebenfalls nützlich.

Phenothiazin-Verbindungen, welche antihistamine Eigenschaften haben, schließen die folgenden Verbindungen und die pharmazeutisch aktiven Salze hiervon ein, und zwar einschließlich der Hydrochloride, der Tartrate und dgl. Beispiele derartiger Verbindungen schließen Phenothiazine ein, welche auch unter den Bezeichnungen Methdilazin HCI, Trimeprazintartrat, Promethazin HCI (Phenergan) und Pyrathiazin HCI bekannt sind. Diese Verbindungen werden unter vielen Handelsnamen verkauft. Die Grundstruktur dieser Phenothiazin-Verbindungen ist:

wobei der Substituent R eine substituierte Aminoalkyl- oder Pyrrolidinylalkyl-Gruppe ist.

Lokale anästhetische Verbindungen, die für diese Erfindung nützlich sind, enthalten gewisse 4-Aminobenzoesäureester und Derivate hiervon mit den Strukturen RHN-CgH,-COOR'oder RHN-CgH.-COOCH₂CH₂R',wobei R Wasserstoff und einen niedrigen Alkyl darstellt und R¹ einen niedrigen Alkyl. . Dialkylaminoalkyl und Dialkylamino bedeutet. Beispiele solcher Verbindungen schließen ein Benzokain, Prokain, Butakain, Tetrakain und Monokain. Eine besonders bevorzugte Verbindung ist Prokain. Die Verbindungen sind als Basen oder als Salze zu gebrauchen, beispielsweise als Hydrochlorid, Butyrat, Kitrat oder Borat.

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Die Auswahl des im einzelnen hinzugefügten Agens oder der Mischung von Agenaien und die Konzentration wird insbesondere im Hinblick auf die Lösbarkeit in dem Medium ausgewählt, f

Ohne daß irgendeine Beschränkung auf eine bestimmte Theorie einer Wirkungsweise erfolgen soll, gibt die nachfolgende Beschreibung der Charakteristiken von roten Blutkörperchen und die Wirkungsweise der oben beschriebenen Substanzen auf die Membranen von roten Blutkörperchen einige Sinweise auf die Natur der verbesserten Resultate, welche durch ihre Anwesenheit hervorgerufen werden.

Ein Vorteil der Benutzung roter Blutkörperchen anstelle von künstlichen Surrogaten für die Überwachung besteht darin, daß sie sofort in einem physiologisch reproduzierbaren Zustand zu erhalten sind, daß sie sich leicht durch Zentrifugieren abtrennen lassen und daß sie einfach in verschiedenen Test-Lösungen resuspendieren lassen. Wasser dringt sehr schnell in die Zellen ein und geht ebenso schnell aus den Zellen heraus, und zwar mehr als hundertmal so schnell wie irgendetwas Gelöstes, so daß das osmotische Gleichgewicht zu allen Zeiten erhalten wird. Dies veranlaßt die Erythrozyten als Osmometer sich zu verhalten, und zwar die Größe proportional dem Eindringen des Gelösten zu erhöhen und zu schrumpfen, wenn das Gelöste wieder austritt, so daß eine Messung der Größe der Zelle dazu benutzt werden kann, um ihren Anteil von einem gegebenen gelösten Stoff zu bestimmen. Weil sie von bikonkaver, scheibenförmiger Form sind, sind geringere Änderungen in Volumen jedoch nicht begleitet von Änderungen im Oberflächenbereich der Membrane. Andererseits haben Änderungen in Volumen jenseits eines gewissen Punktes eine Hämolyse zur Folge, d. h. einen Prozeß, in dem die Membrane porös wird und es dem Zeil inhalt erlaubt, in das umgebende Medium zu diffundieren.

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Ein anderer Vorteil der Erythrozyten ist ihre relative Einfachheit. Sie enthalten keinen Kern, keine Vakuole, keine Mitochrondria, keine Bläschen, keine Körnchen usw., welche normalerweise in anderen Zellen gefunden werden. Dies ist vorteilhaft, weil die Zelle ein Zwei-Abteilungs-System bildet, in dem die Membran allein (ohne Zellwandung) das interne und das äußere Medium trennt.

Erythrozyten bilden die größeren Zellen im Blut. Jedoch sind die Erythrozyten selbst eine extrem heterogene Gruppe von Zellen. Während ihrer Lebenszeit (120 Tage beim Menschen) unterliegen sie Änderungen in der Struktur und der Dimension, die zugeordnet werden können einem Verlust an Lipoid, wobei sie zusätzlich ihre biosynthetischen Fähigkeiten verlieren. Junge Zellen enthalten bemerkenswert mehr Lipoid als ältere Zellen, welche Cholesterin verloren zu haben scheinen und, vorherrschend, Phospholipoid während des Alterungsprozesses.

Normale Erythrozyten entwickeln Membranen, welche resistent sind gegenüber einer osmotischen Lysis, wenn sie in ein Serum inkubiert werden, welches von Patienten stammt, die eine zerstörende Gelbsucht haben. Verbunden mit diesem Wechsel in vitro in dem Bereich der Oberflächenmembranen ist eine proportionale Erhöhung in dem Membraninhalt an Cholesterin, aber nicht an Phospholipoid. Zwei Faktoren sind hierfür möglicherweise verantwortlich, wobei beide auf das Serum der Gallensäuren zurückgehen. Es ist besonders wichtig, daß Gallensäuren eine Verschiebung des freien Cholesterins von dem Lipoproteid-Serum zu den Zellmembranen verursachen. Gallensäuren verhindern auch die Lecithin: Cholesterin-Acyl transferase. (LCAT) und ändern die Verteilung des freien Cholesterins innerhalb des Vorrats an roten Blutkörperchen, wobei rote Blutkörperchen veranlaßt werden, Cholesterin zu gewinnen und die Oberflächenbereiche der Membran und den Widerstand gegenüber osmotischer

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Lysis zu vergrößern.

Der Cholesteringehalt der roten Zellmembran ist nicht im Betrag fixiert, sondern kann innerhalb weiter Grenzen proportional den Änderungen in der Membranoberfläche variieren. Rote Blutkörperchen, die nicht-osmotisch fragil geworden sind, haben Oberflächenbereich verloren. Die rasche Umkehrung dieses Prozesses verhindert die Zerstörung von roten Blutkörperchen, deren Cholesterin in vitro erschöpft worden ist. Die Erhöhung des Cholesteringehalts und eine kleine Erhöhung des Phospholipoidgehalts veranlaßt die roten Blutkörperchen Cholesterin zu gewinnen. Dies führt zu einer reversiblen Ausdehnung der Zelloberflächenbereiche, was aber die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt.

Purin Nukleoside oder Nukleotide wie z.B. Adenosin, Inosin und 5'-AMP sind wichtig für die Funktion der roten Blutkörperchen. Aminosäure-Transport erfordert Natrium-Transport und die notwendige Komponente für den Natrium-Transport ist 5"-AMP, welches die Durchlässigkeit für Natrium bei den roten Blutkörperchen-Membranen erhöht. Adenosintriphosphat ist notwendig für die Wiederherstellüag'.'der Verformbarkeit der Membran bei nahezu normalen Werten. Die V/iederher st ellung von ATP durch Inkubation mit Adenosin, Inosin und 5'-AMP bei Raumtemperatur (22⁰C bis 27⁰C) bezieht sich auf die Erhaltung der Verformbarkeit der Membran.

Gekennzeichnete ATP-Ausbeutung von gespeicherten roten Blutkörperchen oder Zellen,welche in vitro inkubiert sind, wird begleitet von einem übergang von einer Scheibe zu einer Kugel, einem bemerkenswerten Verlust an Verformbarkeit der Membran, einem Verlust an Filterbarkeit der Zellen, einer Erhöhung der Viskosität der Suspension der gepackten Zellen und einer Zuordnung von Hämoglobin und nicht-hämoglobinem Protein zu der Membran. Eine Regeneration von ATP durch Inkubation mit Adenosin liefert eine signifikante Umkehrung all dieser Veränderungen.

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Der reversible Verlust von Verformbarkeit der roten Blutkörperchen korreliert mit der nach einer Transfusion vorhandenen Uberlebensfähigkeit in vitro von gespeichertem Blut. Änderungen in der Verformbarkeit vor einer Änderung der Gestalt und die Beobachtung, daß Geister von roten Blutkörperchen in einem Medium die Deformierbarkeits-Eigenschaften der intakten Zellen wiedergeben, aus denen sie bereitet worden sind, weisen darauf hin, daß die eigentlichen Änderungen in der Membran kritischere Determinanten der Verformbarkeit als der Form allein sind. Die Stabilität der roten Blutkörperchen wird weiterhin erreicht durch gewisse 4-Ami'nobenzoesäureester-Derivate, welche lokale anästhetische Vorgänge bewirken, wie beispielsweise Procainhydrochlorid und einige Phenothiazin-Verbindüngen, welche antihistamine Eigenschaften haben, wie beispielsweise Phenerganhydrochlorid.

Die Gefahr des Wachsens von Mikroorganismen ist eine schwerwiegende Belastung bei der Herstellung eines stabilen Vergleichs- und Überwachungsmediums für vollständiges Blut. Deshalb ist es notwendig, bestimmte spezifische Antibiotika zu beschreiben, um eine Verunreinigung zu vermeiden. Antibiotika mit niedriger Lösbarkeit verursachen eine Ausscheidung von kleinen Teilchen und ergeben einen geringen Wert an Aktivität gegen spezifische Mikroorganismen, wie z.B. Hefe oder Pilze.

Der Coulter-Zähler Modell S Plus, welcher Plättchen zählt, und ebenso andere elektronische Zähleinrichtungen können die hohen Hintergrund-Zahlwerte nicht zulassen, welche durch irgendwelche zu großen Überbleibsel irgendwelcher Art verursacht werden. Die verbesserte Lösbarkeit der Antibiotika und Fungizide in der bevorzugten Ausfuhrungsform liefert ein stabilisierendes Medium, welches frei ist von irgendwelchen Stoffen, die fehlerhafte Zählwerte zur Folge haben würden. Derartige fehlerhafte Resultate wurden die klinische diagnostische Interpretation möglicherweise gefährden. Das Stabi-

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lisierungsmedium liefert auch ein gleichmäßigeres Vergleichsund Uberwachungsmittel, welches in sehr enger Weise frisches menschliches Blut simuliert und deshalb Resultate liefert, welche Messungen guter Qualität für alle elektronischen Einrichtungen gestattet.

Das Medium nach der Erfindung kann eingesetzt werden bei frischen aus vollständigem Blut stammenden roten Blutkörperchen (d.h. zwei Tage), gealterten roten Blutkörperchen und/oder toten roten Blutkörperchen, welche mit der vorstehend beschriebenen Vorbehandlungs-Verdünnung behandelt wurden und so vorbereitet sind für den Gebrauch als Vergleich und überwachung für vollständiges Blut.

Bevorzugte Zusammensetzung eines Stabilisierungs-Mediums für die Erzielung von Langzeitstabilität bei roten Blutkörperchen (ungefähre Werte - Liter-Formulierung):

1	destilliertes Wasser	500	ml	g
2	Propyl-Paraben	0,3-1,0	g	. g
3	Methyl-Paraben	0,5-1,0	g	g
4	Procain-Hydrochlorid	o,i-o,5	g	g
VJl	Deoxycholsäure	0,1-0,9	g	g
6	Laktose	10,0-50,0	g	g
7	Actidione	0,1-0,6	g
8	Trinatriumzitratdihydrat	3,0-8,0	g
9	Zitronensäuremonohydrat	0,3-0,9	g
10	Natriumdihydrogen Phosphatmonohydrat	0,8-2,5	g
11	Phenerganhydrochlorid	0,1-1,0	g
12	Colistimethate, Natrium	0,2-0,9	g
13	Penicillin G, Natrium	0,5x1O⁶	- 3x10
		Einheiten
14	K an am yz in sul fat	0,2-0,8
15	Neomyzinsulfat	0,2-1,0
16	5'-AMP	0,4-1,0
17	Adenin	0,2-0,8
18	Inosin	0,4-1,0
19	Dihydrostreptomyzinsulfat	0,2-1,0

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20 Te tracyclinhydro chlorid 0,2-1,0 g_.

21 35 % Rinder-Albumin 100-350 ml 22. q.s. auf 1 Liter mit destilliertem V/asser *

Weil viele der vorstehend aufgelisteten Chemikalien kommerziell unter verschiedenen Namen bekannt sind, ist die verwendete Bezeichnung aus dem Merck Index, neunte Ausgabe (1976) entnommen, der von Merck and Co., Inc., Rahway, New Jersey herausgegeben ist.

Um die besten Resultate zu erzielen,werden die vorstehend unter 1 bis 20 genannten Ingredenzien in der aufgeführten Reihenfolge zu destilliertem Wasser hinzugefügt, wobei jedes Ingrediens vollständig aufgelöst sein soll, bevor das nächste Ingrediens hinzugefügt wird. Das Produkt wird dann umgerührt bei etwa 800 bis 1200 Umdrehungen pro Minute 12 bis 18 Stunden lang bei 20° bis 30° C. Dann v/erden die Komponenten 21 und 22 hinzugefügt. Das endgültige Produkt sollte einen pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 7_}0 und eine angepaßte Osmolalität von 3^0 + 5 m0sm/kg haben. Jedoch könnte die Osmolalität auch im Bereich von 280 bis 380 m0sm/kg liegen. Das Produkt wird, soweit nötig, gefiltert und bei 4 bis 6° C aufbewahrt. Die Haltbarkeit liegt bei etwa sechs Monaten.

* q.s. = quantity sufficient (benötigte Menge destillierten Wassers zur Erzeugung von 1 Liter)

Patentanwälte DIpl.-lng/E. Eder Dipl.-Ing. ^fe

8 HDnchen 40,"β§ίίίΠϊβ«Τ3«9ββ

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Claims

1„^Mittel für die Bereitung von vollständigen Blut-Ver-

gleichs-Uberwachungen mit Langzeitstabilität für Geräte, die mit elektronischen Mitteln vollständige Blutbestimmungen durchführen, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässerige Lösung vorgesehen ist, die folgende Komponenten enthält:

a) Laktose

b) mindestens ein Fungizid

c) mindestens ein Antibiotikum

d) mindestens eine chemische Substanz, welche die roten Blutzellen-Membranen ändert und welche aus den folgenden Gruppen ausgewählt ist:

1 ) Gallensalze und Cholsäurederivate

2) Phenothiazin-Verbindungen mit antihistaminen Eigenschaften und

e) Rinder-Albumin ο

2. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch mindestens ein Purin₃ Nukleotid oder Nukleosid,

3. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch mindestens ein Purin, Nukleotid oder Kukleosid, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, welche enthält 5'-AMP
Adenin und
Inosin,

Zf. Mittel nach Anspruch 2 oder 3s dadurch gekennzeichnet, daß die Purine, Nukleotide oder Kukleoside 5'-AMP₉ Adenin und Inosin sind.

5« Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis i+₉ dadurch gekennzeichnet, daß das Fungizid gewählt ist von der Gruppe, welche besteht aus

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ORSGiMAL INSPECTED

Methylparaben,
Äthylparaben,
Propylparaben und
Actidion.

6. Mittel nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, daß das Fungizid eine Mischung aus Methylparaben, Propylparaben und Actidion ist.

7. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch das antibiotische Kanamycinsulfat.

8. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Cholsäurederivat Deeoxycholsäure ist.

9. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Phenothiazinsalz, welches antihistamine Eigenschaften hat, Phenerganhydrochlorid ist.

10. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9₅ dadurch gekennzeichnet, daß das ^--Aminobenzoesäureesterderivat, welches lokale anästhetische Eigenschaften aufweist, Procainhydrochlorid ist.

11. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Puffer vorhanden sind, durch welche ein pH-Wert im Bereich zwischen 6,0 bis 7₅0 erreicht wird.

12. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet durch eine Anpassung an eine Osmolalität im Bereich von 330 bis 350 Milliosmolen.

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13„ Verfahren für die Herstellung einer vollständigen Blut-Vergleichs-Uberwachung mit Langzeitstabilität für Geräte, die mit elektronischen Mitteln vollständige Blutbestimmungen durchführen, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

c) Stehenlassen der Verdünnung nach Schritt b) für eine vorbereitende Zeit und Temperatur, welches eine Vorbehandlung der roten Blutkörperchen äquivalent der
Kombination von etwa zwei Tagen bei 22° C bis 27° C
ergibt, um die gewünschte Volumen-und Größenverteilungsbreite zu erhalten;

e) Hinzufügen einer genügenden Menge der vorbehandelten roten Blutkörperchen nach Schritt d) zu dem Mittel
nach Anspruch 1, um den gewünschten Zählwert für die vollständige Blut-Vergleichsüberwachung zu erhalten.

14o Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die vorbehandelnde Verdünnung im wesentlichenaus einer
wässerigen Lösung von Laktose, Natriumazid und einem
nicht-ionischen Schaumerzeugerbesteht.

15o Verfahren nach Anspruch 13* dadurch gekennzeichnet, daß die genannte vorbehandelnde Verdünnung Laktose und einen nicht-ionischen Schaumerzeuger enthält, um die Trennung nach Schritt d) zu steigern.

16o Verfahren nach Anspruch Ή oder 15, dadurch gekennzeichnet;, daß der nicht-ionische Schaumerzeuger Pluronic F68 enthält»

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17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die vorbehandelnde Verdünnung zur Erreichung eines pH-Wertes innerhalb des Bereiches von 6,5 bis 7»5 gepuffert wird und an eine Osmolalität innerhalb des Bereiches von 350-360 mOsm/kg angepaßt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17» dadurch gekennzeichnet, daß die roten Blutkörperchen von mindestens einer der folgenden Komponenten erhalten werden: frisches vollständiges Blut, erloschenes vollständiges Blut, menschliche rote Blutkörperchen und/oder tierische rote Blutkörperchen.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die vollständige Blut-Vergleichs-Uberwachung menschliche oder Surrogat-Blutplättchen enthält.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19» dadurch gekennzeichnet, daß die vollständige Blutbestimmung die Messung der Parameter der Weite der Verteilung der roten Blutkörperchen einschließt.

21. Eine vorbehandelnde Verdünnung für die Steigerung der Trennung roter Blutkörperchen von anderen Komponenten des vollständigen Blutes zur Anwendung bei der Herstellung von vollständigen Blut-Vergleichsüberwachungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Verdünnung Laktose und einen nicht-ionischen Schaumerzeuger enthält.

22. Verdünnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Laktose in ausreichender Menge vorhanden ist, um die Wandungen der weißen Blutkörperchen und. der Plättchen-Zellkomponenten zu modifizieren, und dadurch den nicht-ionischen Schaumerzeuger in die Lage zu versetzen, dorthin gezogen zu werden und so eine Mattenbildung dieser Zellen zu verursachen.

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23. Verdünnung nach Anspruch 21 oder 2Z₁ dadurch gekennzeichnet, daß der nicht-ionische Schaumerzeuger PIuronic F68 enthält.

2.k. Verdünnung nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Natriumazid enthält und gepuffert ist, um einen pH-Wert innerhalb des Bereichs von 6,5 bis 7>5 zu erhalten,und daß dadurch eine gewünschte Größe und Verteilungsbreite der roten Blutkörperchen erzielt wird.

Patentanwälte

Dipl.-lng/p. Eder

Dipl.-Ing. KJSchiesohke

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