DE3006789A1 - METHOD AND ENZYME COMPOSITION FOR THE HYDROLYSIS OF GLYCERINE ESTERS - Google Patents
METHOD AND ENZYME COMPOSITION FOR THE HYDROLYSIS OF GLYCERINE ESTERSInfo
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Description
MILLIPORE CORPORATION Bedford, Massachusetts V.St.A.MILLIPORE CORPORATION Bedford, Massachusetts V.St.A.
Verfahren und Enzymzusammensetzung zur Hydrolyse von GlycerinesternMethod and enzyme composition for the hydrolysis of glycerol esters
Die Erfindung betrifft die Bestimmung von Glycerinestern, insbesondere die klinische in-vitro-Bestimmung von Glycerinestern in Körperflüssigkeiten, und besonders die Hydrolyse von Glyceriden zu Glycerin zu analytischen Zwecken.The invention relates to the determination of glycerol esters, in particular the clinical in-vitro determination of glycerol esters in body fluids, and especially the hydrolysis of glycerides to glycerol to be analytical Purposes.
Die Glyceridkonzentration und insbesondere die Konzentration von Triglyceriden in menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten ist bekanntlich für eine Anzahl pathologischer Verhältnisse signifikant, weshalb die entsprechende Bestimmung zu den üblichen Verfahren der klinischen Chemie gehört. Dabei werden die Glyceride generell hydrolysiert und das so freigesetzte Glycerin nach verschiedenen Verfahren bestimmt. Zur Hydrolyse sind sowohl chemische als auch enzymatisch^ Verfahrensweisen be-The concentration of glycerides and in particular the concentration of triglycerides in human and animal Body fluids are known to be significant to a number of pathological conditions, and therefore are the corresponding determination is one of the usual procedures in clinical chemistry. This is where the glycerides generally hydrolyzed and the glycerine released in this way is determined by various methods. Are for hydrolysis chemical as well as enzymatic ^ procedures involve
604-(MCA 103)-SF-Bk604- (MCA 103) -SF-Bk
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kannt, wobei die enzymatischen Verfahren aufgrund ihrer Sicherheit, Spezifität und leichten Anwendbarkeit allgemein bevorzugt werden.knows, the enzymatic process because of their Safety, specificity and ease of use in general to be favoured.
Als Enzyme wurden bereits mehrere, jeweils aus einer einzigen Quelle stammende Lipasen angegeben, beispielsweise Lipase aus Rhizopus arrhizus (im folgenden kurz als LIPR bezeichnet) (vgl. die US-PS 3 759 793) sowie Lipase aus Pseudomonas fluorescens (im folgenden kurz als LPL bezeichnet) (vgl. Clinica Chimica Acta 8J (1977) 125-130).Several lipases, each originating from a single source, have already been specified as enzymes, for example lipase from Rhizopus arrhizus (hereinafter referred to as LIPR for short) (see US Pat. No. 3,759,793) and lipase from Pseudomonas fluorescens (hereinafter referred to as LPL (see Clinica Chimica Acta 8J (1977) 125-130).
Derartige aus einer einzigen Quelle stammende Lipasen führen jedoch entweder nicht zu einer vollständigen Hydrolyse der Glyceride oder erlauben eine vollständige Hydrolyse lediglich unter eingeschränkten Bedingungen oder unter Verwendung unpraktikabel großer Mengen an Enzym bzw. nur während ungeeignet langer Reaktionszeiten. Aus diesem Grund wurden bisher aus einer einzigen Quelle stammende Lipasen für diesen Zweck nicht eingesetzt. Anstelle davon wurden Enzymgemische angewandt, beispielsweise Gemische von LIPR mit Protease (US-PS 3 703 591), Gemische von LIPR mit Carboxylesterase (US-PS 3 862 009) sowie Gemische von LIPR mit Lipase aus Candida cylindracea (US-PS 4 056 442) .However, such lipases derived from a single source either do not lead to complete hydrolysis of the glycerides or allow complete hydrolysis only under restricted conditions or using impractically large amounts of enzyme or only during unsuitably long reaction times. For this reason, lipases from a single source have not previously been used for this purpose. Instead, enzyme mixtures were used, for example mixtures of LIPR with protease (US Pat. No. 3,703,591), mixtures of LIPR with carboxylesterase (US Pat. No. 3,862,009) and mixtures of LIPR with lipase from Candida cylindracea (US Pat. No. 4,056,442 ).
Derartige Gemische sind jedoch ebenfalls nur beschränkt 'anwendbar: Proteasen begrenzen die Stabilität entsprechender Reagentien, da sie gegebenenfalls Proteine im Reagens oder der Probe angreifen; Carboxylesterasen weisen andererseits den Nachteil auf, daß sie nur schwierig zu reinigen sind; Kombinationen von LIPR mit Lipasen von Candida cyclindracea werden andererseitsHowever, such mixtures are also only of limited use: proteases limit the stability of corresponding reagents, since they may attack proteins in the reagent or the sample; On the other hand, carboxylesterases have the disadvantage that they are difficult to purify; Combinations of LIPR with lipases from Candida cyclindracea , on the other hand, are used
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durch Netzmittel, wie sie üblicherweise bei Reagentien, Proben oder Kontrollproben, insbesondere in automatisch, kontinuierlich arbeitenden Analysatoren (zB Continuousflow-Analyzer) f angewandt werden, inhibiert.by wetting agents, as are usually used in reagents, samples or control samples, in particular in automatically, continuously operating analyzers (eg continuous flow analyzer) f .
Derartige mit einem kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom arbeitende automatische Analysatoren bringen erhebliche Einschränkungen hinsichtlich der Verfahrensbedingungen für die Hydrolyse von Triglyceriden mit sich. Häufig enthalten die Eichproben und Standards grenzflächenaktive Mittel, wobei zugleich kleine Probenmengen und kurze Reaktionszeiten angewandt werden. So wird beispielsweise beim Gerät Technicon SMAC eine feste Inkubationszeit von 2,5 min bei 37 0C angewandt, wobei grenzflächenaktive Mittel bei den zur Eichung verwendeten Standards zur Anwendung kommen, die zur Inhibierung einiger Lipasen und beispielsweise des in der US-PS 4 056 442 angegebenen Enzymgemischs führen.Such automatic analyzers, which operate with a continuous flow of liquid, entail considerable restrictions with regard to the process conditions for the hydrolysis of triglycerides. The calibration samples and standards often contain surface-active agents, with small sample quantities and short reaction times being used at the same time. For example, with the Technicon SMAC device, a fixed incubation time of 2.5 min at 37 ° C. is used, with surface-active agents being used in the standards used for calibration, which inhibit some lipases and for example that in US Pat. No. 4,056,442 lead specified enzyme mixture.
Anschließend an die Hydrolyse der Triglyceride kann das freigesetzte Glycerin in geeigneter Weise bestimmt werden, üblicherweise wird hierfür das Verfahren unter Verwendung von Glycerinkinase angewandt, das in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben ist, beispielsweise in den US-PSen 3 703 591, 3 759 793 und 4 056 442 sowie in der Firmenschrift 'Technicon Method No. SG4-OO23PC61 der Technicon Instruments Corporation von März 1976; auf diese Veröffentlichungen wird hier Bezug genommen.Subsequent to the hydrolysis of the triglycerides, the released glycerol can be determined in a suitable manner, usually using the method using glycerol kinase which is described in numerous publications, for example in US Pat. Nos. 3,703,591, 3,759,793 and 4,056 442 as well as in the company publication 'Technicon Method No. SG4-0023PC6 1 from Technicon Instruments Corporation dated March 1976; these publications are incorporated herein by reference.
Bei einer dieser Verfahrensweisen lassen sich die zur Bestimmung herangezogenen Reaktionen wie folgt zusammenfassen:In one of these procedures, the reactions used for determination can be as follows sum up:
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m · ι -j enzymatische Hydrolyse „, . „„„ Triglyceride - - - > Glycerin + FFSm · ι -j enzymatic hydrolysis ",. „„ „Triglycerides - - -> Glycerin + FFS
Glycerin + ATP — > GP + ADPGlycerin + ATP - > GP + ADP
ADP + PEP $ ATP + PyruvatADP + PEP $ ATP + pyruvate
Pyruvat + NADH ^°-^ » Lactat + NAD;Pyruvate + NADH ^ ° - ^ »lactate + NAD;
dabei bedeuten:mean:
FFS = freie FettsäurenFFS = free fatty acids
ATP = AdenosintriphosphatATP = adenosine triphosphate
GK = GlycerinkinaseGK = glycerol kinase
GP = GlycerinphosphatGP = glycerol phosphate
ADP = AdenosindiphosphatADP = adenosine diphosphate
PEP = PhosphorenolbrenztraubensäurePEP = Phosphorenolpyruvic Acid
LDH = LactatdehydrogenaseLDH = lactate dehydrogenase
PK = PyruvätkinasePK = pyruvate kinase
NAD = Nicotinamid-adenin-dinucleotid (oxidierte Form) undNAD = nicotinamide adenine dinucleotide (oxidized form) and
NADH = Nicotinamid-adenin-dinucleotid (reduzierte Form)NADH = nicotinamide adenine dinucleotide (reduced form)
NADH besitzt eine Absorption bei 340 nm, während NAD keine entsprechende Absorption aufweist; die Abnahme der optischen Absorption bei 340 nm wird gemessen und als Maß für die Konzentration an Triglyceriden in der Probe geeicht.NADH has an absorption at 340 nm, while NAD has no corresponding absorption; the decrease in optical absorption at 340 nm is measured and calibrated as a measure of the concentration of triglycerides in the sample.
Verfahren, bei denen die Abnahme von NAD über andere Enzymreaktionen ermittelt wird, sind ebenfalls bekannt und beispielsweise in der US-PS 4 056 442 sowie in Clinica Chimica Acta _81_ (1977) 125 bis 130 beschrieben. Auch auf diese Druckschriften wird hier Bezug genommen.Methods in which the decrease in NAD is determined via other enzyme reactions are also known and described, for example, in U.S. Patent 4,056,442 and in Clinica Chimica Acta "81" (1977) 125-130. Reference is also made here to these publications.
Erfindungsgemäß wurde ein neuartiges Gemisch von Lipasen entwickelt, die stabil sind und Triglyceride inAccording to the invention, a novel mixture of lipases was developed, which are stable and triglycerides in
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Körperflüssigkeiten in kurzen Reaktionszeiten, wie sie in mit kontinuierlicher Strömung arbeitenden Analysengeräten nur vorliegen, sowie in Gegenwart von grenzflächenaktiven Mitteln vollständig hydrolysieren. Dieses Gemisch läßt sich sowohl für manuelle Einzelbestimmungen als auch bei beliebigen anderen Verfahrensweisen einsetzen und eignet sich insbesondere zur schnellen automatischen Bestimmung in kontinuierlich arbeitenden Analysengeräten.Body fluids in short reaction times like them only exist in analyzers working with continuous flow, as well as in the presence of surface-active ones Completely hydrolyze agents. This mixture can be used both for manual individual determinations as well as in any other procedure and is particularly suitable for fast automatic determination in continuously working analysis devices.
Anschließend an die hiermit vorgenommene Hydrolyse kann die Bestimmung des freigesetzten Glycerins nach irgendeiner geeigneten Verfahrensweise erfolgen, beispielsweise nach dem oben angegebenen Verfahren unter Verwendung von Glycerinkinase und NADH/NAD.Following the hydrolysis carried out in this way, the glycerol released can be determined any suitable procedure, for example by the method given above Use of glycerine kinase and NADH / NAD.
Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung enthält ein Gemisch von Lipase aus Rhizopus arrhizus (LIPR) und aus Lipase von Pseudomonas fluorescens (LPL) im Verhältnis von etwa 2:1 bis etwa 10:1 Einheiten/ml der betreffenden Lipasen, vorzugsweise im Verhältnis von etwa 4:1 bis 10:1 und noch günstiger im Verhältnis von etwa 5:1.The enzyme composition according to the invention contains a mixture of lipase from Rhizopus arrhizus (LIPR) and lipase from Pseudomonas fluorescens (LPL) in a ratio of about 2: 1 to about 10: 1 units / ml of the lipases in question, preferably in a ratio of about 4: 1 up to 10: 1 and even cheaper in a ratio of about 5: 1.
Das Gemisch sollte entsprechend etwa 65 bis 91 Einheiten LIPR und 35 bis 9 Einheiten LPL pro 100 Einheiten an insgesamt vorliegender Lipase enthalten.The mixture should be roughly 65 to 91 units of LIPR and 35 to 9 units of LPL per 100 units contained in total lipase present.
Zur Hydrolyse einer Probe innerhalb der verfügbaren Reaktionszeit muß eine ausreichende Gesamtmenge an Lipase eingesetzt werden. Zur raschen Hydrolyse von etwa 20 /U1 einer Testprobe, die bis zu 5 g/l oder mehr Triglyceride enthält, sollten etwa 150 Einheiten Lipase-Gesamtmenge eingesetzt werden.A sufficient total amount of lipase must be used to hydrolyze a sample within the available reaction time. For rapid hydrolysis of about 20 / U 1 of a test sample containing up to 5 g / L or more triglycerides, about 150 units of total lipase should be used.
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Ein Gemisch von 250 U/ml Lipase von Khizopus arrhizus und 50 U/ml Lipase von Pseudomonas fluorescens ist dabei bevorzugt. Das Gemisch sollte ferner auf einen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und 7,0 und noch bevorzugter zwischen 6,4 und 6,5 gepuffert sein und wird ferner vorzugsweise aus Stabilitätsgründen lyophilisiert bzw- als trockenes Pulver hergestellt.A mixture of 250 U / ml lipase from Khizopus arrhizus and 50 U / ml lipase from Pseudomonas fluorescens is preferred. The mixture should furthermore be buffered to a pH value between about 6.0 and 7.0 and even more preferably between 6.4 and 6.5 and is furthermore preferably lyophilized or produced as a dry powder for reasons of stability.
Lipase aus Rhizopus arrhizus (E. C. 3.1.1.3) ist in den oben genannten Publikationen beschrieben; ein Verfahren zu ihrer Herstellung ist in der US-PS 3 513 angegeben.Lipase from Rhizopus arrhizus (EC 3.1.1.3) is described in the publications mentioned above; a process for their preparation is given in U.S. Patent 3,513.
Lipase aus Pseudomonas fluorescens sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der US-PS 3 431 175 sowie in Clinica Chimica Acta _8j[ (1977) 125 - 130 angegeben.Lipase from Pseudomonas fluorescens and processes for their production are given in US Pat. No. 3,431,175 and in Clinica Chimica Acta _8j [(1977) 125-130.
Beide Enzyme sind im Handel erhältlich; die entsprechenden Mikroorganismen sind bei anerkannten Hinterlegungsstellen hinterlegt.Both enzymes are commercially available; the corresponding microorganisms are with recognized depository offices deposited.
Als Einheit der Lipaseaktivität wird im Rahmen der" Erfindung diejenige Fettsäuremenge verstanden, die von 1 ,umol Natriumhydroxid in 1 min bei 25 0C und pH 8 neutralisiert wird.As a unit of lipase activity in the context of the "invention is that amount of fatty acid is understood, which is neutralized at 25 0 C and pH 8 of 1, umol of sodium hydroxide in 1 min.
Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Lipase-Hydrolysegemisch ist die in dem nachstehenden Beispiel 1 angegebene wäßrige Enzymlösung. Das Enzymgemisch wird aus Gründen der Lagerstabilität vorzugsweise in trockener oder getrockneter Form erzeugt und vor Gebrauch mit destilliertem Wasser wiederhergestellt.A lipase hydrolysis mixture preferred according to the invention is that given in Example 1 below aqueous enzyme solution. For reasons of storage stability, the enzyme mixture is preferably in a dry place or dried form and reconstituted with distilled water before use.
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Zur Verwendung in mit kontinuierlicher Strömung arbeitenden Analysengeräten, beispielsweise dem Gerät Technicon SMAC mit festgelegter Inkubations- bzw. Reaktionszeit von 2,5 min bei 37 0C, wird eine Serumprobe im Volum-Verhältnis 1:6 mit destilliertem Wasser verdünnt, das eine kleine Menge eines grenzflächenaktiven Mittels wie beispielsweise 0,1 % Triton X-100 (DuPont) enthält; jedem Teil der verdünnten Probe werden 4,25 Volumteile des wiederhergestellten Lipasereagens zugesetzt.For use in continuous flow operating analyzers, for example, the device Technicon SMAC with specified incubation and reaction time of 2.5 min at 37 0 C, a serum sample in the volume ratio 1: 6 diluted with distilled water containing a small amount a surfactant such as 0.1% Triton X-100 (DuPont); 4.25 parts by volume of the reconstituted lipase reagent are added to each part of the diluted sample.
118 ,ul der verdünnten Probe werden bei dem oben genannten Gerät eingesetzt; pro Test werden etwa 0,4 ml Lipasereagens zugesetzt. Vollständige Hydrolyse wird in 2,5 min erreicht.118, µl of the diluted sample are added to the above mentioned device used; Approximately 0.4 ml of lipase reagent is added per test. Complete hydrolysis will reached in 2.5 minutes.
Die Vergleichsversuche wurden in einem mit kontinuierlicher Strömung arbeitenden Analysator (Technicon-Gerät) mit festgelegter Reaktionszeit von 2,5 min (37 0C) durchgeführt, wobei (1) das wäßrige Reagens von Beispiel 1 und (2) Standard-Enzymgemische (von Technicon Instrument Corporation) verwendet wurden, die ein Gemisch von LIPR und Protease gemäß der US-PS 3 703 591 enthielten.The comparative experiments were carried out in a continuous flow analyzer (Technicon device) with a fixed reaction time of 2.5 min (37 ° C.), with (1) the aqueous reagent from Example 1 and (2) standard enzyme mixtures (from Technicon Instrument Corporation) containing a mixture of LIPR and protease disclosed in U.S. Patent No. 3,703,591.
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Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angeführt (Triglyceridgehalte in mg/dl).The results obtained are shown in Table 1 (triglyceride contents in mg / dl).
Aus den typischen Ergebnissen geht die gute Korrelation hervor.The good correlation emerges from the typical results.
Die Proben 1 bis 8 waren Patientenseren, deren Tr iglyceridkonzentrationen nach der Durchführung der Hydrolyse mit der bevorzugten Lipase-Zusammensetzung von Beispiel 1 auf einem Technicon-SMAC-Gerät gemessen wurden; die Erwartungswerte für jedes Serum wurden unter Verwendung eines handelsüblichen Lipasereagens auf der Basis der US-PS 3 703 951 ermittelt.Samples 1 to 8 were patient sera whose triglyceride concentrations after performing hydrolysis with the preferred lipase composition of Example 1 were measured on a Technicon SMAC device; the expected values for each serum were using a commercially available lipase reagent based on US Pat. No. 3,703,951.
Die Korrelation dieser Seren zeigt, daß die bei der Geräteeichung eingesetzten grenzflächenaktiven Mittel die Lipasereaktion nicht inhibierten.The correlation of these sera shows that the surfactants used in the device calibration did not inhibit the lipase reaction.
Bei jedem Test wurde das hydrolytisch freigesetzte Glycerin in einen fließenden Strom von Nachweisreagens hineindialysiert, bei dem die oben erläuterten ReaktionenIn each test, the hydrolytically released glycerin was placed in a flowing stream of detection reagent dialysed in, in which the reactions explained above
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von NADH zu NAD verwendet und die resultierende Absorptionsänderung optisch bei 340 nm gemessen und durch Eichung der Triglyceridkonzentration in der Probe zugeordnet wurde.from NADH to NAD used and the resulting change in absorbance measured optically at 340 nm and by calibrating the triglyceride concentration in the sample was assigned.
Ein bevorzugtes Reagensgemisch zur Bestimmung von freiem Glycerin ist im nachfolgenden Beispiel 2 angegeben; die Mengen sind jeweils auf 1 1 des wäßrigen Systems bezogen.A preferred reagent mixture for the determination of free glycerol is given in Example 2 below; the amounts are in each case based on 1 liter of the aqueous system.
I. Glycerinkinase-Reagens:I. Glycerol Kinase Reagent:
GK Triäthylamin-hydrochloridGK triethylamine hydrochloride
II. Glycerin-Substratreagens:II. Glycerin Substrate Reagent:
Trispuffer Magnesiumsulfat ATP PEP NADH LDHTris buffer magnesium sulfate ATP PEP NADH LDH
> 2610 ü> 2610 above sea level
100 mmol100 mmol
32 mmol 8,6 mmol 8,6 mmol 0,306 mmol 0,273 mmol32 mmol 8.6 mmol 8.6 mmol 0.306 mmol 0.273 mmol
£ 2400 U£ 2400 U
> 1200 U.> 1200 U.
Die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse von Beispiel 1 wurden unter Verwendung dieser Reagentien erhalten. The results of Example 1, shown in Table 1, were obtained using these reagents.
Zur Verlängerung der Lagerfähigkeit können den erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen übliche ionische sowie Proteinstabilisatoren zugesetzt werden.To extend the shelf life of the enzyme compositions according to the invention, customary ionic and protein stabilizers can be added.
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Zur Ermittlung der in Tabelle 1 angegebenen Erwartungswerte wurden handelsübliche Reagentien (von Technicon Instrument Corporation) herangezogen.To determine the expected values given in Table 1, commercially available reagents (from Technicon Instrument Corporation).
Aus weiteren Tests geht hervor, daß weder LIPR noch LPL allein zu einer vollständigen Hydrolyse von Triglyceriden in der Probe bzw. im Eichgemisch innerhalb einer Inkubationsdauer von 2,5 min bei 37 0C in der Lage sind und die erfindungsgemäße Enzymkombination eine-synergistische Wirkung besitzt.From further tests it is apparent that neither LIPR are still LPL alone to a complete hydrolysis of triglycerides in the sample or the calibration mixture within an incubation period of 2.5 min at 37 0 C in the situation and the enzyme combination of the invention-a synergistic effect has .
Erforderlichenfalls können auch längere Reaktionszeiten sowie Temperaturen zwischen etwa Raumtemperatur und etwa 50 0C angewandt werden. Zur Erzielung einer vollständigen Hydrolyse innerhalb der zur Verfügung stehenden Reaktionszeit und innerhalb des zur Bestimmung in Frage kommenden Konzentrationsbereichs muß eine ausreichende Enzymgesamtmenge innerhalb der oben angegebenen Mengenverhältnisse eingesetzt werden.If necessary, longer reaction times and temperatures between about room temperature and about 50 ° C. can also be used. To achieve complete hydrolysis within the available reaction time and within the concentration range in question for the determination, a sufficient total amount of enzyme within the proportions given above must be used.
Die Erfindung ist nicht auf die lediglich beispielhaften Angaben der obigen Ausführungsbeispiele beschränkt.The invention is not restricted to the information given by way of example in the above exemplary embodiments.
Die Erfindung betrifft zusammengefaßt eine neuartige, stabile Kombination von Lipase aus Rhizopus arrhizus und Lipase von Pseudomonas fluorescens zur Hydrolyse von Triglyceriden zur freiem Glycerin, insbesondere in Körperflüssigkeiten und für analytische Zwecke.In summary, the invention relates to a novel, stable combination of lipase from Rhizopus arrhizus and lipase from Pseudomonas fluorescens for the hydrolysis of triglycerides to free glycerol, in particular in body fluids and for analytical purposes.
Eine im wesentlichen vollständige und sehr schnelle Hydrolyse wird mit einem Enzymgemisch im MengenverhältnisSubstantially complete and very rapid hydrolysis is achieved with a mixture of enzymes in proportion
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von 2:1 bis 10:1 und vorzugsweise 5:1 erreicht, wobei sich die Mengenangaben auf die Aktivitätseinheiten der jeweiligen Lipase beziehen.from 2: 1 to 10: 1 and preferably 5: 1, wherein the quantities given relate to the units of activity of the respective lipase.
Etwa 150 Einheiten Gesamt-Lipase führen zu einer im wesentlichen vollständigen Hydrolyse der in 20 /ul Serum bis zu einer Minimalkonzentration von 5 g/l enthaltenen Triglyceride innerhalb von 2,5 min bei 37 C.About 150 units of total lipase results in essentially complete hydrolysis of the 20 / µl Serum up to a minimum concentration of 5 g / l triglycerides contained within 2.5 min at 37 C.
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