DE3050077C2

DE3050077C2 -

Info

Publication number: DE3050077C2
Application number: DE3050077T
Authority: DE
Inventors: Kazuyoshi Odawara Jp Morita
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1979-11-26
Filing date: 1980-11-26
Publication date: 1988-11-17
Also published as: DE3050077T1; JPS5675434A; EP0040641A1; WO1981001517A1; EP0040641B1; EP0040641A4; US4474771A; JPS5942657B2; GB2074447A; GB2074447B

Description

Die Erfindung betrifft eine aus Kletten erhaltene aktive Fraktion, die bei der Inhibierung der Mutabilität Aktivität aufweist, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Es ist seit einiger Zeit gut bekannt, daß praktisch alle Carcinogene Mutagenität zeigen. Weiterhin ist die Möglichkeit, daß die Mutagene carcinogen sind, groß. Beispiele hierfür sind Substanzen, die in unserem täglichen Leben angetroffen werden, wie AF-2-(2-furyl)-3-(5-nitro- 2-furyl)-acrylamid, Trp-P-1-(3-amino-1,4-dimetyl-5H- pyrido[4.3-b]indol) und Trp-P-2-(3-amino-1-methyl-5H- pyrido[4.3-b]indol, wobei die beiden letzteren in den angekohlten oder verschmorten Teilen von beispielsweise gebratenem, geröstetem oder gekochtem Fleisch und Fisch anzutreffen sind. Es wurde berichtet, daß diese Substanzen Mutagenität aufweisen und Substanzen sind, die in Säugetieren eine Carcinogenese induzieren.

In der Literaturstelle S. Földeák, G. A. Dombradi, Acta Phys. et Chem. Szeged 10, 91 bis 93 (1964) wird ein Kletten extrakt beschrieben, der das Tumorwachstum verhindert. Es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem nach einer Extraktion des trockenen Pflanzenmaterials mit Dichlormethan das Lösungsmittel wieder abdestilliert wird und anschließend mit Petrolether ein schwer filtrierbarer Niederschlag ausgefällt wird. Nachdem der Niederschlag abzentrifugiert ist, wird das Lösungsmittel erneut abdestilliert. Man erhält ein braunes viskoses Öl, das durch Chromatographie weiter gereinigt wird. Die Aktivität bei der Inhibierung des Tumorwachstums dieses Öls ist jedoch nicht zufrieden stellend.

Die Anmelderin hat kürzlich ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines in Kohlsaft vorhandenen, desmutagenen Faktors vorgeschlagen (vergl. JA-OS 1 22 715/79). Dieses Verfahren umfaßt die Stufen:

1) Zentrifugieren des Kohlsaftes,
2) Ultrazentrifugieren der entstehenden überstehenden Lösung,
3) Behandlung der überstehenden Lösung mit einer Anionenaustausch-Cellulose,
4) Aufbringen der durchgelaufenen Fraktion auf eine Kationenaustausch-Cellulose enthaltende Säule,
5) Sammeln der aktiven Fraktion, die bei niedriger Salzkonzentration eluiert wird, und
6) Adsorbieren der Fraktion an einem Molekularsieb zur weiteren Reinigung der Fraktion.

Die schließlich erhaltene Fraktion zeigt charakteristische Absorptionsspektra bei 280 nm und 404 nm und ist ein Hämoprotein, das gegenüber Hitze stabil ist, das aber die Eigenschaft aufweist, daß es durch proteolytische Enzyme desaktiviert wird.

Von diesem desmutagenen Faktor, der durch Isolierung aus Kohlsaft erhalten wird, ist bekannt, daß er nicht nur die Mutagenität von Trp-P-1-(3-amino-1,4- dimethyl-5H-pyrido[4.3.-b]indol) und Trp-P-2-(3-amino-1- methyl-5H-pyrido[4.3-b]indol) inhibiert, sondern ebenfalls die von N-Butyl-N-acetoxy-nitrosoamin, den Reaktionsprodukten der Sorbinsäure mit Nitraten, 2-Aminoanthracen, Äthidiumbromid wie auch verschiedene Mutagene, die eine Mutagenität als Ergebnis des Metabolismus der Pyrolysate solcher Aminosäuren, wie Tryptophan, Ornithin usw., manifestieren.

Die letzte Fraktion, die aus Kohlsaft erhalten wird, besitzt jedoch den Nachteil, daß sie bei gleichzeitiger Anwesenheit eines proteolytischen Enzyms desaktiviert wird. Weiterhin kann sie nicht nur die Mutagenität solcher Mutagene nicht inhibieren, die ohne Metabolisierung Mutagenität aufweisen, wie die Oxidationsfarben (z. B. 4-Nitro-o- phenylendiamin und 2-Nitro-p-phenylendiamin), sondern sie besitzt weiterhin die Wirkung, daß sie die Mutagenität wesentlich verstärkt (d. h. aktiviert).

Die Anmelderin hat in Agric. Biol. Chem. 42 (6), Seiten 1236-1238, 1978, qualitativ berichtet, daß die überstehende Lösung, die man durch Zentrifugieren von Kohl, Broccoli, grünem Paprika, Auberginen, Äpfeln, Kletten, Schalotten, Ginger, Ananas und Pfefferminzblättern erhält, die Mutagenität von Pyrolysaten des Tryptophans inhibie ren.

Obwohl alle diese Gemüse und Früchte, die Aktivität besitzen, die Mutagenität, die solchen Pflanzen zuzuordnen ist, zu inhibieren, haben weitere Untersuchungen gezeigt, daß von diesen nur die aktive Fraktion, die aus der Klette erhalten wird und in gereinigtem Zustand vorliegt, eine überlegene Aktivität bei der Inhibierung der Mutagenität aufweist. Es wurde jetzt gezeigt, daß die aus Kletten erhaltene Fraktion eine überraschend einzigartige Aktivität aufweist.

Bei den Untersuchungen wurde weiterhin gefunden, daß die wasserlösliche Substanz, die auf gleiche Weise wie Klettensaft aus Pflanzen der gleichen zusammengesetzten Familie, wie die der Kletten, erhalten wird, beispielsweise aus dem Saft von Shungiku, Pestwurz (butterbur) und Salat, nicht die Aktivität aufweist, die Mutagenität, die diesen Substanzen zuzuordnen ist, zu inhibieren.

In der oben erwähnten Literaturstelle werden nur die überstehenden Materialien beschrieben, die man beim Zentrifugieren von Gemüse- und Pflanzensäften erhält. Es finden sich keine Hinweise oder Angaben hinsichtlich eines Verfahrens zur Isolierung der aktiven Komponente aus diesen überstehenden Materialien bzw. Lösungen und hinsichtlich ihrer Reinigung. Somit findet sich kein Hinweis oder Angabe bezüglich der aktiven Komponente im gereinigten Zustand.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen desmutagenen Faktor, der in Kletten vorhanden ist, in gereinigtem Zustand zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäß soll ein desmutagener Faktor in gereinigtem Zustand zur Verfügung gestellt werden, der die Aktivität aufweist, daß er die Mutagenität dieser Substanzen, ohne daß die metabolisiert werden, inhibiert.

Erfindungsgemäß soll in gereinigtem Zustand ein desmutagener Faktor zur Verfügung gestellt werden, der im wesentlichen keine Abnahme in seiner Aktivität bei der Inhibierung der Mutagenität zeigt, selbst wenn er bei erhöhten Temperaturen behandelt oder mit einem proteolytischen Enzym behandelt wird.

Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, gemäß dem ein desmutagener Faktor wirksam aus Kletten isoliert und gereinigt werden kann.

Diese Aufgabe und die Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung erläutert.

Die Erfindung betrifft eine aus Kletten erhaltene aktive Fraktion, die bei der Inhibierung der Mutagenität Aktivität aufweist, erhältlich durch die Anzahl und Reihenfolge der folgenden Verfahrensschritte:

a) Zetrifugieren des Saftes von Kletten zur Entfernung von Fremdmaterialien daraus;
b) Mischen einer Phosphatpufferlösung mit dem entstehenden überstehenden Material, gefolgt von Aussalzen des entstehenden Gemisches durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkalimetallsalzes oder Ammoniumsalzes einer anorganischen Säure und anschließendem Sammeln eines Nie derschlags;
c) Auflösen des Niederschlags in einer Phosphatpufferlösung und anschließende Dialyse der entstehenden Lösung und danach
d) Durchführen einer Ultrafiltration mit der Dialyselösung unter Abnahme einer konzentrierten Lösung, gefolgt gegebenenfalls von Lyophilisieren der konzentrierten Lösung unter Pulverisierung, wobei ein desmutagener Faktor isoliert und gereinigt wird, der einen Absorptions- Wellenlängenpeak im Bereich von 280 nm bis 300 nm aufweist, wobei der desmutagene Faktor eine Substanz ist, die an Anionenaustausch-Cellulose, jedoch nicht an Katio nenaustausch-Cellulose, adsorbiert wird, wobei die Aktivität des desmutagenen Faktors, Mutationen zu inhibieren, stark durch Manganionen abnimmt, aber im wesentlichen keine Abnahme durch Erhitzen bei 100°C während 15 Minuten oder Behandlung mit einem proteolytischen Enzym zeigt.

Die aktive Fraktion, die sich von der Klette ableitet und die erfindungsgemäß in gereinigtem Zustand zur Verfügung gestellt wird, ist eine wasserlösliche, in Kletten enthaltene Substanz, die an Anionenaustausch-Cellulose, jedoch nicht an Kationenaustausch-Cellulose adsorbiert wird. Sie besitzt einen Absorptions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 bis 300 nm und weist die Aktivität auf, daß sie die Mutabilität inhibiert.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen aktiven Fraktion, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die folgenden Stufen aufweist:

a) Zentrifugieren des Saftes von Kletten zur Entfernung von Fremdmaterialien daraus;
b) Mischen einer Phosphatpufferlösung mit dem entstehenden überstehenden Material, gefolgt von Aussalzen des entstehenden Gemisches durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkalimetallsalzes oder Ammoniumsalzes einer anorganischen Säure und anschließendem Sammeln eines Nieder schlags;
c) Auflösen des Niederschlags in einer Phosphatpufferlösung und anschließende Dialyse der entstehenden Lösung und danach
d) Durchführen einer Ultrafiltration mit der Dialyselösung unter Abnahme einer konzentrierten Lösung, gefolgt gegebenenfalls von Lyophilisieren der konzentrierten Lösung unter Pulverisierung, wobei ein desmutagener Faktor isoliert und gereinigt wird, der einen Absorp tions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 nm bis 300 nm aufweist, wobei der desmutagene Faktor eine Substanz ist, die an Anionenaustausch-Cellulose, jedoch nicht an Katio nenaustausch-Cellulose, adsorbiert wird, wobei die Aktivität des desmutagenen Faktors, Mutationen zu inhibieren, stark durch Manganionen abnimmt, aber im wesentlichen keine Abnahme durch Erhitzen bei 100°C während 15 Minuten oder Behandlung mit einem proteolytischen Enzym zeigt.

Die Klette, wie sie in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, ist die Pflanze Arctium lappa Linne oder Arctium lappa L. der Gattung Arctium der zusammengesetzten bzw. entsprechenden Familie.

Die Klette, die bei der vorliegenden Erfindung für die Isolierung der aktiven Fraktion verwendet wird, kann nicht nur die Wurzeln der Klette, sondern ebenfalls ihre Früchte, Stiele und Blätter umfassen. Es ist somit möglich, die geerntete Klette direkt zu verwenden, ohne sie in ihre Teile zu zerlegen. Weiterhin kann sie entweder in frischem oder getrocknetem Zustand verwendet werden.

Es wurde durch Untersuchungen festgestellt, daß die aktive Fraktion, die aus der Klette erfindungsgemäß erhalten wird, überlegene Eigenschaften hinsichtlich ihrer Aktivität bei der Inhibierung der Mutagenität zeigt und keine wesentliche Abnahme aufweist, selbst wenn die Fraktion bei erhöhten Temperaturen von beispielsweise etwa 100°C während 15 Minuten behandelt wird oder wenn sie mit einem proteolytischen Enzym behandelt wird.

Bezüglich der anderen Eigenschaften dieser aktiven Fraktion wurde gefunden, daß die Aktivität bei der Inhibierung der Mutagenität stark durch Manganionen abnimmt, daß aber keine wesentliche Abnahme durch Magnesium- oder Calciumionen auftritt.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolierung der Substanz, die die Mutagenität inhibiert, und ihre Reinigung aus Kletten wird zuerst das Fremdmaterial, das in dem Klettensaft enthalten ist, mittels Zentrifugieren entfernt.

Der Klettensaft kann auf folgende Weise hergestellt werden. Nach dem Waschen der Kletten mit Wasser werden sie in eine Entsaftungsvorrichtung gegeben, die mit einem Filter versehen ist, um den Hauptteil des faserförmigen Materials zu entfernen und um frischen Saft herzustellen. Alternativ kann ein Pulver aus getrockneten Kletten während einer ausreichend langen Zeit in Wasser oder einer Phosphatpufferlösung gegebenenfalls bei erhöhter Temperatur suspendiert werden oder während es mit einer Zermahlungsvorrichtung zerrieben wird. Das Pulver aus getrockneten Kletten sollte so fein wie möglich sein. Wenn man ein solches Pulver verwendet, sollte der Saft bevorzugt hergestellt werden, indem man das Pulver bei normalerweise etwa 20 bis etwa 85°C während etwa 2 bis 24 Stunden behandelt, während das Pulver mit einer Mühle bzw. Zerreibevorrichtung vermahlen wird.

Der so hergestellte Klettensaft wird zur Entfernung von Fremdmaterial daraus zentrifugiert. Das Zentrifugieren kann als übliches Zentrifugieren bei 7000-15 000×G durchgeführt werden. Man kann jedoch auch eine Ultrazentrifugierung bei 100 000-200 000×-G verwenden. Es ist weiterhin möglich, zuerst die übliche Zentrifugierung und dann eine Ultrazentrifugierung zu verwenden. Die übliche Zentrifugierung wird normalerweise während 30 bis 60 Minuten durchgeführt. Bei dem Zentrifugieren werden die Faserstoffe, wie die Chloroplasten oder Mitochondrien, entfernt. Andererseits wird das Ultrazentrifugieren bevorzugt während normalerweise 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Bei dieser Behandlung werden die Microsomen oder Ribosomen entfernt.

Zu dem überstehenden Material, welches man nach Entfernen des Fremdmaterials aus dem Klettensaft, wie oben beschrieben, erhält, gibt man dann eine Phosphatpufferlösung. Wenn der Saft hergestellt worden ist, indem man Klettenpulver zu einer Phosphatpufferlösung gibt, ist es nicht erforderlich, weitere Phosphatpufferlösung zuzugeben. Diese Ausführungsform fällt ebenfalls unter die vorliegende Erfin dung.

Als Phosphatpufferlösung verwendet man bevorzugt eine Lösung, deren pH-Wert normalerweise im Bereich von etwa 6,5 bis etwa 7,5 liegt. Es ist weiterhin bevorzugt, eine Phosphatpufferlösung zu verwenden, deren Konzentration normalerweise etwa 1 bis 2 Mol beträgt. Eine solche Phosphatpufferlösung wird bevorzugt in einer Menge von ½₀ bis ¹/₁₀₀ Vol.-Teilen, bezogen auf das überstehende Material, zugegeben. Die Phosphatpufferlösung sollte bevorzugt in einer solchen Menge zugegeben werden, daß die Konzentration der Phosphationen, die in Form der Phosphatpufferlösung zu dem überstehenden Material zugegeben werden, etwa 10 bis etwa 400 mMol beträgt.

Als Salz, das zu der entstehenden Lösung für die Aussalzung zugegeben wird, kann man wasserlösliche Metallsalze oder Ammoniumsalze anorganischer Säuren verwenden. Beispiele anorganischer Säuren sind Mineralsäuren, wie Kohlensäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure. Als Alkalimetallsalze oder Ammoniumsalze solcher anorganischen Säuren sind normalerweise bevorzugt Kaliumcarbonat, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Kaliumphosphat, etc.; das wasserlösliche Alkalimetallsalz oder Ammoniumsalz der anorganischen Säure wird bevorzugt in einer Menge von etwa 30 bis 80 Gew.-%, bezogen auf das Gemisch aus überstehendem Material und Phosphatpufferlösung, zugegeben.

Die so ausgesetzte Lösung, die einen Niederschlag enthält, wird dann einer Behandlung unterworfen, bei der der Niederschlag daraus abgetrennt wird. Für die Isolierung des Niederschlags kann man verschiedene Methoden, wie ein Filtrieren oder Zentrifugieren, verwenden. Die Filtration kann bei atmosphärischem, verringertem oder superatmosphärischem Druck durchgeführt werden. Die Isolierung des Niederschlags erfolgt jedoch bevorzugt durch Zentrifugieren. Das Zentrifugieren wird normalerweise bei den zuvor erwähnten Bedingungen der üblichen Zentrifugiertechnik durchgeführt.

Der bei der Isolierung erhaltene Niederschlag wird dann in einer Phosphatpufferlösung (pH 6,5 bis 7,5) gelöst und als Lösung der Dialyse unterworfen. Die Phosphatpufferlösung wird bevorzugt in einer Menge von normalerweise etwa 5 bis 10 ml/g Niederschlag verwendet. Obgleich die Dialyse gegenüber Wasser oder einer Phosphatpufferlösung durchgeführt werden kann, ist es im allgemeinen bevorzugt, die letztere zu verwenden.

Die Dialyselösung, aus der Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht durch Dialyse entfernt worden sind, wird dann der Ultrafiltration unterworfen. Die Konzentration der Dialyselösung findet durch Ultrafiltration statt. Es ist bevorzugt, daß die Ultrafiltration weitergeführt wird, bis das Volumen der Dialyselösung ¹/₃ bis ¹/₅ des ursprünglichen Volumens beträgt. Als Filter, die bei der Ultrafiltration verwendet werden können, können z. B. erwähnt werden PM-30, XM-50, XM-100 und XM-300 (hergestellt von Amicon Far East Ltd.). Von diesen ist die Ultrafiltrationsmembran XM-300 besonders bevorzugt, durch die Moleküle mit Molekulargewichten unter etwa 300 000 hindurchgehen.

Die konzentrierte Lösung, die man so erhält, nachdem die Ultrafiltration durchgeführt wurde, enthält die erfindungsgemäße aktive Fraktion. Diese konzentrierte Lösung kann ebenfalls gegebenenfalls nach einem üblichen Lyophilisierungsverfahren pulverisiert werden.

Wenn die konzentrierte Lösung der Lyophilisierung unterworfen wird, ist es bevorzugt, daß Wasser in etwa der 3- bis 5fachen Volumenmenge zu der Lösung zugegeben wird und daß darauf die Lösung erneut einer Ultrafiltration unterworfen wird, bevor die Lyophilisierung durchgeführt wird.

Die den desmutagenen Faktor enthaltende, aktive Fraktion in Form einer konzentrierten Lösung oder eines Pulvers und in gereinigtem Zustand, die erfindungsgemäß zur Verfügung gestellt wird, wird als solche Menschen oder Säugetieren, ausgenommen Menschen, oder nachdem sie mit geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Adjuvantien vermischt worden sind, verabreicht.

Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zubereitung, die die erfindungsgemäße aktive Fraktion zusammen mit einem geeigneten, pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Adjuvans enthält, oder ein Arzneimittel, das die Zusammensetzung enthält. Als Träger oder Adjuvantien können alle die verwendet werden, die dem Fachmann geläufig sind, wie Arzneimittelträgerstoffe, Schmiermittel, Desintegratoren, Beschichtungsmittel für Kapseln, usw. Das Arzneimittel kann in Form von Tabletten, Granulaten, mit Zucker überzogenen Pillen, Pulvern, Sirupen, Lösungen oder Kapseln vorliegen.

Wenn die erfindungsgemäße aktive Fraktion in einer der zuvor angegebenen Formen vorliegt, wird sie bevorzugt oral verabreicht. Die erfindungsgemäße aktive Fraktion kann ebenfalls extern (z. B. durch Anwendung auf die Haut) verabreicht werden. In diesem Falle ist es bevorzugt, sie in Form einer Salbe, z. B. einer, bei der ein öllösliches Grundmaterial, wie Wachs, verwendet wird, oder in Form einer Wasser enthaltenden Emulsion oder einer wäßrigen Lösung zu verwenden.

Säugetieren wird die pharmazeutische Zubereitung verabreicht. Sie ist besonders für Tiere, die gegenüber der Mutagenität empfänglich sind, geeignet. Die Dosismenge kann auf geeignete Weise entsprechend den zu behandelnden Tieren von Spezialisten, wie Ärzten und Pharmazeuten, bestimmt werden. Sie beträgt im allgemeinen etwa 100 mg bis 2,5 g/kg Körpergewicht/Tag.

Wie aus der Tatsache folgt, daß die erfindungsgemäße aktive Fraktion eine Komponente ist, die in Kletten enthalten ist, welche als Nahrungsmittel gegessen werden, ist sie praktisch frei von Toxizität.

Der Ausdruck "Tiere, die gegenüber der Mutagenese empfänglich sind" bedeutet solche Tiere, die ein Mutagen mit der Nahrung aufgenommen haben oder in Kontakt mit einem Mutagen gekommen sind oder von denen man erwarten kann, daß sie ein Mutagen mit der Nahrung aufnehmen oder in Kontakt mit einem Mutagen kommen.

Die durch Lyophilisierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene aktive Fraktion wird zweckdienlich zur Herstellung von irgendeiner Form von Arzneimittel verwendet. Sie ist ein wasserlösliches und stabiles, braunes Pulver, welches von Verfärbungen frei ist und ihre Lagerungsstabilität ist extrem gut.

Entsprechend unseren Untersuchungen wird angenommen, daß die desmutagene Aktivität der aktiven erfindungsgemäßen Fraktion auf solche Weise manifestiert wird, daß sie die Mutagenität, die durch die Mutagene inhibiert wird, inhibiert, indem sie direkt auf die Mutagene wirkt. Die erfindungsgemäße aktive Fraktion wird somit bevorzugt präventiv besonders solchen Säugetieren verabreicht, von denen man erwartet, daß sie Mutagene mit der Nahrung aufnehmen, oder solchen Tieren, von denen eindeutig bekannt ist, daß sie Mutagene mit der Nahrung aufgenommen haben.

Das folgende Beispiel erläutert das Verfahren zur Isolierung und Reinigung der aktiven Fraktion gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie auch die desmutagene Aktivität der aktiven Fraktion und ihre anderen Eigenschaften.

Beispiel (1) Isolierung der aktiven Fraktion aus Kletten und ihre Reinigung

5000 g Kletten werden mit Wasser gewaschen und dann in einem Entsafter zerkleinert. Man erhält etwa 3400 ml Klettensaft. 1400 ml dieses Saftes werden bei 9000×G während 30 min zentrifugiert. Man erhält 2200 ml einer klaren, braunen, überstehenden Lösung.

½₀ Volumenmenge einer 1 M Phosphatpufferlösung (pH 6,8) wird mit dieser überstehenden Lösung vermischt, danach wird das Gemisch ausgesalzt, indem man zu 1100 ml des Gemisches 80 Gew.-% eines Gemisches aus Ammoniumsulfat zugibt. Das ausgesalzte Gemisch wird dann 15 min bei 9000×G zentrifugiert. Man erhält 80 g eines Niederschlags. 60 g dieses Niederschlags werden in einer 50 mMol Phosphatpufferlösung (pH 6,8) gelöst und auf 600 ml aufgefüllt. Die Lösung wird bei 4°C gegenüber der zuvor erwähnten Phosphatpufferlösung (pH 6,8) dialysiert. Man erhält 696 ml Dialyselösung.

464 ml dieser Dialyselösung werden dann auf ¹/₃ ihres ursprünglichen Volumens konzentriert, indem man sie einer Ultrafiltration unterwirft und ein Membranfilter XM-300 verwendet. Die konzentrierte Lösung wird auf 200 ml durch Zugabe einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,8) aufgefüllt und sie wird erneut durch Ultrafiltration konzentriert, indem man das gleiche Filter, wie zuvor erwähnt, verwendet. Man erhält 140 ml einer konzentrierten Lösung.

Von der bei der Ultrafiltration erhaltenen, konzentrierten Lösung werden 70 ml bei -54°C während 24 h unter Verwendung einer Lyophilisiervorrichtung lyophilisiert. Man erhält 450 mg trockenes Pulver.

(2) Ultraviolett-Absorptionseigenschaften der aktiven Fraktion.

Fig. 1 zeigt die ultraviolette Absorptionskurve, die man erhält, indem man die Messungen, die mit einer wäßrigen Lösung des lyophilisierten Pulvers durchgeführt wurden, graphisch aufträgt. In Fig. 1 ist die Absorption auf der Ordinate aufgetragen und die Wellenlänge (nm) ist auf der Abszisse aufgetragen. Aus Fig. 1 folgt, daß die erfindungsgemäße Fraktion einen Absorptionswellenlängenpeak im Bereich von 280 bis 300 nm (maximale Wellenlänge etwa 290 nm) aufweist.

(3) Adsorption der aktiven Fraktion an einem Anionenaustauschharz und einem Kationenaustauschharz.

27 ml der gemäß dem obigen Verfahren (1) erhaltenen, konzentrierten Lösung werden an einer Säule aus DEAE-Cellulose (eine Anionenaustausch-Cellulose) bei folgenden Bedingungen: Säulengröße=2,5×12 cm, Eluierungsrate=36 m/h und Menge an eluiertem Material=10 ml/Reagenzglas chromatographiert. Die Adsorption wird geprüft, indem man die Eluierung unter Verwendung einer Eluierungspufferlösung, nämlich einer 50 mM Phosphatpufferlösung, durchführt, in der man Kaliumchlorid mit einem Konzentrationsgradienten im Bereich von 50 mM bis 2 M gelöst hat. Fraktionen, die eine Hemmaktivität aufweisen, werden bei den Fraktionen nicht nachgewiesen, die eluiert wurden, ohne daß sie an der DEAE-Cellulose-Säule adsorbiert worden sind.

7 ml der konzentrierten Lösung werden auf ähnliche Weise an einer Säule aus CM-Cellulose (Kationenaustausch- Cellulose) bei den folgenden Bedingungen chromatographiert: Säulengröße=2,5×7 cm, Eluierungsrate=40 ml/h, Menge an eluiertem Material=5,8 ml/Reagenzglas. Die Adsorption wird geprüft, indem man die Eluierung unter Verwendung einer Eluierungspufferlösung, nämlich einer 50 mM Phosphatpufferlösung, durchführt, in der man Kaliumchlorid mit einem Konzentrationsgradienten im Bereich von 50 mM bis 0,1 M gelöst hat.

Die gesamte Lösung wird eluiert, ohne daß sie an der CM- Cellulosesäule adsorbiert wurde. Eine Eluierungskurve, wie sie in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist, wird erhalten. Wird die eluierte Fraktion auf ihre Inhibitorwirkungen gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren geprüft, so stellt man fest, daß die desmutagene Rate 88% beträgt. Dieser Wert ist etwa der gleiche (87,4%) wie der einer wäßrigen Lösung eines trockenen Pulvers (87,4%), die 12 mg/ml trockenes Pulver enthält, in einer Menge von 500 µl/Platte, wie aus der folgenden Tabelle 2 folgt. Aus den bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnissen ist weiterhin erkennbar, daß die erfindungsgemäße aktive Fraktion ein Polyelektrolyt ist, der eine starke anionische Base enthält.

(4) Inhibitorwirkungen der aktiven Fraktion

(a) Der Test zur Bestimmung der Inhibitorwirkungen wird auf folgende Weise durchgeführt. Zu einer Lösung des Mutagens in 0,02 ml Dimethylsulfoxid gibt man 0,5 ml einer Fraktion, die man bei jeder der Stufen des obigen Verfahrens (1) erhalten hat, oder die Endfraktion (die aktive erfindungsgemäße Fraktion). Danach erfolgt die Reaktion bei 37°C während 30 min. Zum Vergleich wird die Reaktion auf gleiche Weise, aber unter Verwendung von 0,5 ml Phosphatpufferlösung anstelle der verschiedenen Fraktionen durchgeführt. Die Reaktionsgemische werden dann durch Erhitzen bei 100°C während 10 min sterilisiert. Nach Beendigung der Wärmebehandlung werden 3 ml weicher Agar (0,6% Difco Agar) und 0,1 ml einer Suspension von Salmonella TA 98 (Histidin, erfordernd His^-) zugegeben und die Gemische werden dann auf das zuvor beschriebene, selektive Agarmedium ausgegossen. Die Züchtung erfolgt bei 37°C während 2 Tagen. Danach werden die Kolonien aus Revertanten (Histidin, die kein His⁺ erfordern) gezählt.

Wird ein Mutagen verwendet, das Mutagenität nur bei der Metabolisierung zeigt, wie 2-Aminoanthracen, Äthidiumbromid, Trp-P-1 oder Trp-P-2, erfolgt der Test auf gleiche Weise, aber nach der Zugabe zu den zuvor erwähnten 0,3 ml weichem Agar eines S-9-Gemisches, welches wie im folgenden beschrieben hergestellt wird. Zur Bestätigung wird SD Rattenleber verwendet, ein Leberhomogenat, dessen meta bolische Enzymaktivität durch PCB verstärkt wurde und welches unter Bildung einer Lebermicrosomfraktion (S-9) zentrifugiert wurde. Das S-9-Gemisch wird dann hergestellt, indem man zu dem Lebermicrosom, die man so erhält, anorganische Salze in den folgenden Mengen zugibt.

Anorganische Salze, die zu dem S-9-Gemisch zugegeben werden:

Lebermicrosom 3 ml 0,25 M Phosphatpufferlösung 4 ml 0,16 M MgCl₂ 0,5 ml 0,66 M KCl 0,5 ml 0,05 M G-6-P 1,0 ml 0,04 NADP 1,0 ml

Zusammensetzung des selektiven Agarmediums:

MM (X20) 50 ml 40% Glucose 10 ml 0,8% Difco Nährbrühe 10 ml Biotin (100 µg/ml) 1 ml Agar 15 ml destilliertes Wasser930 ml

Zusammensetzung von MM (X-20):

(NH₄)₂SO₄ 2,0% KH₂PO₄ 20,0% MgSO₄ · 7H₂O 0,2% Natriumcitrat 1,0% pH 7,0 mit KOH

Die Aktivität bei der Inhibierung der Mutagenität der Mutagene wird auf die zuvor beschriebene Weise geprüft. Nimmt man die Menge (ml) der Fraktion, die für die Inhibierung von 50% der Mutagenität erforderlich ist, so wird die Aktivität auf Grundlage der Menge (mg) Protein, die pro Einheitsvolumen (ml) der Fraktion vorhanden ist, an gegeben.

(b) Inhibierung der Mutagenität von 2-Nitro-p- phenylendiamin (80 µg/Platte)

In Tabelle 2 ist der Einfluß der Konzentration auf die desmutagene Wirkung des trockenen Pulvers (erfindungsgemäße aktive Fraktion) angegeben.

Tabelle 2

Aus den Ergebnissen der Tabelle 2, die den Einfluß der Konzentration der erfindungsgemäßen aktiven Fraktion auf die Inhibitorwirkung zeigt, ist erkennbar, daß die Ergebnisse zufriedenstellend sind, wenn 2-Nitro- p-phenylendiamin verwendet wird.

Tabelle 3 zeigt die Inhibitorwirkungen der erfindungsgemäßen aktiven Fraktion (letzte Fraktion) bei verschiedenen Mutagenen.

Tabelle 3

Aus den Ergebnissen der Tabelle 3 folgt insbesondere, daß die erfindungsgemäße aktive Fraktion bemerkenswerte Inhibitorwirkungen zeigt. Das heißt, daß der Inhibitorfaktor, der in den Säften von Kohl und Broccoli vorhanden ist, Pflanzen, die in der zuvor erwähnten Literaturstelle beschrieben werden, nur Inhibitorwirkungen zeigt, wenn er mit solchen Mutagenen verwendet wird, die Mutagenität zeigen, nachdem sie metabolisiert wurden (Äthidiumbromid, 2-Aminoanthracen, Trp-P-1 und Trp-P-2), aber keine Inhibitorwirkungen, wenn er mit einem Teil der Oxidationsfarben verwendet wird, der Mutagenität zeigt, ohne metabolisiert zu sein (z. B. 2-Nitro-p-phenylendiamin oder 2-Nitro-o-phenylendiamin). Dies zeigt, daß die erfindungsgemäße Fraktion, wie aus Tabelle 3 folgt, eine bemerkenswerte Inhibitorwirkung nicht nur, wenn sie zusammen mit der ersteren Klasse der Mutagene verwendet wird, sondern selbst, wenn sie mit der letzteren Klasse zusammen verwendet wird, aufweist. Ihre Funktion und Wirkungen sind somit überraschend einzigartig.

(6) Wärmebeständigkeit der aktiven Fraktion

Als nächstes wird die Wärmebeständigkeit der erfindungsgemäßen Endfraktion geprüft. 500 ml der erfindungsgemäßen Endfraktion (eine wäßrige Lösung eines lyophilisierten Pulvers) werden 15 min auf 100°C unter Rückfluß erhitzt und abgekühlt. 500 ml einer wäßrigen Lösung der Endfraktion, die nicht in der Wärme behandelt worden ist, werden mit den verschiedenen Mutagenen mit den in Tabelle 4 angegebenen Konzentrationen vermischt. Danach werden die Gemische 30 min bei 37°C umgesetzt. Danach wird der Test zur Bestimmung der Inhibitorwirkungen, wie in (5) oben angegeben, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4

Durch diese Ergebnisse wird bestätigt, daß die erfindungsgemäße Endfraktion bzw. letzte Fraktion gegenüber Wärme stabil ist und durch diese nicht entaktiviert wird und daß sie weiterhin zufriedenstellende Inhibitorwirkungen aufweist.

(7) Stabilität der aktiven Fraktion gegenüber proteolytischen Enzymen

Die Stabilität der Endfraktion (einer wäßrigen Lösung eines lyophilisierten Pulvers) gegenüber proteolytischen Enzymen wird ebenfalls geprüft. Als proteolytische Enzyme werden DNase 1 (ein Enzym, welches DNA abbaut), RNase (ein Enzym, welches RNA abbaut) und Pronase (ein Enzym, welches verschiedene Proteine abbaut) verwendet. Sie werden jeweils zu der Endfraktion in solcher Menge zugegeben, daß die Endkonzentration etwa 20 µg/ml beträgt, und das Gemisch wird dann 30 min bei 37°C umgesetzt.

Diese Reaktionsprodukte (500 µl) werden dann mit den in Tabelle 5 aufgeführten Mutagenen vermischt, die die darin angegebenen Konzentrationen aufweisen. Die Gemische werden 30 min bei 37°C umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wird der Versuch zur Bestimmung der Inhibitorwirkungen, wie oben unter (5) beschrieben, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 5

Diese Ergebnisse bestätigen die Tatsache, daß die erfindungsgemäße Endfraktion, die gegenüber den proteolytischen Enzymen extrem stabil ist, durch diese nicht entaktiviert wird und weiterhin zufriedenstellend Inhibitorwirkungen manifestiert.

(8) Stabilität der aktiven Fraktion gegenüber polyvalenten Metallionen oder Protein-Denaturierungsmitteln.

Die Stabilität der erfindungsgemäßen Endfraktion gegenüber verschiedenen mehrwertigen Metallionen oder Protein- Denaturierungsmitteln wird ebenfalls geprüft.

Magnesiumchlorid, Manganchlorid und Calciumchlorid werden jeweils vermischt und gelöst, so daß die Konzentration (Endkonzentration) in der entstehenden Lösung 10 mM an erfindungsgemäßer Endfraktion (einer wäßrigen Lösung eines lyophilisierten Pulvers) beträgt. Andererseits wird im Falle von EDTA, einem Protein-Denaturierungsmittel, die Mischung und Lösung davon auf solche Weise durchgeführt, daß die Konzentration 2,5 mM beträgt, während sie im Falle von SDS (Natriumdodecylbenzolsulfonat), ebenfalls einem Protein-Denaturierungsmittel, die Mischung und Lösung so durchgeführt wurde, daß ihre Konzentration 0,1% beträgt. Die verschiedenen Lösungen werden dann 30 min bei 37°C behandelt.

Danach werden die Reaktionsgemische (500 µl) mit den in Tabelle 6 aufgeführten Mutagenen bei den angegebenen Konzentrationen vermischt, und anschließend erfolgt die Reaktion bei 37°C während 30 min. Nach Beendigung der Reaktion werden die Reaktionsprodukte auf ihre Inhibitorwirkungen, wie oben bei (5), untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 6

Diese Ergebnisse bestätigen die Tatsache, daß die erfindungsgemäße Endfraktion einzigartige Eigenschaften besitzt und daß sie gegenüber Protein-Denaturierungsmitteln und Magnesiumchlorid und Calciumchlorid extrem stabil ist und bei der Einwirkung von Manganchlorid eine große Abnahme in ihrer desmutagenen Aktivität zeigt.

Die erfindungsgemäße Endfraktion ist somit, wie aus den verschiedenen obigen Ergebnissen folgt, ein Polyelektrolyt mit einem Absorptions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 bis 300 nm und einer starken anionischen Base. Sie ist eine antimutagene Substanz mit hoher Inhibitorwirkung, die die Mutagenität von vielen Mutagenen inhibiert und insbesondere von solchen Mutagenen, die Mutagenität manifestieren, ohne daß sie metabolisiert worden sind. Ihre Inhibitoraktivität ist gegenüber Wärme stabil und zeigt im wesentlichen keine Abnahme durch ein proteolytisches Mittel, nimmt jedoch durch Manganionen sehr stark ab.

Claims

1. Eine aus Kletten erhaltene aktive Fraktion, die bei der Inhibierung der Mutagenität Aktivität aufweist, erhältlich durch die Anzahl und Reihenfolge der folgenden Verfahrensschritte:

a) Zentrifugieren des Saftes von Kletten zur Entfernung von Fremdmaterialien daraus;
b) Mischen einer Phosphatpufferlösung mit dem entstehenden überstehenden Material, gefolgt von Aussalzen des entstehenden Gemisches durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkalimetallsalzes oder Ammoniumsalzes einer anorganischen Säure und anschließendem Sammeln eines Niederschlags;
c) Auflösen des Niederschlags in einer Phosphatpufferlösung und anschließende Dialyse der entstehenden Lösung und danach
d) Durchführen einer Ultrafiltration mit der Dialyselösung unter Abnahme einer konzentrierten Lösung, gefolgt gegebenenfalls von Lyophilisieren der konzentrierten Lösung unter Pulverisierung, wobei ein desmutagener Faktor isoliert und gereinigt wird, der einen Absorptions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 nm bis 300 nm aufweist, wobei der desmutagene Faktor eine Sub stanz ist, die an Anionenaustausch-Cellulose, jedoch nicht an Kationenaustausch-Cellulose, adsorbiert wird, wobei die Aktivität des desmutagenen Faktors, Mutationen zu inhibieren, stark durch Manganionen abnimmt, aber im wesentlichen keine Abnahme durch Erhitzen bei 100°C während 15 Minuten oder Behandlung mit einem proteolytischen Enzym zeigt.

2. Verfahren zur Herstellung einer aktiven Fraktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen aufweist:

a) Zentrifugieren des Saftes von Kletten zur Entfernung von Fremdmaterialien daraus;
b) Mischen einer Phosphatpufferlösung mit dem entstehenden überstehenden Material, gefolgt von Aussalzen des entstehenden Gemisches durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkalimetallsalzes oder Ammoniumsalzes einer anorganischen Säure und anschließendem Sammeln eines Nieder schlags;
c) Auflösen des Niederschlags in einer Phosphatpufferlösung und anschließende Dialyse der entstehenden Lösung und danach
d) Durchführen einer Ultrafiltration mit der Dialyselösung unter Abnahme einer konzentrierten Lösung, gefolgt gegebenenfalls von Lyophilisieren der konzentrierten Lösung unter Pulverisierung, wobei ein desmutagener Faktor isoliert und gereinigt wird, der einen Absorptions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 nm bis 300 nm aufweist, wobei der desmutagene Faktor eine Substanz ist, die an Anionenaustausch-Cellulose, jedoch nicht an Kationenaustausch-Cellulose, adsorbiert wird, wobei die Aktivität des desmutagenen Faktors, Mutationen zu inhibieren, stark durch Manganionen abnimmt, aber im wesentlichen keine Abnahme durch Erhitzen bei 100°C während 15 Minuten oder Behandlung mit einem proteolytischen Enzym zeigt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phosphatpufferlösung in einer Menge von ½₀ bis ¹/₁₀₀, ausgedrückt durch das Volumen, mit der überstehenden Lösung, die nach Entfernen des Fremdmaterials aus dem Klettensaft durch Zentrifugieren erhalten wird, vermischt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als wasserlösliches Ammoniumsalz einer anorganischen Säure Ammoniumsulfat verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das wasserlösliche Alkalimetallsalz oder Ammoniumsalz der anorganischen Säure in einer Menge von etwa 30 bis 80 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Gemisches aus überstehender Lösung und Phosphatpufferlösung, zugibt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den gesammelten, ausgesalzten Niederschlag in der Phosphatpufferlösung in einem Verhältnis von 5 bis 10 ml des letzteren/g des ersteren ver mischt.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dialyse gegenüber einer Phosphatpufferlösung durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dialyselösung auf ¹/₃ bis ¹/₅ ihres ursprünglichen Volumens durch Ultrafiltration konzentriert.

9. Pharmazeutische Zubereitung für die Inhibierung der Mutagenität von Mutagenen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als wirksame Komponente die Fraktion gemäß Anspruch 1 zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Adjuvans ent hält.