DE29824556U1

DE29824556U1 - Formulation with papillomavirus-specific protein

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Publication number: DE29824556U1
Application number: DE29824556U
Authority: DE
Original assignee: Medigene AG
Current assignee: Medigene AG
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1998-03-24
Publication date: 2001-08-23
Anticipated expiration: 2008-03-25

Description

Formulierung mit Papillomavirus-spezifischem ProteinFormulation with papillomavirus-specific protein

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Formulierung enthaltend mindestens ein Papillomavirusspezifisches Protein mit ca. 0,3 bis ca. 4 M eines Salzes bei einem pH-Wert von ca. 7,3 bis ca.The present invention relates to a formulation containing at least one papillomavirus-specific protein with about 0.3 to about 4 M of a salt at a pH of about 7.3 to about 10.

7,45.7.45.

Die Papiilomaviren, auch Warzenviren genannt, sind doppelsträngige DNA-Viren mit einer Genomgröße von etwa 8000 Basenpaaren und einem Ikosaeder-förmigen Kapsiel mit einem Durchmesser von ca. 55 nm. Bis heute sind mehr als 100 verschiedene humane Papillomavirustypen bekannt, von denen einige, z.B. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 oder HPV-58, bösartige Tumore und andere, z.B. HPV-6, HPV-11 oder HPV-42, gutartige Tumore verursachen können.The papillomaviruses, also called wart viruses, are double-stranded DNA viruses with a genome size of about 8000 base pairs and an icosahedron-shaped capsule with a diameter of about 55 nm. To date, more than 100 different human papillomavirus types are known, some of which, e.g. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 or HPV-58, can cause malignant tumors and others, e.g. HPV-6, HPV-11 or HPV-42, can cause benign tumors.

Das Genom der Papiilomaviren läßt sich in drei Bereiche unterteilen: Der erste Bereich betrifft eine nicht-kodierende Region, die Regulationselemente für die Transkription und Replikation des Virus enthält. Die zweite Region, sogenannte E-(Early)Region enthält verschiedene Proteinkodierende Abschnitte E1-E7, von denen z.B. das E6- und das E7-Protein für die Transformation von Epithelzellen verantwortlich sind und das El-Protein die DNA-Kopienzahl kontrolliert. Bei der E6- und E7-Region handelt es sich um sogenannte Onkogene, die auch in bösartig entarteten Zellen exprimiert werden. Die dritte Region, auch L-(Late)Region genannt, enthält zwei Proteinkodierende Abschnitte Ll und L2, die für Strukturkomponenten des Viru-scapsids kodieren. Das Ll-Protein ist zu über 90% im viralen Capsid vorhanden, wobei das Verhältnis von L1:L2 im allgemeinen 30:1 ist.The genome of the papillomaviruses can be divided into three regions: The first region is a non-coding region that contains regulatory elements for the transcription and replication of the virus. The second region, the so-called E (early) region, contains various protein-coding sections E1-E7, of which the E6 and E7 proteins are responsible for the transformation of epithelial cells and the El protein controls the number of DNA copies. The E6 and E7 regions are so-called oncogenes that are also expressed in malignant cells. The third region, also called the L (late) region, contains two protein-coding sections Ll and L2, which code for structural components of the viral capsid. The Ll protein accounts for over 90% of the viral capsid, with the ratio of L1:L2 generally being 30:1.

HPV-6 und HPV-11 werden u.a. für Genitalwarzen verantwortlich gemacht, einige Papülomavirustypen wie HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 undHPV-6 and HPV-11 are responsible for genital warts, among others, some papular virus types such as HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 and

HPV-58 sind mit bösartigen Tumoren des anogenitalen Traktes assoziiert. In über 50% der Fälle wird HPV-16 mit dem Gebärmutterhalskrebs (Cervixcarcinom) in Verbindung gebracht. HPV-16 ist der Hauptrisikofaktor für die Ausbildung von cervicalen Neoplasien. Daneben spielt das Immunsystem eine wichtige Rolle beim Fortschritt der Krankheit. So sind vermutlich zelluläre Immunantworten und insbesondere Antigen-spezifische T-Lymphozyten wichtig für den Abwehrmechanismus. Es wurde weiterhin gefunden, daß in hochgradigen cervicalen intraepithelialen Neoplasien (CIN II/III) und cervicalem Tumor das E7-Gen konstitvitiv in allen Schichten des infizierten Epithels exprimiert wird. Daher wird das E7-Protein als potentielles Tumorantigen und als Zielmolekül für aktivierte T-Zellen betrachtet. Die E7-induzierte zelluläre Immunantwort im Patienten ist aber anscheinend nicht stark genug, um den Krankheitsverlauf zu beeinflussen. Die Immunantwort kann evtl. durch geeignete Impfstoffe verstärkt werden.HPV-58 is associated with malignant tumors of the anogenital tract. In over 50% of cases, HPV-16 is associated with cervical cancer (cervical carcinoma). HPV-16 is the main risk factor for the development of cervical neoplasia. The immune system also plays an important role in the progression of the disease. Cellular immune responses and in particular antigen-specific T lymphocytes are probably important for the defense mechanism. It has also been found that in high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN II/III) and cervical tumors, the E7 gene is constitutively expressed in all layers of the infected epithelium. The E7 protein is therefore considered a potential tumor antigen and a target molecule for activated T cells. However, the E7-induced cellular immune response in the patient is apparently not strong enough to influence the course of the disease. The immune response can possibly be enhanced by appropriate vaccines.

Es konnte nun gezeigt werden, daß die Expression des Ll-Gens bzw. die Coexpression des Ll- und L2-Gens Virus-ähnliche Partikel (VLPs) bildet. Die VLPs konnten zur Bildung von neutralisierenden Antikörpern in verschiedenen tierischen Systemen verwendet werden. Die Bildung von virus-neutralisierenden Antikörpern ist jedoch von geringerer klinischer Bedeutung, wenn die Virusinfektion bereits stattgefunden hat, da für die Eliminierung virus-infizierter Zellen eine virus-spezifische zytotoxische T-Zell(CTL)-Antwort notwendig zu sein scheint. Es wurden daher sogenannte chimäre Papillomavirus-ähnliche Partikel (CVLPs) entwickelt, die aus einem chimären Ll-E7-Protein bestehen (Müller, M. et al. (1997) Virology, 234, 93). Einige CVLPs induzieren eine E7-spezifische CTL-Antwort in Mäusen, obwohl Experimente fehlschlugen, Antikörper gegen E7 durch Immunisieren von Mäusen mit CVLPs zu induzieren (Müller, M. et al. (1997), supra). Des weiteren scheinen neutralisierende Antikörper von HPV-assoziierten Erkrankungen in Patienten die Immunantowert auf verabreichtes Ll-Protein zu limitieren (Müller, M. et al.It has now been shown that the expression of the Ll gene or the coexpression of the Ll and L2 genes forms virus-like particles (VLPs). The VLPs could be used to form neutralizing antibodies in various animal systems. However, the formation of virus-neutralizing antibodies is of less clinical importance once the virus infection has already occurred, since a virus-specific cytotoxic T cell (CTL) response appears to be necessary for the elimination of virus-infected cells. So-called chimeric papillomavirus-like particles (CVLPs) were therefore developed, which consist of a chimeric Ll-E7 protein (Müller, M. et al. (1997) Virology, 234, 93). Some CVLPs induce an E7-specific CTL response in mice, although experiments to induce antibodies against E7 by immunizing mice with CVLPs failed (Müller, M. et al. (1997), supra). Furthermore, neutralizing antibodies from HPV-associated diseases in patients appear to limit the immune response to administered Ll protein (Müller, M. et al.

(1997), supra). CVLPs sind jedoch für die Entwicklung eines Impfstoffes nach wie vor interessant, da die über MHC-Moleküle der Klasse I-präsentierten E7-Proteine von Tumorzellen Zielmoleküle von CTLs darstellen würden.(1997), supra). However, CVLPs are still of interest for vaccine development, since the E7 proteins of tumor cells presented via MHC class I molecules would represent target molecules of CTLs.

Peng et al. (1998) Virology, 240, 147 beschreiben nun CVLPs bestehend aus C-terminalverkürztem Ll des Rinderpapillomavirus (BPV) und HPV-16E749._57j welche nach Impfung von C57Bl/6-Mäusen E7-spezifische zytotoxische T-Zellen induzieren und vor dem Auswachsen E7-exprimierender Tumore schützen. Greenstone et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei.Peng et al. (1998) Virology, 240, 147 now describe CVLPs consisting of C-terminally truncated Ll of bovine papillomavirus (BPV) and HPV-16E749. _57j which, after vaccination of C57Bl/6 mice, induce E7-specific cytotoxic T cells and protect against the outgrowth of E7-expressing tumors. Greenstone et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci.

&Igr;:&Igr;:

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USA₅ 95, 1800 beschreiben CVLPs bestehend aus HPV-16Ll plus HPV-16L2 fusioniert mit dem Vollängen HPV-16E7-Protein, welche nach Immunisierung von C57Bl/6-Mäusen vor dem Auswachsen epithelialer E7-exprimierender Tumorzellen schützen, wobei jedoch z;yto-toxische T-Zellen nicht nachgewiesen wurden und somit die Induktion der Immunantwort weniger effizient erscheint.USA ₅ 95, 1800 describe CVLPs consisting of HPV-16Ll plus HPV-16L2 fused with the full-length HPV-16E7 protein, which protect against the outgrowth of epithelial E7-expressing tumor cells after immunization of C57Bl/6 mice, although cytotoxic T cells were not detected and thus the induction of the immune response appears less efficient.

Die Herstellung von VLPs bzw. CVLPs erfolgt im allgemeinen gentechnisch durch Expression der entsprechenden Gene kodierend für ein oder mehrere L-Proteine bzw. L- und Ei-Proteine in geeigneten Expressionssystemen. Die entsprechenden Gene sind beispielsweise bei Kirnbauer,The production of VLPs or CVLPs is generally carried out by genetic engineering by expressing the corresponding genes coding for one or more L proteins or L and egg proteins in suitable expression systems. The corresponding genes are described, for example, by Kirnbauer,

R. et al. (1994) J: Virol. 67, 6929-6936 beschrieben bzw. über die EMBL-Datenbank erhältlich. Die Zugangsnummern lauten z.B. für HPVl8: PAPHPVl8; für HPV31: PAPPPH31; für HPV33: PAPPPH33 oder für HPV58: PAPPPH58. Geeignete Expressionssysteme sind beispielsweise gentechnisch veränderte Hefen, z.B. Saccharomyces (cerevisiae), Pichia (pastoris), Kluyvermyces (lactis), Schizosaccharomyces (pombe) oder Hansenula (polymorpha) (Carter, J. J. et al. (1991), Virology, 182, 513), Insektenzellen, wie z.B. Trichoplusia ni High Five (siehe z.B. Müller, M. et al. (1997), supra) oder prokaryotische Zellen (siehe z.B. WO 96/11272).
Bei der Herstellung der Partikel in prokaryotischen Zellen fallen diese im allgemeinen in der Zelle aus und bilden sogenannte Einschlußkörperchen (Inclusion Bodies), die anschließend renaturiert und in Lösung gebracht werden müssen. Für die Verwendung der genteclinisch hergestellten Partikel bzw. Capside oder deren Vorstufen, den sogenannten Capsomeren, sind nach der Expression weitere Reinigungsschritte notwendig.R. et al. (1994) J: Virol. 67, 6929-6936 or are available from the EMBL database. The accession numbers are, for example, for HPV18: PAPHPV18; for HPV31: PAPPPH31; for HPV33: PAPPPH33 or for HPV58: PAPPPH58. Suitable expression systems are, for example, genetically modified yeasts, e.g. Saccharomyces (cerevisiae), Pichia (pastoris), Kluyvermyces (lactis), Schizosaccharomyces (pombe) or Hansenula (polymorpha) (Carter, JJ et al. (1991), Virology, 182, 513), insect cells, such as Trichoplusia ni High Five (see e.g. Müller, M. et al. (1997), supra) or prokaryotic cells (see e.g. WO 96/11272).
When the particles are produced in prokaryotic cells, they generally precipitate in the cell and form so-called inclusion bodies, which then have to be renatured and dissolved. In order to use the genetically produced particles or capsids or their precursors, the so-called capsomeres, further purification steps are necessary after expression.

Ein wesentliches Problem bei der Verwendung von Capsiden und Capsomeren als Arzneimittel ist deren schlechte Löslichkeit. So neigen beispielsweise Capside oder Capsomere von HPV-16 zur Aggregation, wodurch die Löslichkeit wesentlich verringert wird. Die zum Teil geringe Löslichkeit der Capside bzw. Capsomere führt nicht nur zu einem Verlust an Ausbeute, sondern auch zu einer erschwerten Anwendung als Arzneimittel oder Diagnostikum.A major problem with the use of capsids and capsomeres as drugs is their poor solubility. For example, capsids or capsomeres of HPV-16 tend to aggregate, which significantly reduces solubility. The sometimes low solubility of the capsids or capsomeres not only leads to a loss of yield, but also makes their use as drugs or diagnostic agents more difficult.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine Formulierung bereitzustellen, in der Papillomavirus-spezifische Proteine löslich sind.The object of the present invention was therefore to provide a formulation in which papillomavirus-specific proteins are soluble.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die Löslichkeit von Papillomavirusspezifischen Proteinen sowohl von der Salzkonzentration wie auch vom pH-Wert der Formulierung abhängig ist.It has now surprisingly been found that the solubility of papillomavirus-specific proteins depends on both the salt concentration and the pH value of the formulation.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Formulierung enthaltend mindestens ein spätes Protein (L-Protein) eines oder mehrerer Papillomaviren und/oder mindestens ein frühes Protein (&Egr;-Protein) eines oder mehrerer Papillomaviren und ca. 0,3 bis ca. 4 M, vorzugsweise ca. 0,4 bis ca. 3 M, insbesondere ca. 0,5 bis ca. 2 M, vor allem ca. 1 bis ca. 2 M eines Salzes bei einem pH-Wert von ca. 7,3 bis ca. 7,45, vorzugsweise ca. 7,4, sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.An object of the present invention is therefore a formulation containing at least one late protein (L protein) of one or more papilloma viruses and/or at least one early protein (ε protein) of one or more papilloma viruses and about 0.3 to about 4 M, preferably about 0.4 to about 3 M, in particular about 0.5 to about 2 M, especially about 1 to about 2 M of a salt at a pH of about 7.3 to about 7.45, preferably about 7.4, and optionally suitable additives and/or excipients.

Unter dem Begriff &ldquor;Formulierung" versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung sowohl eine erfindungsgemäße Lösung als auch eine erfindungsgemäße Suspension der genannten Papillomavirus-spezifischen Proteine, wobei immunreaktive Papillomavirus-spezifische Proteine im allgemeinen und insbesondere bei bis zu maximal ca. 5000 g nicht wesentlich sedimentieten.According to the present invention, the term "formulation" is understood to mean both a solution according to the invention and a suspension according to the invention of the said papillomavirus-specific proteins, wherein immunoreactive papillomavirus-specific proteins generally do not sediment significantly and in particular up to a maximum of about 5000 g.

Das Salz ist im allgemeinen ein Alkali- oder Erdalkalisalz, vorzugsweise ein Halogenid oder Phosphat, insbesondere ein Alkalihalogenid, vor allem NaCl und/oder KCl. Die Verwendung von NaCl ist insbesondere für die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung; bevorzugt.The salt is generally an alkali or alkaline earth salt, preferably a halide or phosphate, in particular an alkali halide, especially NaCl and/or KCl. The use of NaCl is particularly preferred for the preparation of a pharmaceutical formulation.

Der pH-Wert der Zusammensetzung wird im allgemeinen mit einem geeigneten organischen oder anorganischen Puffer eingestellt, wie z.B. vorzugsweise mit einem Phosphat-Puffer, Tris-Puffer (Tris(hydroxymethyl)-arninomethan), HEPES-Puffer ([4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethansulfonsäure) oder MOPS-Puffer (3-Morpholino-l-propansulfonsäure). Die Auswahl des jeweiligen Puffers richtet sich im allgemeinen nach der gewünschten Puffermolarilät. Phosphat-Puffer ist beispielsweise für Injektions- und Infusionslösungen geeignet.The pH of the composition is generally adjusted with a suitable organic or inorganic buffer, such as, preferably, a phosphate buffer, Tris buffer (tris(hydroxymethyl)-aminomethane), HEPES buffer ([4-(2-hydroxyethyl)-piperazino]-ethanesulfonic acid) or MOPS buffer (3-morpholino-l-propanesulfonic acid). The selection of the respective buffer generally depends on the desired buffer molarity. Phosphate buffer is suitable, for example, for injection and infusion solutions.

Für die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung als Arzneimittel oder Diagnostikum ist es besonders bevorzugt, wenn die Papülomavirus-spezifischen Proteine keine Papillomavirus-unspezifischen Epitope enthalten, da hierdurch eine Papillomavirus-unspezifische Immunantwort verringert bzw. verhindert werden kann.For the use of the composition according to the invention as a medicament or diagnostic agent, it is particularly preferred if the papillomavirus-specific proteins do not contain any papillomavirus-nonspecific epitopes, since this can reduce or prevent a papillomavirus-nonspecific immune response.

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Unter den Begriffen L-Protein und &Egr;-Protein versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl die Vollängen-Proteine wie auch deren Mutanten, wie z.B. Deletionsmutanten.For the purposes of the present invention, the terms L-protein and ε-protein refer to both the full-length proteins and their mutants, such as deletion mutants.

In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung ein deletiertes L-Protein, vorzugsweise ein deletiertes Ll- und/oder L2-Protein. Die Deletion hat den Vorteil, daß in den deletierten Bereich andere Proteine, beispielsweise Papillomavirus-spezifische E-Proteinsequenzen eingefügt werden können, wodurch sich der Anwendungsbereich der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erweitern läßt. Insbesondere bevorzugt ist ein L-Protein mit einer C-terminalen Deletion und insbesondere ein C-terminal deletiertes Ll-Protein. Die C-terminale Deletion hat den Vorteil, daß die Effizienz der Bildung virus-ähnlicher Partikel gesteigert werden kann, da das am C-Terminus lokalisierte nukleare Lokalisationssignal deletiert ist. Die C-terminale Deletion beträgt daher vorzugsweise bis zu ca. 35 Aminosäuren, insbesondere ca. 25 bis ca. 35 Aminosäuren, vor allem ca. 32 bis ca. 34 Aminosäuren. Beispielsweise ist eine 32 Aminosäuren lange C-terminale Deletion des HPV-16 Ll-Proteins und eine ca. 26 Aminosäuren lange C-terminale Deletion des BPV-I Ll-Proteins (Bovines Papillomavirus Typ 1) ausreichend, um die Bildung von virusähnlichen Partikeln um das mindestens ca. zehnfache steigern zu können.In a further preferred embodiment, the composition according to the invention contains a deleted L protein, preferably a deleted L1 and/or L2 protein. The deletion has the advantage that other proteins, for example papilloma virus-specific E protein sequences, can be inserted into the deleted region, which allows the field of application of the composition according to the invention to be expanded. An L protein with a C-terminal deletion and in particular a C-terminally deleted L1 protein is particularly preferred. The C-terminal deletion has the advantage that the efficiency of the formation of virus-like particles can be increased because the nuclear localization signal located at the C-terminus is deleted. The C-terminal deletion is therefore preferably up to about 35 amino acids, in particular about 25 to about 35 amino acids, especially about 32 to about 34 amino acids. For example, a 32 amino acid C-terminal deletion of the HPV-16 Ll protein and an approximately 26 amino acid C-terminal deletion of the BPV-I Ll protein (bovine papillomavirus type 1) is sufficient to increase the formation of virus-like particles by at least tenfold.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist auch das &Egr;-Protein deletiert, vor allem das E6- und/oder E7-Protein. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn der C-terminale Teil des E-Proteins deletiert ist, vorzugsweise der C-terminale Teil des E7-Proteins, da diese Konstrukte in Verbindung mit deletiertem L-Protein bevorzugt Capsomere und/oder Capside ausbilden können. Insbesondere bevorzugt sind Deletionen bis zu ca. 55 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 55 Aminosäuren, insbesondere ca. 38 bis ca. 43 Aminosäuren.
25 In a further preferred embodiment, the ε protein is also deleted, especially the E6 and/or E7 protein. In particular, it is preferred if the C-terminal part of the E protein is deleted, preferably the C-terminal part of the E7 protein, since these constructs can preferably form capsomeres and/or capsids in conjunction with deleted L protein. Deletions of up to about 55 amino acids are particularly preferred, preferably about 5 to about 55 amino acids, in particular about 38 to about 43 amino acids.
25

Ein besonders bevorzugtes Konstrukt ist beispielsweise E7 mit den N-terminalen Aminosäuren 1 bis ca. 60, da dieses Konstrukt ein Maus-Epitop zur Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten enthält, welches im Bereich der Aminosäuren 49-57 lokalisiert ist. Ein anderes bevorzugtes Konstrukt ist E7 mit den N-terminalen Aminosäuren 1 bis ca. 55, welches in Verbindung mit deletiertem L-Protein Capsomere und Capside bevorzugt bildet, da dieses Konstrukt E7-spezifische Sequenzen im Bereich der Aminosäuren 56-70 vermutlich nicht enthält, welche die Bildung von Capsiden stören können. Besonders bevorzugt ist ein um 32 Ami-A particularly preferred construct is, for example, E7 with the N-terminal amino acids 1 to about 60, since this construct contains a mouse epitope for the activation of cytotoxic T lymphocytes, which is located in the region of amino acids 49-57. Another preferred construct is E7 with the N-terminal amino acids 1 to about 55, which in conjunction with deleted L-protein preferentially forms capsomeres and capsids, since this construct presumably does not contain E7-specific sequences in the region of amino acids 56-70, which can interfere with the formation of capsids. A construct with a length of 32 amino acids is particularly preferred.

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nosäuren C-terminal deletiertes Ll-Protein von HPV-16, welches mit einem E7-Protein von HPV-16 mit den Aminosäuren 1-55 oder 1-60 verbunden ist. Diese Konstrukte induzieren nicht nur neutralisierende Antikörper oder eine spezifische CTL-Antwort, sondern verhindern einerseits die Bildung von Tumoren und verursachen andererseits einen Rückgang von bereits bestehenden Tumoren im Tierexperiment. Vor allem E7 mit den Aminosäuren 1-60 zeigt eine deutliche prophylaktische wie auch therapeutische Wirkung bei Tumoren. Eine besonders: bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung ist daher ein LlAE7i._x-Fusionsprotein, vorzugsweise in Form eines CVLPs, insbesondere von HPV16, wobei &khgr; eine ganze Zahl von 55 bis einschließlich 60 bedeutet, und insbesondere ein LlACE7i.₅₅- oder LlACE7i_6o-Fusionsprotein.no acids C-terminally deleted Ll protein from HPV-16, which is linked to an E7 protein from HPV-16 with the amino acids 1-55 or 1-60. These constructs not only induce neutralizing antibodies or a specific CTL response, but also prevent the formation of tumors and cause a regression of already existing tumors in animal experiments. In particular, E7 with the amino acids 1-60 shows a clear prophylactic as well as therapeutic effect on tumors. A particularly preferred embodiment of the present invention is therefore a LlAE7i. _x fusion protein, preferably in the form of a CVLP, in particular from HPV16, where &khgr; is an integer from 55 to 60 inclusive, and in particular a LlACE7i. ₅₅ or LlACE7i_6o fusion protein.

Zur Herstellung eines sowohl prophylaktisch wie auch therapeutisch wirksamen Arzneimittels ist es bevorzugt, das L-Protein an das &Egr;-Protein beispielsweise in Form eines Fusionsproteins zu binden. Des weiteren ist es bevorzugt, wenn die beschriebenen Papillomavirus-spezifischen Proteine in Form eines Capsids und/oder Capsomers vorliegen, da durch die Capside und/oder Capsomere und insbesondere durch den Anteil von L-Protein die Immunreaktion noch deutlich gesteigert werden kann. Als Fusionsproteine, die zur Capsid- und/oder Capsomerbildung geeignet sind, sind daher beispielsweise Fusionsproteine aus deletiertem Ll und E7, E6 und/oder El bevorzugt.To produce a drug that is both prophylactically and therapeutically effective, it is preferred to bind the L protein to the ε protein, for example in the form of a fusion protein. Furthermore, it is preferred if the papilloma virus-specific proteins described are present in the form of a capsid and/or capsomer, since the immune reaction can be significantly increased by the capsids and/or capsomers and in particular by the proportion of L protein. Fusion proteins made from deleted Ll and E7, E6 and/or El are therefore preferred as fusion proteins that are suitable for capsid and/or capsomer formation.

Capside sind im Sinne der vorliegenden Erfindung virale oder virus-ähnliche Strukturen in einer im allgemeinen ikosaedrischen Form, die im allgemeinen aus ca. 72 Capsomeren aufgebaut sind.In the sense of the present invention, capsids are viral or virus-like structures in a generally icosahedral shape, which are generally composed of approximately 72 capsomeres.

Capsomere sind im Sinne der vorliegenden Erfindung assemblierte Proteine enthaltend mindestens ein Papillomavirus-Strukturprotein, vorzugsweise Ll oder Deletionen von Ll. Beispielsweise können 5 Fusionsproteine zu einem Capsomer assemblieren, die wiederum zu einem Capsid assemblieren können.In the sense of the present invention, capsomeres are assembled proteins containing at least one papillomavirus structural protein, preferably Ll or deletions of Ll. For example, 5 fusion proteins can assemble to form a capsomere, which in turn can assemble to form a capsid.

Für die Herstellung eines humanen Arzneimittels bzw. Diagnostikums sind für die beschriebenen Konstrukte Proteine bzw. Peptide des humanen Papillomavirus (HPV) und vorzugsweise von HPV-6, HPV-Il, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-52 und/oder HPV-58, insbesondere HPV-16, HPV-18, HPV-31 und/oder HPV-45 geeignet. Vor allem fur die Herstellung einer Kombinationsvaccine ist es vorteilhaft, Proteine bzw. Peptide ausFor the production of a human drug or diagnostic agent, proteins or peptides of the human papilloma virus (HPV) and preferably of HPV-6, HPV-II, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-52 and/or HPV-58, in particular HPV-16, HPV-18, HPV-31 and/or HPV-45, are suitable for the described constructs. It is particularly advantageous to use proteins or peptides from

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verschiedenen HPV-Typen zu kombinieren, beispielsweise eine Kombination von HPV-16 und HPV-18 bzw. HPV-18, HPV-31, HPV-45 und HPV-58 im Falle von z.B. Cervixcarcinom oder HPV-6 und HPV-11 im Fall von z.B. Condylomen.different HPV types, for example a combination of HPV-16 and HPV-18 or HPV-18, HPV-31, HPV-45 and HPV-58 in the case of e.g. cervical carcinoma or HPV-6 and HPV-11 in the case of e.g. condyloma.

Die Expressionsvektoren können beispielsweise prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z.B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derviate (siehe z. B. WO96/11272). Beispiele für eukaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GALl (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J. J. et al. (1991) supra) und für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus-Vektoren, insbesondere das Autographa Californica-Virus, wie in EP-Bl-O 127 839 oder EP-B&Igr;&Ogr; 549 721 offenbart (siehe z. B. auch WO94/20137), und für die Expression in Säugerzellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind. Es eignen sich jedoch auch kommerziell erhältliche Baculovirus Expressionssysteme wie z. B.The expression vectors can, for example, be prokaryotic or eukaryotic expression vectors. Examples of prokaryotic expression vectors for expression in E. coli are, for example, the vectors pGEM or pUC derivatives (see, for example, WO96/11272). Examples of eukaryotic expression vectors for expression in Saccharomyces cerevisiae are, for example, the vectors p426Met25 or p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J. J. et al. (1991) supra) and for expression in insect cells are, for example, baculovirus vectors, in particular the Autographa Californica virus, as described in EP-B1-0 127 839 or EP-B&I&Ogr; 549 721 (see also WO94/20137), and for expression in mammalian cells, for example, the vectors Rc/CMV and Rc/RSV or SV40 vectors, all of which are generally available. However, commercially available baculovirus expression systems such as

der Baculo Gold ™ Transfection Kit von Pharmingen oder das Bac-to-Bac™ Baculovirus Expressionsystems von Gibco BRL. Weitere geeignete Expressionssysteme sind rekombinante Vaccinia-Viren (siehe z. B. WO 93/02184).the Baculo Gold™ Transfection Kit from Pharmingen or the Bac-to-Bac™ Baculovirus Expression System from Gibco BRL. Other suitable expression systems are recombinant vaccinia viruses (see e.g. WO 93/02184).

Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirtszelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z. B. EP-Bl-O 154 133), den ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Rüssel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen (siehe z.In general, the expression vectors also contain promoters suitable for the respective host cell, such as the trp promoter for expression in E. coli (see e.g. EP-Bl-O 154 133), the ADH2 promoter for expression in yeast (Rüssel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682), the baculovirus polyhedrin promoter for expression in insect cells (see e.g.

B. EP-Bl-O 127 839 oder U.S. 5,004,687) oder den frühen SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232).B. EP-Bl-O 127 839 or U.S. 5,004,687) or the early SV40 promoter or LTR promoters e.g. of MMTV (mouse mammary tumor virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232).

Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DH5, HBlOl oder BL21, die Hefestämme Saccharomyces cerevisia, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces oder Hansenula (Carter, J. J. et al. (1991), Virology, 182, 513), die Insektenzellinie Lepidopteran, z. B. von Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou oder Galleria Mellonela oder die tierischen Zellen COS, C127, Vero, 293 und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind (siehe z. B. WO94/00152).Suitable host cells include, for example, the E. coli strains DH5, HBlOl or BL21, the yeast strains Saccharomyces cerevisia, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces or Hansenula (Carter, J. J. et al. (1991), Virology, 182, 513), the insect cell line Lepidopteran, e.g. from Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou or Galleria Mellonela or the animal cells COS, C127, Vero, 293 and HeLa, all of which are generally available (see, e.g. WO94/00152).

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Die kodierenden Nukleinsäuren für die einzelnen Papillomavirus-spezifischen Proteine können beispielsweise über eine PCR(&ldquor;polymerase chain reaction")-Amplifizierung aus einer Genbank isoliert und kloniert werden. Beispielsweise ist das Genom von BPV-I unter der GenBank Accession No. X02346 oder HPV-16 unter der GenBank Accession No. K02718 allgemein erhältlieh. Eine HPV-16 Ll-Sequenz ist beispielsweise auch in WO94/05792 offenbart. Die Sequenz des 98 Aminosäure-langen HPV16 E7-Proteins ist beispielsweise bei Seedorf et al. (1985) Virology, 145, 181-185 beschrieben. Eine andere Methode, die gewünschten Nukleinsäuren zu erhalten, ist, die Papillomavirus-spezifischen Gene direkt aus Warzen oder Tumore mittels PCR zu isolieren. Geeignete Primer für die E6- und E7-Gene aus HPV-16 und HPV-18 sind z. B. in WO93/21958 offenbart. Weitere Literaturstellen für die gewünschten Nukleinsäuren sind beispielsweise Kirnbauer, R. et al. (1994), supra bzw. die oben bereits erwähnten in der EMBL-Datenbank hinterlegten Klone.The coding nucleic acids for the individual papillomavirus-specific proteins can be isolated and cloned from a gene bank, for example, by PCR ("polymerase chain reaction") amplification. For example, the genome of BPV-I is generally available under GenBank Accession No. X02346 or HPV-16 under GenBank Accession No. K02718. An HPV-16 Ll sequence is also disclosed in WO94/05792, for example. The sequence of the 98 amino acid-long HPV16 E7 protein is described, for example, in Seedorf et al. (1985) Virology, 145, 181-185. Another method of obtaining the desired nucleic acids is to isolate the papillomavirus-specific genes directly from warts or tumors by PCR. Suitable primers for the E6 and E7 genes from HPV-16 and HPV-18 are, for example, in WO93/21958. Further literature references for the desired nucleic acids are, for example, Kirnbauer, R. et al. (1994), supra or the clones deposited in the EMBL database mentioned above.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Expressionsvektor so konstruiert, daß das exprimierte Fusionsprotein um keine weiteren, durch den Vektor verursachte Aminosäuren verlängert ist. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, daß durch Mutagenese in einer PCR-Reaktion mittels geeigneter Primer-Oligonucleotide unerwünschte Nucleotide, die für zusätzliche Aminosäuren kodieren, entfernt werden (Ho et a. (1989) Gene, 77, 51-59). Auf diese Weise erhält man ein Fusionsprotein, welches frei von zusätzlichen Aminosäuren und somit frei von möglicherweise zusätzlichen Fremdepitopen ist, die immunologische Nebenreaktionen bewirken können.In a further preferred embodiment, the expression vector is constructed in such a way that the expressed fusion protein is not extended by any further amino acids caused by the vector. This is achieved, for example, by removing undesirable nucleotides that code for additional amino acids by mutagenesis in a PCR reaction using suitable primer oligonucleotides (Ho et al. (1989) Gene, 77, 51-59). In this way, a fusion protein is obtained that is free of additional amino acids and thus free of possibly additional foreign epitopes that can cause immunological side reactions.

Nach der Expression des beschriebenen Fusionsproteins ist es bevorzugt, dieses weiter zu reinigen bzw. zu renaturieren. Beispiele von chromatographischen Reinigungsverfahren finden sich Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L. (1982) J. Virol. Meth., 5, 151; Nakai, Y. et al. (1987) J. Gen. Virol., 68, 1891; Hofmann, K. J. et al. (1995) Virology, 209, 506; Rose, R. C. et al. (1993) J. Virol., 67, 1936, Sasagawa, T. et al. (1995) Virology, 206,126 oder WO 95/31532..After expression of the described fusion protein, it is preferred to further purify or renature it. Examples of chromatographic purification methods can be found in Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L. (1982) J. Virol. Meth., 5, 151; Nakai, Y. et al. (1987) J. Gen. Virol., 68, 1891; Hofmann, K. J. et al. (1995) Virology, 209, 506; Rose, R. C. et al. (1993) J. Virol., 67, 1936, Sasagawa, T. et al. (1995) Virology, 206,126 or WO 95/31532.

Als Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, die beispielsweise zur weiteren Stabilisierung des Papillomavirus-spezifischen Proteins in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung dienen, eignen sich beispielsweise Detergentien, wie z.B. Triton-X-100 oder Natriumdesoxycholat, aber auch Polyole, wie z. B. Polyethylenglykol oder Glycerin, Zucker, wie z. B. Saccharose oder Glukose, zwitter-Suitable additives and/or excipients which serve, for example, to further stabilize the papillomavirus-specific protein in the composition according to the invention are, for example, detergents such as Triton-X-100 or sodium deoxycholate, but also polyols such as polyethylene glycol or glycerin, sugars such as sucrose or glucose, zwitter-

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ionische Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren wie Glycin oder insbesondere Taurin oder Betain und/oder Protein, wie z. B. bovines oder humanes Serumalbumin. Bevorzugt sind Detergentien, Polyole und/oder zwitterionische Verbindungen.ionic compounds, such as amino acids such as glycine or in particular taurine or betaine and/or protein, such as bovine or human serum albumin. Detergents, polyols and/or zwitterionic compounds are preferred.

Andere Zusatz- und/oder Hilfsstoffe sind Proteaseinhibitoren, wie z. B. Aprotinin, &egr;-Aminocapronsäure oder Pepstatin A.Other additives and/or excipients are protease inhibitors, such as aprotinin, ε-aminocaproic acid or pepstatin A.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Formulierung wird das oben beschriebene Papillomavirus-spezifische Protein beispielsweise in eine Lösung enthaltend ca. 0,3 bis ca. 4 M, vorzugsweise ca. 0,4 bis ca. 3 M, insbesondere ca. 0,5 bis ca. 2 M, vor allem ca. 1 bis ca. 2 M eines Salzes bei entsprechendem pH-Wert von ca. 7,3 bis ca. 7,45, vorzugsweise ca. 7,4 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und Hilfsstoffe, eingebracht und/oder gegen die beschriebene Zusammensetzung dialysiert.To prepare the formulation according to the invention, the papillomavirus-specific protein described above is introduced, for example, into a solution containing about 0.3 to about 4 M, preferably about 0.4 to about 3 M, in particular about 0.5 to about 2 M, especially about 1 to about 2 M of a salt at a corresponding pH of about 7.3 to about 7.45, preferably about 7.4, and optionally suitable additives and excipients, and/or dialyzed against the described composition.

Die erfindungsgemäße Formulierung eignet sich als Arzneimittel oder Diagnostikum. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn das Arzneimittel kein Adjuvans enthält, d.h. keine Substanz, die die Immunogenität des Papillomavirus-spezifischen Proteins verstärkt, da insbesondere in Anwesenheit eines L-Proteins vor allem von Ll die Immunogenität bereits ausreichend verstärkt ist. Diese Eigenschaft ist insbesondere bei der Zulassung als Arzneimittel oder Diagnostikum von Vorteil, da die einzigen von den Zulassungsbehörden zugelassenen immunstimulierenden Materialien zur Zeit Aluminiumsalze sind.The formulation according to the invention is suitable as a medicament or diagnostic agent. In particular, it is preferred if the medicament does not contain an adjuvant, i.e. no substance that increases the immunogenicity of the papillomavirus-specific protein, since in the presence of an L protein, especially Ll, the immunogenicity is already sufficiently increased. This property is particularly advantageous for approval as a medicament or diagnostic agent, since the only immunostimulating materials currently approved by the regulatory authorities are aluminum salts.

Das Arzneimittel eignet sich insbesondere zur Vermeidung und/oder Behandlung von Papillomavirus-spezifischem gutartigem oder bösartigem Tumor, insbesondere von bösartigem Tumor, wie z. B. Larynx-, Cervix-, Penis-, Vulva- oder Analcarcinom, und das Diagnostikum zur Diagnose von einer oder mehreren Papillomavirus-Infektion(en). Beispiel eines Diagnostikums ist die dem Fachmann bekannte Immunodiagnostik, beispielsweise ein ELISA zur Messung von Papillomavirus-spezifischen Antikörpern (siehe z.B. Voller, A. et al. (1976) Bull. World Health Organ., 53, 55-63) oder ein Hauttest gemäß z.B. Höpfl et al. (1991) Lancet. I, 373-374).The medicament is particularly suitable for preventing and/or treating papillomavirus-specific benign or malignant tumors, in particular malignant tumors, such as laryngeal, cervical, penile, vulvar or anal carcinoma, and the diagnostic agent is suitable for diagnosing one or more papillomavirus infections. An example of a diagnostic agent is immunodiagnosis known to the person skilled in the art, for example an ELISA for measuring papillomavirus-specific antibodies (see e.g. Voller, A. et al. (1976) Bull. World Health Organ., 53, 55-63) or a skin test according to e.g. Höpfl et al. (1991) Lancet. I, 373-374).

Im allgemeinen kann das Arzneimittel oral, parenteral, wie z.B. subcutan, intramuskulär oder über die Schleimhaut, in flüssiger oder suspendierter Form, in Form eines Elixiers oder als Kap-In general, the drug can be administered orally, parenterally, such as subcutaneously, intramuscularly or via the mucous membrane, in liquid or suspended form, in the form of an elixir or as a capsule.

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seln verabreicht werden, vorzugsweise als Injektions- oder Infusionslösung. Bei den erfindungsgemäßen Formulierungen kann auf ein Adjuvans verzichtet werden, was besonders vorteilhaft ist.administered, preferably as an injection or infusion solution. The formulations according to the invention do not require an adjuvant, which is particularly advantageous.

Injektionslösungen werden im allgemeinen dann verwendet, wenn nur relativ geringe Mengen einer Lösung bzw. Suspension, beispielsweise ca. 1 bis ca. 20 ml, dem Organismus zugeführt werden soll. Infusionslösungen werden im allgemeinen dann verwendet, wenn eine größere Menge einer Lösung oder Suspension, beispielsweise ein oder mehrere Liter, appliziert werden sollen. Da im Gegensatz zur Infusionslösung bei Injektionslösungen nur wenige Milliliter verabreicht werden, machen sich geringe Abweichungen vom pH-Wert und vom osmotischen Druck des Blutes bzw. der Gewebsflüssigkeit bei der Injektion nicht oder nur unwesentlich im Hinblick auf die Schmerzempfindung bemerkbar. Eine Verdünnung der erfindungsgemäßen Formulierung vor der Anwendung ist daher im allgemeinen nicht erforderlich. Bei der Applikation größerer Mengen sollte hingegen kurz vor der Applikation die erfindungsgemäße Formulierang so weit verdünnt werden, daß eine isotonische Lösung erhalten werden kann. Ein Beispiel inner isotonischen Lösung ist eine 0,9%-ige Natriumchloridlösung. Bei der Infusion kann die Verdünnung beispielsweise mit sterilem Wasser während der Applikation z.B. über einen sog. Bypaß erfolgen. Injection solutions are generally used when only relatively small amounts of a solution or suspension, for example about 1 to about 20 ml, are to be administered to the organism. Infusion solutions are generally used when a larger amount of a solution or suspension, for example one or more liters, is to be administered. Since, in contrast to infusion solutions, only a few milliliters are administered with injection solutions, small deviations from the pH value and the osmotic pressure of the blood or tissue fluid during injection have little or no effect on the sensation of pain. Dilution of the formulation according to the invention before use is therefore generally not necessary. When applying larger amounts, however, the formulation according to the invention should be diluted shortly before use to such an extent that an isotonic solution can be obtained. An example of an internally isotonic solution is a 0.9% sodium chloride solution. During infusion, dilution can be carried out, for example, with sterile water during application, e.g. via a so-called bypass.

Der wesentliche Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die erfindungsgemäße Zusammensetzung im wesentlichen nicht zu einem Ausfallen von immunreaktiven Papillomavirusspezifischem Protein führt. Insbesondere bleiben mehr als ca. 90%, vor allem mehr als ca. 95% des Proteins in Lösung und fallen auch nicht für einen Zeitraum von mindestens ca. 12 Stunden aus. Auch ist das imrnunoreaktive Papillomavirus-spezifische Protein durch Zentrifugation bei maximal 5000 g nicht wesentlich sedimentierbar.The essential advantage of the present invention is that the composition according to the invention essentially does not lead to precipitation of immunoreactive papillomavirus-specific protein. In particular, more than about 90%, especially more than about 95% of the protein remains in solution and does not precipitate for a period of at least about 12 hours. The immunoreactive papillomavirus-specific protein is also not significantly sedimentable by centrifugation at a maximum of 5000 g.

Die Figur und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken. The figure and the following examples are intended to illustrate the invention in more detail without limiting it.

Fig. 1 zeigt graphisch die Abhängigkeit der Löslichkeit Virus-ähnlicher Partikel von der Salzkonzentration. Fig. 1 graphically shows the dependence of the solubility of virus-like particles on the salt concentration.

-11-Beispiele -11- Examples

1. Herstellung von chimären Genen kodierend für HPV16L1E7-Fusionsproteine1. Production of chimeric genes encoding HPV16L1E7 fusion proteins

Die Herstellung von HPV 16L1AC* E7 1-55 erfolgte nach Müller, M. et al. (1997), supra. Hierbei wurde der HPV-16Ll offene Leserahmen (ORF) aus dem Plasmid HPV-16-114/k-Ll/L2-pSynxtVr (Kirnbauer, R. et al. (1994) J. Virol. 67, 6929) mit der Restriktionsendonuklease BgIII ausgeschnitten und in den Vektor pUC19 (New England Biolabs) in die BamHI-Stelle kloniert.
Zur Herstellung von HPV- 16Ll AC wurden zwei Primer konstruiert, die zu HPV-16Ll ORF komplementär sind. Der erste Primer hat die SequenzHPV 16L1AC* E7 1-55 was produced according to Müller, M. et al. (1997), supra. The HPV-16Ll open reading frame (ORF) was excised from the plasmid HPV-16-114/k-Ll/L2-pSynxtVr (Kirnbauer, R. et al. (1994) J. Virol. 67, 6929) using the restriction endonuclease BglII and cloned into the vector pUC19 (New England Biolabs) in the BamHI site.
To produce HPV-16Ll AC, two primers were constructed that are complementary to HPV-16Ll ORF. The first primer has the sequence

AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC
und der zweite Primer
AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG.AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC
and the second primer
AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG.

Beide Primer kodieren 5' eine EcoRV Restriktionsenzymschnittstelle. In den stromabwärtsliegenden Primern folgt auf die EcoRV Stelle ein TAA Translationsstopkodon, um die letzten 34 Aminosäuren des HPV 16Ll ORF zu deletieren. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, um den gesamten Ll ORF und den gesamten Vektor zu amplifizieren. Das lineare Produkt wurde mit EcoRV gespalten, mit T4 DNA-Ligase zirkularisiert und E.coli DH5ct-Zellen transformiert. Die Klone wurden auf die Anwesenheit einer EcoRV Stelle analysiert. Das erhaltene Konstrukt pUCHPV16LlAC wurde benutzt, um den ORF von HPV16E7 1-50 in die EcoRV Stelle zu klonieren. Both primers encode a 5' EcoRV restriction enzyme site. In the downstream primers, the EcoRV site is followed by a TAA translation stop codon to delete the last 34 amino acids of the HPV 16Ll ORF. The PCR reaction was performed to amplify the entire Ll ORF and the entire vector. The linear product was digested with EcoRV, circularized with T4 DNA ligase and transformed into E. coli DH5ct cells. The clones were analyzed for the presence of an EcoRV site. The resulting construct pUCHPV16LlAC was used to clone the ORF of HPV16E7 1-50 into the EcoRV site.

Zur Klonierung des Fragmentes wurden Primer mit einer 5'EcoRV Restriktionsenzymschnittstelle verwendet. Es wurde folgendes Primerpaar verwendet:
AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC
und
TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC.Primers with a 5'EcoRV restriction enzyme site were used to clone the fragment. The following primer pair was used:
AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC
and
TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC.

Die PCR Produkte wurden mit EcoRV gespalten und in die EcoRV Stelle des modifizierten Ll-Gens insertiert.The PCR products were digested with EcoRV and inserted into the EcoRV site of the modified Ll gene.

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Zur Eliminierung der EcoRV Stellen wurden zwei PCR-Reaktionen durchgeführt, um zwei überlappende Fragmente des Klons pUC-HPV16LlACE7 1-50 zu amplifizieren. Die resultierenden DNA-Fragmente überlappten an der Position der L1/E7 Grenze (&ldquor;Four Primer PCR", Ho, S. N. et al (1989) Gene 77, 51). Jedoch enthielten die Primer nicht die zwei EcoRV Restriktionsenzymschnittstellen. Fragment 1 wurde mit den Primern Pl und P2 und Fragment 2 mit den Primern P3 und P4 hergestellt.To eliminate the EcoRV sites, two PCR reactions were performed to amplify two overlapping fragments of the clone pUC-HPV16LlACE7 1-50. The resulting DNA fragments overlapped at the position of the L1/E7 boundary ("Four Primer PCR", Ho, S. N. et al (1989) Gene 77, 51). However, the primers did not contain the two EcoRV restriction enzyme sites. Fragment 1 was prepared with primers Pl and P2 and fragment 2 with primers P3 and P4.

Pl: GTTATGACATACATACATTCTATG (Ll)
P2: CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC (E7)
P3: CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC (E7)Pl: GTTATGACATACATACATTCTATG (Ll)
P2: CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTTGCGTCC (E7)
P3: CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC (E7)

P^CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG (E7)P^CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG (E7)

Ein Zehntel der gereinigten Produkte wurde gemischt und als Matrize in der PCR-Reaktion mit ausschließlich den Primern Pl und P4 benutzt. Das resultierende Produkt wurde mit EcoNI (Ll) und Hindlll (stromabwärts vom Stopkodon auf den Primer P4) gespalten und benutzt, um ein EcoNI/Hindlll Fragment des klonierten HPV 16Ll ORF zu ersetzen. Der resultierende Klon unterscheidet sich daher vom Klon HPV16L1ACE7 1-50 durch den Verlust der zwei internen E-coRV Restriktionsenzymschnittstellen und der korrespondierenden nicht-HPV Aminosäuren Asp und He zwischen dem Ll ORF und E7 und stromabwärts von E7. Die erste EcoRV Stelle wurde durch die ursprünglichen Ll Aminosäuren an dieser Position ersetzt (AIaGIy). Die zweiteOne tenth of the purified products was mixed and used as template in the PCR reaction with primers Pl and P4 only. The resulting product was digested with EcoNI (Ll) and HindIII (downstream of the stop codon on primer P4) and used to replace an EcoNI/HindIII fragment of the cloned HPV 16Ll ORF. The resulting clone therefore differs from clone HPV16L1ACE7 1-50 by the loss of the two internal E-coRV restriction enzyme sites and the corresponding non-HPV amino acids Asp and He between the Ll ORF and E7 and downstream of E7. The first EcoRV site was replaced by the original Ll amino acids at this position (AIaGIy). The second

EcoRV Stelle wurde durch ein Translationsstopsignal ersetzt. Zusätzlich enthält dieser Klon (HPV16L1AC*E7 1-52) die ersten 52 Aminosäuren von HPV16E7. Klon HPV16L1AC*E7 1-52 wurde zur Herstellung des Klons HPV16L1AC*E7 1-55 mit Hilfe des Primers Pl in Kombination mit P5 verwendet.EcoRV site was replaced by a translation stop signal. In addition, this clone (HPV16L1AC*E7 1-52) contains the first 52 amino acids of HPV16E7. Clone HPV16L1AC*E7 1-52 was used to generate clone HPV16L1AC*E7 1-55 using primer Pl in combination with P5.

P5: CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG (E7 1-55)P5: CATCTGAAGCTTATCAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG (E7 1-55)

In allen Fällen wurden EcoNI und Hindill benutzt, um die korrespondierenden Fragmente zu ersetzen. Die Klone wurden durch DNA-Sequenzierung analysiert.
30 In all cases, EcoNI and HindIII were used to replace the corresponding fragments. The clones were analyzed by DNA sequencing.
30

2. Herstellung von rekombinanten Baculoviren2. Production of recombinant baculoviruses

Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen wurden als Monolayer oder in Suspensionskultur in TNM-FH Insektenmedium (Sigma, Deisenhofen) mit 10% fötalem Kälberserum und 2 mM Glutamin herangezogen. Rekombinante Baculoviren HPV16L1ACE7 1-55 wurden durch Cotransfektion von 10 &mgr;g der rekombinanten Plasmide und 2 &mgr;g von linearisiertem Baculo-Gold IDNA (Pharmingen, San Diego, CA) in Sf9 Zellen transfiziert. Rekombinante Viren wurden gemäß der Angaben des Herstellers gereinigt. Um die Expression zu testen, wurden 10 Sf9 Zellen mit rekombinantem Baculovirus und einer m.o.i. (&ldquor;multiplicity of infection") von 5 bis 10 infiziert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen mit PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂PO₄, 1,5 mM KH₂PO₄, pH 7,2) gewaschen. Die Zellen wurden dann in SDS-Probenpuffer lysiert und durch SDS-Gelchromatographie und Immunoblotassay getestet.Spodoptera frugiperda (Sf9) cells were grown as monolayers or in suspension culture in TNM-FH insect medium (Sigma, Deisenhofen) with 10% fetal calf serum and 2 mM glutamine. Recombinant baculoviruses HPV16L1ACE7 1-55 were transfected into Sf9 cells by cotransfection of 10 μg of the recombinant plasmids and 2 μg of linearized Baculo-Gold IDNA (Pharmingen, San Diego, CA). Recombinant viruses were purified according to the manufacturer's instructions. To test expression, 10 Sf9 cells were infected with recombinant baculovirus at a moi (multiplicity of infection) of 5 to 10. After incubation, the medium was removed and the cells were washed with PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na ₂ PO ₄ , 1.5 mM KH ₂ PO ₄ , pH 7.2). The cells were then lysed in SDS sample buffer and tested by SDS gel chromatography and immunoblot assay.

3. Reinigung von virusähnlichen Partikeln3. Purification of virus-like particles

Für die Herstellung von CVLPs wurden Trichoplusia ni (TN) High Five-Zellen bei 27⁰C bis zu einer Dichte von 1-1,5 &khgr; 10⁶ Zellen pro ml in Ex-CeIl 405 serumfreiem Medium gezüchtet (JRH, Biosciences, Lennexa, KS). Eine 400 ml Kultur wurde geemtet und mit einer m.o.i. von 2 bis 5 mit rekombinanten Baculoviren für eine Stunde mit periodischen Inversionen infiziert. Es wurden bis zu 240 ml Medium hinzugegeben und die Zellen wuchsen 3 bis 4 Tage lang. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und in 10 ml Extraktionspuffer resuspendiert (25 mM Tris/HCl, pH 7,5; 500 mM NaCl, 1 mM EDTA) und für 45 Sekunden bei 60 Watt beschallt. Nach der Zentrifugation bei 10.000 rpm im Sorvall SS34 Rotor wurde das Pellet im 6 ml Extraktionspuffer gelöst, für 30 Sekunden bei 60 Watt beschallt und erneut zentrifugiert. Die Überstände wurden kombiniert und auf einen Zweistufengradienten aus 40% (w/v) Saccharose und 57,5% (w/v) CsCl aufgebracht. Nach der Zentrifugation in einem SW-28 Rotor bei 27.000 rpm für zwei Stunden wurden die Interphase und die CsCl-Schicht gesammelt, auf eine CsCl-Dichte von 1,38 g/ml justiert und bei 45.000 rpm für 16 Stunden zentrifugiert. Die Gradienten wurden fraktioniert und jede Fraktion wurde durch Western Blot mit Anti-HPVl6LImAb Camvirl (Pharmingen, San Diego, CA) getestet. Die reaktiven Fraktionen wurden vereinigt und über eine Ultrafiltration mit Centricon 30 Mikrokonzentrator (Amicon Corp. Beverly, MA) gegen Hepes-For the preparation of CVLPs, Trichoplusia ni (TN) High Five cells were grown at 27 ⁰ C to a density of 1-1.5 × 10 ⁶ cells per ml in Ex-CeIl 405 serum-free medium (JRH, Biosciences, Lennexa, KS). A 400 ml culture was harvested and infected at an moi of 2 to 5 with recombinant baculoviruses for one hour with periodic inversions. Up to 240 ml of medium was added and cells were grown for 3 to 4 days. Cells were then pelleted and resuspended in 10 ml of extraction buffer (25 mM Tris/HCl, pH 7.5; 500 mM NaCl, 1 mM EDTA) and sonicated for 45 seconds at 60 watts. After centrifugation at 10,000 rpm in the Sorvall SS34 rotor, the pellet was dissolved in 6 ml extraction buffer, sonicated for 30 seconds at 60 watts, and centrifuged again. The supernatants were combined and applied to a two-step gradient of 40% (w/v) sucrose and 57.5% (w/v) CsCl. After centrifugation in a SW-28 rotor at 27,000 rpm for two hours, the interphase and CsCl layer were collected, adjusted to a CsCl density of 1.38 g/ml, and centrifuged at 45,000 rpm for 16 hours. The gradients were fractionated, and each fraction was assayed by Western blot with anti-HPVl6LImAb Camvirl (Pharmingen, San Diego, CA). The reactive fractions were pooled and purified against Hepes by ultrafiltration using a Centricon 30 microconcentrator (Amicon Corp. Beverly, MA).

&lgr;.&lgr;.

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Puffer (1 mM Hepes, 149 mM NaCl, 0,5 mM KCl, pH 7,2) dialysiert und die Anwesenheit von CVLPs mittels Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Die Konzentration von L1E7-Protein wurde in einem SDS-GeI, welches mit Coomassie blue angefärbt wurde, durch Vergleich mit BSA-Standards ungefähr bestimmt.buffer (1 mM Hepes, 149 mM NaCl, 0.5 mM KCl, pH 7.2) and the presence of CVLPs was confirmed by transmission electron microscopy. The concentration of L1E7 protein was approximately determined in an SDS gel stained with Coomassie blue by comparison with BSA standards.

4. Mikrodialyseexperimente4. Microdialysis experiments

Als Probe wurde eine Fraktion mit Virus-ähnlichen Partikeln verwendet, die aus High Five-Zellen durch Saccharosekissen- und Cäsiumchlorid-Gleichgewicht-Ultrazentrifugation isoliert worden waren.A fraction containing virus-like particles isolated from High Five cells by sucrose cushion and cesium chloride equilibrium ultracentrifugation was used as a sample.

In einem 50 ml Plastikgefäß mit Schraubverschluß wurden 40 ml der entsprechenden Lösung vorgelegt. Auf diese Lösung wurde vorsichtig ein Dialysefilter mit einem Porendurcltunesser von 0,025 &mgr;&eegr;&igr; gelegt, der auf der Flüssigkeit während der Durchführung der Dialyse schwimmt. Auf diesen Filter wurden 30 &mgr;&idiagr; der reinen CVLP-Lösung pipettiert und das Gefäß verschlossen. Mindestens 12 Stunden wurde das Gefäß bei 4-6°C stehen gelassen, so daß die Lösung des Tropfen gegen die Dialyselösung (50 mM Tris/HCl, pH 7,5 mit steigender NaCl-Konzentration) ausgetauscht wurde. Der Tropfen wurde mit der Kolbenhubpipette entnommen und es v/urde mit 30 &mgr;&idiagr; Reservoirlösung ausgeglichen. Nach Zentrifugation bei 10.000 g (10 min, 4°C) wurde der Überstand im ELISA (Kemeny, D. M. (1994) Indirekter ELISA aus: ELISA, Anwendung des Enzyme Linked Immunosorbent Assay im biologisch/medizinischen Labor, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, S. 111, Test 6.2) mit einem konformationsspezifischen monoklonalen Antikörper gegen HPV 16Ll und in einem Proteinassay untersucht. Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mit einem Bicinchonsäureassay (Smith, P. K. et al. (1985) Anal. Biochem., 150, 76-85) gegen Rinderserumalbumin als Standard. Das Ergebnis ist in Fig. 1 dargestellt.40 ml of the appropriate solution were placed in a 50 ml plastic container with a screw cap. A dialysis filter with a pore diameter of 0.025 μm was carefully placed on this solution and floated on the liquid during dialysis. 30 μl of the pure CVLP solution were pipetted onto this filter and the container was closed. The container was left to stand at 4-6°C for at least 12 hours so that the solution in the drop was exchanged for the dialysis solution (50 mM Tris/HCl, pH 7.5 with increasing NaCl concentration). The drop was removed with the piston pipette and it was balanced with 30 μl of reservoir solution. After centrifugation at 10,000 g (10 min, 4°C), the supernatant was examined in an ELISA (Kemeny, D. M. (1994) Indirect ELISA from: ELISA, Application of the Enzyme Linked Immunosorbent Assay in biological/medical laboratories, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, p. 111, Test 6.2) with a conformation-specific monoclonal antibody against HPV 16Ll and in a protein assay. The protein concentration was determined using a bicinchonic acid assay (Smith, P. K. et al. (1985) Anal. Biochem., 150, 76-85) against bovine serum albumin as a standard. The result is shown in Fig. 1.

-1--1-

M26780GBMM26780GBM

SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LOG

<110> MediGene Aktiengesellschaft 5 <110> MediGene AG 5

<120> Formulierung mit Papillomavirus-spezifischem Protein<120> Formulation with papillomavirus-specific protein

<150> 198 12 940.8 <151> 1998-03-24<150> 198 12 940.8 <151> 1998-03-24

<160> 9<160> 9

<170> FastSEQ for Windows Version 15 <170> FastSEQ for Windows Version 15

<210> 1 <211>40 <212>DNA<210> 1 <211>40 <212>DNA

<213> künstliche Sequenz 20 <213> artificial sequence 20

<220> <223> sonstige Nucleinsäure: DNA-Primer.<220> <223> Other nucleic acid: DNA primer.

<400> 1 25 <400> 1 25

aaagatatct tgtagtaaaa atttgcgtcc taaaggaaacaaagatatct tgtagtaaaa atttgcgtcc taaaggaaac

<210>2 <211>44 <212>DNA <213> künstliche Sequenz<210>2 <211>44 <212>DNA <213> artificial sequence

<220><220>

<223> sonstige Nucleinsäure: DNA-Primer. 35 <223> other nucleic acid: DNA primer. 35

<400> 2<400> 2

aaagatatct aatctacctc tacaactgct aaacgcaaaa aacgaaagatatct aatctacctc tacaactgct aaacgcaaaa aacg

<210>3 <211>35 <212>DNA <213 > künstl iche Sequenz<210>3 <211>35 <212>DNA <213> artificial sequence

• · · &idigr; J &idigr; » &Ggr;&Igr;*!• · · &idigr; J &idigr; » &Ggr;&Igr;*!

-2--2-

<400> 3<400> 3

aaaagatatc atgcatggag atacacctac attgcaaaagatatc atgcatggag atacacctac attgc

<210>4 <211> 34 <212>DNA <213> künstliche Sequenz<210>4 <211> 34 <212>DNA <213> artificial sequence

<400> 4<400> 4

ttttgatatc ggctctgtcc ggttctgctt gtccttttgatatc ggctctgtcc ggttctgctt gtcc

<210>5 <211>24 <212>DNA <213> künstliche Sequenz<210>5 <211>24 <212>DNA <213> artificial sequence

<400> 5<400> 5

gttatgacat acatacattc tatggttatgacat acatacattc tatg

<210> 6 <211>35 <212>DNA <213> künstliche Sequenz<210> 6 <211>35 <212>DNA <213> artificial sequence

<400> 6<400> 6

ccatgcattc ctgcttgtag taaaaatttg cgtccccatgcattc ctgcttgtag taaaaatttg cgtcc

<210>7 <211>29<210>7 <211>29

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-3--3-

<212>DNA <213> künstliche Sequenz<212>DNA <213> artificial sequence

<400> 7<400> 7

ctacaagcag gaatgcatgg agatacaccctacaagcag gaatgcatgg agatacacc

<210>8 <211>36 <212>DNA<210>8 <211>36 <212>DNA

<213> künstliche Sequenz 15 <213> artificial sequence 15

<400> 8 20 <400> 8 20

catctgaagc ttagtaatgg gctctgtccg gttctgcatctgaagc ttagtaatgg gctctgtccg gttctg

<210>9 <211>38 <212>DNA <213> künstliche Sequenz<210>9 <211>38 <212>DNA <213> artificial sequence

<400> 9<400> 9

catctgaagc ttatcaatat tgtaatgggc tctgtccgcatctgaagc ttatcaatat tgtaatgggc tctgtccg

Claims

1. Medicament or diagnostic agent for preventing, treating or diagnosing papillomavirus infections and/or papillomavirus-specific tumors, comprising a formulation which contains at least one late protein (L protein) of one or more papillomaviruses and/or at least one early protein (E protein) of one or more papillomaviruses and 0.3 to 4 M, preferably 0.4 to 3 M, in particular 0.5 to 2 M, especially 1 to 2 M of a salt at a pH of 7.3 to 7.45, preferably 7.4, and optionally suitable additives and/or excipients which do not contribute to stabilizing the formulation.

2. Medicament or diagnostic agent according to claim 1, characterized in that the salt is an alkali or alkaline earth salt, preferably a halide or phosphate, in particular an alkali halide, especially NaCl and/or KCl.

3. Medicament or diagnostic agent according to claim 1 or 2, characterized in that the pH is adjusted with a buffer, preferably with a phosphate buffer, Tris buffer, HEPES buffer or MOPS buffer.

4. Medicament or diagnostic agent according to one of claims 1-3, characterized in that the formulation contains no adjuvant.

5. Medicament or diagnostic agent according to one of claims 1-4, characterized in that the formulation is used as an injection or infusion solution.

6. Medicament or diagnostic agent according to one of claims 1-5, characterized in that the L protein is a deleted L protein, preferably a deleted L1 and/or L2 protein.

7. Medicament or diagnostic agent according to claim 6, characterized in that the L protein is a C-terminally deleted L protein, in particular a C-terminally deleted L1 protein.

8. Medicament or diagnostic agent according to claim 6 or 7, characterized in that up to about 35 amino acids are deleted from the L-protein, preferably about 25 to about 35 amino acids, in particular about 32 to about 34 amino acids.

9. Medicament or diagnostic agent according to one of claims 1-8, characterized in that the E protein is a deleted E protein, especially a deleted E6 and/or E7 protein.

10. Medicament or diagnostic agent according to claim 9, characterized in that the deleted E protein is a C-terminally deleted E protein, especially a C-terminally deleted E7 protein.

11. Medicament or diagnostic agent according to claim 9 or 10, characterized in that up to about 55 amino acids are deleted, preferably about 5 to about 55 amino acids, in particular about 38 to about 43 amino acids.

12. Medicament or diagnostic agent according to one of claims 1-11, characterized in that the L protein is bound, preferably fused, to the E protein.

13. Medicament or diagnostic agent according to one of claims 1-12, characterized in that the said protein or proteins are present in the form of a capsid and/or capsomer.

14. Medicament or diagnostic agent according to one of claims 1-13, characterized in that the said protein or proteins do not contain any papillomavirus-nonspecific epitopes.

15. Medicament or diagnostic agent according to one of claims 1-14, characterized in that the papillomavirus is a human papillomavirus (HPV).

16. Medicament or diagnostic agent according to claim 15, characterized in that the HPV is selected from HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-42, HPV-45, HPV-52 and/or HPV-58.

17. Medicament or diagnostic agent according to one of claims 1-16, characterized in that the tumor is a laryngeal, cervical, penile, vulvar or anal carcinoma.