DE29913701U1 - Arrangement for detecting the fluorescence radiation from matrix-shaped sample carriers - Google Patents
Arrangement for detecting the fluorescence radiation from matrix-shaped sample carriersInfo
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Description
Anordnung zum Erfassen der Fluoreszenzstrahlung von matrixförmigen ProbenträgernArrangement for detecting the fluorescence radiation of matrix-shaped sample carriers
Die Erfindung betrifft eine Anordnung zum Erfassen der Fluoreszenzstrahlung von matrixförmigen Probenträgern, insbesondere zur Analyse von chemischen und biologischen Probenträgern, wie z.B. Nanotiterplatten oder Bio-Chips.The invention relates to an arrangement for detecting the fluorescence radiation of matrix-shaped sample carriers, in particular for the analysis of chemical and biological sample carriers, such as nanotiter plates or biochips.
Für Aufgaben der biotechnischen Analyse (Screening) großer Probenmengen, vorzugsweise für die Genanalyse (z.B. bei der Virendiagnostik) ist die Verwendung sogenannter Mikrotiterplatten und zugehöriger Handhabetechnik eine eingeführte Technik (Pharmaforschung, klinische Praxis usw.). Diese Technik zeichnet sich dadurch aus, daß in einer Mikrotiterplatte der Größe 8 cm &khgr; 12 cm je nach Ausführungsform 96 (verbreitetster Typ), 384 oder 1536 verschiedene Probensubstanzen untergebracht werden können. Zum Befüllen der einzelnen Kavitäten sind je nach Art der Mikrotiterplatte Probenmengen in der Größenordnung von 100 &mgr;&Igr; erforderlich.For tasks involving biotechnical analysis (screening) of large sample quantities, preferably for genetic analysis (e.g. in virus diagnostics), the use of so-called microtiter plates and the associated handling technology is an established technique (pharmaceutical research, clinical practice, etc.). This technique is characterized by the fact that, depending on the design, 96 (most common type), 384 or 1536 different sample substances can be accommodated in a microtiter plate measuring 8 cm x 12 cm. Depending on the type of microtiter plate, sample quantities in the order of 100 μl are required to fill the individual cavities.
Im Zuge der Effektivitätssteigerung sind international Forschungs- und Entwicklungsarbeiten zur wesentlichen Vergrößerung der Anzahl der (gleichzeitig verarbeitbaren) Kavitäten bei gleichzeitiger wesentlichen Verkleinerung der erforderlichen Probenmengen und einer wesentlichen Erhöhung des Probendurchsatzes im Gange. Diese Ziele sollen erreicht werden durch den Übergang von Mikrotiterplatten zu (z.B. mit mikrophotolithographischen Technologien hergestellten) Bio-Chips und schnellem Auslesen und Verarbeiten (High Throughput-Screening, HTS) der Bio-Chips.In order to increase efficiency, international research and development work is underway to significantly increase the number of cavities (that can be processed simultaneously) while at the same time significantly reducing the required sample quantities and significantly increasing sample throughput. These goals are to be achieved by moving from microtiter plates to biochips (e.g. produced using microphotolithographic technologies) and rapid reading and processing (high throughput screening, HTS) of the biochips.
Zum Auslesen von Bio-Chips (wie auch von Mikrotiterplatten oder beliebigen anderen chemischen Probenträgern) wird das Probenmaterial mit Licht je nach Art der Proben im UV-bis in den NIR-Bereich bestrahlt, um bestimmte Substanzen in den Proben (bevorzugt werden Fluoreszenz-Marker dem Probenmaterial zugesetzt) durch die Wirkung der Beleuchtungsstrahlung zu einer stimulierten Strahlung zu veranlassen und damit das Vorhandensein von bestimmten Substanzen (oder Bestandteilen, an die eine Marker-Substanz angekoppelt hat) nachzuweisen bzw. deren Anteil im Probenmaterial zu bestimmen.To read biochips (as well as microtiter plates or any other chemical sample carriers), the sample material is irradiated with light in the UV to NIR range, depending on the type of sample, in order to stimulate certain substances in the samples (fluorescence markers are preferably added to the sample material) through the effect of the illumination radiation and thus to detect the presence of certain substances (or components to which a marker substance has coupled) or to determine their proportion in the sample material.
Ein einzelner Bio-Chip kann auf einer Fläche von einigen mm2 bis cm2 mehrere zehntausend Spots (vergleichbar mit den Kavitäten der Mikrotiterplatte) beinhalten, wobei in Summe über alle Spots lediglich Probenmengen in der Größenordnung von einigen Nanolitern (nl) erforderlich sind. Wegen der dadurch enorm gestiegenen Zahl der auszuwertenden Proben setzt sich zum schnellen Auslesen der matrixförmigen Anordnung der Pixel neben demA single bio-chip can contain several tens of thousands of spots (comparable to the cavities of a microtiter plate) on an area of a few mm 2 to cm 2 , whereby the total sample volume required across all spots is only a few nanolitres (nl). Due to the enormous increase in the number of samples to be evaluated, the matrix-shaped arrangement of the pixels is used in addition to the
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ebenfalls etablierten Scannerprinzip (mit serieller Laserbeleuchtung der Spots und Detektion der angeregten Strahlung mittels eines Einzelempfängers, z.B. Photonenzähler [SEV bzw. PMT]) zunehmend das sogenannte Kameraprinzip durch. Dabei werden die Pixel des Bio-Chips parallel beleuchtet und viele oder alle Pixel des Probenträgers gleichzeitig ausgelesen unter Verwendung einer optoelektronischen Empfängermatrix (z.B. CCD). Beispiele für das Kamera-Prinzip sind die Geräte:The so-called camera principle is increasingly being used in place of the also established scanner principle (with serial laser illumination of the spots and detection of the excited radiation using a single receiver, e.g. photon counter [SEV or PMT]). The pixels of the bio-chip are illuminated in parallel and many or all of the pixels of the sample carrier are read out simultaneously using an optoelectronic receiver matrix (e.g. CCD). Examples of the camera principle are the following devices:
DIANA (Raytest, US)DIANA (Raytest, US)
ARTHUR-Fluoroimager (EG&G Wallac, Fl)ARTHUR Fluoroimager (EG&G Wallac, Fl)
ArrayWoRx (Applied Precision, US)
10ArrayWoRx (Applied Precision, US)
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Ein Beispiel für die Anwendung des Kamera-Prinzipes ist ein Nanotiterplatten-Auslesesystem aus einem BMBF-Verbundprojekt LINDAU (Laser-induzierte Fluoreszenz-Detektion auf mikrostrukturierten Probenträgern zur Analytik im Umweltbereich), das in dem Fachartikel "Optische Mikrosysteme für die Umweltmeßtechnik" (in: Laser und Optoelektronik, 30 (1), 1998, S. 33-35) beschrieben ist. Gemäß dieser Veröffentlichung arbeitet man mit einer direkten Auflichtbeleuchtung über einen dichroitischen Spiegel, der die Strahlungswellenlängen von Beleuchtung und Fluoreszenzstrahlung weitgehend trennen soll. Obwohl die hier verwendete (und auch allgemein empfohlene) Beleuchtungsart bei der Analyse von Fluoreszenzstrahlung eines Objekts die Auflichtbeleuchtung ist, weil sie die wenigsten Probleme bei unterschiedlicher Transmission der untersuchten Proben mit sich bringt, haben reflektierte oder gestreute Anteile des Beleuchtungslichts - infolge der spezifischen Oberfläche der Bio-Chip-Pixel, wie sie nachfolgend noch genauer beschrieben wird, auch bei Einsatz guter Sperrfilter für die Wellenlängen der Beleuchtungsstrahlung merklichen Einfluß auf das Meßergebnis, da der Empfänger wegen der sehr viel schwächeren Fluoreszenzstrahlung eine sehr hohe Empfindlichkeit aufweisen muß.An example of the application of the camera principle is a nanotiter plate reading system from a BMBF joint project LINDAU (laser-induced fluorescence detection on microstructured sample carriers for environmental analysis), which is described in the technical article "Optical microsystems for environmental measurement technology" (in: Laser and Optoelectronics, 30 (1), 1998, pp. 33-35). According to this publication, direct incident light illumination is used via a dichroic mirror, which is intended to largely separate the radiation wavelengths of illumination and fluorescence radiation. Although the type of illumination used here (and also generally recommended) for the analysis of fluorescent radiation from an object is incident illumination, because it causes the least problems with different transmission of the samples being examined, reflected or scattered parts of the illumination light - due to the specific surface of the bio-chip pixels, as described in more detail below - have a noticeable influence on the measurement result even when good blocking filters for the wavelengths of the illumination radiation are used, since the receiver must have a very high sensitivity due to the much weaker fluorescent radiation.
Eine weitere im Stand der Technik übliche Maßnahme zur Steigerung der Empfindlichkeit der Detektion von Fluoreszenzstrahlung ist die optische Abbildung der Probenpixel auf den Empfänger mittels hochaperturiger Objektive, um möglichst viel von dem an sich schwachen Fluoreszenzlicht auf den Empfänger zu konzentrieren. Beispielsweise weisen Anbieter von Bio-Chip-Analysegeräten, so z.B. der Anbieter von Laserscansystemen, General Scanning, Inc. (USA), als Verkaufsargument auf die hohe Apertur des verwendeten Objektivs hin. Auch nach allgemeiner Lehrmeinung, wie man sie beispielweise bei O. Beyer im Handbuch der Mikroskopie (Verlag Technik Berlin, 3. Auflage, 1988, S. 221 ff.) für die Fluoreszenzmikroskopie nachlesen kann, sind bei Objektiven gleicher VergrößerungAnother measure commonly used in the state of the art to increase the sensitivity of the detection of fluorescence radiation is the optical imaging of the sample pixels onto the receiver using high-aperture lenses in order to concentrate as much of the weak fluorescence light as possible onto the receiver. For example, suppliers of bio-chip analysis devices, such as the supplier of laser scanning systems, General Scanning, Inc. (USA), point to the high aperture of the lens used as a sales argument. According to general opinion, as can be read for example in O. Beyer's Handbuch der Mikroskopie (Verlag Technik Berlin, 3rd edition, 1988, p. 221 ff.) for fluorescence microscopy, for lenses with the same magnification
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diejenigen mit hoher Apertur zu bevorzugen, wobei zur weiteren Apertursteigerung noch auf Objektivimmersionen verwiesen wird.those with high aperture are to be preferred, whereby lens immersion is also recommended for further aperture increase.
Die Oberfläche jedes einzelnen Spots eines Bio-Chips ist (nach einer ganzen Reihe von technologischen Schritten zur Präparation des Bio-Chips) im optischen Sinne allgemein nicht eben, da sie zunächst eine gewölbte Tröpfchenform aufweist, die dann im Laufe der Bearbeitungsschritte nach und nach eintrocknet und damit eine unregelmäßige (schrumpelige) Oberfläche erhält. Damit ergeben sich bei der üblichen Auflichtbeleuchtung Probleme im Auswertekanal dadurch, daß durch Reflexion und Streuung an der allgemein unregelmäßigen, rauhen Oberfläche unerwünschte Anteile der Beleuchtungsstrahlung zum Empfänger gelangen. Dieser Tatsache wird in dem oben erwähnten Fluoroimager von EG&G WALLAC [vgl. z.B. Firmenprospekt 1442-960-01 (April 1998) zum ARTHUR multi-wavelength fluoroimager] insoweit Rechnung getragen, daß Durchlichtbeleuchtung, indirekte und laterale Auflichtbeleuchtung angeboten werden. Als Strahlungsquellen zur lateralen Anregung von Fluoreszenz werden ein Xenon-Strahler, der ein kontinuierliches Spektrum mit relativ gleichbleibender Intensität abgibt, und UV-Strahler, die sich durch intensive diskrete Spektrallinien im nahen UV- und sichtbaren Bereich auszeichnen, verwendet, wobei die gewünsche Beleuchtungswellenlänge durch Auswahl eines entsprechenden Anregungsfilters ausgewählt werden kann. Ob oder inwieweit durch diese Arten der Beleuchtung jedoch die Quantität der erzeugten Fluoreszenzstrahlung unterschiedlicher Proben vergleichbar ist, kann der Veröffentlichung nicht entnommen werden.The surface of each individual spot of a biochip (after a whole series of technological steps to prepare the biochip) is generally not optically flat, as it initially has a curved droplet shape, which then gradually dries out during the processing steps, giving it an irregular (wrinkled) surface. This causes problems in the evaluation channel with conventional incident light illumination, as undesirable parts of the illumination radiation reach the receiver due to reflection and scattering on the generally irregular, rough surface. This fact is taken into account in the above-mentioned fluoroimager from EG&G WALLAC [see, for example, company brochure 1442-960-01 (April 1998) for the ARTHUR multi-wavelength fluoroimager], in that transmitted light, indirect and lateral incident light illumination are offered. A xenon emitter, which emits a continuous spectrum with relatively constant intensity, and UV emitters, which are characterized by intense discrete spectral lines in the near UV and visible range, are used as radiation sources for the lateral excitation of fluorescence. The desired illumination wavelength can be selected by choosing an appropriate excitation filter. However, the publication does not indicate whether or to what extent the quantity of fluorescence radiation generated by different samples is comparable using these types of illumination.
Der Erfindung liegt das Problem zugrunde, eine Anordnung zum Erfassen der Fluoreszenzstrahlung matrixförmiger Probenträger mit einer Vielzahl von Einzelproben zu realisieren, mit der ein quantitatives Auslesen der von den einzelnen Probensubstanzen charakteristisch beeinflußten Fluoreszenzstrahlung mit großer Empfindlichkeit möglich ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Anregungsintensität bei Verwendung von unterschiedlichen Fluoreszenzstoffen vergleichbar zu machen.The invention is based on the problem of realizing an arrangement for detecting the fluorescence radiation of matrix-shaped sample carriers with a large number of individual samples, with which a quantitative readout of the fluorescence radiation characteristically influenced by the individual sample substances is possible with great sensitivity.
A further object of the invention is to make the excitation intensity comparable when using different fluorescent substances.
Erfindungsgemäß wird das Problem bei einer Anordnung zum Erfassen der Fluoreszenzstrahlung von matrixförmigen Probenträgern mit einer Vielzahl von Einzelproben, die metrisch geordnete Pixel auf einem Substrat darstellen und eine durch die jeweilige Probensubstanz charakteristisch beeinflußte Fluoreszenzstrahlung abgeben, mit einer Beleuchtungseinrichtung zum gleichzeitigen Anregen der Fluoreszenzstrahlung einer VielzahlAccording to the invention, the problem is solved in an arrangement for detecting the fluorescence radiation of matrix-shaped sample carriers with a large number of individual samples, which represent metrically arranged pixels on a substrate and emit fluorescence radiation that is characteristically influenced by the respective sample substance, with an illumination device for simultaneously exciting the fluorescence radiation of a large number
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von Substratpixeln, enthaltend eine Lichtquelle und ein spektral schmalbandiges Anregungsfilter, das je nach vorliegendem Fluoreszenzstoff wechselbar ist, mit einer Übertragungsoptik zum Übertragen der von einzelnen Substratpixeln abgegebenen Fluoreszenzstrahlung auf einen Empfänger mit einer Vielzahl von Empfängerelementen und einem dem Empfänger vorgelagerten wechselbaren Filter zum Durchlassen der Wellenlänge des Fluoreszenzstoffes und Blockieren der Anregungswellenlänge, dadurch gelöst, daß die Übertragungsoptik ein abbildendes Objektiv enthält, über das jedes Substratpixel einer festgelegten Gruppe von Empfängerelementen des Empfängers zugeordnet ist und das mit einer zusätzlichen Aperturblende zur Beschränkung des Winkelbereichs der vom Objektiv erfaßten Fluoreszenzstrahlung ausgestattet ist, so daß den Empfängerelementen, die jeweils einem bestimmten Substratpixel zugeordnet sind, im wesentlichen kein Fluoreszenzlicht benachbarter Substratpixel zugeführt wird, und daß die Beleuchtungseinrichtung eine Dunkelfeldbeleuchtungseinheit zur großflächigen Beleuchtung einer Vielzahl von Substratpixeln unter Ausbildung eines bezüglich der Achse des Objektivs symmetrischen Anregungsstrahlenbündels, das die Apertur des Objektivs sowie einen wesentlichen, die Objektivapertur umgebenden Winkelbereich ausspart, aufweist.of substrate pixels, containing a light source and a spectrally narrow-band excitation filter, which can be changed depending on the fluorescent substance present, with a transmission optics for transmitting the fluorescent radiation emitted by individual substrate pixels to a receiver with a plurality of receiver elements and an exchangeable filter arranged in front of the receiver for letting the wavelength of the fluorescent substance through and blocking the excitation wavelength, solved in that the transmission optics contains an imaging lens, via which each substrate pixel is assigned to a fixed group of receiver elements of the receiver and which is equipped with an additional aperture diaphragm for limiting the angular range of the fluorescent radiation detected by the lens, so that essentially no fluorescent light from neighboring substrate pixels is supplied to the receiver elements, which are each assigned to a specific substrate pixel, and in that the illumination device has a dark field illumination unit for large-area illumination of a plurality of substrate pixels, forming an excitation beam bundle that is symmetrical with respect to the axis of the lens, which extends the aperture of the lens and has a significant angular range surrounding the objective aperture.
Vorteilhaft wird als Objektiv ein Mikroobjektiv eingesetzt, um eine ausreichend vergrößerte Abbildung mit geringen Abbildungsfehlern der Substratpixel auf dem Empfänger zu erhalten.It is advantageous to use a micro lens as the objective in order to obtain a sufficiently magnified image with low imaging errors of the substrate pixels on the receiver.
Zur Vermeidung eines nachweisbaren Übersprechens der Fluoreszenzstrahlung benachbarter Substratpixel auf ihnen nicht zugeordnete Empfängerelemente wird die zusätzliche Aperturblende vorzugsweise so dimensioniert, daß die wirksame numerische Apertur des Mikroobjektivs um 10 bis 30% reduziert ist.
Es ist zweckmäßig, als Objektiv ein Mikroobjektiv mit einer außerhalb des Objektivs liegenden Aperturblendenebene, in der die zusätzliche Aperturblende einfach angebracht werden kann, vorzusehen.To avoid detectable crosstalk of the fluorescence radiation of neighboring substrate pixels to receiver elements not assigned to them, the additional aperture stop is preferably dimensioned such that the effective numerical aperture of the micro objective is reduced by 10 to 30%.
It is expedient to use a micro objective lens with an aperture diaphragm plane located outside the objective lens, in which the additional aperture diaphragm can be easily attached.
Vorzugsweise kann ein Mikroobjektiv mit zehnfacher Vergrößerung und einer Apertur von 0,2 bis 0,25 eingesetzt werden. Dabei ist mittels der zusätzlichen Aperturblende die wirksame Apertur des Mikroobjektivs um 15 bis 30% zu reduzieren.Preferably, a micro objective with tenfold magnification and an aperture of 0.2 to 0.25 can be used. The effective aperture of the micro objective can be reduced by 15 to 30% using the additional aperture diaphragm.
Bei einem ins Unendliche abbildenden Mikroobjektiv ist zweckmäßig die Übertragungsoptik durch eine in einem längenverstellbaren Tubus angeordnete Tubuslinse ergänzt zur Erzeugung einer scharfen optischen Abbildung der die Fluoreszenzstrahlung emittierenden Substratpixel auf die zugeordneten Gruppen von Empfängerelementen.In a micro-objective that images to infinity, the transmission optics are expediently supplemented by a tube lens arranged in a length-adjustable tube in order to produce a sharp optical image of the substrate pixels emitting the fluorescence radiation onto the associated groups of receiver elements.
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Die Dunkelfeldbeleuchtungseinheit wird aus Gründen der Homogenität der Anregungsstrahlung in der Substratebene zweckmäßig symmetrisch ausgeführt.
Das kann zum einen vorteilhaft mittels Lichtleitern, deren Lichtaustrittsfenster, verteilt um die optische Achse des Objektivs, auf einen Fleck des Substrats fokussiert sind, geschehen.
Zum anderen wird als Dunkelfeldbeleuchtungseinheit zur Durchlichtbeleuchtung des Substrats vorzugsweise ein rotationssymmetrisch aufgebauter Dunkelfeldkondensor zur Erzeugung eines ringförmigen Anregungsstrahlenbündels verwendet. Dazu ist ein Trocken-Dunkelfeldkondensor besonders geeignet.The dark field illumination unit is designed symmetrically for reasons of homogeneity of the excitation radiation in the substrate plane.
On the one hand, this can be done advantageously by means of light guides whose light exit windows, distributed around the optical axis of the lens, are focused on a spot on the substrate.
On the other hand, a rotationally symmetrical dark field condenser is preferably used as a dark field illumination unit for transmitted light illumination of the substrate to generate an annular excitation beam. A dry dark field condenser is particularly suitable for this purpose.
Bei Verwendung eines Dunkelfeldkondensors ist es vorteilhaft, diesem eine zusätzliche Optik als Kollektor voranzustellen.When using a dark field condenser, it is advantageous to place an additional optic in front of it as a collector.
Um Fluoreszenzstrahlungsmessungen bei Anregung mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen vergleichbar zu machen, sind die spektrale Emission der Beleuchtungseinrichtung und die spektrale Empfindlichkeit des Empfängers so aufeinander abzustimmen, daß deren Produkt über einen für die zu detektierenden Fluoreszenzsubstanzen erforderlichen Wellenlängenbereich annähernd eine Konstante ergibt. Zur optimalen Anregung von Fluoreszenzstrahlung unterschiedlicher Fluoreszenzstoffe wird vorteilhaft eine intensive, kontinuierliche Lichtquelle mit einem austauschbaren, an die Anregungswellenlänge des Fluoreszenzstoffes angepaßten Bandpaßfilter eingesetzt.In order to make fluorescence radiation measurements comparable when excited with different excitation wavelengths, the spectral emission of the illumination device and the spectral sensitivity of the receiver must be matched to one another so that their product is approximately constant over a wavelength range required for the fluorescent substances to be detected. For optimal excitation of fluorescence radiation from different fluorescent substances, it is advantageous to use an intensive, continuous light source with an exchangeable bandpass filter adapted to the excitation wavelength of the fluorescent substance.
Als breitbandige Lichtquelle ist zweckmäßig eine Halogenlampe oder Xenonlampe eingesetzt. Damit die Lichtquelle räumlich und damit vorzugsweise thermisch von den übrigen Komkponenten getrennt ist, wird die Lichtquelle vorteilhaft über einen Lichtleiter mit der Dunkelfeldbeleuchtungseinheit gekoppelt. Diese Kopplung erfolgt vorzugsweise mittels eines Flüssigkeitslichtleitkabels, um die Transmissionsverluste der Intensität der Anregungsstrahlung im gewünschten Wellenlängenbereich gering zu halten.A halogen lamp or xenon lamp is advantageously used as a broadband light source. In order to ensure that the light source is spatially and therefore preferably thermally separated from the other components, the light source is advantageously coupled to the dark field illumination unit via a light guide. This coupling is preferably carried out using a liquid light guide cable in order to keep the transmission losses of the intensity of the excitation radiation in the desired wavelength range to a minimum.
Bei Verwendung einer Lichtquellenankopplung über Lichtleitkabel sind die spektrale Emission der Lichtquelle, die spektrale Transmission des Lichtleiters und die spektrale Empfindlichkeit des Empfängers so aufeinander abgestimmt, daß das Produkt aus diesen drei spektralen Größen annähernd eine Konstante ergibt.When using a light source coupling via fiber optic cable, the spectral emission of the light source, the spectral transmission of the fiber optic cable and the spectral sensitivity of the receiver are coordinated in such a way that the product of these three spectral quantities is approximately constant.
Die erwähnten optischen Baugruppen werden für die Anpassung an spezielle Anwendungsfälle in vorteilhafter Weise zu austauschbaren Modulen zusammengesetzt. Zweckmäßig ist die erfindungsgemäße Anordnung aufeinanderfolgend in ein Lichtquellenmodul, vorzugsweise mit angeschlossenem Lichtleiter zur Übertragung desThe optical assemblies mentioned are advantageously assembled into exchangeable modules for adaptation to special applications. The arrangement according to the invention is expediently successively divided into a light source module, preferably with a connected light guide for transmitting the
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Anregungslichts, ein Modul zur Lichteinkopplung und Strahlaufweitung, ein Substratträgermodul, ein Abbildungsmodul für die Fluoreszenzstrahlung und ein Kameramodul unterteilt, wobei das Substratträgermodul insbesondere zur Aufnahme großflächiger Substrate und zum fortlaufend aufeinanderfolgenden Verarbeiten mehrerer Substrate eine Substratverschiebeeinheit enthält.Excitation light, a module for light coupling and beam expansion, a substrate carrier module, an imaging module for the fluorescence radiation and a camera module, wherein the substrate carrier module contains a substrate displacement unit in particular for receiving large-area substrates and for continuously processing several substrates one after the other.
Der Grundgedanke der Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß die im Stand der Technik der Fluoreszenzanalyse geltende Empfehlung, die Übertragung des sehr schwachen Fluoreszenzlichts auf den Empfänger mit möglichst hochaperturigen Objektiven zu realisieren, nicht in jedem Fall günstig ist. Wie sich in theoretischen und experimentellen Ergebnissen bei der Erprobung des Kamera-Prinzips gezeigt hat, führen große Aperturwerte von realen Abbildungsoptiken bei einer quantitative Erfassung der Fluoreszenzintensitäten von kleinen und eng benachbarten Matrixelementen zu merklichem Übersprechen (Anteile der Fluoreszenzstrahlung eines bestimmten Substratpixels gelangen bei der Abbildung auf eine CCD-Matrix auch auf benachbarte Empfängerelemente, die eigentlich jeweils ausschließlich die Fluoreszenzintensität eines benachbarten Substratpixels erfassen sollten).
Insbesondere bei einer hohen Objektivapertur führt das Übersprechen zu einer solchen Beeinflussung der Fluoreszenzmessungen, daß diese Verfälschung der einzelnen Probenmeßwerte für quantitative Fluoreszenzanalysen nicht tolerierbar ist. Die Lösung dieses Problems wird gemäß der Erfindung erreicht, indem die vorgegebene Apertur eines vergrößernd abbildenden Objektivs in einem solchen Umfang beschränkt wird, daß das Übersprechen der Fluoreszenzstrahlung ausreichend unterdrückt wird. Dabei hängt das Ausmaß der Reduzierung der Apertur im wesentlichen vom Korrektionsgrad des Objektivs gegenüber Abbildungsfehlern (Aberrationen) ab. So sind bei Einsatz von (in der Regel gut korrigierten) Mikroobjektiven Reduzierungen unter 30% völlig ausreichend, während bei Fotoobjektiven Aperturreduzierungen bis 50%, teilweise sogar bis zu 65%, vonnöten sind, um das Übersprechen ausreichend zu unterbinden.The basic idea of the invention is based on the knowledge that the recommendation in the state of the art of fluorescence analysis to transmit the very weak fluorescent light to the receiver using lenses with the highest possible aperture is not always favorable. As has been shown in theoretical and experimental results when testing the camera principle, large aperture values of real imaging optics lead to noticeable crosstalk when quantitatively recording the fluorescence intensities of small and closely adjacent matrix elements (parts of the fluorescence radiation of a certain substrate pixel also reach neighboring receiver elements when imaging on a CCD matrix, which should actually only record the fluorescence intensity of a neighboring substrate pixel).
Particularly with a high objective aperture, crosstalk influences the fluorescence measurements to such an extent that this falsification of the individual sample measurement values is intolerable for quantitative fluorescence analyses. The solution to this problem is achieved according to the invention by limiting the specified aperture of a magnifying objective to such an extent that the crosstalk of the fluorescence radiation is sufficiently suppressed. The extent of the aperture reduction depends essentially on the degree of correction of the objective against imaging errors (aberrations). When using (usually well-corrected) micro objectives, reductions of less than 30% are completely sufficient, while with photo objectives, aperture reductions of up to 50%, sometimes even up to 65%, are necessary to sufficiently prevent crosstalk.
Nicht nur im letzteren Fall geht mit der Aperturverringerung auch eine erhebliche Lichtschwächung der Fluoreszenzstrahlung einher, die durch geeignete Maßnahmen bei der Beleuchtung der Substrate kompensiert werden muß. Dazu wird den unterschiedlichen verwendeten Fluoreszenzstoffen bezüglich deren spezifischer optimaler Anregungswellenlänge und einer gleichmäßig intensiven Anregung bei den unterschiedlichen Anregungswellenlängen Rechnung getragen durch Verwendung einer geeigneten kontinuierlich intensiven Lichtquelle, Übertragungsmedien mit entsprechend hoherNot only in the latter case, the aperture reduction is accompanied by a considerable attenuation of the fluorescence radiation, which must be compensated by suitable measures when illuminating the substrates. For this purpose, the different fluorescent substances used are taken into account with regard to their specific optimal excitation wavelength and a uniformly intensive excitation at the different excitation wavelengths by using a suitable continuously intensive light source, transmission media with a correspondingly high
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Transmission und abgestimmten spektralen Charakteristiken von Beleuchtung und Empfänger. Für die letztere Maßnahme werden die spektrale Emission der Beleuchtungseinrichtung und die spektrale Empfindlichkeit des Empfängers so aufeinander abgestimmt, daß deren Produkt über einen für die zu detektierenden Fluoreszenzstoffe erforderlichen Wellenlängenbereich annähernd eine Konstante ergibt. Zu erwähnen ist in diesem Zusammenhang, daß - genau genommen - das Produkt aus der spektralen Emission der Beleuchtung auf der Anregungswellenlänge und der spektralen Empfindlichkeit des Empfängers auf der Emissionswellenlänge der Fluoreszenz eine Konstante ergeben müßte. Da die Anregungswellenlänge und die Fluoreszenzwellenlängen der gebräuchlichen Fluoreszenzfarbstoffe jedoch nur um einige 10 nm auseinanderliegen, kann diese kleine Ungenauigkeit außer Betracht bleiben, wenn das Produkt der spektralen Charakteristika über den gesamten benötigten Wellenlängenbereich ausreichend konstant ist.Transmission and coordinated spectral characteristics of illumination and receiver. For the latter measure, the spectral emission of the illumination device and the spectral sensitivity of the receiver are coordinated in such a way that their product is approximately constant over a wavelength range required for the fluorescent substances to be detected. It should be mentioned in this context that - strictly speaking - the product of the spectral emission of the illumination at the excitation wavelength and the spectral sensitivity of the receiver at the emission wavelength of the fluorescence should be constant. However, since the excitation wavelength and the fluorescence wavelengths of the common fluorescent dyes are only a few tens of nm apart, this small inaccuracy can be ignored if the product of the spectral characteristics is sufficiently constant over the entire required wavelength range.
Mit der erfindungsgemäßen Anordnung ist es somit möglich, das Übersprechen der Fluoreszenzstrahlung benachbarter Substratpixel auf dem Empfänger zu minimieren und die dabei zwangsläufig eintretenden Einbußen an detektierter Fluoreszenzintensität durch effizientere Beleuchtung der untersuchten Substratpixel zu kompensieren. Somit wird ein quantitatives Auslesen von Fluoreszenzstrahlung realisiert, bei dem jede einzelne auf einem Probenträger mit einer Vielzahl von Einzelproben befindliche Probensubstanz mit großer Empfindlichkeit bezüglich der Menge des enthaltenen Fluoreszenzstoffes analysiert werden kann und dessen Ergebnisse gerade auch bei Anwendung verschiedener Fluoreszenzstoffe untereinander vergleichbar sind.With the arrangement according to the invention, it is thus possible to minimize the crosstalk of the fluorescence radiation of neighboring substrate pixels on the receiver and to compensate for the inevitable loss of detected fluorescence intensity by more efficient illumination of the substrate pixels being examined. This enables quantitative reading of fluorescence radiation, in which each individual sample substance on a sample carrier with a large number of individual samples can be analyzed with great sensitivity with regard to the amount of the fluorescent substance contained and whose results are comparable with one another, especially when using different fluorescent substances.
Die Erfindung soll nachstehend anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert werden. Die Zeichnungen zeigen:The invention will be explained in more detail below using an embodiment. The drawings show:
Fig 1: eine Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Anordnung in modularer Bauweise,Fig. 1: an embodiment of the arrangement according to the invention in modular construction,
Fig. 2: eine Intensitätsverteilung der Fluoreszenzstrahlung eines Substratpixels bei der Abbildung auf den Empfänger ohne die Reduzierung der Apertur des Objektivs,Fig. 2: an intensity distribution of the fluorescence radiation of a substrate pixel when imaged onto the receiver without reducing the aperture of the objective,
Fig.3: eine Intensitätsverteilung der Fluoreszenzstrahlung eines Substratpixels bei der Abbildung auf den Empfänger mit reduzierter Apertur des Objektivs,Fig.3: an intensity distribution of the fluorescence radiation of a substrate pixel when imaged onto the receiver with reduced aperture of the objective,
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Fig. 4: eine Darstellung der spektralen Charakteristika von Lichtquelle, Flüssigkeitslichtleiter und EmpfängerFig. 4: a representation of the spectral characteristics of the light source, liquid light guide and receiver
Die erfindungsgemäße Anordnung besteht, wie Fig. 1 entnehmbar, in ihrem Grundaufbau aus einer Lichtquelleneinheit (nicht dargestellt), die über einen angekoppelten Lichtleiter 1 spektral an den verwendeten Fluoreszenzstoff angepaßtes Anregungslicht bereitstellt, einer Beleuchtungsoptik 23, einem Substrat 32, einer Übertragungsoptik 43 mit einer beschränkenden Aperturblende 42 und einem Empfänger in Form einer CCD-Kamera 51.The arrangement according to the invention consists, as can be seen in Fig. 1, in its basic structure of a light source unit (not shown) which provides excitation light spectrally adapted to the fluorescent substance used via a coupled light guide 1, an illumination optics 23, a substrate 32, a transmission optics 43 with a restricting aperture stop 42 and a receiver in the form of a CCD camera 51.
Die Gesamtheit der optischen Komponenten ist in Modulen aufgebaut, in einem Lichtquellenmodul mit angeschlossenem Lichtleiter 1 zur Bereitstellung des Anregungslichts, einem Beleuchtungsmodul 2 zur Lichteinkopplung und Strahlaufweitung, einem Substratträgermodul 3 und einem Abbildungsmodul 4 für die Abbildung der vom Substrat 32 erzeugten Fluoreszenzstrahlung auf die in einem Kameramodul 5 enthaltene CCD-Kamera 51. Der Modulaufbau ermöglicht die einfache Anpassung der erfindungsgemäßen Anordnung an spezielle Anforderungen zur Analyse verschiedenster Substrate 32, die von Nanotiterplatten über getupfte Objektträger aus Glas (spotted glass slides) bis zu Bio-Chips mit mehreren zehntausend Spots reichen können. Der in Fig. 1 skizzierte Aufbau geht - ohne Beschränkung der Allgemeinheit - von einem Substrat 32 in Form eines Bio-Chips mit 20.000 Spots aus, bei denen ein Bio-Chip 32 jeweils als Ganzes ausgelesen werden kann und eine Substratbewegung mit Hilfe einer Substratverschiebeeinheit 33 lediglich zum Einbringen des nächsten Bio-Chips 32 vonnöten ist.The entirety of the optical components is constructed in modules, in a light source module with a connected light guide 1 for providing the excitation light, an illumination module 2 for coupling in light and beam expansion, a substrate carrier module 3 and an imaging module 4 for imaging the fluorescence radiation generated by the substrate 32 onto the CCD camera 51 contained in a camera module 5. The modular structure enables the arrangement according to the invention to be easily adapted to special requirements for the analysis of a wide variety of substrates 32, which can range from nanotiter plates to spotted glass slides to biochips with several tens of thousands of spots. The structure outlined in Fig. 1 is based - without loss of generality - on a substrate 32 in the form of a bio-chip with 20,000 spots, in which a bio-chip 32 can be read out as a whole and a substrate movement with the aid of a substrate displacement unit 33 is only necessary to introduce the next bio-chip 32.
Das aus dem Lichtleiter 1 austretende Beleuchtungslicht wird von der Beleuchtungsoptik 23 aufgenommen und zur Ausleuchtung des Bio-Chips 32 übertragen. Dazu sorgt eine geeignete Lichtleiterhalterung 22 am Eingang des dem Lichtquellenmodul nachgeordneten Beleuchtungsmoduls 2 zur Lichteinkopplung und Strahlformung für eine ordnungsgemäße Arretierung und Justierung des Lichtleiters 1 gegenüber der Beleuchtungsoptik 23. Die Beleuchtungsoptik 23 realisiert bezüglich des Bio-Chips 32 ein Durchlicht-Dunkelfeldverfahren und besteht aus einem Kollektor 21 und einem Trocken-Dunkelfeldkondensor 31. Der Kollektor 21 sammelt zunächst die aus dem Lichtleiter 1 divergent austretende Lichtquellenstrahlung, bevor der Dunkelfeldkondensor 31 eine ringförmige Beleuchtung derart realisiert, daß der innere Aperturwinkel der Beleuchtung deutlich größer als der vorgegebene Aperturwinkel des Objektivs 41 der Übertragungsoptik 43 ist. Der vergrößerte Aperturwinkel des Dunkelfeldkondensors 31 dient der AussparungThe illumination light emerging from the light guide 1 is received by the illumination optics 23 and transmitted to illuminate the bio-chip 32. For this purpose, a suitable light guide holder 22 at the entrance of the lighting module 2 arranged downstream of the light source module for light coupling and beam shaping ensures that the light guide 1 is properly locked and adjusted relative to the illumination optics 23. The illumination optics 23 implements a transmitted light dark field process with respect to the bio-chip 32 and consists of a collector 21 and a dry dark field condenser 31. The collector 21 first collects the light source radiation emerging divergently from the light guide 1 before the dark field condenser 31 implements an annular illumination such that the inner aperture angle of the illumination is significantly larger than the predetermined aperture angle of the objective 41 of the transmission optics 43. The enlarged aperture angle of the dark field condenser 31 serves to
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von durch den Bio-Chip 32 hindurchtretender, gebeugter Anregungsstrahlung, so daß diese nicht in die Apertur des Objektivs 41 eintreten kann. Des weiteren ist zur Abschirmung von unerwünschtem Streulicht beliebiger Genese eine geeignet geformte Streulichtblende 34 vor dem Objektiv 41 angebracht.of diffracted excitation radiation passing through the bio-chip 32, so that it cannot enter the aperture of the objective 41. Furthermore, a suitably shaped stray light shield 34 is mounted in front of the objective 41 to shield against unwanted stray light of any origin.
Die im Bio-Chip 32 enthaltenen Fluoreszenzstoffe geben infolge der über den Dunkelfeldkondensor 31 indirekt einfallenden Anregungsstrahlung Fluoreszenzstrahlung ab, die für jedes einzelne Substratpixel des Bio-Chips 32 quantitativ erfaßt werden soll. Dazu ist eine exakte Zuordnung der Abbildung der Fluoreszenzstrahlung jedes einzelnen Substratpixels zu einer bestimmten Gruppe von Empfängerelementen der CCD-Kamera 51 realisiert, wobei ein Übersprechen der von einem bestimmten Substratpixel des Bio-Chips 32 stammenden Fluoreszenzstrahlung auf nicht zugeordnete Empfängerpixel der CCD-Kamera 51 wegen der Meßwertverfälschung weitgehend ausgeschlossen werden muß.
Zur gleichzeitigen Erfassung möglichst vieler (hier sogar aller) Substratpixel des auszulesenden Bio-Chips 32 wird in Übereinstimmung mit der allgemeinen Lehre der Fluoreszenzanalyse die optische Abbildung mit einem hochaperturigen Mikroobjektiv 41 (z.B. Mikroobjektiv 10 &khgr; 0,2 der Reihe EPIPLAN®) realisiert. Um das oben erwähnte Übersprechen der Fluoreszenzstrahlung zu unterdrücken, ist eine zusätzliche Aperturblende 42 in der außerhalb des Objektivs 41 liegenden Aperturblendenebene (gegebenenfalls auch in einer konjugierten Ebene) angebracht, die die angegebene Apertur des Mikroobjektivs 41 auf 0,16 bis 0,15 (um ca. 25%) reduziert. Die zusätzliche Aperturblende 42 wird, wie in Fig. 1 für ein als Beispiel angegebenes Mikroobjektiv 41 mit außerhalb liegender Aperturblendenebene dargestellt, am einfachsten in die Anschraubfassung des Objektives 41 integriert und kann damit bei der Fertigung des feststehenden Teils des Tubus 45 berücksichtigt werden.
Die Wirkung der zusätzlichen Aperturblende 42 ist bei vergleichender Betrachtung der Figuren 2 und 3 deutlich zu erkennen. Die Figuren 2 und 3 zeigen den Effekt, daß sich bei kleinerer Apertur die Fluoreszenzenergie besser auf das Empfängerelement und dessen unmittelbare Umgebung konzentrieren läßt. Das heißt, daß die bei großer numerischer Apertur des Objektivs 41 (gemäß Fig. 2) „gewonnene" Fluoreszenzenergie nicht nur zu einem guten Teil nicht vom zugeordneten Empfängerelement genutzt werden kann, sondern sogar noch zu einer Verfälschung der Meßwerte der benachbarten Empfängerelemente führt. Folglich ist beim Auslesen (gemäß dem sogenannten Kamera-Prinzip) von kleinen und eng benachbarten fluoreszierenden Elementen eines Bio-Chips 32 die Forderung nach einer möglichst großen Abbildungsapertur für eine quantitative Fluoreszenzanalyse nicht unbedingt sinnvoll. Dies ist im wesentlichen darauf zurückzuführen, daß bei realen optischThe fluorescent substances contained in the bio-chip 32 emit fluorescent radiation as a result of the excitation radiation incident indirectly via the dark field condenser 31, which is to be quantitatively recorded for each individual substrate pixel of the bio-chip 32. For this purpose, an exact assignment of the image of the fluorescent radiation of each individual substrate pixel to a specific group of receiver elements of the CCD camera 51 is implemented, whereby crosstalk of the fluorescent radiation originating from a specific substrate pixel of the bio-chip 32 to unassigned receiver pixels of the CCD camera 51 must be largely excluded due to the falsification of the measured values.
In order to simultaneously capture as many (here even all) substrate pixels as possible of the biochip 32 to be read, the optical imaging is carried out using a high-aperture micro-objective 41 (e.g. micro-objective 10 x 0.2 of the EPIPLAN® series) in accordance with the general teaching of fluorescence analysis. In order to suppress the above-mentioned crosstalk of the fluorescence radiation, an additional aperture diaphragm 42 is mounted in the aperture diaphragm plane outside the objective 41 (possibly also in a conjugated plane), which reduces the specified aperture of the micro-objective 41 to 0.16 to 0.15 (by approx. 25%). The additional aperture stop 42 is most easily integrated into the screw-on mount of the objective 41, as shown in Fig. 1 for an example micro objective 41 with an external aperture stop plane, and can thus be taken into account when manufacturing the fixed part of the tube 45.
The effect of the additional aperture stop 42 can be clearly seen when comparing Figures 2 and 3. Figures 2 and 3 show the effect that with a smaller aperture the fluorescence energy can be better concentrated on the receiver element and its immediate surroundings. This means that the fluorescence energy "gained" with a large numerical aperture of the objective 41 (according to Figure 2) not only cannot be used to a large extent by the assigned receiver element, but even leads to a falsification of the measured values of the neighboring receiver elements. Consequently, when reading out (according to the so-called camera principle) small and closely adjacent fluorescent elements of a bio-chip 32, the requirement for the largest possible imaging aperture for a quantitative fluorescence analysis is not necessarily sensible. This is essentially due to the fact that with real optical
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abbildenden Elementen stets Abbildungsfehler (Aberrationen) vorhanden sind, die nicht oder nicht ausreichend korrigiert sind und somit das Fluoreszenzlicht der einzelnen Substratpixel untereinander vermischen (überlagern). Dagegen ist gemäß Fig. 3 aufgrund der Reduzierung der Apertur des eingesetzten Mikroobjektivs 41 mittels der zusätzlichen Aperturblende 42 die Fluoreszenzlicht-„Streuung" deutlich verringert gegenüber der Intensitätsverteilung bei normaler (voller) Apertur desselben Objektivs 41, wie sie für die Aufnahme von Fig. 2 vorhanden war.imaging elements always have imaging errors (aberrations) that are not or not sufficiently corrected and thus mix (overlay) the fluorescent light of the individual substrate pixels. In contrast, according to Fig. 3, due to the reduction of the aperture of the micro objective 41 used by means of the additional aperture diaphragm 42, the fluorescent light "scattering" is significantly reduced compared to the intensity distribution with a normal (full) aperture of the same objective 41, as was present for the image in Fig. 2.
Generell ist der Betrag der Reduzierung der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs einerseits von der numerischen Apertur selbst und andererseits - in wesentlich größerem Maße - vom Korrektionsgrad der Abbildungsfehler des Objektivs abhängig. Bei gängigen Mikroobjektiven mit einer numerischen Apertur zwischen 0,2 bis 0,25 ist reicht in der Regel eine Verringerung der numerischen Apertur um 15 bis 30%, um ein Übersprechen von Fluoreszenzlicht auf benachbarte Pixel ausreichend zu unterdrücken. Zum Vergleich sei angemerkt, daß beim Einsatz guter Fotoobjektive mit ähnlichen Aperturwerten eine Reduzierung um bis zu 50%, teilweise sogar bis zu 65% erforderlich ist, um das Übersprechen, wie in Fig. 3 dargestellt, hinreichend zu vermindern.In general, the amount of reduction in the numerical aperture of the lens used depends on the numerical aperture itself and, to a much greater extent, on the degree of correction of the lens's imaging errors. For common micro lenses with a numerical aperture of between 0.2 and 0.25, a reduction in the numerical aperture of 15 to 30% is usually sufficient to adequately suppress crosstalk of fluorescent light to neighboring pixels. For comparison, it should be noted that when using good photo lenses with similar aperture values, a reduction of up to 50%, sometimes even up to 65%, is necessary to adequately reduce the crosstalk, as shown in Fig. 3.
Das in den Substratpixeln des Bio-Chips 32 angeregte Fluoreszenzlicht wird zu einem Teil vom Mikroobjektiv 41 erfaßt, durch die zusätzliche Aperturblende 42 begenzt und über nachfolgende optische Elemente auf die CCD-Kamera 51 abgebildet. Da das verwendete Mikroobjektiv 41 den Bio-Chip 32 ins Unendliche abbildet, ist die Übertragungsoptik 43 mit einer Tubuslinse 44 komplettiert, die über einen einstellbaren Tubus 45 und eine Kamera-Adapteroptik 52 für eine scharfe Abbildung der Substratpixel des Bio-Chips 32 in die Ebene der Empfängerelemente der CCD-Kamera 51 sorgt. Mit dem Tubus 45 und der darin befindlichen Tubuslinse 43 wird eine Abbildung so realisiert, daß jedem Substratpixel eindeutig eine Gruppe von Empfängerelementen (z.B. 4, 9, 16 oder 25) der CCD-Kamera 51 zugeordnet ist. Die optischen Abstände der genannten Elemente, Mikroobjektiv 41, Tubuslinse 44 und Kamera-Adapteroptik 52, sind im Tubus 45 in gewissen Grenzen noch frei wählbar, da im Gegensatz zu einem herkömmlichen Mikroskop-Strahlengang, bei dem chromatische Abbildungsfehler in der Regel lediglich im Zusammenwirken der gesamten Abbildungsoptik korrigiert sind, die Abbildung nur für einen engen chromatischen Bereich der Fluoreszenzstrahlung realisiert werden muß.The fluorescent light excited in the substrate pixels of the bio-chip 32 is partially captured by the micro-objective 41, limited by the additional aperture diaphragm 42 and imaged onto the CCD camera 51 via subsequent optical elements. Since the micro-objective 41 used images the bio-chip 32 to infinity, the transmission optics 43 are completed with a tube lens 44, which, via an adjustable tube 45 and a camera adapter optics 52, ensures a sharp image of the substrate pixels of the bio-chip 32 in the plane of the receiver elements of the CCD camera 51. With the tube 45 and the tube lens 43 located therein, an image is created in such a way that each substrate pixel is clearly assigned to a group of receiver elements (e.g. 4, 9, 16 or 25) of the CCD camera 51. The optical distances of the above-mentioned elements, micro objective 41, tube lens 44 and camera adapter optics 52, can still be freely selected within certain limits in the tube 45, since, in contrast to a conventional microscope beam path, in which chromatic imaging errors are usually only corrected in the interaction of the entire imaging optics, the imaging only has to be realized for a narrow chromatic range of the fluorescence radiation.
Innerhalb des Tubus 45 ist weiterhin ein (möglichst direkt dem Empfänger vorgeordnetes) Filter 46 zum Durchlassen der Fluoreszenzstrahlung und Blockieren der AnregungsstrahlungInside the tube 45 there is also a filter 46 (preferably arranged directly in front of the receiver) for letting through the fluorescence radiation and blocking the excitation radiation
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vor der Tubuslinse 44 angebracht, das je nach Fluoreszenzfarbstoff im Bio-Chip 32 entsprechend der nachzuweisenden Fluoreszenzwellenlänge austauschbar ist.in front of the tube lens 44, which is exchangeable depending on the fluorescent dye in the bio-chip 32 according to the fluorescence wavelength to be detected.
Der Kameramodul 5 enthält eine (z.B. mit Peltierelement) gekühlte CCD-Kamera 51, um durch Unterdrückung thermischen Rauschens auch bei langen Integrationszeiten des CCD (von einigen Sekunden bis zu einigen Minuten) ein großes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen. Somit können auch auf diesem Wege die Verluste an Fluoreszenzenergie, die aus der verringerten Objektivapertur resultieren, durch Verlängerung der Integrationszeit der CCD-Kamera 51 zumindestens teilweise ausgeglichen werden.The camera module 5 contains a cooled CCD camera 51 (e.g. with a Peltier element) in order to achieve a high signal-to-noise ratio by suppressing thermal noise even with long integration times of the CCD (from a few seconds to a few minutes). In this way, the losses in fluorescence energy resulting from the reduced objective aperture can be at least partially compensated by extending the integration time of the CCD camera 51.
Aufgrund des erwünschten großen Probendurchsatzes bei der Fluoreszenzanalyse von Bio-Chips sind jedoch lange Integrationszeiten nur bedingt vertretbar, so daß die - infolge der mittels zusätzlicher Aperturblende 42 reduzierten Apertur des Objektivs 41 - eintretende Schwächung der auf die CCD-Kamera 51 einfallenden Fluoreszenzstrahlung durch weitere geeignete Maßnahmen kompensiert werden muß.However, due to the desired high sample throughput in the fluorescence analysis of biochips, long integration times are only partially acceptable, so that the attenuation of the fluorescence radiation incident on the CCD camera 51 - as a result of the aperture of the objective 41 being reduced by means of an additional aperture diaphragm 42 - must be compensated by further suitable measures.
Dabei stellt sich als erste wirkungsvolle Maßnahme eine besser zugeschnittene Anpassung der Anregungsstrahlung an die Anregungswellenlänge der Fluoreszenzstoffe dar. Die Schwierigkeit besteht allerdings darin, alle gängigen Fluoreszenzfarbstoffe, die bei der Bio-Chip-Analyse zum Nachweis bestimmter Inhaltsstoffe (z.B. DNA-Sequenzen) eingesetzt werden und unterschiedliche Anregungswellenlängen haben, mit gleicher Intensität anzuregen und damit die Fluoreszenzmessungen verschiedener Substrate auch bei Verwendung unterschiedlicher Fluoreszenzstoffe vergleichbar zu machen. Deshalb wird eine intensive Lichtquelle mit kontinuierlichem Spektrum, z.B. eine Halogenlampe, verwendet. Die emittierte Strahlung der Halogenlampe kann in an sich bekannter Weise mittels eines Anregungsfilters, welches schmalbandig für die optimale Anregungswellenlänge des im Biochip 32 verwendeten Fluoreszenzfarbstoffes durchlässig ist, dann bei nahezu gleichbleibender Intensität für beliebige Fluoreszenzstoffe frei gewählt werden.The first effective measure is a better tailored adaptation of the excitation radiation to the excitation wavelength of the fluorescent substances. The difficulty, however, is to excite all common fluorescent dyes that are used in bio-chip analysis to detect certain ingredients (e.g. DNA sequences) and have different excitation wavelengths with the same intensity and thus make the fluorescence measurements of different substrates comparable even when using different fluorescent substances. Therefore, an intensive light source with a continuous spectrum, e.g. a halogen lamp, is used. The radiation emitted by the halogen lamp can be freely selected in a conventional manner using an excitation filter that is narrow-band permeable for the optimal excitation wavelength of the fluorescent dye used in the biochip 32, and then at almost the same intensity for any fluorescent substance.
Eine zweite die meßbare Fluoreszenzintensität der Subtratpixel des Bio-Chips 32 fördernde Maßnahme liegt in der Anpassung der spektralen Charakteristika der Beleuchtung und des Empfängers. Dazu sind - bei Zugrundelegung der speziellen Ausführung der Erfindung gemäß Fig. 1 - beleuchtungsseitig die spektrale Emission der Lichtquelle und die spektrale Transmission des Lichtleiters 1 und empfangsseitig die spektrale Empfindlichkeit der CCD-A second measure that promotes the measurable fluorescence intensity of the substrate pixels of the bio-chip 32 is the adaptation of the spectral characteristics of the illumination and the receiver. For this purpose - based on the special embodiment of the invention according to Fig. 1 - on the illumination side, the spectral emission of the light source and the spectral transmission of the light guide 1 and on the receiving side, the spectral sensitivity of the CCD
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Kamera 51 so gestaltet, daß das Produkt dieser Größen über den Bereich der erforderlichen Anregungs- und Fluoreszenzwellenlängen nahezu eine Konstante ergibt. Fig. 4 zeigt die Ergebnisse, wie sie für die im Beispiel verwendete Halogenlampe, den Lichtleiter 1 in Form eines Flüssigkeitslichtleiters vom Typ LUMATEC Ser. 380 und die CCD-Kamera 51 mit einem CCD-Chip vom Typ FT 1010 erzielt wurden.Camera 51 is designed so that the product of these quantities is almost constant over the range of the required excitation and fluorescence wavelengths. Fig. 4 shows the results obtained for the halogen lamp used in the example, the light guide 1 in the form of a liquid light guide of the type LUMATEC Ser. 380 and the CCD camera 51 with a CCD chip of the type FT 1010.
Genau genommen müßte eigentlich das Produkt aus der spektralen Emission der Lichtquelle und der spektralen Transmission des Lichtleiters 1 auf der Anregungswellenlänge sowie der spektralen Empfindlichkeit des Empfängers auf der Emissionswellenlänge der Fluoreszenzstrahlung eine Konstante ergeben. Da jedoch die Anregungswellenlängen und die zugehörigen Fluoreszenzwellenlängen der gebräuchlichen Fluoreszenzfarbstoffe nur um einige 10 nm auseinanderliegen, kann diese kleine Ungenauigkeit außer Betracht bleiben, wenn das Produkt der spektralen Charakteristika über den gesamten benötigten Wellenlängenbereich ausreichend konstant ist.
Die vorgenannten Maßnahmen zur Verbesserung der Fluoreszenzlichtausbeute bei 5 erfindungsgemäß reduzierter wirksamer Apertur des Objektivs 41 ermöglichen es, die für eine quantitative Auswertung jedes Substratpixels notwendige Fluoreszenzlichtmenge auf den Empfängerelementen der CCD-Kamera 51 zu erreichen, ohne bei der Fluoreszenzauslesung eine Verringerung des Chip-Durchsatzes aufgrund von erheblich erhöhten CCD-Integrationszeiten in Kauf nehmen zu müssen.Strictly speaking, the product of the spectral emission of the light source and the spectral transmission of the light guide 1 at the excitation wavelength and the spectral sensitivity of the receiver at the emission wavelength of the fluorescent radiation should result in a constant. However, since the excitation wavelengths and the corresponding fluorescence wavelengths of the common fluorescent dyes are only a few tens of nm apart, this small inaccuracy can be ignored if the product of the spectral characteristics is sufficiently constant over the entire required wavelength range.
The aforementioned measures for improving the fluorescence light yield with a reduced effective aperture of the objective 41 according to the invention make it possible to achieve the amount of fluorescence light required for a quantitative evaluation of each substrate pixel on the receiver elements of the CCD camera 51 without having to accept a reduction in the chip throughput during fluorescence reading due to significantly increased CCD integration times.
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Claims (18)
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE29913701U DE29913701U1 (en) | 1999-08-02 | 1999-08-02 | Arrangement for detecting the fluorescence radiation from matrix-shaped sample carriers |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE29913701U DE29913701U1 (en) | 1999-08-02 | 1999-08-02 | Arrangement for detecting the fluorescence radiation from matrix-shaped sample carriers |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE29913701U1 true DE29913701U1 (en) | 1999-11-04 |
Family
ID=8077143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE29913701U Expired - Lifetime DE29913701U1 (en) | 1999-08-02 | 1999-08-02 | Arrangement for detecting the fluorescence radiation from matrix-shaped sample carriers |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE29913701U1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10145221A1 (en) * | 2001-09-13 | 2003-04-10 | Lavision Biotec Gmbh | Apparatus for detecting luminescence from micro-arrays, comprises directing white light at the micro-array through an optical system and optically gathering the emitted fluorescence at a detector to be digitized for processing |
| DE10005844A1 (en) * | 2000-02-10 | 2004-07-22 | Andresen, Karin | Optical detection of binding between biological test material and material on biochip, including removing dot formed by hybridization from biochip by dissolution before analysis using UV irradiation |
-
1999
- 1999-08-02 DE DE29913701U patent/DE29913701U1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10005844A1 (en) * | 2000-02-10 | 2004-07-22 | Andresen, Karin | Optical detection of binding between biological test material and material on biochip, including removing dot formed by hybridization from biochip by dissolution before analysis using UV irradiation |
| DE10145221A1 (en) * | 2001-09-13 | 2003-04-10 | Lavision Biotec Gmbh | Apparatus for detecting luminescence from micro-arrays, comprises directing white light at the micro-array through an optical system and optically gathering the emitted fluorescence at a detector to be digitized for processing |
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