DE3009901A1 - Vorrichtung zum nachweis von aenderungen der mineralionenkonzentration in organischen geweben und deren verwendung - Google Patents
Vorrichtung zum nachweis von aenderungen der mineralionenkonzentration in organischen geweben und deren verwendungInfo
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Description
SCJENCE UNION ET CIE.
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Nachweis oder zur Bestimmung von Änderungen der Konzentration
von bestimmten Ionen und bestimmten Molekülen in organischen Geweben, und insbesondere zur kontinuierlichen
in-situ-Bestimmung solcher Konzentrationsänderungen in lebenden Geweben, mit großer Genauigkeit sowie die Verwendung
dieser Vorrichtung.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere eine Vorrichtung zum Nachweis von schnellen Änderungen der intraorganischen
Konzentration von mineralischen Kationen mit Hilfe einer Lichtemission.
Die erfindungsgemäße Nachweis- bzw. Bestimmungsvorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem hohlen Träger
besteht, der mit drei Zuführungselementen versehen ist, die in einer Ebene angeordnet sind und zu einer
Spitze zusammenlaufen, wobei eines dieser Elemente dazu dient, eine Perfusion des Organismus1 mit einer Lösung
einer Licht emittierenden oder Photo emittierenden Substanz zu bewirken, und das zweite Element, das aus einer optischen
Faser aus Kunststoff, Glas oder Quarz besteht, das Licht leitet oder führt und mit einem Photoelektronenvervielfacher
oder Sekundärelektronenvervielfacher verbunden 0 ist und das dritte Element ein leitendes Element darstellt,
das aus einer Mikropipette besteht, die mit einer leitenden Salzlösung gefüllt ist, und dazu dient, die elektrische
Aktivität der benachbarten Zellelemente zu messen.
Die beigefügte Zeichnung dient der weiteren Erläuterung der Erfindung. In der Zeichnung zeigen
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Figur 1 einen Längsschnitt durch die erfindungsgemäße Vorrichtung und
Figur 2 anhand von Kurven den Zusammenhang zwischen dem epileptischen Zustand und der Calciumionenkonz
entration.
In der Figur 1 ist ein Längsschnitt durch die erfindungsgemäße
Vorrichtung dargestellt. Die Figur 1 zeigt die erfindungsgemäße Mikroelektrode, deren extrem feine
Spitze an ihrem Ende A vorliegt. Die Mikroelektrode ist konisch geformt und umfaßt drei Mikroröhrchen, die an ihren
ausgezogenen, spitzen Enden zusammengefaßt sind. Sie sind symmetrisch um eine Längsachse oder radial angeordnet.
Das Mikroröhrchen B, das dazu dient, in den Organismus eine Licht emittierende oder photoemittierende Substanz
zu injizieren, ist an seinem basalen Ende mit einer Vorrichtung verbunden, die es ermöglicht, die Flüssigkeit
unter einem ausreichenden, vorbestimmten, konstanten Druck zu injizieren, um in dieser Weise die Flüssigkeit
langsam in das lebende Gewebe eindiffundieren zu lassen. Die optische Mikrofaser C stellt eine Sonde dar, die dazu
dient, den Lichtstrahl zu leiten, der sich durch die chemische Reaktion zwischen der Licht emittierenden Substanz
und den an der Injektionsstelle vorliegenden Ionen ergibt.
0 Die optische Faser C ist über einen Lichtleiter mit einer Photovervielfacherzelle verbunden, mit der die Intensität
der Lichtreaktion, die an der Injektionsstelle abläuft, nachgewiesen oder gemessen werden kann.
Die optische Faser, aus der das Mikroröhrchen B besteht, umfaßt einen Kern mit einem hohen Brechungsindex und
einen Hüllbereich mit einem wesentlich niedrigeren Bre-
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chungsindex, so daß lediglich das an der Spitze emittierte
Licht der Photovervielfacherzelle zugeführt wird.
Die optische Faser endet in. einer kegelstumpfförmigen
in
Spitze, die durch Ausziehen 'der Hitze und durch Abbrechen unter dem Mikroskop derart gebildet worden ist,
daß die Spitze einen Durchmesser zwischen 1 und 5 (im
aufweist.
Das Mikroröhrchen D besitzt ein ausgezogenes, spitzes Ende und einen konischen Körper, der als Reservoir oder
Behälter für eine Salzlösung dient. In diesen Behälter oder in dieses Reservoir taucht eine Elektrode aus
einem beständigen Metall ein, die mit einem Impedanzadapter oder Impedanzwandler und schließlich einem
Oszillographen verbunden ist.
Es ist damit möglich, die erfindungsgemäße Vorrichtung
dazu zu verwenden, gleichzeitig eine Lichtemission und eine Potentialänderung nachzuweisen und gegebenenfalls
zu messen.
Die gesamte Mikroelektrode besitzt eine Länge von 5 bis 10 cm. Ihr Durchmesser an der Spitze beträgt 2 bis 20 μπι.
Ihr Durchmesser in der Mitte hängt von ihrem Anwendungsgebiet ab.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
ist das Mikroröhrchen B, dessen Durchmesser an der Spitze 10 -um beträgt, mit einer wäßrigen Lösung einer Licht
emittierenden Substanz gefüllt und mit einem Kolben, einer Mikrometerschraube oder einem Elektroventil verbunden,
welche Einrichtungen einen konstanten Injektionsdruck von etwa 20 cm Wassersäule sicherstellen. Das Mikroröhrchen
C ist über eine Justiereinrichtung mit einer
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Photovervielfacherzelle oder Photovervielfacherröhre des Kathodentyps verbunden. Die optische Transmission
wird durch einen Siliconfettpunkt oder -tropfen erleichtert.
Die Mikroelektrode D enthält eine 2,5 mNatriumchloridlösung oder irgendeine andere leitende Salzlösung. Die
in diesen Behälter eingetauchte Elektrode ist vorzugsweise eine mit einem Mikrogalvanometer verbundene Silberchloridelektrode
oder Silberchloridnadel.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist insbesondere geeignet
zum Nachweis oder zur Bestimmung von Änderungen der Calciumionenkonzentration im Zellbereich, insbesondere
in der Struktur der Hirnrinde. Es hat sich gezeigt, daß ein Protein des Organismus1 Medusa luminosa (Aequoria)
in Gegenwart von Calciumionen Licht emittiert, wobei die gebildete Photonenmenge proportional ist der Calciumionenkonzentration
in einem bestimmten biologischen Medium.
Aus diesem Grunde ergibt sich dann, wenn man das Mikroröhrchen B mit einer Lösung von Aequorin (*Sigma) füllt
und diese Lösung mit konstantem Druck injiziert, eine Lichtreaktion, die mit Hilfe der über die optische Faser
C verbundenen Photovervielfacherzelle nachgewiesen und 0 gemessen werden kann.
Gleichzeitig werden mit Hilfe der in das Mikroröhrchen D eintauchenden Mikroelektrode die elektrischen Phänomene
nachgewiesen, die die Lichtreaktion begleiten. 35
Die durchgeführten Messungen haben gezeigt, daß die Nachweisausbeute der Lichtreaktion etwa 70 % beträgt.
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Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann man
somit sehr schnelle Änderungen der Calciumionenkonzentration (Ca"1"1")' in der Hirnrinde aufzeichnen und messen,
die sich unter dem Einfluß eines chemischen Reizmittels, das eine tonische oder klonische epileptische Krise verursacht,
wie beispielsweise Penicillin, ergeben.
Während der Periode der Ruhe oder während eines tiefen Schlafes bleibt die Calciumionenkonzentration der Hirnrinde
konstant. Durch die Verabreichung von Penicillin ergeben sich schnelle typische epileptische Entladungen
oder Anfälle, die von elektrischen Schocks gefolgt werden.
Dieser Sachverhalt ergibt sich aus der beigefügten Figur 2, aus der zu erkennen ist, daß jede isolierte
epileptische Spitze des Kurvenverlaufs von beträchtlichen
Änderungen der Calciumionenkonzentration begleitet wird, die im allgemeinen in einer Folge von drei
getrennten Phasen ablaufen. So ergibt sich eine erste Phase der Verminderung der Calciumionenkonzentration
vor der Entladung oder dem Anfall, dann eine deutliche Steigerung der Calciumionenkonzentration zu Beginn der
Spitze und dann eine dritte Phase der Verminderung der Calciumionenkonzentration in der Endphase der Spitze.
Während der epileptischen Krise unterliegt die Calciumionenkonzentration
kontinuierlichen Änderungen. Die Figur 2C verdeutlicht diese charakteristischen Änderungen
und insbesondere die deutliche Steigerung der Calciumionenkonzentration in der Spitzenphase.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung besitzt somit den Vorteil einer sehr hohen Meßgeschwindigkeit oder Nachweisge-
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schwindigkeit und einer großen Unerapfindlichkeit gegenüber
intrazellularen Ionenströmen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann weiterhin für den Nachweis anderer neurobiologischer Reaktionen des
Zentralnervensystems verwendet werden, indem man ebenfalls eine Licht emittierende, fluoreszierende oder
Licht absorbierende chemische Reaktion ausnützt.
Man kann in dieser Weise durch Fluoreszenzmessung die Anwesenheit von beispielsweise Catecholaminen, wie
Adrenalin, oder von Serotonin oder von reduziertem Nikotinamid-adenindiphosphat (NADH-) nachweisen.
Weiterhin kann man Änderungen der Magnesiumkonzentration nachweisen, indem man als photochemisches Reagens
Luciferin und eine Luciferase verwendet.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung
ist die Mikropipette B durch eine optische Mikrofaser aus Quarz ersetzt, die den gleichen Spitzendurchmesser
besitzt und deren basales Ende das Lichtbündel einer ultraviolettes Licht abgebenden Lampe aufnimmt.
Unter diesen Bedingungen entspricht das von der optischen Mikrosonde C aufgefangene und weitergeleitete
Licht der Fluoreszenz von in dem Organismus vorhandenen Verbindungen, die durch das ultraviolette Licht
angeregt worden sind. Das basale Ende der Sonde C ist über ein handelsübliches Differentialspektrophotometer
mit einem Photoelektronenvervielfacher oder Sekundärelektrodenvervielfacher
verbunden, so daß es möglich wird, den Prozentsatz der Lichtemission in Abhängigkeit
von der der untersuchten Substanz entsprechenden Wellen-
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länge im Vergleich zu einer nichtspezifischen Aktivitat
zu analysieren.
Die am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers und der Mikroelektrode D aufgefangenen elektrischen Signale
werden verstärkt, aufgezeichnet und ausgelesen, um eine wissenschaftliche oder industrielle Nutzung zu ermöglichen,
beispielsweise die Untersuchung von toxischen oder manische Zustände verursachenden organischen Substanzen in
Geweben oder die Untersuchung von Indolsubstanzen in Gewebeschnitten.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch industriell angewandt werden. Dazu füllt man die oben beschriebene
Mikropipette B mit einer Substanz, die mit ionischen Bestandteilen spezifisch reagiert, beispielsweise mit
Arsenazo, dessen Lichtabsorption von der lokalen CaI-ciumionenkonzentration
abhängt. Man verwendet in dem System eine optische Mikrofaser C der gleichen Art, wie
sie oben beschrieben wurde, verbindet diese jedoch an ihrem basalen Ende über eine geeignete Monochromatoreinrichtung
mit einer Lampe. Mit Hilfe dieser Vorrichtung, die mit einem Spektrophotometer verbunden ist,
wird es möglich, lokale Änderungen der Konzentration von Ionen oder biologischen Molekülen mit Hilfe des
Reagens1 zu messen, dessen Lichtabsorption sich mit
0 der Konzentration der betreffenden Ionen oder der betreffenden Moleküle ändert.
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Claims (13)
- Patentanwälte Dipl.-Ing.;H. WEicKM-A.NNj'Dip^-.-PHYs. Dr. K. Fincke »Dipl.-Ing. F. A."Weιckmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. Liska \8000 MÜNCHEN 86, DEN k ,'1VPOSTFACH 860 820MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22HtM/ei 7906681SCIENCE UNION ET CIE. (Societe Francaise de Recherche Medicale )14, Rue du VaI d'Or 92150 Suresnes, FrankreichVorrichtung zum Nachweis von Änderungen der Mineralionenkonzentration in organischen Geweben und deren VerwendungPATENTANSPRÜCHE(1J Vorrichtung zum Nachweis von Änderungen der Mineralionenkonzentration in organischen Geweben, gekennzeichnet durch eine hohle Mikroelektrode, die mit drei in einer Ebene liegenden Zuführungseinrichtungen versehen ist, welche zu dem inneren Ende (A) der030040/0684SCIENCE UNION ET CIE,Mikroelektrode hin zusammengeführt sind, wobei eine der Zuführungseinrichtungen (B) dazu dient, dem Organismus eine Lösung einer Licht emittierenden Substanz zuzuführen, die zweite Zuführungseinrichtung (C), die aus einer das Licht leitenden optischen Faser besteht, mit einem Photoelektronenvervielfacher verbunden ist, und die dritte Zuführungseinrichtung (D) aus einer Mikropipette besteht, die mit einer elektrisch leitenden Salzlösung gefüllt ist.
- 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch g e kennzeichnet, daß die Mikroelektrode an ihrem Ende eine öffnung aufweist.
- 3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Enden der drei Zuführungseinrichtungen (B,C,D) am inneren Ende Qk) der Mikroelektrode vereinigt sind.
- 4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Zuführungseinrichtung (B) an ihrem basalen Ende eine Einrichtung aufweist, mit der eine Flüssigkeit unter einem konstanten vorbestimmten Druck zugeführt werden kann.
- 5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch g e kennzeichnet, daß die optische Faser der Zuführungseinrichtung (C) einen Kern mit einem -erhöhten Brechungsindex und einen Hüllbereich mit einem wesentlich niedrigeren Brechungsindex und an ihrer Spitze eine.n Durchmesser zwischen 1 und 25 μπι aufweist.
- 6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch g e -030040/0684SCIENCE UNION ET CIE.kennzeichnet , daß die Zuführungseinrichtung (D) eine Mikropipette darstellt, die eine ausgezogene Spitze und einen als Reservoir dienenden konisch geformten Körper aufweist.
- 7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch g e kennzeichnet, daß das Mikroröhrchen (D) eine Mikroelektrode aus einem beständigen Metall enthält, die mit einem Impedanzadapter und einem Mikrogalvanometer verbunden ist.
- 8. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuführungseinrichtung (B) mit einer Lösung gefüllt ist, die den photochemischen Nachweis von Calciumionen oder Magnesiumionen ermöglicht.
- 9. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 1 zum Nachweis von Änderungen der Calciumionenkonzentration mit Hilfe einer Licht emittierenden Substanz, wie beispielsweise Aequorin.
- 10. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuführungseinrichtung (B) gemäß Anspruch 4 aus einer das ultraviolette Licht, das dazu dient, die Fluoreszenz bestimmter biologischer Verbindungen zu verursachen, leitenden Quarzmikrofaser besteht.
- 11. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 10 zum Nachweis von Änderungen der Konzentration von Catecholaminen.
- 12. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 10 zum Nach-030040/0684SCIENCE UNION ET CIE.weis von toxischen oder manische Zustände hervorrufenden organischen Substanzen durch Messen ihrer Fluoreszenz im ultravioletten Licht.
- 13. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 10 in dem Strahlengang eines üblichen Differentialspektrophotometers zur Messung von Änderungen der Konzentration von biologischen Verbindungen im Gewebe über ihr Absorptionsspektrum.030040/0684
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