DE2917000C2

DE2917000C2 - 1β-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-4-hydroxymethyl-4-cyclopenten-2α,3α-diol (Neplanocin A), Verfahren zu dessen Herstellung und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2917000C2
Application number: DE2917000A
Authority: DE
Inventors: Naoki Tagata Shizuoka Muto; Masaru Otani; Masatoshi Tsujino; Satoshi Yaginuma
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1978-05-25
Filing date: 1979-04-26
Publication date: 1985-10-03
Also published as: SE7903672L; CA1128882A; NL182231B; CH641804A5; IT7922957A0; DK149313C; DE2917000A1; NL182231C; MX5788E; ES480384A1; FR2426688B1; IT1115245B; DE2954197C2; DK149313B; SE443576B; HU192741B; FR2426688A1; DK177079A; GB2021582A; SU906388A3

Description

HOH₂C

OH OH

dadurch gekennzeichnet, daß man Ampullarilla sp. A 11079 Ferm-P Nr. 4494 in einem Nährmedium, welches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und eine anorganische Substanz enthält, kultiviert und aus der Kulturmasse

a) Neplanocin A isoliert oder

b) eine Verbindung der Formel (Neplanocin D)

OH

HOH₂C-

OH OH

isoliert und diese nach an sich bekannten chemischen Arbeitsweisen in Neplanocin A überführt.

3. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es neben üblichen Hilfs- und Trägerstoffen Neplanocin A nach Anspruch 1 enthält.

Es sind bereits zahlreiche carbocyclische Analoga von Purinnucleosiden bekannt. So werden z. B. in Suhadolnik, Nucleoside Antibiotics, 1970, Seiten 236 bis 245, den 2,3-Dihydroxy-4-hydroxymethyl-cycIopentyI-60 rest enthaltende Purinverbindungen, wie Aristeromycin, und weitere, auf chemischem Wege hergestellte Analoga von Purinribonucleosiden beschrieben.

Die Erfindung betrifft nun ein neues antibiotisches carbocyclisches Analogon von Adenosin mit Hemmwirkung auf pflanzenpathogene Mikroorganismen und mit einer Antitumoraktivität. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung, bei dem man Actinomyceten Ampullariella sp. A 11079 65 FERM-P Nr. 4494 in einem Nährmedium kultiviert und daraus die neue antibiotische Verbindung isoliert. Die Erfindung betrifft weiterhin ein diese Verbindung enthaltendes Arzneimittel. Die neue Verbindung erhält die Bezeichnung Neplanocin A. Sie ist l/i-(6-Amino-9 H-purin-9-yl)-4-hydroxymethyl-4-cyclopentcnc-2a,3ir-diol. Neplanocin A ist eine schwach basische Substanz mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

(1) Elcmcntaranalyse:

gefunden: C 49,96% H 5,00% N 26,43%;
berechnet: C 50,19% H 4,97% N 26,60%.

(2) Molekulargewicht (errechnet aus <ier massenspektroskopischen Analyse): 263

(3) Molekularformel: C, ,HIjN₅O;,

(4) Schmelzpunkt (bestimmt durch thermische Analyse): 2'.6°C

(5) spezifische Drehung: [a]# = -157° (c = 0,45%, H₂O)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum (14 y/ml):

in H,O: gemäß Fig. I: Ä„_w, = 263 ταμ, £j* = 602,1

bei pH 3: X_max = 261 ma, £ *_m = 566,4

bei pH 10: A_mo< = 263 πΐμ, E\\_m = 595,0.

(7) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr):

gemäß Fig. 2, Absorptionsbanden bei 3360, 3200,2920, 1640, 1600,1570,1480, 1415, 1370, 1330, 1300, 1250, 1205, 1160, 1115, 1080, 1050, 1005, 910, 850, 790, 730 cm"¹.

(8) Kernmagnetisches Resonanzspektrum: gemäß Fig. 3 (interner Standard DSS in Deuteriumdimethylsulfoxid, 100 MHz).

(9) Löslichkeit:

Löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Essigsäure und wäßriges Aceton. Unlöslich: Äthylacetat, Chloroform, Benzol, Hexan.

(10) Farbreaktionen: positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat, Perjodatoxidation und Anisaldehyd.

negativ: Eisen(III)-chlorid, Ninhydrin, Anilinphthalat, Molisch und Fehling.

(11) schwach basisch

(12) weiße nadelförmige Kristalle

(13) Rf-Werte (Kieselgel): n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1 : 1); Rf = 0,36

n-Butanol : konzentriertes Ammoniak : Wasser (10 : 0,5 : 2); Rf = 0,27 n-Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 1 : 1); Rf = 0,41 Aceton : Wasser (10 : 1); Rf = 0,34

Äthylacetat : Methanol : Wasser (10 : 2 : 1); Rf = 0,21 Chloroform : Methanol : Essigsäure (10 : 2 : 1); Rf= 0,17.

(14) Strukturformel:

NH₂

40

HO-H₂C-

OH OH

Die biologischen Eigenschaften von Neplanocin A sind wie folgt:

(1) Wachstumshemmende Aktivität auf pflanzenpathogene Pilze:

Eine 100 y/ml-Lösung von Neplanocin A auf eine Agarplatte von Helminthosporium oryzae M 0306 zeigt eine llemmzone mit einem Durchmesser von 18,9 mm.

(2) Antitumoraktivität:

Mausleukämie-L-1210-Tumorzellen (10⁶ Zellen) wurden intraperitoneal in Mäuse inokuliert. Ein Tag nach der Transplantation wurde Neplanodn A (jeweils 0,16 mg/kg, 0,32 mg/kg, 0,63 mg/kg, 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg bzw. 5.0 mg/kg) intraperitoneal einmal täglich über einen Zeitraum von 5 Tagen verabreicht. 10 Mäuse in der Kontrollgruppe und 7 Mäuse in jeder Gruppe der behandelten Tiere wurden verwendet. Die Ergebnisse sind in der F i g. 4 dargestellt. Nach 15tätiger Beobachtung war die durchschnittliche Überlebcnszeit, ausgedrückt in Tagen, für die Kontrollgruppe 7,4 Tage. Die Verlängerung der Lebenszeit im Vergleich zu der Konlrollgruppe wurde bei den Gruppen, die das Arzneimittel erhalten hatten, beobachtet. Die Verlängerung der Lebenszeit betrug 158% bei 0,16 mg/kg, 170% bei 0,32 mg/kg, und bei den Gruppen mit 2,5 mg/kg und 5 mg/kg wurden keine Todesfälle beobachtet. Erhebliche lebensverlängernde Effekte wie bei L-1210 wurden auch bei Mäusen mit Ehrlich-Ascitestumor. Sarcoma-180, und P-388-Leukämie und bei Ratten mit Yoshida-Sarcoma beobachtet, als diese das Neplanocin A erhielten.

(3) Akute Toxizität:

LD₅₁₁: 13,7 mg/kg (i. p., Mäuse).

Bei intraperitonealer Verabreichung über 14 Tage mit 5 mg/kg/Tag wurden keine Todesfälle beobachtet.

Anwendung und Dosierung

Zur Therapie von akuter Leukämie wird das Arzneimittel intravenös in einer Dosis von 5 bis 20 mg/Tag, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, einmal am Tag über einen Zeitraum von 7 Tagen verabreicht. Das Neplanoein A wird auch wirksam zur Therapie von chronischer Laukämie, gastroenteralen Carcinomen, pulmoniircn Carcinomen, Uteruskrebs, Brustkrebs und maligner lymphatischer Leukämie verwendet.

Neplanocin A kann in Form eines physiologisch annehmbaren Salzes einer Mineralsäure oder einer organischen Säure, beispielsweise als Hydrochlorid, Acetat, Tartrat, Citrat oder Succinat, verwendet werden.

Ein neplanocinerzeugender Mikroorganismus wurde aus einer Erdprobe isoliert, die in einem Zwiebelfeld in ίο Niigataken, Japan, gesammelt worden war. Der Mikroorganismus gehört zur Gattung Ampuliariella. Der Stamm wird als Ampuliariella sp. A 11 079 bezeichnet, und er wurde beim Institute for Microbial Industry and Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 4494 hinterlegt.

Ampuliariella sp. A 11 079 FERM-P Nr. 4494 erzeugt auf einem Agarmedium mit anorganischen Salzen und Stärke bei 10- bis 15tätiger Kultivierung (bei 30⁰C) ein gekrümmtes und verzweigtes Substratmycelium mit η einem Durchmesser von 0,5 bis 0,8 um und in geringem Maße ein nicht-gereiftes Luftmycelium.

Aufgrund der ermittelten taxonomischen Werte gehört der Stamm zu der Gattung Ampuliariella, wenn man »key to the genera of family Actinoplanaceae« in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, Seiten 707 bis 708, heranzieht. Der Stamm wird daher als Ampuliariella sp. A 11 079 bezeichnet.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Neplanocin A;

Fig. 2 das Infrarotabsorptionsspektrum von Neplanocin A;

Fig. 3 das NMR-Spektrum von Neplanocin A;

Fig. 4 den Effekt von Neplanocin A auf Mäuse mit L-1210-Leukämie.

Erfindungsgemäß wird das Neplanocin A dadurch hergestellt, daß man einen Stamm Ampuliariella sp. All 079 FERM-P Nr. 4494 in einem geeigneten Nährmedium züchtet. Die Kultivierung des Mikroorganismus kann nach einer Anzahl von verschiedenen Wegen, beispielsweise in synthetischen Medien oder natürlichen Medien und als flüssige oder feste Kultur, durchgeführt werden. Bei der technischen Herstellung werden flüssige Medien bevorzugt. Für das Medium können assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere Substanzen für die das Neplanocinantibiotikum erzeugenden Mikroorganismen verwendet werden. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Saccharose, Glycerin, lösliche Stärke, Molassen. Assimilierbare Stickstoffquellen, wie z. B. Pepton, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenpulver, Fleischextrakt, Reiskleie, Caseinhydrolysat, Nitrate, Ammoniumsalze werden verwendet. Ein anorganisches Salz, wie Natriumchlorid, Phosphate (von Calcium, Magnesium, Eisen(II) oder Mangan), kann gleichfalls verwendet werden. Ein Antischaummittel, beispielsweise ein Siliconöl oder Sojabohnenöl, kann zugefügt werden. Für flüssige Kulturen wird vorzugsweise eine Untertauch-Belüftungskultur verwendet. In diesem Falle wird die Kultivierungstemperatur als die optimale Temperatur Für Mikroorganismen ausgewählt, und sie beträgt vorzugsweise 25 bis 30⁰C. Die Kultivierungszeit kann von den Bedingungen abhängen und beträgt im allgemeinen 2 bis 4 Tage. Der pH-Wert des Mediums während der Kultivierung wird vorzugsweise bei neutralen oder leicht sauren Bedingungen gehalten.

Die auf diese Weise kultivierten Medien enthalten antibiotische Neplanocine. Die Isolierung des antibiotischen Neplanocin A kann durch herkömmliche Isolierungsmaßnahmen für Mikroorganismen-Metaboliten durchgeführt werden. Neplanocin A ist eine schwach basische Substanz und kann durch Adsorption an geeigneten Adsorbentien und anschließende Elution mit einem geeigneten Lösungsmittel isoliert werden. Beispiele für geeignete Adsorbentien sind Aktivkohle, Kationenaustauscherharze, aktives Aluminiumoxid und Kieselgcl. Das Elutionslösungsmittel kann anhand des verwendeten Adsorbens ausgewählt werden. Als Beispiele können mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel wie wäßriges Methanol, wäßriges Aceton oder wäßriges Dioxan, oder saure, alkalische oder Salzlösungen genannt werden. Die Neplanocine können weiterhin auf der Grundlage der schwach basischen Natur der Substanzen isoliert und gereinigt werden. Beispielsweise können sie auf einem Kationenaustauscherharz adsorbiert und durch eine geeignete saure, alkalische oder salzhaltige so Lösung eluiert werden.

Eine Kombination aus Adsorbens und Ionenaustauscherharz kann vorzugsweise für die Isolierung, Elution und Reinigung der Antibiotika angewendet werden. So wird z. B. das Kulturfiltrat auf ein Kationenaustauscherharz aufgegeben, und dann wird mit einer alkalischen Lösung, beispielsweise einer 3,7 N-wäßrigen Ammoniaklösung eluiert, wodurch eine Aktivfraktion erhalten wird. Nachdem ihr pH-Wert auf einen neutralen oder schwach alkalischen Wert eingestellt worden ist, werden die Antibiotika auf Aktivkohle adsorbiert und anschließend mit 70%igem Methanol eluiert.

Das Eluat wird auf einem Anionenaustauscherharz adsorbiert, und es wird erneut mit Wasser eluiert, um die Aktivfraktionen zu sammeln. Die kombinierten Fraktionen werden konzentriert, wodurch ein Rohmaterial erhalten wird. Schließlich werden sie durch Kieselgel-Adsorptionschromatographie gereinigt. Eine weitere Reinigung kann durch Umkristallisation erfolgen. Die Reinheit der Substanz kann nachgeprüft werden, wenn die Substanz einen einzigen Schmelzpunkt oder einen einzigen Flecken bei der Papierchromatographie, der Dünnschichtchromatographie und Elektrophorese bei Ultraviolettlicht mit 263 ΐτίμ zeigt.

Erfindungsgemäß wird aus der Kulturbrühe auch eine Verbindung der Formel

OH

HOH₂C

HO OH

die die Bezeichnung Neplanocin D erhalten hat, isoliert und nach üblichen chemischen Methoden wie folgt in Neplanocin A umgewandelt:

Drei Hydroxygruppen im Cyclopentenring des Neplanocins D werden durch Umsetzung mit Benzoylchlorid geschützt. Die Hydroxygruppe im Purinring von Neplanocin D wird in eine Mercaptogruppe umgewandelt, indem man beispielsweise mit Phosphorpentasulfid umsetzt. Danach wird die Schutzgruppe für die Hydroxygruppe entfernt, wodurch das Neplanocin-D-derivat (III) erhalten wird. Die Methylierung mit Methyljodid liefert das Neplanocin-D-derivat (IV). Das Neplanocin-D-derivat (IV) wird mit methanolischem Ammoniak behandelt, wodurch Neplanocin A erhalten wird.

Nach einem weiteren Verfahren werden die drei Hydroxygruppen im Cyclopentenring des Neplanocins D /um Schutz acetyliert, indem sie mit Essigsäureanhydrid umgesetzt werden. Danach wird die erhaltene Verbindung [2] in das Neplanocin-D-derivat [3] umgewandelt, indem man sie mit Thionylchlorid umsetzt. Das Ncplanocin-D-derivat [3] kann in Neplanocin A umgewandelt werden, indem mit methanolischem Ammoniak behandelt wird.

Diese Reaktionen können wie folgt dargestellt werden.

Benzoylchlorid

HOH₂C-

OH OH

Neplanocin D

BzOH₂C

P₂S₅

BzOH₂C

CH₁I

HOH₂C-

OH OH

Neplanocin-D-derivat

methanolischer Ammoniak

Neplanocin A

HOH₂C-

OH OH

Neplanocin-D-derivat

(III)

IO

20

25

30

40

45

50

55

60

65

(W)

(2) OH

Neplanocin D

Essigsäureanhydrid

H [2] N< ;!anocin-D-derivat |3|

|; ► Neplanocin A

.ir 20 Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Neplanocin-D-derivaten sind wie folgt:

f,' Neplanocin-D-derivat

% (III) (IV)

fi Molekulargewicht (errechnet aus der 280 294

I rnassenspektroskopischen Analyse)

I Molekularformel C_nH₁₂N₄O₃S Ci₂H₁₄N₄O₁S

|, _3ü Schmelzpunkt 260-262⁰C (Zers.) 177-178°C

I spezifische Drehung - [atf = -141,7 (c = 0,7, 11,0)

Ultraviolettabsorptionsspektrum (in H₂O) 226 rna 222 ιπμ

324 τημ 288 πΐμ

j 35 ²⁹⁵ "*

i: Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

I Beispiel 1

(ι 100 ml des wäßrigen Mediums (pH 6,5), enthaltend 2% Glucose, 2% Stärke, 1% Hefeextrakt, 1% Cascinhydro-

Sf lysat und 0,2% Calciumcarbonat, wurden in einen 500-ml-Kolben gegeben und 15 min bei 120⁰C sterilisiert. In

I 45 zwei Kolben mit diesem Medium wurde eine Schleife voll einer Schrägkultur von Ampullarieila sp. A 11 079

j FERM-P Nr. 4494 inokuliert, und es wurde bei 30⁰C eine Schüttelkultur vorgenommen. Nach 4 Tagen wurde das

I Kulturmedium in 20 1 des gleichen sterilisierten Mediums, wie oben beschrieben, in einen 30-1-Standgefaß-

[i fermentator gegeben, und es wurde bei 3O⁰C unter Rühren mit 300 Upm und Belüftung mit 20 l/min 48 h lang

I kultiviert.

I 50 Das so kultivierte Medium wurde in 200 1 eines wäßrigen Mediums (pH 6,5) übertragen, das 4% Glucose,

\ 1% Sojabohnenpulver, 0,4% Fleischextrakt, 0,4% Pepton, 0,1% Hefeextrakt, 0,25% NaCl und 0,1% Calciumcarbo-

I nat enthielt. Es wurde 40 h lang bei 30°C unter Rühren mit 180 Upm und Belüften mit 130 l/min kultiviert. Die

I erhaltene Kulturbrühe (etwa 200 1) wurde filtriert, und die Mycelien wurden mit Wasser gewaschen. Das Filtrat

und das Waschwasser wurden kombiniert, wodurch etwa 140 1 eines klären Filtrats erhalten wurden (Aktivität 55 57 mcg/ml als Neplanocin A).

Das erhaltene Filtrat wurde durch eine Säule mit 20 1 Kationenaustauscherharz Amberlite IR-120 (H⁺-Typ) (Warenzeichen) geleitet, um das Material zu adsorbieren. Es wurde mit 100 1 Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit 3,7 N-wäßrigem Ammoniak, und das primäre Eluat (301) wurde verworfen. 901 des nachfolgenden Eluats wurden gesammelt, durch Zugabe von 6 N-HCl auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und sodann durch 41 60 Aktivkohle in einer Säule geleitet. Dann wurde mit Wasser gewaschen und hierauf mit 90 I einer 70%igen methanolischen Lösung eluiert. Das so erhaltene Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wodurch 1,5 1 eines Konzentrats erhalten wurden. Das Konzentrat wurde auf eine Säule mit 10 1 Amberlite IRA-410 (OH~-Typ) aufgegeben, und es wurde mit Wasser eluiert. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 4 N-IICI auf 7 eingestellt. Das Eluat wurde im Vakuum konzentriert, und das Material wurde unter Abkühlen ausgefällt. Hs 65 wurde filtriert, wodurch 41,8 g rohes Neplanocin A (Reinheit etwa 12%) erhalten wurden.

Das rohe Neplanocin A (41,8 g) wurde in einer kleinen Wassermenge aufgelöst und auf eine Säule (8,3 X 40 cm) aufgegeben, die mit 2 1 Kieselgel in einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: 28%igem wäßrigen Ammoniak : Wasser (10 : 0,2 : 1) gepackt war. Danach wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch

cluiert. Jeweils 150 ml des Eluats wurden fraktioniert, und aktive Fraktionen wurden in den Fraktionen Nr. 24 bis 52 festgestellt. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, im Vakuum konzentriert und unter Abkühlen stehen gelassen.

Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, wodurch 2,6 g rohes kristallines Neplanocin A (Ausbeute 32%) erhalten wurden.

Das rohe Neplanocin A wurde in etwa 60 ml heißem Wasser aufgelöst und bei Raumtemperatur stehengelassen. Die ausgefällten weißen nadelförmigen Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, wodurch 2,01 g Kristalle von Neplanocin A erhalten wurden (Ausbeute 25,2%).

Beispiel 2

Das wie im Beispiel 1 erhaltene Filtrat wurde mit 3,6 kg pulverförmiger Aktivkohle versetzt. Nach 40minütigem Rühren wurde die Aktivkohle durch Filtration gesammelt und gründlich mit Wasser gewaschen. Die EIution erfolgte mit 70%iger Methanollösung. 401 Eluat wurde im Vakuum getrocknet, wodurch 80 g rohes Pulver, das Neplanocin D enthielt, erhalten wurden.

Die 80 g rohes Pulver wurden auf eine Säule aufgegeben, die mit 6 1 Kieselgel in n-Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 1 : 1) bepackt war. Danach wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert. Jeweils 600 g des Eluats wurden fraktioniert. Neplanocin D wurde in den Fraktionen Nr. 20 bis 37 festgestellt. Die Aktivfraktionen wurden gesammelt, im Vakuum auf 30 ml konzentriert und unter Kühlen stehengelassen. Der Rückstand wurde durch Filtration gesammelt, wodurch 460 mg rohes kristallines Neplanocin D erhalten wurden.

Die 460 mg rohe Kristalle wurden in 3 ml heißem Wasser aufgelöst und auf eine Säule von Sephadex G-15 Π 850 ml, mit Wasser gepackt) aufgegeben. Sodann wurde mit Wasser eluiert. Jeweils 100 ml des Eluats wurden fraktioniert und die Eluatfraktionen Nr. 15 und 16 (200 ml) wurden gesammelt. Sie wurden bei vermindertem Druck auf 20 ml konzentriert und bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wurden 314 mg ausgefälltes Neplanocin D als weiße nadeiförmige Kristalle erhalten.

(1) 376 mg Neplanocin D, gelöst in 10 ml wasserfreiem Pyridin, wurden gründlich bei 55°C gerührt. 0,9 ml Bcnzoylchlorid wurden tropfenweise zugegeben, und es wurde 2 h bei 60 bis 65°C gerührt. Danach wurde die Lösung 2 h bei 40 bis 45°C gehalten und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. 10 ml Wasser wurden unter Rühren zugesetzt, und nach 25 min wurde die Lösung unter vermindertem Druck in einer Abdampfvorrichtung zur Trockene eingedampft. Das getrocknete Material wurde in 30 ml Chloroform aufgelöst, dreimal mit 10 ml I N-HCI und zweimal mit 1 N-Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Danach wurde es zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen.

Die Chloroformschicht wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat entwässert und konzentriert, wodurch 747 mg einer hellcremefarbenen Verbindung (I) erhalten wurden (Ausbeute 91%).

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung (I) sind wie folgt:

[a]i; = -199° (c = 0,6, Methanol),

Molekularformel: C₃₂H₂₄N₄O₇, Molekulargewicht: 576 (Massenspektrum),

Schmelzpunkt: 116 bis 117°C,

Ultraviolettabsorptionsspektrum: k_max = 232 mu, E\\_m = 704,

Rf-Wert (Chloroform : Methanol = 10 : 1); Rf = 0,53.

(2) 735 mg der oben erhaltenen Verbindung (I) und 1,0736 g Phosphorpentasulfid, gelöst in 19 ml Pyridin, wurden gründlich miteinander verrührt. Es wurden tropfenweise 0,19 ml Wasser zugesetzt. Nach 4stündigem Erhitzen am Rückfluß wurde das Reaktionsgemisch abgekühlt und im Vakuum konzentriert, wodurch ein braunes öliges Material erhalten wurde. Dieses ölige Material wurde in siedendes Wasser unter Rühren gegossen. Es wurde 30 min lang weitergerührt, wodurch eine gelbliche Substanz erhalten wurde. Diese wurde filtriert, um den Niedcrschlag zu sammeln, mit einem Gemisch aus Äthanol: Äther (1:1) gewaschen, mit Äther weiter gewaschen und getrocknet, wodurch 561 mg der Verbindung (II) (Ausbeute 74.3%) erhalten wurden.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung (II) waren wie folgt:

W₁; = -286,9° (c = 0,6, CHCl₃), Molekularformel: C₃₂H₂₄N₄O₆S,

Molekulargewicht: 592,

Schmelzpunkt: 235 bis 239°C (Zersetzung unter Schaumbildung),

UV-Spektrum (in Methanol):

232 m,x, (£j^% = 858,5),

323 mix, (£i'L = 327,5),
Rf-Wert (Chloroform : Methanol = 10 : 1); Rf = 0,82.

(3) 525 mg der unter (2) erhaltenen Verbindung (II) wurden in 31 ml wasserfreiem Methanol aufgelöst. 0,62 ml frisch-hergestellte 2 N-Lösung von Natriummethylat in Methanol wurden zugesetzt, und es wurde 2 h lang unter Rühren am Rückfluß erhitzt, um die Benzoylgruppe zu entfernen.

Nach dem Abdestillieren des Methanols wurden etwa 50 ml Wasser zugesetzt, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von Essigsäure auf 7,5 eingestellt. Die Lösung wurde zweimal mit 20 ml Äthylacetat extrahiert, und die

wäßrige Schicht wurde konzentriert, wodurch Neplanocin-D-derivat (ΙΠ) in Form von nadelformigen Kristallen erhalten wurde. Die Umkristallisation erfolgte aus heißem Wasser, wobei HC mg Neplanocin-D-derivat (III; erhalten wurden (Ausbeute 44,3%).
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften tier Verbindung (III) sind wie folgt:

spezifische Drehung: wegen Meßschwankungen unmöglich zu messen,
Molekularformel: C_nH₁₂N₄O₃S,
Molekulargewicht: 280 (Massenspektrum),
Schmelzpunkt: 260 bis 262°C (Zers.),
ίο UV-Spektrum in H₂O:

226 ro·*, (Ep_cm = 388,6),

324 πι_:α (£|^% _cm = 968,0),

Rf-Wert (Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser = 10 : 1 : 1); Rf = 0,21.

(4) Zu 37 mg Neplanocin-D-derivat (III), gelöst in 0,3 ml0,4 N-NaOH, wurden 0,009 ml Methyijodid gegeben Es wurde 10 min lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden 0,05 ml 0,4 N-NaOH zugesetzt, und e: wurden weitere 0,009 ml Methyijodid zugegeben. Dann wurde erneut geschüttelt und bei Raumtemperatur ste hengelassen. Zu dieser Lösung wurden 10 ml Wasser gegeben, und das Gemisch wurde im Vakuum auf 2 ml kon zentriert. Es wurde auf eine Säule von Sephadex G-15 (1,4 X 49 cm) aufgegeben. Die Elution erfolgte mit Wasser wobei jeweils 3 g Eluat fraktioniert wurden. Die Fraktionen Nr. 17 bis 19 wurden gesammelt, konzentriert unc abgekühlt, wodurch 35 mg kristallines Neplanocin-D-derivat (IV) erhalten wurden (Ausbeute 90%).
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Neplanocin-D-derivat (IV) sind wie folgt:

[a]^:J = -141,7 (c =0,7, H₂O),
Molekularformel: C₁₂H₁₄N₄O₃S,

Molekulargewicht: 294 (Massenspektrum),
Schmelzpunkt: 177 bis 178⁰C,
UV-Spektrum in Wasser:

222 ma, (E\"''_cm = 415,8),
288 ma, (Ef*_m = 676,3),

295 m«, (E\\_m = 670,7),
Rf-Wert (Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser = 10 : 1 : 1); Rf = 0,42.

(5) Synthese von Neplanocin A aus Neplanocin-D-derivat (IV)

50 mg des Neplanocin-D-derivats (IV), gelöst in 1,5 ml methanolischem Ammoniak (O°C-Sättigung), wurder in ein "erschlossenes Rohr eingegeben und 7 h auf 146 bis 148°C erhitzt. Nach Entfernung des Lösungsmittel; unter vermindertem Druck wurde der Rückstand in 3 ml heißem Wasser aufgelöst und sodann abgekühlt wodurch 33 mg Neplanocin A in Form von nadeiförmigen Kristallen erhalten wurden (Ausbeute 74%).

Beispiel 3

(1) Zu 1,14 g Neplanocin D, gelöst in 12 ml wasserfreiem Pyridin, wurde 1 ml Essigsäureanhydrid gegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. 30 ml η-Hexan wurden zugesetzt, unt das Gemisch wurde in Eiswassergekühlt, wodurch 1 g der Verbindung [2] in Form von Kristallen erhalten wurde

(2) 1 g der Verbindung [2] wurde zu 25 ml einer Chloroformlösung gegeben, die 0,8 ml Thionylchlorid unc

0,4 ml Dimethylformamid enthielt. Das Gemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur am Rückfluß erhitzt. Da; Chloroform wurde unter vermindertem Druck ab<1estilliert. Der Rückstand wurde unter Rühren in 100 ml Eiswasser gegossen. Die Extraktion erfolgte mit 100 ml Chloroform. Es wurde mit NaHCO₃ und Wasser gewascher und mit Natriumsulfat getrocknet. Das Neplanocin-D-derivat (3) wurde nach dem Trocknen im Vakuum erhalten.

(3) Herstellung von Neplanocin A aus Neplanocin-D-derivat [3]

Das Neplanocin-D-derivat [3] wurde in ein verschlossenes Stahlrohr gegeben. Es wurden 35 ml gesättigte methanolische Ammoniaklösung zugegeben, und es wurde 5 h lang bei 100⁰C umgesetzt. Nach dem Abkühler wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockene eingedampft, wodurch ein kristallines Pulver erhalten wurde, das durch Säulenchromatographie mit Kieselgel gereinigt wurde, wodurch 286 mg Neplanocin A erhalten wurden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. ljS-(6-Amino-9 H-purin-9-yl)-4-hydroxymethyl-4-cyclopenten-2a,3a-diol (Neplanocin A) der Formel: NH₂

HOH₂C-

OH OH

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 1 NH₂