DE3005020C2

DE3005020C2 -

Info

Publication number: DE3005020C2
Application number: DE3005020A
Authority: DE
Inventors: Louis Paris Fr Ostre
Original assignee: Sanofi Sante Animale SA
Current assignee: Ceva Sante Animale SA
Priority date: 1979-02-12
Filing date: 1980-02-11
Publication date: 1991-08-01
Also published as: ATA74580A; IT8019844A0; IT1212401B; AU5541280A; SE8001062L; GB2046567B; AT368842B; DK57980A; SE452244B; BG48331A3; PL122629B1; AU537458B2; NL8000876A; CH643988A5; GB2046567A; HU185784B; RO85921A; RO85921B; YU43215B; YU34980A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Silieren von frischen bzw. Grünpflanzen, wodurch es ermöglicht wird, daß die Pflanzen je nach Bedarf zu einem späteren Zeitpunkt, d. h. nach ihrer Ernte, in appetitanregender Form konsumiert bzw. verfüttert werden können.

Verfahren zur Silierung von Grünpflanzen sind mit einer Anzahl von Schwierigkeiten verbunden.

Das Silieren beruht auf dem Prinzip, daß frische bzw. Grünpflanzen über einen längeren oder kürzeren Zeitraum in einem geschlossenen, dichten Behälter aufbewahrt werden, und zwar unter sauren Bedingungen, damit die Entwicklung von fäulniserregenden, alkalisch machenden und gasentwickelnden Keimen verhindert wird, was darauf beruht, daß sich diese Keime unter sauren Bedingungen nicht entwickeln. Die Erzielung eines guten Silierens ist schwierig und mit zahlreichen Problemen verbunden. Das Hauptproblem ist die mögliche Bildung von Gärungsprodukten, die für die Tiere, an die das Silofutter verfüttert wird, ja sogar für die Menschen, die das Fleisch dieser Tiere und die Milchprodukte verzehren, gesundheitsgefährlich sind.

Die Erforschung des Siliermechanismus ergab folgendes: Den im Siliermedium enthaltenen Milchsäurebakterien wird die Erzeugung von Milchsäure aus zur Verfügung stehenden, löslichen Zuckern ermöglicht, damit der pH des Siliermediums auf einen Wert in der Nähe von 4 sinken kann. Es kommt jedoch relativ häufig vor, daß die zu silierenden Pflanzen nicht genügend vergärbare Zucker enthalten, daß die Vermehrung der einzelnen in dem Siliermedium enthaltenen Milchsäurebakterien unzureichend ist, daß der pH nicht schnell genug auf einen Wert von 4 herabsinkt, daß sich Buttersäurebakterien und anaerobe Bakterien entwickeln, durch die die restlichen Zucker in Buttersäure, Essigsäure, Kohlendioxid und Wasserstoff umgewandelt werden, und daß die Proteine bis zur Stufe des Ammoniaks und anderer Metaboliten abgebaut werden.

Zur Beseitigung dieser Probleme sind verschiedene Lösungen vorgeschlagen worden. Es ist insbesondere bekannt, durch Zugabe verschiedener Säuren eine chemische Säuerung zu bewirken, jedoch sind diese Verfahren nicht ungefährlich. Es ist auch bekannt, durch Zugabe von in hohem Maße zur Spaltung von Kohlenhydraten befähigten Bakterien eine biologische Säuerung zu bewirken, jedoch ist die Verwirklichung der biologischen Säuerung mit Schwierigkeiten verbunden.

Es sind auch Verfahren bekannt, bei denen man in den Silo ein an Kohlenhydraten reiches Grundmaterial, z. B. Melasse, hineingibt, jedoch sind diese Verfahren kostspielig, und man erzielt damit keine gleichmäßigen Ergebnisse.

Aus der FR-PS 23 61 828 (DE 27 36 880 A1) ist ein Verfahren zur Silierung von Grünpflanzen durch Milchsäure-Säuerung bekannt, bei dem zu den Pflanzen vor dem Silieren Bakterien hinzugegeben werden, die zum Hervorrufen der Milchsäuregärung befähigt sind, und bei dem auch Wirkzusatz für den Abbau von höheren Kohlenhydraten zu vergärbaren Zuckern, die von den Milchsäuregärung verursachenden Bakterien ausgenutzt werden können, hinzugegeben wird. Dieser Abbau-Wirkzusatz besteht aus grampositiven Bakterien, die eine Fermentierung von Stärke, Glucose, Mannit, Rhamnose, Saccharose, Amygdalin und/oder Arabinose bewirken, jedoch zur Fermentierung von Maltose, Inosit oder Sorbit nicht befähigt sind. Diese Bakterien haben folgende Eigenschaften: VP +; Oxidase +; Catalase ∓; Nitrate ∓; Harnstoff -; Citrate -; Indol -; H₂S -. Der Abbau-Wirkzusatz kann auch ein Enzym oder mehrere Enzyme enthalten, die zum Spalten von Polysacchariden, insbesondere zum Spalten der Stärken, der Pentosane und anderer komplexer Polysaccharide in vergärbare Zucker, befähigt sind. Insbesondere kann nach der FR-PS 23 61 828 zu den zu silierenden Pflanzen ein hemicellulolytischer Komplex pilzlichen Ursprungs hinzugegeben werden, der als hauptsächliche Aktivität eine Galactomannanase-Aktivität und sekundäre Aktivstoffe wie Xylanasen, Amylasen, Pectinasen und eine Amylase zur Gewährleistung der Bildung der für die Erzeugung der Milchsäure durch die Bakterien notwendigen Maltose aufweist.

Das Verfahren der FR-PS 23 90 908 stellt gegenüber dem Verfahren der FR-PS 23 61 828 eine Verbesserung dar. Während bei dem Verfahren der FR-PS 23 61 828 als Amylase eine Exoamylase pilzlichen Ursprungs eingesetzt wird, durch die Stärke nicht vollständig abgebaut wird, handelt es sich bei der in dem Verfahren der FR-PS 23 90 908 eingesetzten Amylase um eine Amylase bakteriellen Ursprungs. Dieses Enzym (Endoamylase) wirkt auf die verflüssigten Stärken und erzeugt hauptsächlich α-D-Maltose und etwas α-D-Glucose. Diese Endoamylase wirkt in einem pH-Bereich zwischen 5 und 8. In der FR-PS 23 90 908 wird auch die Verwendung von Amyloglucosidase beschrieben, die gegenüber den Ketten der Amylose und des Amylopectins in bezug auf die Erzielung von α-D-Glucose eine viel stärkere Wirkung entfaltet.

Die Enzymzusammensetzung gemäß der FR-PS 23 90 908 enthält auch einen hemicellulolytischen Komplex pilzlichen Ursprungs, der auf die Polysaccharid-Bestandteile der Zellmembranen und auf die Dextrine wirkt, und zwar in pH-Bereichen zwischen 5,5 und 2.

Aufgabe der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zum Silieren von Pflanzen, bei dem sowohl der Enzymkomplex als auch der Bakterienkomplex verbessert ist.

Diese Aufgabe wird durch das in Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren gelöst.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Enzymkomplex ist dadurch gekennzeichnet, daß er, gegebenenfalls unter zusätzlicher Verwendung von an sich bekannten Enzymen, einen cellulolytischen Komplex oder eine Cellulase enthält, der oder die zur Spaltung der β-glykosidischen 1,3- und 1,4-Bindungen der Polysaccharide befähigt ist, die durch die bekannte Enzymzusammensetzung nicht angegriffen werden.

Bei dem im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten cellulolytischen Komplex handelt es sich um einen cellulolytischen Komplex pilzlichen Ursprungs, durch den die natürliche Cellulose und die anderen Polysaccharide, die in den Zellmembranen enthalten sind, abgebaut werden.

Dieses Enzym wirkt in einem pH- Bereich zwischen 2 und 5. Hinsichtlich des Abbaus der pflanzlichen Strukturen besteht eine synergistische Zusammenwirkung zwischen dem cellulolytischen Komplex und dem hemicellulolytischen Komplex.

Wegen der Umgebung der Cellulose in der Pflanze werden für die Hydrolyse der Cellulose mehrere Enzyme oder ein einzelnes Enzym benötigt, die mehrere Funktionen erfüllen, die nachstehend angegeben werden:

- Hydrolyse der amorphen Zonen,
- Quellung der kristallinen Bereiche und Spaltung der Wasserstoffbindungen zwecks Bildung von linearen Molekülen,
- Hydrolyse der Cellobiose zu Glucose,
- Transglucosylierung der Di- und Oligosaccharide sowie Spaltung der unregelmäßigen Bindungen der Cellulose und ihrer primären Hydrolyseprodukte.

Der cellulolytische Komplex ist entsprechend den vorstehend angegebenen Kriterien nach einer großen Anzahl von Versuchen mit verschiedenen Pflanzen ausgewählt worden.

Eine Cellulase wird durch ihre Aktivität definiert, die in Internationalen Einheiten (IE) pro Gramm des Produkts ausgedrückt wird, wobei eine IE die Enzymmenge ist, durch die auf einem gegebenen Cellulosesubstrat pro Minute das Äquivalent von einem Mikromol Glucose in Form von reduzierendem Zucker freigesetzt wird.

Die Aktivitäten variieren in Abhängigkeit von dem verwendeten Substrat:

- Wenn die Aktivität auf Papierpulver aus Whatman CC 31-Papier getestet wird, erhält man die Aktivität C₁;
- wenn die Aktivität auf Carboxymethylcellulose getestet wird, erhält man die Aktivität C_x.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Komplex weist eine sehr hohe cellulolytische Aktivität auf und besitzt auch sekundäre Aktivitäten vom hemicellulolytischen Typ. Die starke cellulolytische Wirkung äußert sich in einer sehr starken Aktivität C₁, einer sehr starken Aktivität C_x und einer Cellobiase- Aktivität (β-Glucosidase-Aktivität).

Die Aktivität C₁ des Enzymkomplexes, die gemäß hypothetischen Annahmen aus einer Aktivität C_x besteht, zu der ein unbekannter Faktor hinzugetreten ist, äußert sich insbesondere in einer lösbarmachenden Wirkung auf die Cellulose.

C₁ ist zum Abbau der nativen Cellulose (kristalline Cellulose mit einem Polymerisationsgrad von mehr als 3500 Glucoseeinheiten) in amorphe Cellulose befähigt.

Die Aktivität C_x des Enzymkomplexes äußert sich insbesondere in der reduzierenden Wirkung der Endo- und Exoglucanasen. Diese Enzyme wirken hauptsächlich auf die Cellulosefasern in den Zonen mit schwacher Kristallinität und zerlegen die langen Verkettungen der Glucose in kleinere Einheiten.

Die Aktivität der β-Glucosidase äußert sich in einer Wirkung auf die nach der Wirkung des C_x erhaltenen Cellobiose-Einheiten.

Diese unterschiedlichen Aktivitäten können nicht getrennt betrachtet werden. In bezug auf den Abbau dieser Homopolymeren existiert ein synergistischer Mechanismus zwischen C₁ und C_x. Die enzymatischen Mechanismen der Aktivitäten C₁ und C_x führen zur Bildung von Cellobiose, die anschließend unter Bildung von zwei Glucoseeinheiten durch eine β-Glucosidase hydrolysiert wird.

Die Hydrolysereaktionen der Cellulose sind anscheinend gemäß dem nachstehenden Schema aufgeteilt:

Der Komplex C₁ macht die kristalline Cellulose (Cellulose mit einem Polymerisationsgrad, der mehr als 3500 Glucosemonomeren entspricht) löslich und erzeugt reaktive Cellulose (amorphe Cellulose).

Unter der Wirkung des Enzymkomplexes C_x (Endo- und Exoglucanasen) werden die Ketten der reaktiven Cellulose zerteilt, und zwar entweder im Inneren der Kette und zufällig im Falle der Endoglucanasen oder von den nicht reduzierenden Enden ausgehend im Falle der Exoglucanasen.

Diese Reaktionen führen insgesamt zur Bildung von Cellobiose-Einheiten.

Die Cellobiose-Einheiten werden durch eine β-Glucosidase hydrolysiert, wodurch zwei Moleküle Glucose gebildet werden.

Im Falle der erfindungsgemäß eingesetzten Pilz- Cellulasen ist der Enzymkomplex C₁ und C_x in der Lage, die native, unlösliche Cellulose unter Bildung von Glucose zu hydrolysieren.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Cellulasen wurden nicht nur im Hinblick auf die vorstehend angegebenen, allgemeinen Kriterien ausgewählt. Ihre Auswahl wurde vielmehr auch unter Berücksichtigung des Siliermediums getroffen, das in Abhängigkeit von dem polysaccharolytischen Verhalten dieser Cellulasen besonderer Art ist.

Dieses polysaccharolytische Verhalten wurde auf zwei Typen von Substraten bestimmt:

a) auf reinen Substraten;
b) auf dehydratisierten Substraten.

Reine Substrate

Man bestimmte die Aktivität der Cellulasen A, B, C, D, E und F auf verschiedenen Substraten bei einer gegebenen Konzentration in einem mit 0,1 m Acetat gepufferten Medium.

Die Aktivität wurde gemäß den üblichen Vorschriften getestet, d. h. bei pH 4,8 und 50°C nach 20minütiger Hydrolyse. Die reduzierende Wirkung wurde unter Anwendung des Hexacyanoferrat-Verfahrens bestimmt.

Dehydratisierte Substrate

Auch die Aktivität der Enzyme A, B, C, D, E und F auf verschiedenen dehydratisierten pflanzlichen Substraten wurde bestimmt.

Die Aktivität wurde bei den pH-Werten 3,8; 4,8 und 5,8 und 30°C nach einer Hydrolyse von 24 h getestet. Die reduzierende Wirkung wurde unter Anwendung des Dinitrosalicylsäure-Verfahrens bestimmt.

Die Analyse dieser verschiedenen Verhaltensweisen erlaubte eine Bestimmung der Aktivität des bei der Silierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden cellulolytischen Komplexes:

So wurde gefunden, daß die Cellulase oder der cellulolytische Komplex, die beim erfindungsgemäßen Verfahren zu frischen Pflanzen für die Silierung hinzuzugeben sind, einer Aktivität C₁ von 50 bis 0,005 IE und einer Aktivität C_x von 500 bis 0,05 IE pro 100 g der Pflanzen entsprechen müssen, wobei diese Aktivitäten bei pH 4,8 und 50°C nach 20minütiger Hydrolyse bestimmt werden.

Außerdem muß die ausgewählte Cellulase selbst nach einem langen Verweilen in dem Silo eine bedeutende Aktivität beibehalten.

Wie durch Versuche gezeigt wurde, muß der cellulolytische Komplex unter Bedingungen, die an die Bedingungen der Silierung angenähert sind, nach 10 Tagen mindestens 30% seiner anfänglichen Aktivität beibehalten.

Die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaus der pflanzlichen Struktur ist eine Funktion der Beseitigung der Glucose. Diese Verschiebung des enzymatischen Gleichgewichts wird durch Verwendung von Bakterien mit einem hohen Fermentiervermögen erzielt; die Säuerung des Mediums erfolgt sehr rasch. Wenn die pflanzliche Masse stabilisiert ist, werden die Vermehrung der Bakterien sowie die Bildung von Milchsäure angehalten, und zwar im Gegensatz zur cellulolytischen Aktivität der Cellulase, die mehr als 10 Tage länger andauert.

Diese Aktivität verursacht im Inneren des Gärfutters eine Erzeugung und Ansammlung von Glucose und erhöht dadurch den Nährwert der silierten Pflanzen.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Enzymkomplex enthält daher eine Cellulase oder einen cellulolytischen Komplex mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften, gegebenenfalls in Verbindung mit den in der FR-PS 23 90 908 beschriebenen Enzymen, d. h. mit einer Pilz-Amylase, einer Bakterien-Amylase, einer Amyloglucosidase und einem hemicellulolytischen Komplex.

Die in dem Enzymkomplex vorhandenen Enzyme haben demnach eine komplementäre Wirkung hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber den Kohlenhydraten, von den komplizierteren bis den einfacheren, und zwar in pH-Bereichen, die zwischen den Werten 7 und 2 liegen können. Die maximalen Werte der Aktivität für jedes Enzym wechseln sich ab entsprechend der Herabsetzung des pH-Werts, der in dem Silo nicht unter 3,5 herabsinkt, und in den von 10 bis 30°C variierenden Temperaturintervallen, die mit den Bedingungen des Silos verträglich sind.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Bakterienkomplex ist gekennzeichnet durch die Verwendung neuer, für die Silierung von Pflanzen geeigneter Bakterienstämme, die für sich oder im Gemisch mit den Bakterienstämmen und/oder den Enzymen eingesetzt werden können, die nach dem Stand der Technik bekannt und erfindungsgemäß beschrieben worden sind. Der neue Bakterienkomplex führt zu in hohem Maße verbesserten Ergebnissen der Silierung. Bei dem im erfindungsgemäßen Verfahren und in dem erfindungsgemäßen Mittel eingesetzten, neuen Bakterienstämmen handelt es sich um gramnegative Bakterien, die zur Familie der Enterobacteriaceae, Gattung Erwinia oder Pectobacterium, Gruppe Herbicola, gehören und als Enterobacter agglomerans bezeichnet werden (Klassifizierung gemäß Bergey, Manual of Bacteriology, 8. Auflage). Der Stamm Enterobacter agglomerans ist unter der Register Nr. I-114 im Institut Pasteur, Paris, am 11. Februar 1980 hinterlegt worden.

In Tabelle I werden die Eigenschaften dieser Bakterien aufgeführt:

Enterobacter agglomerans
Gram
-
Verwendung von Malonat	+
Glucose	+
Phenylalanindesaminase	-
ONPG (β-Galactosidase)	+
Indol	-
H₂S	-
LDC (Lysindecarboxylase)	-
ODC	-
Urease	-
Saccharose	+
Arginindihydrolase	-
Salicin	-
Adonit	-
Insoit	-
Sorbit	-
Arabinose	+
Maltose	-
Trehalose	+
Xylose	-
Stärke	+
Oxidase	-
Gelatine	+
Amygdalin	+
Melibiose	-
VP (Vöges-Proskauer)	+
Rhamnose	-

Der Einsatz dieser für sich oder in Verbindung mit anderen Bakterienstämmen und/oder mit Enzymen verwendeten, neuen Bakterienstämme zum Silieren von Pflanzen erfolgt in der nach dem Stand der Technik bekannten Art und Weise. Die Bakterien können auf einem Getreidemehle enthaltenden Nährsubstrat gezüchtet werden. Der erfindungsgemäß in das Silo einzuführende Bakterienkomplex enthält eine Mischung der benötigten Bakterien, die auf einem löslichen oder nichtlöslichen Träger aufgebracht sind, gegebenenfalls zusammen mit dem erfindungsgemäß empfohlenen Enzymkomplex.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Enzyme und die Bakterien auf einen Träger auf Getreidebasis (Weizen, Gerste, gekeimte Gerste) aufgebracht, der vorzugsweise in fein gemahlener bzw. fein zerriebener Form eingesetzt wird.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Bakterien und die Enzyme auf einen Träger vom Typ der vorgelierten Stärke, der Maltohexose usw. aufgebracht, d. h. auf einen Träger, der in kaltem Wasser leicht löslich ist.

Die Stärke und die anderen in den Trägern enthaltenen Polysaccharide kommen zu den Kohlenhydraten der Pflanzen hinzu und erhöhen so den Nährwert des Gärfutters. Das erfindungsgemäße Mittel aus der Mischung der auf einem Träger befindlichen Bakterien und dem Enzymkomplex, der auf einem Träger auf Getreidebasis aufgebracht ist oder nicht, kann jeden dieser Bestandteile in verschiedenen Anteilen enthalten. Die trockene Mischung bzw. das trockene Mittel enthält pro Gramm eine Kokkenmenge in der Größenordnung von 100 000 bis zu einer Million und eine Bazillenmenge in einer Größenordnung von 100 000 bis zu einer Million.

Die Mengen der Cellulase, des hemicellulolytischen Komplexes, der Amylase und der Amyloglucosidase können variabel sein; sie werden in Abhängigkeit von der Art des zu behandelnden Futters berechnet.

Die Menge der Cellulase, die zu den frischen, zu silierenden Pflanzen hinzuzufügen ist, muß einer Aktivität C₁ von 50 bis 0,005 IE pro 100 g Pflanzen entsprechen. Die Cellulase muß daher in einer Menge von 2 bis 2×10⁻⁴‰, bezogen auf das Gewicht der frischen Pflanzen, eingesetzt werden, wenn die Cellulase einen Titer bzw. einen Gehalt von 250 IE/g hat. Die anderen Enzyme werden in den folgenden Mengen eingesetzt:
Bakterien-Amylasen mit einem Gehalt von 250 Einheiten/g in einer Menge von 0,05 bis 0,20‰, auf das Gewicht der Pflanzen bezogen,
Pilz-Amylasen mit einem Gehalt von 50 000 PS 50-Einheiten/ g in einer Menge von 0,10 bis 0,20‰, auf das Gewicht der Pflanzen bezogen,
Amyloglucosidase mit einem Gehalt von 200 AG-Einheiten/ g in einer Menge von 0,10 bis 0,70‰, auf das Gewicht der Pflanzen bezogen, und ein
hemicellulolytischer Komplex mit einem Gehalt von 35 000 IE/g in einer Menge von 0,05 bis 0,20‰, auf das Gewicht der Pflanzen bezogen.

Wenn die Enzyme gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf einen Träger auf Getreidebasis aufgebracht werden, kann das in das Silo bzw. zum Silieren einzumischende, erfindungsgemäße Mittel etwa 1 kg Enzyme pro kg Träger enthalten. Im Falle eines löslichen Trägers ändert sich das Konzentrationsverhältnis von Enzym und Träger; es kann zwischen 1/1,5 und 1/4 variieren.

Durch das Einmischen von Cellulase in den Träger wird die Menge der zur Verfügung stehenden, vergärbaren Zucker erhöht, wodurch eine stärkere und schnellere Bildung von Milchsäure hervorgerufen wird. Auf diese Weise wird das pflanzliche Protein besser konserviert. Andererseits wird der Nährwert des Mediums dadurch nur erhöht.

Zur Veranschaulichung der Vorteile beim Einsatz eines cellulolytischen Komplexes und von Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae wurden Versuche in Mikrosilos und Minisilos durchgeführt. Die verschiedenen Konservierungsparameter sowie die Parameter, durch die die pflanzliche Struktur verändert wird, wurden untersucht.

1 - In Mikrosilos durchgeführte Versuche

Eine erste Reihe von Versuchen wurde im Labor in Mikrosilos durchgeführt, und zwar im Mai unter Verwendung von Luzerne. Die Mikrosilos hatten ein Fassungsvermögen von 1 kg. Die Luzerne wurde fein zerhackt und dann entsprechend der nachstehenden Versuchsvorschrift siliert:

A - Eine Reihe von Mikrosilos wurde unter Verwendung des Konservierungs-Zusatzstoffes mit der nachstehenden allgemeinen Zusammensetzung behandelt:

Träger auf Getreidebasis:\|90%
Vormischung:	10%

Die Vormischung bestand aus:

- einem Bakterienkomplex (5 Milchsäurebakterien auf Lactose als Träger);
- einem Enzymkomplex mit folgenden Bestandteilen:
- · einer Amylase pilzlichen Ursprungs;
- · einer Amylase bakteriellen Ursprungs;
- · einer Amyloglucosidase und
- · einem hemicellulolytischen Komplex pilzlichen Ursprungs mit einer galactomannanasischen bzw. Galactomannanase- Aktivität als Hauptaktivität und
- einem energiereichen Träger (fein gemahlene Gerste+Lactoserum)

wobei der Bakterienkomplex und der Enzymkomplex jeweils in einer Menge von 1% in die Zusammensetzung der Vormischung eingingen.

Der Konservierungs-Zusatzstoff wurde in einem Anteil von 2% zu der Luzerne hinzugegeben, was einer Einmischung der Vormischung in einer Menge von 0,2% entspricht, und auch 1% Gerste wurde zu der Luzerne hinzugegeben.

B - Eine Reihe von Mikrosilos wurde mit dem gleichen Konservierungs-Zusatzstoff wie bei A behandelt, wobei jedoch eine Cellulase pilzlichen Ursprungs, die von Trichoderma viride herrührte, dazu hinzugegeben wurde. Diese Cellulase hatte eine Aktivität C₁ von 250 Einheiten/ g und eine Aktivität C_x von 2500 Einheiten/g. (Diese Aktivitäten waren bei pH 4,8 und 50°C bei einer Reaktionszeit von 20 min bestimmt worden.) Diese Cellulase wurde in einer Menge von 2 g/t, d. h. in einer Menge von 2×10⁻⁴ Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der frischen Pflanzen (Versuch B), bzw. in einer Menge von 200 g/t (d. h. von 0,02%), bezogen auf das Gewicht der frischen Pflanzen, (Versuch B′) eingemischt.

C - Vergleichs-Mikrosilos

Zum Vergleich wurde eine Reihe von Mikrosilos mit Luzerne herangezogen, die keinen Konservierungs- Zusatzstoff enthielten: T=0.

Nach 100tägigem Silieren wurden die Mikrosilos geöffnet. Folgende Parameter wurden bestimmt: pH, Milchsäuregehalt und N_NH₃/N_gesamt. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle gezeigt:

Man stellt fest, daß die Zugabe einer Cellulase zu dem Bakterien- und Enzymkomplex gemäß der FR-PS 23 90 908 zu einer Verbesserung der Gebrauchsleitung des Konservierungs-Zusatzstoffes führt. Man erzielt eine bessere Konservierung der Pflanzen, die sich beim Vergleich von A und B′ in folgendem äußert:
in einer Verminderung des pH-Werts von 4,13 auf 3,73 (Verminderung um 10%);
in einem Anstieg der Erzeugung von Milchsäure um 15% und
in einer relativen Verminderung des Verhältnisses N_NH₃/N_gesamt um 8%, was zu einer besseren Konservierung des pflanzlichen Proteins führt und auf eine schnelle Säuerung des Siliermediums zurückzuführen ist.

2 - In Minisilos durchgeführte Versuche

Diese Versuche wurden im Juni unter Verwendung von Luzerne in Minisilos mit einem Fassungsvermögen von 150 kg durchgeführt.

Die Luzerne wurde fein zerhackt und dann einer Silierung entsprechend der nachstehenden Versuchsvorschrift unterzogen.

A - Eine Reihe von Minisilos wurde unter Verwendung des gleichen Konservierungs-Zusatzstoffes wie bei den Mikrosilos (unter Punkt A) behandelt, wobei die Vormischung in einer Menge von 0,2% eingemischt wurde.

B - Eine Reihe von Minisilos wurde unter Verwendung der bei A angegebenen Zusammensetzung und Dosismenge behandelt, wozu die gleiche Cellulase pilzlichen Ursprungs in einer Menge von 2 g/t hinzugegeben wurde.

Nach 100tägigem Silieren wurden die Minisilos geöffnet. Die Analyse des Gärfutters führte zu folgenden Ergebnissen:

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht der Vorteil der Zugabe einer Cellulose zu dem aus der FR-PS 23 90 908 bekannten Bakterien- und Enzymkomplex deutlich hervor.

Die Zugabe der Cellulase führt zu folgenden Ergebnissen:
zu einem geringeren pH-Wert (3,94 gegenüber 4,20, d. h. eine Verminderung um 6%);
zu einer bedeutenderen Menge an Milchsäure (Zunahme um 41,9%) und
zu einer viel besseren Konservierung des Proteinanteils des Gärfutters, was durch die Analyse bestätigt wird. In diesem Fall erhält man folgende Ergebnisse:
ein geringeres N_NH₃/N_gesamt-Verhältnis (relative Verminderung um 27,6%),
einen um 6% erhöhten Proteingehalt und
einen um 20,1% verminderten Gehalt an ammoniakalischem Stickstoff.

Diese größere Säuerungsgeschwindigkeit kann dadurch erklärt werden, daß die Bakterien schneller über eine bedeutende Menge an leicht in Milchsäure umwandelbaren, vergärbaren Zuckern verfügen können. In dieser Verfügbarkeit von vergärbaren Zuckern findet man die Wirkung der in das Siliermedium eingeführten Cellulase wieder.

In den nachstehenden Beispielen besteht die Mischung auf dem Träger entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren aus dem in der FR-PS 23 61 828 und/ oder der FR-PS 23 90 908 beschriebenen Komplex, dem in der Erfindung beschriebenen Enzymkomplex, zu dem gramnegative Bazillen aus der Familie der Enterobacteriaceae, Gattung Erwinia oder Pectobacterium, Gruppe Herbicola, in einer Menge hinzugefügt werden, die einer Einmischung von 10⁵ bis 10⁶ Bazillen/g in die Mischung entspricht.

Beispiele

In Silos mit einem Fassungsvermögen von 4 m³ wurden mit im Juni zu Beginn der Ährenbildung geerntetem Knäuelgras "Lucifer" Versuche durchgeführt. Die fein gehackten Futterpflanzen wurden unter vier Bedingungen eingelagert:

A: Silierung ohne Behandlung;
B: Durchführung der Silierung mit 4 l Ameisensäure/ t in bekannter Weise;
C: Durchführung der Silierung mit der Vormischung, deren Zusammensetzung in den FR-PSS 23 61 828 und 23 90 908 angegeben wird, wobei zu dem zu silierenden Futter 7 kg der Kultur von sieben Bakterien auf einem Träger hinzugegeben wurden, deren Eigenschaften in der FR-PS 23 61 828, Seite 7, Nrn. 1 bis 7, angegeben werden, und wobei Enzyme in einer Menge von 10 kg/t eingemischt wurden;
D: Durchführung der Silierung mit der Vormischung gemäß C unter Zugabe von Bazillen gemäß der Erfindung, d. h. von gramnegativen Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae, Gattung Erwinia oder Pectobacterium, Gruppe Herbicola, die mit Enterobacter agglomerans bezeichnet werden. Die Einmischung des Komplexes erfolgte in einer Menge von 10 kg/t;
E (nachgereicht): Die Durchführung der Silierung erfolgte unter Beachung der Beispiele der Patentanmeldung P 30 05 020.5, Seite 30 ff. mit einer Vormischung gemäß D unter Zugabe einer Cellulase pilzlichen Ursprungs, die von Trichoderma viride abstammt, wobei diese Cellulase eine Aktivität von 250 Einheiten/g und eine Aktivität C_x von 2500 Einheiten/g aufwies (diese Aktivitäten waren bei pH 4,8 und 50°C bei einer Reaktionszeit von 20 Minuten bestimmt worden). Diese Cellulase wurde in einem Anteil von 200 g/t (d. h. von 0,02%), bezogen auf das Gewicht der frischen Pflanzen, eingearbeitet.
Aus den Untersuchungsergebnissen ergibt sich, daß die erfindungsgemäße Behandlung eine deutliche Erhöhung des Gehalts an Milchsäure von 90 auf 120 g/kg Trockenmaterial gegenüber der bekannten Verfahrensweise C ergibt, wobei auch ein guter Schutz des Proteins erzielt werden kann.

Nach 90 bis 100 Tagen wurden die verschiedenen Silos geöffnet, und die silierten Pflanzen (Gärfutter) wurden analysiert. Man erhielt die nachstehend (in Tabelle II) aufgeführten Ergebnisse.

Tabelle II

Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse kann festgestellt werden, daß die Mischung gemäß den FR-PSS 23 61 828 und 23 90 908 schon zu einer Verbesserung bei der Konservierung des Gärfutters führt, wobei sich die Verbesserung in folgendem äußert:

- in einer Verminderung des pH-Werts von 5,28 auf 4,02,
- in einer Erhöhung des Gehalts an Milchsäure von 23 auf 90 g/kg Trockenmaterial und
- in einem besseren Schutz des Proteins, der sich aus einer Verminderung des Verhältnisses N_NH₃/N_gesamt von 17,76 auf 14% und aus einer Verminderung des Verhältnisses N_löslich/N_gesamt von 63,80 auf 48,10% ergibt.

Diese Mischung hat den Vorteil, daß weder Propionsäure noch Buttersäure gebildet wird.

Das erfindungsgemäße Mittel führt zu einer weiteren Verbesserung, die sich in folgendem äußert:

- in einer Verringerung des pH-Werts von 4,02 auf 3,70,
- in einer Erhöhung des Gehalts an Milchsäure von 90 auf 112 g/kg Trockenmaterial und
- in einem verbesserten Schutz des Proteins, der sich aus einer Verminderung des Verhältnisses N_NH₃/N_gesamt von 14 auf 8% und aus einer Verminderung des Verhältnisses N_löslich/N_gesamt von 48,10 auf 44% ergibt.

Auch diese Mischung, d. h. das erfindungsgemäße Mittel, hat den Vorteil, daß weder Propionsäure noch Buttersäure durch Vergärung gebildet wird.

Die Verdaubarkeit und die Aufnahme der Gärfutterbereitungen wurden bei Schafen gemessen. Nach Verabreichung der verschieden behandelten Gärfutterbereitungen fand man folgende Ergebnisse:

B: Behandlung mit Ameisensäure: 0,64 UF/kg;
C: Behandlung entsprechend den FR-PSS 23 61 828 und 23 90 908: 0,74 UF/kg;
D: Erfindungsgemäße Behandlung: 0,82 UF/kg.

Wie aus Tabelle III ersichtlich ist, führt die Stickstoffbilanz bei im Wachstum befindlichen Tieren zu Ergebnissen, aus denen der Vorteil der Verabreichung von Gärfuttern, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind, hervorgeht.

Tabelle III

Im Falle des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die zurückbehaltene Stickstoffmenge mehr als das Doppelte der Stickstoffmenge, die nach der Behandlung des Silofutters mit Ameisensäure zurückbehalten wird.

Claims

1. Verfahren zum Silieren von Grünpflanzen, bei dem zu den Grünpflanzen vor dem Silieren Wirkzusätze für den Abbau von höheren Kohlenhydraten zu vergärbaren Kohlenhydraten hinzugegeben sind, die von Milchsäuregärung verursachenden Bakterien ausgenutzt werden, wobei der Wirkzusatz aus Bakterien und einem Enzymkomplex, gegebenenfalls in Verbindung mit einer Pilz-Amylase, einer Bakterien- Amylase, einer Amyloglucosidase und einem hemicellulolytischen Komplex pilzlichen Ursprungs, der als hauptsächliche Aktivität eine Galactomannanase-Aktivität aufweist, besteht, dadurch gekennzeichnet, daß zu den Grünpflanzen zusätzlich

a) eine Cellulase pilzlichen Ursprungs, die von einem Trichoderma viride-Stamm herrührt und zur Spaltung der β-glykosidischen 1,3- und 1,4-Bindungen der Polysaccharide befähigt ist und eine Aktivität C₁ von 0,005 bis 50 IE und eine Aktivität C_x von 0,05 bis 500 IE pro 100 g der Grünpflanzen hat, wobei diese Aktivitäten, die bei pH 4,8 und 50°C nach 20minütiger Hydrolyse bestimmt sind, unter den Silierbedingungen nach Ablauf von 10 Tagen zu mindestens 30% beibehalten werden, und
b) gramnegative Bakterien des Stammes Enterobacter agglomerans, gehörend zur Familie der Enterobacteriaceae, Gattung Erwinia oder Pectobacterium, Gruppe Herbicola, hinterlegt im Institut Pasteur unter der Register Nr. I-114,

hinzugegeben werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae zusammen mit bekannten Bakterien einsetzt, die zum Abbau der höheren Kohlenhydrate zu vergärbaren Kohlenhydraten befähigt sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae zusammen mit grampositiven Bakterien einsetzt, die eine Vergärung von Stärke, Glucose, Mannit, Rhamnose, Saccharose, Amygdalin und Arabinose bewirken, jedoch nicht zur Fermentierung von Maltose, Inosit oder Sorbit befähigt sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzyme auf einem Träger auf Getreidebasis in einer Menge von etwa 1 kg Enzyme pro 9 kg Träger einmischt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien auf einem Getreidemehle enthaltenden Träger gezüchtet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien und die Enzyme auf einem aus Getreidestärke, vorgelierter Stärke und Maltohexose ausgewählten, in kaltem Wasser löslichen Träger in einem Gewichtsverhältnis von Enzym zu Träger von 1 : 1,5 bis 1 : 4 eingemischt werden.