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DE3012921A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von l-threonin - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von l-threonin

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DE3012921A1
DE3012921A1 DE19803012921 DE3012921A DE3012921A1 DE 3012921 A1 DE3012921 A1 DE 3012921A1 DE 19803012921 DE19803012921 DE 19803012921 DE 3012921 A DE3012921 A DE 3012921A DE 3012921 A1 DE3012921 A1 DE 3012921A1
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threonine
microorganism
plasmid
dna
genus escherichia
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Ajinomoto Co Inc
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Description

BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Fermentation.
Für die fermentative Herstellung von L-Threonin hat man bekanntlich bisher auxotrophe oder gegen bestimmte Wirkstoffe resistente Mutanten der Genera Brevibacterium und Escherichia verwendet (GB-PS 1223 725, GB-PS 1 223 470 und JA-AS 44876/1973)
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue, zur Bildung von L-Threonin befähigte Mikroorganismen und ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Züchtung dieser Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin durch Züchtung eines L-Threonin bildenden Mikroorganismus in einem übliche Nährstoffe enthaltenden Kulturmedium und Gewinnung des im Kulturmedium angereicherten L-Threoninsf das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus züchtet, der erhalten wurde, indem einem Empfänger-Mikroorganismus des Genus Escherichia ein Plasmid einverleibt wurde, welches mit einem Desoxyribonucleinsäure-Fragment insertiert wurde, welches aus einem gegen Λ-Amino-ß-hydroxy-valeriansäure resistenten Mutanten des Genus Escherichia erhalten wurde und welches die genetische Information für die L-Threonin-Synthese enthält.
Erfindungsgemäß wird als Donor für die Desoxyribonucleinsaure (nachstehend als DNA bezeichnet) eine Mutante des Genus Escherichia gewählt, die resistent gegen a-Amino-p-hydroxyvaleriansäure ist (nachstehend AHV). Aus dieser Mutante wird dann ein DNA-Fragment, das die für die L-Threonin-Synthese verantwortliche genetische Information trägt, erhalten und schließlich wird dieses DNA-Fragment in ein aus Escherichia coli erhaltenes
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Plasmid eingefügt (insertiert) . Das rekombinierte Plasmid wurde erfolgreich in einen Mikroorganismus des Genus Escherichia eingeschleust.
Es wurde außerdem festgestellt, daß ein Stamm mit höherer Produktionsleistung für L-Threonin erhalten werden kann, wenn als Wirtsorganismus für das rekombinierte Plasmid ein Mikroorganismus verwendet wird, der keinen L-Threonin-Bedarf hat. Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Mikroorganismen L-Threonin in einer weit höheren Ausbeute bilden, als die bisher bekannten L-Threonin bildenden Mutanten.
Die verwendete, gegen AHV resistente Mutante des Genus Escherichia ist bekannt (JA-AS 26709/1970) und wird mit Hilfe von üblichen künstlichen Mutationsmethoden erhalten. Chromosomale DNA wird aus der Mutante in üblicher Weise extrahiert und nach einer üblichen Methode mit Restriktionsendonuclease behandelt, Erfindungsgemäß wurde als Restriktionsendonuclease Hind III verwendet, um das DNA-Fragment zu erhalten, welches die für die L-Threonin-Synthese verantwortliche genetische Information trägt. Es können jedoch auch andere Restriktionsendonucleasen, wie Bam HI verwendet werden, wobei ähnliche Ergebnisse wie mit Hind III erhalten werden.
Als Vektor-DNA kann jedes beliebige aus Escherichia coli extrahierte geöffnete (relax-type) Plasmid verwendet werden. Zur Insertion des DNA-Fragments, das aus einem AHV-resistenten Stamm von Escherichia erhalten wird und die genetische Information für die L-Threonin-Biosynthese trägt, in den Vektor kann eine übliche Verfahrensweise angewendet werden. Das so erhaltene rekombinierte Plasmid kann dann mit Hilfe von üblichen Transformations-Methoden in einen Mikroorganismus des Genus Escherichia eingeschleust werden, wenn auch in Abhängigkeit von den jeweiligen Methoden die Wirksamkeit variieren kann.
Als Wirtsorganismus für das rekombinierte Plasmid wird normalerweise eine Mutante von Escherichia mit L-Threonin-Bedarf verwendet, da diese Mutante für die Selektion und Isolierung
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der transformierten Organismen günstig ist. Falls eine Mutante, die für ihr Wachstum kein L-Threonin benötigt, speziell eine gegen AHV resistente Mutante, als Wirtsorganismus verwendet wird, so werden L-Threonin bildende Transformanten mit höherer Produktivität erhalten.
Die so erhaltenen transformierten Mikroorganismen (Transformanten) können mit Hilfe üblicher Methoden selektiert und isoliert werden, die auf die Eigenschaften der Vektor-DNA und/oder des WirtsOrganismus abgestellt sind.
Zur Züchtung des so erhaltenen L-Threonin bildenden Stammes werden übliche Methoden angewendet, die den Methoden zur Züchtung von bekannten L-Threonin bildenden Mikroorganismen entsprechen. So wird ein übliches Kulturmedium verwendet, welches Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Ionen und erforderlichenfalls organische Spurennährstoffe, wie Vitamine oder Aminosäuren, enthält. Zu Beispielen für Kohlenstoffquellen gehören Glucose, Saccharose, Stärkehydrolysat und Melassen. Als Stickstoffquelle können gasförmiges Ammoniak, wässriges Ammoniak, Ammoniumsalze und entsprechende andere Verbindungen verwendet werden. Wenn dem Medium L-Asparaginsäure in einer Menge von mehr als 50 mg/dl zugesetzt wird, wird die Ausbeute an L-Threonin gewöhnlich verbessert.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wobei der pH-Wert und die Temperatur des Mediums auf geeignete Werte eingestellt werden, und so lange fortgesetzt, bis die Bildung von L-Threonin aufhört.
In dem Kulturmedium angereichertes L-Threonin kann in üblicher Weise gewonnen werden.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann L-Threonin in einer höheren Ausbeute gebildet werden, als mit Hilfe von bekannten Methoden. Darüber hinaus ist die Menge der als Nebenprodukte gebildeten Aminosäuren gering, so daß das L-Threonin mit Hilfe eines einfachen Verfahrens in hoher Ausbeute gewonnen werden kann.
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Beispiel 1
Aus dem L-Threonin bildenden Stamm AJ 11332 (FERM-P 4898, NRRL B-12097) (pro-, thi-, ile-, met-, AHV*), der von Escherichia coli K-12 (ATCC 10798) abgeleitet ist, wurden neue Stämme mit hoher Produktivität für L-Threonin mit Hilfe der folgenden Verfahrensstufen hergestellt:
(1) Herstellung von chromosomaler DNA, welche die genetische Information für hohe Produktivität für L-Threonin trägt.
Der Stamm AJ 11332 wurde 3 Stunden bei 37°C unter Schütteln in einem Liter L-Medium gezüchtet, das 1 96 Pepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,1 96 Glucose und 0,5 96 NaCl enthielt und auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt war, und in der exponent!eilen Wachstumsphase wurden die Bakterienzellen gewonnen. Chromosomale DNA wurde mit Hilfe der üblichen Methode mit Phenol extrahiert, wobei 5,3 mg gereinigte DNA erhalten wurden.
(2) Herstellung der Vektor-DNA.
Zum Klonen des Gens, das die hohe Produktionsleistung für L-Threonin kontrolliert (Threonin-Operon, welches den Mutationspunkt der AHV-Resistenz enthält), wurde DNA aus dem Plasmid pBR 322, einem Vektor, der sowohl Ampicillinals auch Tetracyclin-Resistenz-Gene als Marker enthält, in folgender Weise hergestellt:
Ein Stamm von Escherichia coli K-12, der das Plasmid pBR 322 enthält, wurde bei 370C in 1 1 eines Glucose-"Casaminosäure"-anorganische Salze enthaltenden Mediums, dem 170 ml Chloramphemicol zugesetzt waren, inkubiert. Das Glucose-"Casaminosäure"-anorganische Salz-Medium enthält 2 g Glucose, 1 g NH4Cl, 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl, 0,1 g MgSO4.7H2O, 0,015 g CaCl2.2H2O, 20 g "Casaminosäure", 0,05 g L-Tryptophan, 0,05 g Thymin und 100 μg Thiamin.HCl pro Liter und der pH-Wert des Mediums war auf 7,2 eingestellt. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurde die Plasmid-DNA verstärkt
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und in großem Umfang in den Bakterienzellen angereichert.
Nach 16-stündiger Inkubierung wurden die Zellen gewonnen und durch Behandlung mit Lysozyra und SDS lysiert. Das Lysat wurde bei 30 000g X eine Stunde lang zentrifugiert, um die. überstehende Flüssigkeit zu gewinnen. Nach dem Konzentrieren der überstehenden Flüssigkeit wurden 580 pg der Plasmid-DNA durch Fraktionierung mit Hilfe der Cäsiumchlorid-Äthidiumbromid-Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifu- gierung gewonnen.
(3) Insertion des chromosomalen DNA-Fragments in den Vektor.
Je 10 pg der chromosomalen DNA und der Vektor-DNA wurden bei 370C 1 Stunde lang mit der Restriktionsendonuclease Hind III behandelt, um die DNA-Ketten zu spalten, und dann jeweils 5 Minuten bei 65°C erhitzt.
Die dem Abbau unterworfene chromosomale DNA-Lösung und Vektor-DNA-Lösung wurden vermischt und dann 24 Stunden lang bei 100C in Gegenwart von ATP und Dithioerythrit der Renaturierungsreaktion von DNA-Fragmenten unter der Einwirkung von DNA-Ligase des T^-Phagen unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde dann 5 Minuten auf 650C erhitzt und das zweifache Volumen an Äthanol wurde zugesetzt. Die ausgefällte rekombinante DNA wurde dann gewonnen.
(4) Genetische Transformation mit dem Hybrid-Plasmid, das die genetische Information für hohe Threonin-Bildung trägt.
Ein L-Threonin benötigender Stamm von Escherichia coli Nr. 255, der von dem Threonin-bildenden Stamm AJ 11332 durch mutagene Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin abgeleitet worden war, wurde unter Schütteln in 10 ml L-Medium bei 370C gezüchtet.
In der exponentiellen Wachstumsphase wurden die Zellen gewonnen und in einer 0,1 m MgCL^-Lösung und dann in einer 0,1 m CaClp-Lösung in einem Eisbad suspendiert, wobei kompetente Zellen mit Fähigkeit zur DNA-Aufnahme erhalten wurden.
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In die Suspension der kompetenten Zellen wurde die in Stufe (3) erhaltene DNA, welche die Hybrid-Plasmid-DNA enthält, gegeben. Die Suspension wurde 30 Minuten in einem Eisbad gehalten, dann 2 Minuten lang auf 42°C erwärmt und erneut 30 Minuten lang in einem Eisbad stehengelassen. Die Zellen, in die die DNA eingeschleust worden ist, wurden in L-Medium inokuliert und das Medium wurde 2 Stunden bei 370C geschüttelt, wodurch die Transformationsreaktion vervollständigt wurde. Die Zellen wurden gewonnen, gewaschen und wieder suspendiert. Ein kleiner Anteil der Zellsuspension wurde auf einer Agarplatte ausgestrichen, die pro Liter 2 g Glucose, 1 g (NH^^SO^, 7 g K2HPO^, 2 g KH2PO^, 0,1 g MgSO^.7H2O, 0,5 g Natriumeitrat.2H2O, 20 mg Ampicillin, 100 mg L-Prolin, 100 mg L-Isoleucin, 100 mg L-Methionin und 1 mg Thiamin.HCl sowie 2 g Agar enthielt (der pH-Wert war auf 7,2 eingestellt). Die Platte wurde bei 37°C bebrütet. Nach 3-tägiger Bebrütung erschienen auf der Platte 21 Kolonien. Sämtliche Kolonien wurden entnommen, gereinigt und isoliert.
Jeder der so erhaltenen Transformanten hatte keinen L-Threonin-Bedarf und war resistent gegen Ampicillin und hatte somit offensichtlich andere Eigenschaften als Stamm Nr. 255, der als Wirtsorganismus verwendet wurde. Das bedeutet, daß nur die Zellen als wachsende Kolonien selektiert wurden, welche das pBR 322-Plasmid enthalten, in welches das chromosomale DNA-Fragment mit dem Gen für die Threonin-Synthese insertiert wurde.
(5) Herstellung von L-Threonin mit Hilfe der neuen Threoninbildenden Stämme.
Tabelle 1-A zeigt die experimentellen Ergebnisse der fermentativen Bildung von L-Threonin unter Verwendung von Stamm AJ 11334 (FERM-P 4900, NRRL B-12099), der eines der in Stufe (4) erhaltenen Klone darstellt.
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Das Fermentationsmedium enthielt 3 g/dl Glucose, 1 g/dl (NH4J2SO4, 0,2 g/dl KH2PO4, 0,1 g/dl MgSO4.7H2O, 2 ppm Fe++, 2 ppm Mn++, 1 mg/1 Thiamin-HCl, 300 mg/1 L-Prolin, 100 mg/1 L-Isoleucin, 100 mg/1 L-Methionin, 2 g/dl CaCO, und der pH-Wert des Mediums wurde mit KOH auf 7,0 eingestellt. 20 ml-Anteile des Mediums wurden in 500 ml-Kolben gegeben, mit AJ 11334 inokuliert und 70 Stunden bei 37°C geschüttelt.
Kontrollversuche wurden unter Züchtung des Elternstammes AJ 11332 unter den gleichen Kulturbedingungen durchgeführt.
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte der Stamm AJ 11334 im Vergleich mit AJ 11332 bemerkenswert erhöhte Produktivität für L-Threonin.
Tabelle 1-B zeigt ein Beispiel für die fermentative Bildung von L-Threonin unter Verwendung von AJ 11333 (FERM-P 4899, NRRRL B-12098), einem anderen in Stufe (4) erhaltenen Klon. Das Fermentationsmedium wurde durch Zugabe von 0,1 g/dl Hefeextrakt zu dem gleichen Medium, welches in Versuch A gemäß Tabelle 1 verwendet worden war, hergestellt. Die Züchtungsbedingungen waren die gleichen wie in dem Versuch gemäß Tabelle 1-A, mit der Ausnahme, daß die Temperatur 300C betrug.
Auch in diesem Fall zeigte der Stamm AJ 11333 bemerkenswert erhöhte Produktivität für L-Threonin.
Tabelle 1
Stamm gebildetes L-Threonin
g/dl
A AJ 11334
AJ 11332		 0,54
0,29
B AJ 11333
AJ 11332		 0,54
0,13
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Die Menge an Threonin wurde durch mikrobiologische Prüfung der durch Zentrifugieren der Kulturbrühe erhaltenen überstehenden Flüssigkeit bestimmt.
(6) Einschleusung des Hybrid-Plasmid in einen Stamm ohne L-Threonin-Bedarf.
Das in AJ 11334 enthaltene Hybrid-Plasmid wurde in der in Stufe (2) beschriebenen Methode isoliert und einem Eltern-Stamm AJ 11332, der zum Wachstum kein L-Threonin benötigt, und der L-Threonin produziert, einverleibt. Zu diesem Zweck wurde eine analoge Transformationsmethode wie in Stufe (4) angewendet.
Der transformierte Mikroorganismus AJ 11335 (FERM-P 4901, NRRL B 12100), der als Ampicillin-resistente Kolonie selektiert wurde, wurde in einer ähnlichen Methode, wie sie in Stufe (5) beschrieben ist, für die fermentative Bildung von L-Threonin eingesetzt.
Die gebildete und im Kulturmedium angereicherte Menge an L-Threonin sowie die Menge der als Nebenprodukt gebildeten Aminosäuren wurden durch Flüssigkeitschromatographie bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
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ASt-
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Il ti Il Il Il Il Il Il Il II Il
J-:fμ f-'jii el 2
Di f vorstehe:nd beschriebene Fermc-nt-ai; i on wui'do unter Voi'wcndurig ν η AJ 11333 und AJ 11335 durchgeführt. AJ 5; Kulturmedium wui'do dar gleiche wie in Tabelle 1-A und Medien verwendet, die durch 7u£5ai ζ von 0,05 g/dl bzw. 0,1 g/dl Asparaginsäure ru diosem Medium erhalten wurden.
Die. dabei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 3 gerfigt-
Rianim
AJ 11333
AJ 11335
Tabelle 3
0, 1 0
0,05
0 _
0,10
0,05
030043/0746
(g/dl) L-Threonin (g/dl)
0,75 0,70
1,10 0,98 0,83
BAD 0RIGi?4AL

Claims (5)

Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin durch Züchtung eines L-Threonin bildenden Mikroorganismus in einem übliche Nährstoffe enthaltenden Kulturmedium und Gewinnung des im Kulturmedium angereicherten L-Threonins, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Mikroorganismus züchtet, der erhalten wurde, indem einer Mutante von Escherichia coli ohne L-Threonin-Bedarf als Empfänger-Mikroorganismus ein Plasmid einverleibt wurde, in welches ein Desoxyribonucleinsäure-Fragment insertiert wurde, welches aus einem gegen cc-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure resistenten Mutanten des Genus Escherichia erhalten wurde und welches die genetische Information für die L-Threonin-Synthese enthält.
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ORIGINAL INSPECTED
- 2 - „Λ? HM
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß als L-Threonin bildender Mikroorganismus Escherichia coli NRRL B-12100 verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Kulturmedium L-Asparaginsäure enthält.
4r. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus mit hoher Produktivität für L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) chromosomale DNA aus einem gegen a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure resistenten Mikroorganismus des Genus Escherichia gewinnt,
b) durch Behandlung mit einer Restriktionsendonuclease das DNA-Fragment mit der für die L-Threonin-Synthese verantwortlichen genetischen Information gewinnt,
c) dieses DNA-Fragment in ein Plasmid insertiert, das
aus einem Mikroorganismus des Genus Escherichia extrahiert wurde und
d) das rekombinierbe Plasmid einem Mikroorganismus des Genus Escherichia ohne L-Threoninbedarf als Wirtsorganismus einverleibt.
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5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß man eine gegen a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure resistente Mutante verwendet.
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DE19803012921 1979-04-02 1980-04-02 Verfahren zur fermentativen herstellung von l-threonin Granted DE3012921A1 (de)

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