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DE29724250U1 - Immobilisierung von Nucleinsäuren in hoher Dichte - Google Patents

Immobilisierung von Nucleinsäuren in hoher Dichte

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DE29724250U1
DE29724250U1 DE29724250U DE29724250U DE29724250U1 DE 29724250 U1 DE29724250 U1 DE 29724250U1 DE 29724250 U DE29724250 U DE 29724250U DE 29724250 U DE29724250 U DE 29724250U DE 29724250 U1 DE29724250 U1 DE 29724250U1
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Germany
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substrate
dna
fluid
immobilized
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DE29724250U
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Sequenom Inc
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Description

Immobilisierung von Nucleinsäuren in hoher Dichte Verwandte Anmeldungen
Für Zwecke der nationalen US-Phase ist diese Patentanmeldung eine Teilfortführung einer US-Anmeldung, eingereicht unter der Anwalts-Listennummer 7352-2001B am 8. Oktober 1997, für Maryanne J. O'Donnell-Maloney, Charles R. Cantor, Daniel P. Little und Hubert Köster, unter dem Titel "Methods of High-Density Immobilization of Nucleic Acids and Uses Thereof" (Verfahren zur Immobilisierung mit hoher Dichte von Nucleinsäuren und deren Anwendungen), die eine Teilfortführung der US-Patentanmeldung, Serien-Nr. 08/746 055 ist, eingereicht am 6. November 1996, für Maryanne J. O'Donnell-Maloney, Charles R. Cantor und Hubert Köster, unter dem Titel "High-Density Immobilization of Nucleic Acid Molecules" (Immobilisierung mit hoher Dichte von Nucleinsäuremolekülen) . Die vorliegende Patentanmeldung ist außerdem eine Teilfortführung der US-Patentanmeldung, Serien-Nr. 08/746 055, der US-Patentanmeldung, Serien-Nr. 08/786 988, eingereicht am 23. Januar 1997, für Daniel P. Little, Maryanne J. O'Donnell-Maloney, Charles
R. Cantor und Hubert Köster, unter dem Titel "Systems and Methods for Preparing and Analyzing Low Volume Analyte Array Elements" (Systeme und Verfahren zur Herstellung und Analyse von Analyten-Anordnungselementen mit geringem Volumen), und der US-Patentanmeldung, Serien-Nr. 08/787 639, eingereicht am
23. Januar 1997, für Daniel P. Little und Hubert Köster, unter dem Titel "Systems and Methods for Preparing Low Volume Analyte Array Elements" (Systeme und Verfahren zur Herstellung von Analyten-Anordnungselementen mit geringem Volumen). Für internationale Zwecke wird der Prioritätsvorteil für jede dieser Patentanmeldungen beansprucht.
Die vorliegende Patentanmeldung steht in Verbindung mit den US-Patentschriften Nr. 5 547 835, 5 622 824, 5 605 798.
Wo dies zulässig ist, wird der Gegenstand jeder der oben angegebenen Patentanmeldungen und Patente in seiner Gesamtheit hier einbezogen.
Technischer Hintergrund der Erfindung
Auf den Gebieten der Molekularbiologie und der Biochemie sowie bei der Diagnose von Krankheiten ist die Nucleinsäure-Hybridisierung ein leistungsfähiges Werkzeug für den Nachweis, die Isolierung und Analyse von spezifischen Oligonucleotid-Sequenzen geworden. Typischerweise verwenden derartige Hybridisierungstests eine Oligodesoxynucleotid-Sonde, die auf einem festen Träger immobilisiert worden ist; wie z. B. beim umgekehrten Dot-Blot-Verfahren bzw. Punkt-Autoradiogramm-Verfahren (Saiki, R.K., Walsh, P.S., Levenson, CH. , und Erlich, H.A. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 6230). In letzter Zeit sind Anordnungen von immobilisierten DNA-Sonden, die auf einer festen Oberfläche fixiert sind, zum Sequenzieren mittels Hybridisierung (SBH) entwickelt worden (Dramanac, R., Labat, I., Brukner, I., und Crkvenjakov, R. (1989) Genomics 4, 114-128); Strezoska, Z., Pauneska, T., Radosavljevic, D., Labat, I., Drmanac, R., und Crkvenjakov, R. (1991) Proc. Natl. Akad. Sei. USA 88, 10089-10093). Die SBH verwendet eine geordnete Anordnung von immobilisierten Oligodesoxynucleotiden auf einem festen Träger. Eine Probe einer unbekannten DNA wird auf die Anordnung aufgebracht, und das Hybridisierungsmuster wird beobachtet und analysiert, um gleichzeitig viele kurze Sequenzinformationsstücke zu erzeugen. Es ist eine verbesserte Version der SBH entwickelt worden, die als Positions-SBH (PSBH) bezeichnet wird und Doppelstrangsonden verwendet, die einzelsträngige 3'-Überhänge enthalten (Broude, N-.E., Sano, T., Smith, CL. , und Cantor,CR. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 3072-3076) . Es ist nunmehr möglich, ein PSBH-Einfangverfahren mit der herkömmlichen Sanger-Sequenzierung zu verbinden, um Sequenzierungsleitern zu erzeugen, die z. B. durch Gelelektrophorese nachweisbar sind (Fu, D., Broude, N.E., Röster, H., Smith, CL., und Cantor, CR. (1995) (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 10162-10166).
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Für die in diesen Programmen verwendeten Anordnungen gibt es eine Anzahl von Kriterien, die für eine erfolgreiche Ausführung erfüllt sein müssen. Zum Beispiel muß die immobilisierte DNA stabil sein und darf während der Hybridisierung, des Waschens oder der Analyse nicht desorbieren. Die Dichte des immobilisierten Oligodesoxynucleotids muß für die nachfolgenden Analysen ausreichen. Es muß eine minimale unspezifische Bindung der DNA an die Oberfläche vorhanden sein. Außerdem sollte der Immobilisierungsprozeß nicht die Fähigkeit der immobilisierten Sonden stören, zu hybridisieren und als Substrate für eine enzymatische Festphasensynthese zu dienen. Für die Mehrzahl der Anwendungen ist es am besten, wenn nur ein Punkt der DNA immobilisiert ist, idealerweise ein Endpunkt.
In den letzten Jahren sind eine Anzahl von Verfahren für die kovalente Immobilisierung von DNA auf festen Trägern entwickelt worden, bei denen versucht wird, alle oben angeführten Kriterien zu erfüllen. Zum Beispiel ist eine geeignet modifizierte DNA kovalent auf ebenen Oberflächen fixiert worden, die mit Aminosäuren (Running, J.&Agr;., und Urdea, M.S.
(1990) BioTechniques 8, 276-277; Newton, CR. , et al., (1993) Nucl. Acids Res. 21, 1155-1162; Nikiforov, T.T., und Rogers, Y.H., (1995) Anal. Biochem. 227, 201-109), Carboxylgruppen (Zhang, Y., et al., (1991) Nucl. Acids Res. 19, 3929-3933), Epoxygruppen (Lamture, J.B., et al., (1994) Nucl. Acids Res.
22, 2121-2125; Eggers, M.D., et al., (1994) BioTechniques 17, 516-524) oder Aminogruppen (Rasmussen, S.R., et al., (1991) Anal. Biochem. 198, 138-142) funktionalisiert waren. Obwohl viele von diesen Verfahren für ihre jeweiligen Anwendungen recht erfolgreich waren, war die Dichte der Oligonucleotid-Bindung (maximal etwa 20 fmol DNA pro Quadratmillimeter Oberfläche) (Lamture, J.B., et al., (1994) Nucl. Acids Res. 22, 2121-2125; Eggers, M.D., et al., (1994) BioTechniques 17, 516-524) viel geringer als die theoretische Packungsgrenze von DNA.
Daher wird ein Verfahren zum Erzielen höherer Dichten von immobilisierten Nucleinsäuren auf einer Oberfläche benötigt. Insbesondere wird ein Verfahren zum Erzielen höherer Dichten von auf einer Oberfläche immobilisierten Nucleinsäuren
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benötigt, das die Verwendung, Manipulation und weitere Reaktion der immobilisierten Nucleinsäuren sowie eine Analyse der Reaktionen gestattet.
In Verbindung mit dem Bedarf an verbesserten Nucleinsäure-Immobilisierungsverfahren, beispielsweise zur Verwendung in Analyse- und Diagnosesystemen steht die Notwendigkeit zur Entwicklung technisch ausgereifter Laborwerkzeuge, welche die Prüfung und Analyse biologischer Proben automatisieren und beschleunigen. In vorderster Reihe der jüngsten Bemühungen zur Entwicklung besserer Analysewerkzeuge steht das Ziel, die Analyse biochemischer Strukturen voranzutreiben. Dies gilt besonders für humangenomische DNA, die sich aus mindestens etwa einhunderttausend Genen zusammensetzt, die sich auf vierundzwanzig Chromosomen befinden. Jedes Gen codiert ein spezifisches Protein, das eine spezifische biochemische Funktion innerhalb einer lebenden Zelle erfüllt. Änderungen in einer DNA -Sequenz sind als Mutationen bekannt und können zu Proteinen mit veränderten oder in bestimmten Fällen sogar verlorengegangenen biochemischen Aktivitäten führen; dies kann wiederum eine Erbkrankheit verursachen. Gegenwärtig sind mehr als 3000 Erbkrankheiten bekannt. Außerdem läßt zunehmendes Beweismaterial darauf schließen, daß bestimmte DNA-Sequenzen eine Person für irgendeine aus einer Anzahl von Erbkrankheiten prädisponieren können, wie z. B. Diabetes, Arteriosklerose, Fettleibigkeit, bestimmte Autoimmunkrankheiten und Krebs. Dementsprechend ist die Analyse der DNA eine schwierige, aber verdienstvolle Beschäftigung, die verspricht, grundlegende Informationen für die Behandlung vieler lebensbedrohender Krankheiten zu liefern.
Leider wird die Analyse von DNA durch den Umfang und die Tatsache besonders erschwert, daß genomische DNA sowohl codierende als auch nichtcodierende Sequenzen aufweist (&zgr;. &Bgr;. Exons und Introns). So gesehen, sind herkömmliche Verfahren zur Analyse chemischer Strukturen, wie z. B. das manuelle Pipettieren von Quellenmaterial zur Herstellung von Proben für die Analyse, von minimalem Wert. Um den Umfang der notwendigen Analyse anzusprechen, haben Wissenschaftler Parallelverarbeitungsprotokolle für DNA-Diagnose entwickelt.
Zum Beispiel haben Wissenschaftler Robotergeräte entwickelt, die manuelles Pipettieren und Tupfen überflüssig machen, indem ein Roboterarm bereitgestellt wird, der an seinem proximalen Ende ein Stiftwerkzeug trägt, das aus einer Matrix von Stiftelementen besteht. Die einzelnen Stifte der Matrix sind so voneinander beabstandet, daß jeder Stift in eine Kavität einer Mikrotiterplatte getaucht werden kann. Der Roboterarm taucht die Stifte in die Kavitäten der Mikrotiterplatte und benetzt dadurch jedes der Stiftelemente mit Probenmaterial Dann bewegt der Roboterarm das Stiftwerkzeug in eine Position oberhalb einer Zieloberfläche, senkt das Stiftwerkzeug auf die Oberfläche ab und bringt die Stifte in Kontakt mit dem Ziel, um darauf eine Tüpfel- bzw. Spot-Matrix zu bilden. Dementsprechend beschleunigt das Stiftwerkzeug die Herstellung von Proben durch parallele Abgabe von Probenmaterial.
Obwohl dieses Stiftwerkzeugverfahren gut funktioniert, um die Herstellung von Probenanordnungen zu beschleunigen, leidet es unter verschiedenen Nachteilen. Erstens kommt das Stiftwerkzeug während der Tüpfeloperation tatsächlich in Kontakt mit der Oberfläche des Substrats. In Anbetracht dessen, daß jedes Stiftwerkzeug eine feine Spitze benötigt, damit ein Fleck von geringer Fleckgröße auf das Ziel aufgetupft wird, führt der ständige Kontakt des Stiftwerkzeugs mit der Zieloberfläche zum Verschleiß und zur Verformung der feinen und empfindlichen Spitzen des Stiftwerkzeugs. Dies führt- zu Fehlern, welche die Genauigkeit und die Produktivität verringern. Ein von Wissenschaftlern entwickeltes Alternativverfahren verwendet eine chemische Fixierung von Probenmaterial auf der Substratoberfläche. In einem besonderen Verfahren wird DNA an Ort und Stelle auf einer Substratoberfläche synthetisiert, um eine Menge von räumlich getrennten und verschiedenen chemischen Produkten zu erzeugen. Derartige Verfahren sind insofern im wesentlichen photolithographisch, als sie die Festphasenchemie, photolabile Schutzgruppen und photoaktivierte Lithographie miteinander kombinieren. Diese Systeme funktionieren zwar gut bei der Erzeugung von.Probenmaterialanordnungen, sind aber chemisch intensiv, zeitraubend und teuer.
Ferner ist es lästig, daß keines der obigen Verfahren eine ausreichende Kontrolle über das Volumen des Probenmaterials bietet, das auf die Oberfläche des Substrats abgegeben wird. Infolgedessen kann ein Fehler daraus entstehen, daß diese Verfahren keine Probenanordnungen mit gut kontrollierten und genau reproduzierbaren Probenvolumina liefern. In einem Versuch, dieses Problem zu umgehen, werden beim Herstellungsprozeß häufig reichliche Mengen von Reagensmaterialien abgegeben. Dies kann zwar ausreichende Probenvolumina sicherstellen, ist aber eine Verschwendung von Probenmaterialien, die oft teuer und begrenzt verfügbar sind.
Auch nach der Herstellung der Proben sehen sich die Wissenschaftler noch mit dem Bedarf an hochentwickelten Diagnoseverfahren konfrontiert, um die hergestellten Proben zu analysieren. Dazu nutzen die Wissenschaftler verschiedene Verfahren zur Identifikation von Materialien, wie z. B. DNA. Zum Beispiel können Nucleinsäuresequenzen durch Hybridisieren mit einer Sonde identifiziert werden, die zu der zu identifizierenden Sequenz komplementär ist. Typischerweise wird das Nucleinsäurefragment mit einer empfindlichen Reporter- bzw. Indikatorfunktion markiert, die radioaktiv, fluoreszierend oder chemilumineszierend sein kann. Diese Verfahren können zwar gut funktionieren, haben aber bestimmte Nachteile. Radioaktive Markierungen können gefährlich sein, und die von ihnen erzeugten Signale klingen mit der Zeit ab. Nichtisotope (d. h. fluoreszierende) Markierungen leiden unter mangelnder Empfindlichkeit und Signalschwund, wenn während des Identifikationsverfahrens Laser mit hoher Intensität verwendet werden. Außerdem ist das Markieren ein arbeits- und zeitaufwendiges, fehleranfälliges Verfahren. Infolgedessen ist der Prozeß der Herstellung und Analyse eines biochemischen Probenmaterials komplex und fehleranfällig.
Daher besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, verbesserte Systeme und Verfahren zur Herstellung von Probenmaterialanordnungen bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung von Systemen, welche die schnelle Herstellung von Probenanordnungen gestatten. Eine weitere Aufgabe
der Erfindung ist die Bereitstellung von Trägern, an die Nucleinsäuremoleküle in hoher Dichte gebunden werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Es werden Verfahren zum Immobilisieren von Nucleinsäuren in hoher Dichte auf einer Oberfläche bereitgestellt, die auf der schnellen Reaktion einer freien Thiolgruppe einer modifizierten Oberfläche oder einer modifizierten Nucleinsäure unter geeigneten Bedingungen mit einer thiolreaktiven Funktionalität der anderen Komponente (Oberfläche oder Nucleinsäure) basieren. Diese Reaktion kann direkt oder über ein bifunktionelles Vernetzungsmittel ablaufen. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die modifizierte Nucleinsäure eine Thiolgruppe auf, und das Vernetzungsmittel enthält eine Iodacetylgruppe.
Außerdem werden feste Träger bereitgestellt, an denen "Kügelchen" fixiert sind, die mit Nucleinsäuremolekülen verbunden sind. Die Kügelchen sind nicht unbedingt kugelförmig, sondern beziehen sich auf Teilchen, die mit dem festen Träger konjugiert sind, um dadurch die Oberfläche des festen Trägers zu vergrößern und/oder eine alternative Oberfläche für die Konjugation von Nucleinsäuren oder anderen Molekülen bereitzustellen. Die Kügelchen haben vorzugsweise eine Größe von etwa 1 &mgr;&idiagr;&eegr; bis 100 &mgr;&idiagr;&eegr;. Es werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die mindestens ein Kügelchen enthalten, das mit einem festen Träger konjugiert und außerdem mit mindestens einem Molekül konjugiert ist, insbesondere mit einer Nucleinsäure. Das Kügelchen wird aus irgendeinem geeigneten, dem Fachmann bekannten Matrixmaterial geformt, wozu quellfähige und nicht quellfähige Materialien gehören. Der feste Träger ist irgendein dem Fachmann bekannter Träger zur Verwendung als Trägermatrix in chemischen Synthesen und Analysen. In solchen Fällen ist die Nucleinsäure über ein Schwefelatom an das "Kügelchen" gebunden, wie hierin beschrieben wird. In bestimmten Ausführungsformen können die Kügelchen auf dem festen Träger in Vertiefungen oder Grübchen auf der Oberfläche konjugiert sein, oder die Kügelchen können in Form einer regelmäßigen Anordnung auf dem Träger angeordnet sein.
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Vorzugsweise besteht das Kügelchen aus einem Material, das unter Materialien ausgewählt ist, die als feste Träger für die Synthese und für Biotests bzw. Assays dienen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Silicagel, Glas, magnetisches Material, Harze aus Polystyrol/1% Divinylbenzol, wie z. B. Wang-Harze, d. h. Fmoc-aminosäure-4-(hydroxymethyl)phenoxymethylcopoly(styrol-1% divinylbenzol)-Harz (DVD-Harz), Chlortrityl(2-chlortritylchloridcopolystyrol-DVB-harz)harz, Merryfield (chlormethyliertes Copolystyrol-DVB)-Harzmetall, Kunststoff, Cellulose, vernetzte Dextrane, wie z. B. diejenigen, die unter dem Handelsnamen Sephadex (Pharmacia) vertrieben werden, und Agarosegel, wie z. B. Gele, die unter dem Handelsnamen Sepharose (Pharmacia) vertrieben werden, das ein wasserstoffgebundenes Agarosegel vom Polysaccharid-Typ ist, und andere derartige Harze und Festphasenträger, die dem Fachmann bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Kügelchen eine Größe im Bereich von etwa 0,1 bis 500 pm Durchmesser, stärker bevorzugt von etwa 1 bis 100 &mgr;&igr;&agr; Durchmesser.
Der feste Träger hat irgendeine gewünschte Form, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: ein Kügelchen, eine Kapillare, eine Platte, eine Membran, einen Wafer, einen Kamm, einen Stift, einen Wafer mit Grübchen, eine Anordnung von Stiften oder Nanoliter-Vertiefungen bzw. -kavitäten sowie andere Geometrien und Formen, die dem Fachmann bekannt sind.
Nach einem weiteren Aspekt werden Ausstattungen bzw. Kits für immobilisierte Nucleinsäuren auf einem unlöslichen Träger bereitgestellt. In einer Ausführungsform kann der Kit eine geeignete Menge 'der folgenden Bestandteile aufweisen: i) ein thiolreaktives Vernetzungsmittel; und ii) ein oberflächenmodifizierendes Reagens zum Modifizieren einer Oberfläche mit einer Funktionalität, die mit dem thiolreaktiven Vernetzungsmittel reagieren kann. Der Kit kann wahlweise einen unlöslichen Träger aufweisen, z. B. eine feste Oberfläche, magnetische Mikrokügelchen oder Silicium-Wafer, zur Verwendung beim Immobilisieren von Nucleinsäuren. Der Kit kann außerdem wahlweise geeignete Puffer sowie Gebrauchsanweisungen enthalten.
Die Anwendung dieser Verfahren zum Immobilisieren von Nucleinsäuremolekülen auf einem festen Träger führt zu einer
mindestens 12,5 mal höheren Immobilisierung als früher beschriebene Verfahren. Die Verfahren sind daher besonders gut für die Ausbildung von Nucleinsäure-Abschußrampen für die Massenspektrometrie verwendbar.
Die Nucleinsäuren, die unter Anwendung der hier bereitgestellten Verfahren auf einer Oberfläche immobilisiert werden, können in den verschiedensten Festphasen-Nucleinsäurechemie-Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Nucleinsäuresynthese (chemische und enzymatisehe), Hybridisierung und/oder Verlängerung, sowie bei Diagnoseverfahren, die auf dem Nachweis von Nucleinsäuren und PoIymorphismus-Analysen basieren (siehe z. B. die US-Patentschrift Nr. 5 605 7 98). Dementsprechend werden hier ferner Verfahren zur Reaktion von Nucleinsäuremolekülen bereitgestellt, bei denen die Nucleinsäuremoleküle auf einer Oberfläche immobilisiert werden, indem entweder ein thiolhaltiges Derivat des Nucleinsäuremoleküls mit einem unlöslichen Träger zur Reaktion gebracht wird, der eine thiolreaktive Gruppe enthält, oder indem eine thiolhaltiger unlöslicher Träger mit einem Derivat des Nucleinsäuremoleküls, das eine thiolreaktive Gruppe enthält, zur Reaktion gebracht wird und danach die immobilisierten Nucleinsäuremoleküle weiter umgesetzt werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Verfahren zur Reaktion immobilisierter Nucleinsäuren wird die immobilisierte Nucleinsäure ferner durch Hybridisieren mit einer Nucleinsäure zur Reaktion gebracht, die zu der immobilisierten Nucleinsäure oder zu einem Teil davon komplementär ist. Solche Hybridisierungsreaktionen können verwendet werden, um die Gegenwart einer spezifischen Nucleinsäure in einer Probe nachzuweisen.
Dies ist von besonderem Nutzen beim Nachweis von Pathogenen in einer Probe, wie z. B. einer biologischen Probe, die bei der Diagnose von Krankheiten verwendet werden kann.
Daher werden hierin auch Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäure in einer Probe bereitgestellt, wobei eine thiolhaltige Nucleinsäure, die zu der Ziel-Nucleinsäure komplementär ist, unter Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren auf einer Oberfläche immobilisiert wird und die Probe unter Bedingungen, durch welche die Ziel-Nucleinsäure in der
Probe mit der immobilisierten Nucleinsäure hybridisiert, in Kontakt mit der Oberfläche gebracht wird. Die hybridisierte Ziel-Nucleinsäure kann unter Anwendung der verschiedensten Verfahren nachgewiesen werden, wobei das bevorzugte Verfahren die Massenspektrometrie ist. Ferner werden hierin Verfahren zum Nachweis von Veränderungen (z. B. von Deletionen, Insertionen und Konversionen) in der Nucleotidsequenz der Ziel-Nucleinsäure bereitgestellt. Bei diesem Verfahren wird das durch Massenspektrometrie bestimmte Molekulargewicht der hybridisierten Ziel-Nucleinsäure mit dem Molekulargewicht verglichen, das für die Ziel-Nucleinsäuresequenz erwartet wird. Abweichungen des gemessenen Molekulargewichts von dem erwarteten Molekulargewicht weisen auf eine Veränderung in der Nucleotidsequenz der Ziel-Nucleinsäure hin.
Bei anderen, hier bereitgestellten Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäure in einer Probe wird die Ziel-Nucleinsäure auf einer Oberfläche immobilisiert, die thiolreaktive Gruppen enthält. Bei diesem Verfahren wird vor der Immobilisierung die Ziel-Nucleinsäure in einer Reaktion amplifiziert, bei der ein Oligonucleotid-Primer eine 3'- oder 5'-Disulfidbindung enthält, und das entstehende Produkt wird reduziert, um eine thiolhaltige Nucleinsäure zu erzeugen. Die thiolhaltige Nucleinsäure wird auf einer Oberfläche immobilisiert, die thiolreaktive Gruppen enthält, und mit einer einzelsträngigen Nucleinsäure in Kontakt gebracht, die.zu der immobilisierten Nucleinsäure oder einem Teil davon komplementär ist. Die Hybridisierung der einzelsträngigen Nucleinsäure kann durch die verschiedensten Verfahren nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann die einzelsträngige Nucleinsäure mit einer leicht nachweisbaren Komponente markiert werden, z. B. mit radioaktiven oder chemilumineszierenden Markierungen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die einzelsträngige Nucleinsäure durch Massenspektrometrie nachgewiesen.
In einer weiteren Ausführungsform der Verfahren zur Reaktion von immobilisierten Nucleinsäuren läßt man die immobilisierte Nucleinsäure ferner durch Verlängerung einer Nucleinsäure reagieren, die mit der immobilisierten Nucleinsäure oder einem Teil davon hybridisiert ist. Verlängerungsreaktionen wie
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diese können &zgr;. B. bei Verfahren zum Sequenzieren von DNA-Molekülen angewandt werden, die unter Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren auf einem unlöslichen Träger immobilisiert werden. Folglich werden hierin auch Verfahren zur Be-Stimmung der Sequenz eines DNA-Moleküls auf einem Substrat bereitgestellt, bei denen ein thiolhaltiges Derivat des DNA-Moleküls auf der Oberfläche eines unlöslichen Trägers immobilisiert wird, der thiolreaktive Gruppen enthält, und mit einer einzelsträngigen Nucleinsäure hybridisiert wird, die komplementär zu einem Teil des immobilisierten DNA-Moleküls ist, bevor die DNA-Synthese in Gegenwart eines oder mehrerer Didesoxynucleotide ausgeführt wird.
Die Verlängerung bzw. Extension eines Nucleinsäure-Primers, der mit einer Nucleinsäure hybridisiert ist, die nach dem hier bereitgestellten Verfahren auf einer Oberfläche immobilisiert ist, kann auch beim Nachweis von Nucleotidsequenz-Veränderungen (z. B. Deletionen, Insertionen, Konversionen) einer Ziel-Nucleinsäure angewandt werden. Dementsprechend werden hierin Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einer Ziel-Nucleinsäuresequenz bereitgestellt, wobei eine einzelsträngige Nucleinsäure mit einer thiolhaltigen Ziel-Nucleinsäure hybridisiert wird, die entsprechend den hierin bereitgestellten Verfahren auf einem festen Träger immobilisiert ist, und wobei die hybridisierte einzelsträngige Nucleinsäure durch Anlagerung von Nucleotiden an das 3'-Ende des Moleküls verlängert wird. Das Verlängerungsprodukt wird z. B. durch Massenspektrometrie charakterisiert, um festzustellen, ob sich seine Eigenschaften von denjenigen unterscheiden, die von einer Sequenz zu erwarten sind, welche zu der immobilisierten Ziel-Nucleinsäure komplementär ist. So wird z. B. das Molekulargewicht des durch Massenspektrometrie bestimmten Verlängerungsprodukts mit dem erwarteten Molekulargewicht einer Nucleinsäure verglichen, die zur Ziel-Nucleinsäure komplementär ist. Abweichungen des erwarteten Molekulargewichts weisen auf eine Veränderung in der Sequenz der Ziel-Nucleinsäure hin. In bestimmten Ausführungsformen der hierin bereitgestellten Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einer Ziel-Nucleinsäuresequenz kann die Ziel-Nucleinsäure vor der
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Immobilisierung auf einer thiolreaktiven Oberfläche in einer Reaktion amplifiziert werden, in der ein Oligonucleotid-Primer eine 3'- oder 5'-Disulfidbindung enthält. Das entstehende Produkt wird reduziert, um eine thiolhaltige Ziel-Nucleinsäure zu erzeugen. Die thiolhaltige Ziel-Nucleinsäure wird dann auf einer Oberfläche immobilisiert, die thiolreaktive Gruppen enthält, und die einzelsträngige komplementäre Nucleinsäure wird daran hybridisiert und verlängert.
In einer weiteren Ausführungsform der hierin bereitgestellten Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einer Ziel-Nucleinsäuresequenz wird eine zur Ziel-Nucleinsäure komplementäre, einzelsträngige Nucleinsäure auf einer Oberfläche durch eine Verbindung immobilisiert, die eine Bindung zwischen einer Thiolgruppe und einer thiolreaktiven Funktionalität sowie eine spaltbare Linker-Komponente aufweist. Die Probe, welche die Ziel-Nucleinsäure enthält, wird mit der Oberfläche unter Bedingungen in Kontakt gebracht, durch welche das Ziel mit der immobilisierten einzelsträngigen Nucleinsäure hybridisiert. Die immobilisierte einzelsträngige Nucleinsäure wird durch Anlagerung von Nucleotiden an das 3'-Ende des Moleküls verlängert. Im Anschluß an die Verlängerung wird das doppelsträngige Molekül denaturiert, und das einzelsträngige immobilisierte Verlängerungsprodukt wird in der Position des Linkers von der Oberfläche abgespalten. Das Verlängerungsprodukt wird beispielsweise durch Massenspektrometrie charakterisiert, um festzustellen, ob sich seine Eigenschaften von denjenigen unterscheiden, die von einer Sequenz erwartet werden, die zu der immobilisierten Ziel-Nucleinsäure komplementär ist.
Es versteht sich, daß alle Anwendungen der Festphasen-Nucleinsäurechemie, die auf Nucleinsäuren basieren, die nach den hierin bereitgestellten Verfahren auf einem festen Substrat immobilisiert sind, sowohl mit thiolhaltigen Nucleinsäuren und einer thiolreaktiven Oberfläche als auch mit thiolreaktiven Nucleinsäuren und einem thiolhaltigen Träger ausgeführt werden können.
Außerdem werden hierin Verfahren zur Ausbildung einer Anordnung von Nucleinsäuren auf einer Substratoberfläche durch Inkontaktbringen von thiolhaltigen Nucleinsäuren mit einem un-
löslichen Träger bereitgestellt, der thiolreaktive Gruppen enthält, die in einer regelmäßigen Anordnung auf der Oberfläche des Trägers positioniert sind. In einem hier bereitgestellten alternativen Verfahren zur Ausbildung einer Anordnung von Nucleinsäuren auf einer Substratoberfläche wird ein unlöslicher Träger, der Thiol-Funktionalitäten enthält, die in einer regelmäßigen Anordnung auf der Oberfläche des Trägers positioniert sind, mit Nucleinsäuren in Kontakt gebracht, die eine thiolreaktive Gruppe enthalten.
Ferner werden hierin Systeme und Verfahren zur Herstellung einer Probe zur Analyse und insbesondere Systeme und Verfahren zur Abgabe geringer Volumina von Fluidmaterial auf eine Substratoberfläche für die Herstellung einer Probenanordnung zur diagnostischen Analyse bereitgestellt. Hier bereitgestellte Systeme und Verfahren zur Herstellung von Probenmaterialanordnungen sind im allgemeinen in der Anwendung weniger kostenaufwendig und sparen Reagenzien, wobei sie die schnelle Herstellung von Probenanordnungen mit hoher Reproduzierbarkeit ermöglichen.
In Bezug auf Systeme und Verfahren zur Abgabe geringer Volumina von Fluidmaterial auf eine Substratoberfläche werden hierin serielle und parallele Abgabegeräte bereitgestellt, die zur Herstellung von aus mehreren Elementen bestehenden Probenmaterialanordnungen auf einer Substratoberfläche verwendet werden können. Die Substratoberflächen können eben oder geometrisch so verändert sein, daß sie Vertiefungen zur Aufnahme von Material aufweisen.
In einer Ausführungsform handelt es sich um ein Gerät, das die parallele Entwicklung einer Probenanordnung ermöglicht. Zu diesem Zweck kann das Gerät als eine Einheit von Bläschen- bzw. Vesikelelementen oder Stiften aufgefaßt werden, wobei jeder der Stifte eine enge Innenkammer aufweisen kann, die sich zur Aufnahme von Nanoliter-Volumina eines Fluids eignet. Jeder der Stifte kann innerhalb eines Gehäuses sitzen, das selbst eine Innenkammer aufweist. Das Innengehäuse kann mit einer Druckquelle verbunden sein, die den Druck innerhalb der inneren Gehäusekammer steuert, um der Fluiddurchfluß durch
die Innenkammer&eegr; der Stifte zu regulieren. Dies ermöglicht die gesteuerte Abgabe definierter Fluidvolumina aus den Vesikeln.
In einer alternativen Ausführungsform weist das Gerät eine Düseneinheit auf, die einen Kapillarstift mit einer inneren Kammer und ein an dem Stift montiertes Wandlerelement aufweisen kann, das in der Lage ist, Fluid durch die innere Kammer des Stifts zu treiben, um das Fluid aus dem Stift auszustoßen. Auf diese Weise kann das Gerät einen Fleck bzw. Spot des Fluids auf eine Substratoberfläche abgeben, indem es das Fluid aus dem Stift herausspritzt. Als Alternative kann der Wandler verursachen, daß ein Fluidtropfen aus der Kapillare austritt, so daß Fluid auf das Substrat übertragen werden kann, indem der Tropfen mit der Substratoberfläche in Kontakt gebracht wird.
Ferner kann das Gerät eine Probenmaterialanordnung ausbilden, indem es Probenmaterial in einer Serie von Schritten abgibt, während es den Stift oberhalb der Substratoberfläche in verschiedene Positionen bewegt, um die Probenanordnung auszubilden. In einer weiteren Ausführungsform werden die hergestellten Probenanordnungen an eine Platteneinheit weitergegeben, welche die Probenanordnungen zur Analyse durch Massenspektrometrie übergibt. Zu diesem Zweck ist ein Massenspektrometer vorgesehen, das ein Signal mit einer Gruppe von Spektren erzeugt, das als Anzeige für die Zusammensetzung des zu analysierenden Probenmaterials aufgefaßt werden kann.
Nach einem Aspekt kann die hierin bereitgestellte Abgabevorrichtung zur Abgabe definierter Fluidvolumina, einschließlich Nanovolumina und Subnanovolumina des Fluids, in chemischen oder biologischen Verfahren auf die Oberfläche eines Substrats die folgenden Bestandteile aufweisen: ein Gehäuse mit mehreren Seitenwänden und einem unteren Abschnitt mit darin ausgebildeten Öffnungen, wobei die Wände und der untere Abschnitt des Gehäuses ein Innenvolumen abgrenzen; eine(n) oder mehrere fluiddurchlässige Vesikeln oder Stifte, die innerhalb der Öffnungen montiert sind und eine Fluidaufnahmekammer in Nanovolumen-Größe zur Aufnahme von Nanovolumina des Fluids aufweisen, wobei die Fluidaufnahmekammer in Fluidverbindung mit dem Innenvolumen des Gehäuses steht, sowie ein Ab-
gabeelement, das mit dem Innenvolumen des Gehäuses in Verbindung steht, um selektiv Nanovolumina des Fluids aus den fluiddurchlässigen Vesikeln von Nanovolumen-Größe abzugeben, wenn das Fluid in die Fluidaufnahmekammern der Vesikeln eingefüllt wird. Wie hier beschrieben, wird dadurch ermöglicht, daß das Abgabeelement Nanovolumina des Fluids auf die Substratoberfläche abgibt, wenn die Vorrichtung über dem Substrat und in Dekkung mit diesem angeordnet wird.
In einer Ausführungsform weist die fluiddurchlässige Vesikel ein offenes proximales Ende und einen distalen Spitzenabschnitt auf, der über den unteren Abschnitt des Gehäuses hinausreicht, wenn er innerhalb der Öffnungen montiert ist. Auf diese Weise kann das offene proximale Ende die Fluidaufnahmekammer bei der Montage.innerhalb der Öffnungen in Fluidverbindung mit dem Innenvolumen bringen. Wahlweise sind die mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln lösbar und auswechselbar innerhalb der Gehäuseöffnungen montiert oder können alternativ eine Klebstoffabdichtung zur festen Montage der Vesikeln innerhalb des Gehäuses aufweisen.
In einer Ausführungsform weist die Fluidaufnahmekammer eine enge Bohrung auf, die in ihren Abmessungen so angepaßt ist, daß sie durch Kapillarwirkung mit dem Fluid gefüllt wird, und die so bemessen werden kann, daß sie sich durch Kapillarwirkung im wesentlichen vollständig mit dem Fluid füllt.
In einer Ausführungsform weisen die mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln eine Anordnung von Fluidabgabenadeln auf, die aus Metall, Glas, Siliciumdioxid, Polymermaterial oder irgendeinem anderen geeigneten Material geformt sein können.
In einer Ausführungsform kann das Gehäuse einen oberen Abschnitt und mechanische Vorspannelemente aufweisen, um die mehreren flüssigkeitsdurchlässigen Vesikeln in Dichtungskontakt mit dem unteren Gehäuseabschnitt vorzuspannen. In einer besonderen Ausführungsform weist jede fluiddurchlassige Vesikel einen proximalen Endabschnitt mit einem Flansch und ferner ein Dichtungselement auf, das zwischen dem Flansch und einer Innenfläche des unteren Gehäuseabschnitts angeordnet ist, um zwischen dem Innenvolumen und einer äußeren Umgebung eine
Dichtung auszubilden. Die Vorspannelemente können mechanische Elemente sein und können mehrere Federelemente aufweisen, die jeweils an einem Ende mit dem proximalen Ende jedes der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln und am anderen Ende mit einer Innenfläche des oberen Gehäuseabschnitts verbunden sind. Die Federn können eine mechanische Vorspannkraft auf das proximale Ende der Vesikel ausüben, um die Dichtung auszubilden.
In einer weiteren Ausführungsform weist das Gehäuse außerdem einen oberen Abschnitt und ein Befestigungselement auf, um den oberen Gehäuseabschnitt am unteren Gehäuseabschnitt zu befestigen. Das Befestigungselement kann mehrere Öffnungen zur Aufnahme von Befestigungsmitteln aufweisen, die innerhalb des oberen oder des unteren Gehäuseabschnitts ausgebildet sind, sowie mehrere Befestigungsmittel zur Montage innerhalb der Öffnungen, um den oberen Abschnitt und den unteren Abschnitt des Gehäuses aneinander zu befestigen.
In einer Ausführungsform kann das Abgabeelement eine Druckquelle aufweisen, die in Fluidverbindung mit dem Innenvolumen des Gehäuses steht, um das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen. Außerdem kann in einer Ausführungsform, in welcher die fluiddurchlässigen Vesikeln durch Kapillarwirkung gefüllt werden, das Abgabeelement eine Drucksteuereinrichtung aufweisen, welche die Druckquelle variieren kann, um das Innenvolumen des Gehäuses in wechselnde Druckzustände zu bringen. Dadurch wird ermöglicht, daß das Regelelement der Steuereinrichtung das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand bringt, der ausreicht, um die Kapillarwirkung zu kompensieren und die Fluidaufnahmekammer jeder Vesikel bis zu einer vorgegebenen Höhe zu füllen, die einer vorgegebenen Fluidmenge entspricht. Außerdem kann die Steuereinrichtung ferner ein Fluidauswahlelement zum selektiven Entleeren einer ausgewählten Nanovolumen-Fluidmenge aus der Kammer jeder Vesikel aufweisen. In einer besonderen Ausführungsform ist eine Drucksteuereinrichtung enthalten, die unter der Steuerung eines Computerprogramms arbeitet, das in einem Datenverarbeitungssystem abläuft, um eine variable Steuerung über den an der Innenkammer des Gehäuses anliegenden Druck bereitzustellen.
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In einer Ausführungsform kann die fluiddurchlässige Vesikel ein proximales Ende aufweisen, das zum Innenvolumen des Gehäuses hin offen ist, und die Fluidaufnahmekammern der Vesikeln sind so bemessen, daß sie sich im wesentlichen vollständig durch Kapillarwirkung mit dem Fluid füllen, ohne am proximalen offenen Ende einen Meniskus zu bilden. Wahlweise kann die Vorrichtung mehrere Vesikeln aufweisen, wobei ein erster Teil der mehreren Vesikeln Fluidaufnahmekammern einer ersten Größe und ein zweiter Teil Fluidaufnahmekammern einer zweiten Größe aufweist, wodurch mehrere Fluidvolumina abgegeben werden können.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Abgabevorrichtung aufweisen: ein Fluidauswahlelement mit einer Druckquelle, die mit dem Gehäuse gekoppelt ist und in Verbindung mit dem Innenvolumen steht, um das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen, sowie ein mit 'der Druckquelle gekoppeltes Einstellelement zum Variieren des Drucks im Innenvolumen des Gehäuses, um an die Fluidkammer jeder der fluiddurchlässigen Vesikeln einen Überdruck anzulegen und die daraus abgegebene Fluidmenge zu variieren. Das Auswahlelement und das Einstellelement können Computerprogramme sein, die in einem Datenverarbeitungssystem ablaufen, das den Betrieb einer mit der Innenkammer verbundenen Drucksteuereinrichtung lenkt.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform dient die hier bereitgestellte Vorrichtung zur Abgabe eines Fluids bei chemischen oder biologischen Verfahren in eine oder mehrere Vertiefungen bzw. Kavitäten eines Mehrkavitätensubstrats. Die Vorrichtung kann aufweisen: ein Gehäuse mit mehreren Seiten und einem unteren Abschnitt, in dem mehrere Öffnungen ausgebildet sind, wobei die Wände und der untere Abschnitt ein Innenvolumen abgrenzen; mehrere fluiddurchlässige Vesikeln, die innerhalb der Öffnungen montiert sind und eine Fluidaufnahmekammer aufweisen, die mit dem Innenvolumen des Gehäuses in Verbindung steht, und eine Fluidauswahl- und Abgabeeinrichtung, die mit dem Innenvolumen des Gehäuses in Verbindung steht, zur variablen Auswahl einer in die Fluidaufnahmekammern der Vesikeln eingefüllten Fluidmenge, die aus einer einzigen Gruppe der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln abzugeben ist.
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Dementsprechend gibt die Abgabeeinrichtung eine ausgewählte Fluidmenge in die Kavitäten des Mehrkavitätensubstrats ab, wenn die Vorrichtung über dem Substrat.und in Deckung mit diesem angeordnet wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird hier eine Fluidabgabevorrichtung zur Abgabe von Fluid bei chemischen oder biologischen Verfahren in eine oder mehrere Kavitäten eines Mehrkavitätensubstrats bereitgestellt, welche aufweist: ein Gehäuse mit mehreren Seiten und oberen und unteren Abschnitten, wobei in dem unteren Abschnitt mehrere Öffnungen ausgebildet sind, wobei die Wände und der obere und der untere Gehäuseabschnitt ein Innenvolumen abgrenzen; mehrere innerhalb der Öffnungen· montierte fluiddurchlässige Vesikeln, die eine Fluidaufnahmekammer aufweisen, die so dimensioniert ist, daß sie Nanovolumina des Fluids aufnimmt, wobei die Fluidaufnahmekammer in Fluidverbindung mit dem Gehäusevolumen steht, und ein mechanisches Vorspannelement zum mechanischen Vorspannen der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln in Dichtungskontakt mit dem unteren Gehäuseabschnitt.
Allgemeine Verfahren zur Herstellung einer Probenmaterialanordnung auf einer Substratoberfläche, wie sie hierin beschrieben werden, weisen die folgenden Schritte auf: Bereitstellen einer Vesikel mit einer Innenkammer, die ein Fluid enthält, Anordnen der Vesikel angrenzend an eine erste Position auf der Substratoberfläche, Steuern des Gefäßes zur Abgabe eines Nanolitervoluminens eines Fluids in der ersten Position der Substratoberfläche, und Bewegen der Vesikel zu einer Gruppe von Positionen, die an die Substratoberfläche angrenzen, wodurch Fluid in jeder Position der Positionsgruppe abgegeben wird, um eine Probenmaterialanordnung auszubilden.
Substrate, die bei den hierin beschriebenen allgemeinen Verfahren zur Herstellung einer Probenmaterialanordnung verwendet werden, können sowohl ebene Oberflächen zur Aufnahme des Probenmaterials als auch Oberflächen mit darin ausgebildeten Vertiefungen zum Festlegen von Positionen für die Aufnahme des Fluids aufweisen, das aus den Kammern der Vesikeln ausgestoßen werden kann. Solche Substrate können Silicium, Metall, Kunststoff, eine Membran, Polymermaterial, ein Metall-
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Propfpolymer sowie ein chemisch funktionalisiertes, mit Kügelchen funktionalisiertes, mit Dendritstrukturen aus eingefangenem Material funktionalisiertes Substrat oder beliebige Kombinationen der obigen Substrate oder irgendein ähnliches geeignetes Material zur Aufnahme des abgegebenen Fluids sein.
Es versteht sich, daß bei den hierin beschriebenen allgemeinen Verfahren zur Herstellung einer Probenmaterialanordnung auf einer Substratoberfläche die Vorrichtung sowohl ein Analytenmaterial als auch ein Trägermaterial abgeben kann, wie
z. B. ein Matrixmaterial, das die Analyse des Analyten unterstützt. Zu diesem Zweck können die hierin bereitgestellten Verfahren die Schritte zur Abscheidung eines Matrixmaterials auf den Substratstoff aufweisen. Ferner können die Verfahren auch einen Warteschritt über eine vorgegebene Zeitspanne aufweisen, um ein Lösungsmittel des Matrixmaterials verdampfen zu lassen. Sobald das Lösungsmittel des Matrixmaterials verdampft ist, können die hier beschriebenen Verfahren einen Schritt zum Ausstoßen eines Volumens des Analytenfluids in das eingedampfte Matrixmaterial aufweisen, um sich zusammen mit dem Matrixmaterial aufzulösen und eine kristalline Struktur auf der Substratoberfläche zu bilden. Es versteht sich, daß dieser Schritt zum Wiederauflösen des Matrixmaterials zusammen mit dem Analytenmaterial die Analyse der Zusammensetzung des Materials bei bestimmten Analysenverfahren unterstützt, wie z. B.
bei der Massenspektrometrie.
Bei einer alternativen Verfahrensweise können die hier beschriebenen Verfahren einen Schritt zur Abgabe eines Gemischs, das aus dem 'Analytenmaterial und dem Matrixmaterial besteht, sowie anderer Materialzusammensetzungen aufweisen.
Auf diese Weise werden die Matrix und der Analyt als ein Materialvolumen auf die Substratoberfläche abgegeben.. In einem weiteren Schritt können die vorbereiteten Probenmaterialanordnungen einem Diagnosegerät zugeführt werden, um Informationen zu ermitteln, welche die Zusammensetzung des Probenmaterials darstellen.
Ein derartiges Diagnosegerät kann ein Massenspektrometer aufweisen. Die Massenspektrometer können Laufzeitmassenspektrometer, Fouriertransformations-Massenspektrometer oder
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irgendein anderer geeigneter Massenspektrometertyp sein, der die Analyse der Zusammensetzung der Probenanordnung gestattet. Bei einer praktischen Ausführung der Verfahren weist der Schritt zur Bereitstellung einer Vesikel mit einer inneren Kammer den Schritt zur Bereitstellung einer Vesikel mit einem piezoelektrischen Element auf, um zu bewirken, daß sich das Fluid durch die Kammer bewegt. Dieses Verfahren kann außerdem den Schritt zur Bewegung der Vesikel durch rasterartiges Führen der Vesikel quer über die Substratoberfläche aufweisen, um die Probenmaterialanordnung auszubilden.
Bei einer alternativen praktischen Ausführung der Verfahren können Parallelverarbeitungsprotokolle angewandt werden, wobei die während der Verarbeitung verwendete Vesikel eine Vesikeleinheit mit mehreren, zu einer Matrix angeordneten Vesikeln zur Abgabe von Fluid in eine erste Gruppe von mehreren Positionen auf der Substratoberfläche aufweist. Auf diese Weise sorgt das Verfahren in einer einzigen Operation zur Ausbildung einer Probenmaterialmatrix auf der Substratoberfläche. Durch Anwendung mehrerer Druckschritte mit der Vesikelmatrix kann zur Ausbildung einer großen Probenmaterialmatrix auch Offsetdruck angewandt werden. Andere Druckverfahren können durch die vorliegende Erfindung angewandt werden, ohne von ihrem Schutzumfang abzuweichen.
In einer weiteren Ausführungsform kann Fluid auf die Oberfläche des Substrats abgegeben werden, indem die Vesikel mit der Substratoberfläche in Kontakt gebracht wird, um die Substratoberfläche mit Probenmaterial zu betupfen. Als Alternative bieten die Verfahren ein anderes, kontaktfreies Druckverfahren, wobei die erfindungsgemäßen Verfahren die Ausbildung eines Fluidtropfens an der distalen Spitze der Vesikel bewirken. Dieser Fluidtropfen wird mit der Substratoberfläche in Kontakt gebracht, um Probenmaterial darauf abzugeben. Dies sorgt für die kontrollierte Abgabe eines bekannten Fluidvoluraens, ohne zum Kontakt der Vesikel mit der Substratoberfläche zu führen.
In weiteren Ausführungsformen werden Vesikeln mit einer inneren Kammer bereitgestellt, die in ihren Abmessungen so an-
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gepaßt ist, daß sie das Füllen der Kammer durch Kapillarwirkung zuläßt.
Nach einem weiteren Aspekt werden Verfahren zur Analyse eines Materials bereitgestellt, welche die folgenden Schritte aufweisen: Bereitstellen einer Vesikel, die sich zum Transport eines Fluids mit darin enthaltenem Material eignet, Anordnen der Vesikel angrenzend an eine erste Position auf der Oberfläche des Substrats, Steuern der Vesikel zur Abgabe eines Nanolitervoluminens des Fluids, um ein definiertes und gesteuertes Fluidvolumen in der ersten Position der Substratoberfläche abzugeben, Bewegen der Vesikel in eine zweite Position, die an eine zweite Stelle auf der Substratoberfläche angrenzt, um ein definiertes und gesteuertes Volumen des Materials entlang einer Anordnung von Positionen auf der Substratoberfläche abzugeben, und Ausführen einer massenspektrometrischen Analyse des Materials in jeder Position der Anordnung. Diese Verfahren können den Schritt zum Vermischen eines Matrixmaterials und eines Analytenmaterials zur Ausbildung des Fluids aufweisen, das auf die Substratoberfläche abgegeben wird. Als Alternative kann diese Ausführungsform die Schritte zum Füllen einer in der Vesikel enthaltenen Kammer mit einem Matrixmaterial und zur Abgabe des Matrixmaterials an die Positionsanordnung aufweisen. Anschließend kann der Analyt abgegeben werden. Der Schritt zur Ausführung der Massenspektrometrie kann den Schritt zur Ausführung einer matrixunterstützten Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie sowie einer Laufzeit-Massenspektrometrie oder einer Fouriertransformations-Massenspektrometrie aufweisen.
Nach einem anderen Aspekt wird eine Vorrichtung zur Ausbildung einer Probenmaterialanordnung auf einer Substratoberfläche bereitgestellt. Eine solche Vorrichtung weist auf: eine Vesikel mit einem distalen Ende, das sich zum Transport eines Fluids darauf eignet, einen beweglichen Arm mit einem an der Vesikel montierten distalen Abschnitt, eine Steuereinrichtung zum Bewegen des Arms, um die Vesikel angrenzend an eine erste Position auf der Oberfläche des Substrats anzuordnen und die Vesikel so zu steuern, daß sie ein Nanolitervolumen des Fluids in der ersten Position der Substratoberfläche abgibt,
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und ein Diagnosegerät zum Analysieren des Materials, um ein Zusammensetzungssignal zu erzeugen, welches die chemische Zusammensetzung des Materials darstellt. In dieser· Vorrichtung kann die Vesikel einen Schaft aus massivem Material und eine Vesikel mit einer für den Transport des Fluids geeigneten Innenkammer sowie mit einer Kammer zum Transport eines Fluids in einem Wandlerelement für das Ausstoßen des Fluids aus der Kammer aufweisen.
Ferner werden hierin Substrate bereitgestellt, die eine Oberfläche zum Tragen einer Anordnung eines Matrixmaterials aufweisen und nach einem Verfahren mit den folgenden Schritten hergestellt werden: Bereitstellen einer Vesikel, die sich zum Transport eines Fluids eignet, das ein Matrixmaterial enthält, Anordnen der Vesikel angrenzend an eine erste Position auf der Oberfläche des Substrats, Steuern der Vesikel zur Abgabe des Fluids in die erste Position der Substratoberfläche und Bewegen einer Vesikel zu einer Gruppe von Positionen angrenzend an die Substratoberfläche sowie Abgabe von Fluid in jeder dieser Positionen, um eine Anordnung von Matrixmaterial auszubilden.
Das Substrat selbst kann ein flaches Siliciumplättchen sowie irgendein anderes geeignetes Material sein und kann mit Grübchen versehen sein, Vertiefungen bzw. Kavitäten aufweisen und Kavitäten mit rauhen Innenflächen aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen weisen die Verfahren zur Ausbildung einer Anordnung von Nucleinsäuren auf einer Substratoberfläche, wie sie hier bereitgestellt werden, die folgenden Schritte auf: Inkontaktbringen vorher festgelegter Positionen der Oberfläche eines unlöslichen Trägers mit thiolhaltigen Nucleinsäurelösungen, die mit einer Vesikel in die Positionen abgegeben werden, die eine innere Kammer aufweist, welche die entsprechenden Lösungen enthält, wodurch die vorgegebenen Positionen thiolreaktive Gruppen enthalten. Als Alternative wird die gesamte Oberfläche des Substrats mit den thiolreaktiven Gruppen derivatisiert, und thiolhaltige Nucleinsäure wird auf eine anordnungsbildende Weise in vorgegebene Positionen auf der Oberfläche abgegeben. Außerdem werden hierin Substrate mit einer Oberfläche bereitgestellt, die
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eine durch die hierin beschriebenen Verfahren ausgebildete Anordnung von Nucleinsäuren aufweist.
Die obigen und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus den nachstehenden Figuren, der ausführlichen Beschreibung und den Patentansprüchen verständlicher werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 zeigt ein System zur Herstellung von Anordnungen eines Probenmaterials zur Analyse.
Fig. 2 zeigt eine Stifteinheit, die sich zur Verwendung mit dem in Fig. 1 abgebildeten System für die Implementierung eines Parallelverfahrens zur Abgabe von Material an eine Substratoberfläche eignet.
Fig. 3 zeigt einen unteren Abschnitt der in Fig. 2 dargestellten Einheit.
Fig. 4 zeigt eine alternative Ansicht des unteren Abschnitts der in Fig. 2 abgebildeten Stifteinheit.
Fig. 5A-5D zeigen ein Verfahren zur Herstellung einer Probenmaterialanordnung.
Fig. 6A-6B zeigen eine alternative Einheit zur Abgabe von Material an die Oberfläche eines Substrats.
Fig. 7 zeigt eine Schemazeichnung, welche die kovalente Bindung von Oligodesoxynucleotiden an eine Siliciumdioxidoberfläche darstellt, wie in den hier angegebenen Verfahren beschrieben. Im einzelnen wurde Siliciumdioxid mit 3-Aminopropyltriethoxysilan zur Reaktion gebracht, um eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminogruppen auf der Oberfläche zu erzeugen. Dann wurde ein heterobifunktionelles Vernetzungsmittel mit dem primären Amin zur Reaktion gebracht, um eine Iodacetamid-Gruppe einzubauen. Ein Oligodesoxynucleotid, das ein 3'- oder 5'-Disulfid enthielt (dargestellt als 5'), wurde mit Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) behandelt, um das Disulfid zu einem freien Thiol zu reduzieren, das dann mit der Iodacetamido-Oberflache verbunden wurde.
Fig. 8 zeigt ein Diagramm, in dem die Konjugation von Oligodesoxynucleotid-Sonden mit einer Siliciumoberfläche als
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Funktion der TCEP-Konzentration dargestellt ist, die in der Disulfid-Reduktion verwendet wurde.
Fig. 9 zeigt ein matrixunterstütztes Laserdesorptions/Ionisations-Laufzeit-(MALDI-TOF-)Massenspektrum eines Silicium-Wafers mit der Oligodesoxynucleotid-Sequenz mit der Bezeichnung "TCUC" (5'-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG-S'; Seq.-ID-Nr. 1), die im wesentlichen gemäß der Beschreibung in Fig. 7 kovalent gebunden ist, und der daran hybridisierten Oligodesoxynucleotidsequenz mit der Bezeichnung "MJM6" (S'-CCGGGTACCGAGCTCGAA-TTC-31; Seq.-ID-Nr. 2).
Fig. 10 zeigt eine Schemazeichnung der Immobilisierung von spezifischen thiolhaltigen DNA-Zielen die durch Polymerasekettenreaktion (PCR) auf der Oberfläche eines Silicium-Wafers erzeugt wurden. Ein zu einem Abschnitt der DNA-Zielsequenz komplementäres Oligonucleotid [Seq.-ID-Nr.: 7] wurde mit dem immobilisierten DNA-Ziel hybridisiert, und es wurde eine MALDI-TOF MS-Analyse ausgeführt, die ein vorherrschendes Signal bei einem beobachteten Masse-Ladungs-Verhältnis von 3618,33 zeigte, daß dem hybridisierten Oligonucleotid mit einem theoretischen Masse-Ladungs-Verhältnis von 3622,4 entsprach .
Fig. 11 zeigt eine Ausführungsform eines Substrats mit darin eingeätzten Kavitäten, die sich zur Aufnahme von Material für die Analyse eignen.
Fig. 12 zeigt ein Beispiel für Spektren, die. man von einem linearen Laufzeit-Massenspektrometergerät erhielt und welche die Materialzusammensetzung des Probenmaterials auf der Oberfläche des in Fig:. Il abgebildeten Substrats darstellen.
Fig. 13 zeigt Molekulargewichte, die für das Probenmaterial mit den in Fig. 12 identifizierten Spektren ermittelt wurden.
Fig. 14 zeigt ein Schema einer 4 &khgr; 4-DNA-Anordnung (16 Positionen) auf der Oberfläche eines Silicium-Wafers mit den thiolhaltigen Oligonucleotid-Molekülen, bezeichnet als "Oligomer 1" [5'-CTGGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-(S)-3'; Seq.-ID-Nr.: 8], Oligomer 2 [S'-iSJ-CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATT-S'; Seq.-ID-Nr.: 3] und "Oligomer 3" (Seq.-ID-Nr.: 1; ein Derivat des "TCUC"-Oligonucleotids mit freiem Thiol von Beispiel 1) , die im we-
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sentlichen gemäß der Beschreibung in Beispiel 2 in 16 Positionen auf der Oberfläche des Silicium-Wafers kovalent gebunden sind.
Fig. 15 zeigt ein Schema der Hybridisierung spezifischer Oligonucleotide an jeder der 16 Positionen der DNA-Hybridisierungsanordnung von Fig. 14, wobei das zu dem Oligomer 1 komplementäre Oligonucleotid (5'-GATGATCCGACGCATCAGa-ATGT-31; Seq.-ID-Nr.: 9) an das Oligomer 1 gebunden ist, während das zum Oligomer 2 komplementäre Oligonucleotid (51-AATACTACACAG-S'; Seq.-ID-Nr.: 7) an das Oligomer 2 und das zum Oligomer 3 komplementäre Oligonucleotid (5'-CCGGGTACCGaGCTC-GAATTC-3'; Seq.-ID-Nr.: 2) an das Oligomer 3 gebunden ist.
Fig. 16 zeigt ein repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum einer 4 &khgr; 4-DNA-Anordnung (16 Positionen) auf einem Silicium-Wafer, die schematisch in Fig. 15 dargestellt ist. Das Spektrum zeigt ein einzelnes, vorherrschendes Signal eines experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnisses in jeder Position entsprechend den spezifischen hybridisierten Oligonucleotiden. Die 2+ zeigt die Position eines doppelt geladenen Moleküls an, das als Vergleichsstandard bei der MALDI-TOF MS-Analyse verwendet wird. Das * bezeichnet Restmengen eines verunreinigenden Oligonucleotids, die nach den Waschverfahren auf der Oberfläche des Plättchens zurückbleiben. Die relative Position des ^-Signals zeigt die annähernde Größe des verunreinigenden Oligonucleotids .
Fig. 17 zeigt ein repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum einer 8 &khgr; 8-DNA-Anordnung (64 Positionen). Das Spektrum zeigt ein einzelnes, vorherrschendes Signal eines experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnisses, das den vorausgesagten spezifischen hybridisierten Oligonucleotiden entspricht. Das * bezeichnet Restmengen eines verunreinigenden Oligonucleotids, die nach den Waschverfahren auf der Oberfläche des Wafers zurückbleiben. Die relative Position des *- Signals zeigt die ungefähre Größe des verunreinigenden Nucleotids.
Fig. 18 ist eine Darstellung der Nucleotid-Verlängerung eines DNA-Primers, der mit einer thiolhaltigen DNA-Matrize reassoziiert ist, die auf der Oberfläche eines SIAB-
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derivatisierten Silicium-Wafers immobilisiert ist. Ein komplementärer 12-mer-Oligonucleotid-Primer [Seq.-ID-Nr.: 12] wurde an ein thiolhaltiges 27-mer-Oligonucleotid [Seq.-ID-Nr. 11] hybridisiert, das durch das SIAB-Vernetzungsmittel auf einem Siliciumträger immobilisiert war. Die Siliciumoberflache, die das immobilisierte doppelsträngige DNA-Molekül enthielt, wurde mit DNA-Polymerase in Gegenwart von dATP, dCTP, dGTP und ddTTP unter Verlängerungsbedingungen inkubiert und einer MALDI-TOF MS-Analyse unterworfen. Das Massenspektrum des Silicium-Wafers zeigte die Gegenwart von zwei vorherrschenden Signalen; eines mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis gleich dem des unverlängerten 12-mer-Oligonucleotids, sowie ein Signal, das einem 15-mer-DNA-Molekül entsprach, das auf dem Wafer um 3 Nucleotide bis zur ersten Position in der Sequenz verlängert worden ist, in der ein ddTTP eingebaut war.
Fig. 19 zeigt ein Diagramm eines Experiments, das entworfen wurde, um den Effekt des Abstands zwischen der SIAB-derivatisierten Oberfläche und dem bei den Primerverlängerungsreaktionen ausgebildeten doppelstrangigen DNA-Molekül zu prüfen. Zwei thiolhaltige Oligonucleotide von unterschiedlicher Sequenz [Seq.-ID-Nrn.: 8 & 11] wurden auf einer SIAB-derivatisierten Siliciumoberflache immobilisiert und mit spezifischen Oligonucleotiden inkubiert, die ein doppelsträngiges DNA-Molekül mit Spacern (= nichtcodierenden DNA-Sequenzen) von 0, 3, 6, 9 und 12 Basen zwischen der SIAB-derivatisierten Oberfläche und dem doppelstrangigen DNA-Molekül ausbilden, das von dem an der immobilisierten thiolhaltigen DNA hybridisierten Oligonucleotid gebildet wird. Das freie 3'-Ende des hybridisierten Oligonucleotids wurde entweder mit Sequenase-DNA-Polymerase oder mit ThermoSequenase-DNA-Polymerase in Gegenwart der drei Desoxynucleotidtriphosphate und des entsprechenden Dxdesoxynucleotidtriphosphats unter Verlängerungsbedingungen verlängert, und die entstehenden Reaktionsprodukte wurden einer MALDI-TOF MS-Analyse unterworfen.
Fig. 20 zeigt ein repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum der spezifischen Verlängerungsprodukte des in Fig. 19 dargestellten Primerverlängerungsexperiments (primer extension) . Die Spektren in der linken Spalte sind diejenigen, die
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sich aus der MALDI-TOF MS-Analyse der Verlängerungsreaktionen ergeben, in denen Sequenase verwendet wurde. Die Spektren in der rechten Spalte sind diejenigen, die sich aus der Analyse der Verlängerungsreaktionen ergeben, in denen ThermoSequenase verwendet wurde. ThermoSequenase-DNA-Polymerase konnte das 3&Lgr;-Ende des hybridisierten DNA-Primers verlängern, wobei der Abstand zwischen dem doppelsträngigen DNA-Molekül und der Oberfläche des derivatisierten Silicium-Wafers zwischen 0 und 12 Nucleotiden variierte. Sequenase-DNA-Polymerase konnte gleichfalls die hybridisierte DNA verlängern, wobei der Abstand zwischen dem doppelsträngigen DNA-Molekül und dem Silicium-Wafer 3 bis 9 Nucleotide betrug.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN Definitionen
Wenn nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie normalerweise vom Fachmann auf dem Gebiet verstanden wird, zu dem die vorliegende Erfindung gehört. Alle Patentschriften und Veröffentlichungen, auf die hierin Bezug genommen wird, werden hier zur Bezugnahme einbezogen.
Der Begriff "Nucleinsäure", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf Oligonucleotide oder Polynucleotide, wie zum Beispiel Desoxyribonucleinsäure (DNA) und Ribonucleinsäure (RNA) , sowie auf Analoge von RNA oder DNA, die beispielsweise aus Nucleotid-Analogen bestehen, die jeweils in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form vorliegen können. Nucleinsäuremoleküle können synthetisch sein oder können aus einer bestimmten biologischen Probe unter Anwendung einer beliebigen Anzahl von dem Fachmann bekannten Verfahren isoliert werden, wobei das gewählte spezielle Verfahren für die jeweilige biologische Probe geeignet ist.
Zu "Nucleotiden", wie sie hierin verwendet werden, gehören Nucleosidmono-, -di- und -triphosphate. Nucleotide schließen außerdem modifizierte Nucleotide ein, wie zum Beispiel Phosphorthioat-Nucleotide und Deazapurin-Nucleotide. Ein vollständiger Satz von kettenverlängernden Nucleotiden bezieht
sich auf vier verschiedene Nucleotide, die an jeder der vier verschiedenen Basen, welche die DNA-Matrize bilden, hybridisieren können.
Der Begriff "Nucleinsäuresynthese", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf irgendein Verfahren, wodurch Oligonucleotide oder Polynucleotide erzeugt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Verfahren, die mit chemischen oder enzymatischen Reaktionen verbunden sind.
Der Begriff "Anordnung" (array) bezieht sich auf eine geordnete Anordnung von Elementen oder Positionen. Die Anordnung kann eine beliebige Anzahl von Elementen oder Positionen enthalten und kann in den verschiedensten Formen vorliegen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Anordnung zweidimensional und enthält &eegr; &khgr; m Elemente, wobei m und &eegr; ganze Zahlen sind, die gleich oder verschieden sein können. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind &eegr; und m jeweils gleich 4 oder ein Vielfaches davon.
Der Begriff "Vernetzungsmittel" ist ein Fachbegriff und bezieht sich, wie er hier gebraucht wird, auf Reagenzien, die eine Nucleinsäure an einem unlöslichen Träger immobilisieren können, vorzugsweise durch kovalente Bindungen. So schließen zur Verwendung hierin geeignete "Vernetzungsmittel" die verschiedensten Mittel ein, die mit einer funktioneilen Gruppe, die auf einer Oberfläche des unlöslichen Trägers vorhanden ist, und mit einer in dem Nucleinsäuremolekül vorhandenen funktioneilen Gruppe reaktionsfähig sind. Reagenzien, die eine solche Reaktionsfähigkeit aufweisen können, sind unter anderem homo- und heterobifunktionelle Reagenzien, von denen viele dem Fachmann bekannt sind. Heterobifunktionelle Reagenzien werden bevorzugt.
Der Begriff "thiolreaktive Funktionalität", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf eine Funktionalität, die zu einer schnellen Reaktion mit einer nucleophilen Thiolkomponente fähig ist, um eine kovalente Bindung zu erzeugen (z. B. eine Disulfid- oder Thioetherbindung). Im allgemeinen sind Thiolgruppen gute Nucleophile, und bevorzugte thiolreaktive Funktionalitäten sind reaktive Elektrophile. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von thiolreaktiven Funktionalitäten bekannt, zu
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denen beispielsweise Halogenacetyle (vorzugsweise Iodacetyl) , Diazoketone, Epoxyketone, &agr;,ß-ungesättigte Carbonyle (z. B. &agr;,&bgr;-Enone) und andere reaktive Michael-Akzeptoren (einschließlich Maleinimide), Säurehalogenide, Benzylhalogenide und dergleichen gehören. In bestimmten Ausführungsformen kann eine freie Thiolgruppe eines Disulfids mit einer freien Thiolgruppe reagieren (d. h. durch Bildung einer Disulfidbindung, einschließlich durch Disulfidaustausch). Ein "thiolreaktives" Vernetzungsmittel, wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Vernetzungsmittel (oder eine Oberfläche) , das (die) mindestens eine thiolreaktive Funktionalität aufweist oder so modifiziert werden kann, daß es (sie) diese Funktionalität aufweist. Man wird erkennen, daß die Reaktion einer Thiolgruppe durch Blockieren mit einer geeigneten Schutzgruppe vorübergehend verhindert werden kann, wie es auf diesem Gebiet herkömmlich ist (siehe z. B. T.W. Greene und P.G.M. Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis" (Schutzgruppen in der organischen Synthese), 2. Aufl., John Wiley & Sons, (1991)).
Der Begriff "selektiv spaltbarer Linker", wie er hier gebraucht wird, bezeichnet einen Linker, der unter ausgewählten Bedingungen gespalten wird, wie z. B. ein photospaltbarer Linker, ein chemisch spaltbarer Linker und ein enzymatisch spaltbarer Linker (d. h. eine Restriktionsendonuclease-Stelle oder ein Ribonucleotid/RNase-AufSchluß). Der Linker ist zwisehen dem Träger und der immobilisierten DNA eingebaut.
Die Begriffe "Protein", "Polypeptid" und "Peptid", wie sie hier gebraucht werden, werden austauschbar verwendet, wenn auf eine translatierte Nucleinsäure (z. B. ein Genprodukt) Bezug genommen wird.
Der Begriff "Probe", wie er hierin gebraucht wird, soll eine Zusammensetzung bezeichnen, die ein nachzuweisendes Material enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe eine "biologische Probe" (d. h. irgendein aus einer lebenden Quelle gewonnenes Material (z. B. von Mensch, Tier, Pflanze, Bakterien, Pilzen, Einzellern, Viren). Die biologische Probe kann in irgendeiner Form vorliegen, einschließlich fester Materialien (z. B. Gewebe, Zellpellets und Biopsien) und biologischer Fluide (z. B. Urin, Blut, Speichel, Frucht-
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wasser und Mundspülflüssigkeit (die Buccalzellen enthält)). Vorzugsweise werden feste Materialien mit einem Fluid vermischt .
Der Begriff "Substrat", wie er hier gebraucht wird, soll einen unlöslichen Träger bezeichnen, auf den eine Probe entsprechend den hier beschriebenen Materialien aufgebracht wird. Beispiele geeigneter Substrate sind unter anderem Kügelchen (z. B. Silicagel, Glas mit kontrollierter Porosität, Magnetwerkstoff, Sephadex/Sepharose, Cellulose) , Kapillaren, ebene Träger, wie z. B. Glasfaserfilter, Glasflächen, Metallflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Kupfer und Silicium), Kunststoffmaterialien einschließlich Multi- bzw. Mehrkavitätenplatten oder Membranen (z. B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid), Stifte (z. B. Stiftanordnungen, die sich für die kombinatorische Synthese oder Analyse eignen) oder Kügelchen in Vertiefungen von ebenen Oberflächen, wie z. B. von Wafern (z. B. Silicium-Wafern) mit oder ohne Platten.
Bei den hier bereitgestellten besonderen Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren an einem Substrat sind bevorzugte Substrate diejenigen, die eine Bindung von Nucleinsäuren an das Substrat in hohen Dichten unterstützen können, vorzugsweise derart, daß die kovalent gebundenen Nucleinsäuren auf dem Substrat in einer Dichte von mindestens etwa 20 fmol/mm vorhanden sind, stärker bevorzugt mindestens etwa 75
2 2
fmol/mm , noch stärker bevorzugt mindestens etwa 85 fmol/mm ,
2
noch stärker bevorzugt mindestens etwa 100 fmol/mm und am
2
stärksten bevorzugt mindestens etwa 150 fmol/mm . Zu den am stärksten bevorzugten Substraten zur Verwendung bei den hier bereitgestellten besonderen Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren an Substraten gehört Silicium, während zu den weniger bevorzugten Substraten polymere Materialien gehören, wie z. B. Polyacrylamid. Zu den verwendbaren Substraten bei den hier bereitgestellten Verfahren für die Herstellung von Anordnungen gehören die verschiedensten unlöslichen Trägermaterialien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Silicagel, Glas mit kontrollierter Porosität, Cellulose, Glasfaserfilter, Glasoberflächen, Metalloberflächen (Stahl, Gold, SiI-
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ber, Aluminium, Silicium und Kupfer), Kunststoffmaterialien (&zgr;. B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid) und Silicon.
Immobilisierung von Nucleinsäuren in hoher Dichte auf festen Trägern
Die hierin beschriebenen Verfahren sorgen für die Immobilisierung von Nucleinsäuremolekülen in hoher Dichte auf einem unlöslichen (z. B. festen) Träger. Im allgemeinen werden Nucleinsäuremoleküle auf dem unlöslichen Träger entweder direkt oder mit Hilfe von Vernetzungsmitteln immobilisiert.
Bei Ausführungsformen der Verfahren, bei denen kein Vernetzungsmittel verwendet wird, wird eine modifizierte Nucleinsäure direkt mit einer geeignet funktionalisierten Oberfläche zu einer immobilisierten Nucleinsäure umgesetzt. So kann zum Beispiel eine iodacetyl-modifizierte Oberfläche (oder eine andere thiolreaktive Oberflächen-Funktionalität) mit einer thiolmodifizierten Nucleinsäure zu immobilisierten Nucleinsäuren reagieren.
Nach den hier bereitgestellten Verfahren wird das Vernetzungsmittel so ausgewählt, daß es eine hohe Dichte von Nucleinsäuren liefert, die auf den unlöslichen Träger immobilisiert sind. Ohne die Theorie dadurch einschränken zu wollen, glauben wir, daß die hier beschriebene hohe Dichte von immobilisierten Nucleinsäuren zumindest teilweise auf eine relativ schnelle Reaktion zurückzuführen ist, die zwischen dem Vernetzungsmittel und der Nucleinsäure (z. B. einer thiolmodifizierten Nucleinsäure) auftritt, verglichen mit anderen Reaktionen, die früher zum Immobilisieren von Nucleinsäuren verwendet wurden. Außerdem kann eine hohe Dichte zumindest teilweise auf einen engen Abstand der reaktiven Gruppen (z. B. Aminogruppen einer anderen reaktiven Funktionalität) auf dem funktionalisierten unlöslichen Träger zurückzuführen sein. Folglich werden Reagenzien zum Modifizieren der Oberfläche im allgemeinen so ausgewählt, daß sie dicht beabstandete Funktionalitäten auf dem funktionalisierten Träger liefern. Das Vernetzungsmittel (und andere Reagenzien, die zum Funktionalisieren der Trägeroberfläche oder des Nucleinsäuremoleküls verwendet werden)
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können so ausgewählt werden, daß sie jeden gewünschten Abstand der immobilisierten Nucleinsäuremoleküle von der Trägeroberfläche und jeden gewünschten Abstand der immobilisierten Nucleinsäuren voneinander liefern. So kann die sterische Hinderung der Nucleinsäuremoleküle durch die Wahl eines geeigneten Vernetzungsmittels vermindert oder beseitigt werden. In bestimmten Ausführungsformen kann das Vernetzungsmittel so gewählt werden, daß es mehrere reaktive Funktionalitäten liefert, wie sie bei der Dendrimer-Synthese zur Anlagerung von mehreren Nucleinsäuren an eine einzige vernetzende Komponente verwendet werden. Vorzugsweise wird das Vernetzungsmittel so gewählt, daß es mit dem Nucleinsäuremolekül in hohem Maße reaktionsfähig ist, um eine schnelle, vollständige und/oder selektive Reaktion zu ergeben. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Reaktionsvolumen der Reagenzien (z. B. der Thiolgruppe und der thiolreaktiven Funktionalität) klein.
Nucleinsäuren und Linker
Bevorzugte Nucleinsäuren zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind "thiolmodifizierte Nucleinsäuren", d. h.
Nucleinsäuren, die so derivatisiert sind, daß sie mindestens eine reaktive Thiolkomponente enthalten. Wie weiter unten im Beispiel 1 ausführlicher beschrieben, werden Nucleinsäuren, die mindestens ein reaktives Thiol enthalten, vorzugsweise durch Behandeln einer Nucleinsäure, die ein 3'- oder 5'-Disulfid enthält, mit einem Reduktionsmittel hergestellt, das vorzugsweise nicht in nachfolgenden Reaktionen konkurriert (d. h. es reagiert nicht^ mit einer Iodacetimido-Funktionalität). Disulfid-derivatisierte Nucleinsäuren können nach den verschiedensten Verfahren synthetisiert werden. Zum Beispiel kann eine Nucleinsäure am 3'- oder 5'-Ende durch Reaktion mit einem disulfidhaltigen Modifikationsmittel modifiziert werden. Alternativ kann ein thiolierter Primer enzymatisch oder nichtenzymatisch an die Nucleinsäure gebunden werden. Eine 5'-Phosphoramidat-Funktionalität kann gleichfalls einen Bindungspunkt für ein Thiol oder ein disulfidhaltiges Cytosin oder Desoxycytosin liefern. Beispiele geeigneter Reduktionsmittel zur Reduktion einer disulfid-modifizierten Nucleinsäure sind unter
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anderem: Tris (2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) (vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 1-10OmM (am stärksten bevorzugt etwa 1OmM)) wird bei einem pH-Wert im Bereich von 3-6 (am stärksten bevorzugt etwa 4,5), einer Temperatur im Bereich von 20-450C (am stärksten bevorzugt etwa 37°C) über eine Zeit im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 h (am stärksten bevorzugt etwa 5 h) zur Reaktion gebracht; Dithiothreitol (vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 25 bis 10OmM (je nachdem, ob der Reaktionspartner isoliert ist) wird bei einem pH-Wert im Bereich von 6-10 (am stärksten bevorzugt etwa 8) und einer Temperatur im Bereich von 25-450C (am stärksten bevorzugt etwa 37°C) über eine Zeit im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 h (am stärksten bevorzugt etwa 5 h) zur Reaktion gebracht. TCE bietet einen Vorteil bei dem niedrigen pH-Wert, bei dem es reaktionsfähig ist. Durch diesen niedrigen pH-Wert werden Thiole wirksam protoniert, so daß nucleophile Reaktionen von Thiolen unterdrückt werden und weniger Nebenreaktionen als bei anderen Disulfid-Reduktionsmitteln auftreten, die bei höheren pH-Werten verwendet werden.
Wie weiter unten in Beispiel 1 beschrieben, ist ein bevorzugtes bifunktionelles Vernetzungsmittel N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat (SIAB). Andere Vernetzungsmittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Dimaleinimid, Dithio-bis-nitrobenzoesäure (DTNB), N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiolpropionat (SPDP) , Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) und 6-Hydrazinonicotinimid (HYNIC), die gleichfalls in dem neuen Verfahren verwendet werden können. Wegen weiterer Beispiele von Vernetzungsmitteln siehe z. B.
Wong, "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking" (Chemie der Proteinkonjugation und -vernetzung), CRC Press (1991), und Hermanson, "Bioconjugate Techniques" (Biokonjugat-Verfahren), Academic Press (1995).
In bevorzugten Ausführungsbeispielen wird die Nucleinsäure unter Verwendung der photospaltbaren Linker-Komponente immobilisiert, die während der Massenspektrometrie gespalten wird. Typische Beispiele von photolabilen bzw. lichtempfindlichen Vernetzungsmitteln schließen ein, sind aber nicht be-
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schränkt auf 3-Amino(2-nitrophenyl)propionsäure (Brown et al.
(1995) Molecular Diversity, S. 4-12, und Rothschild et al.
(1996) Nucleic Acids Res. 24: 361-66).
In einer weiteren Ausführungsform der hier bereitgestellten Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einer Ziel-Nucleinsäuresequenz sowie der Immobilisierungsverfahren wird eine zur Ziel-Nucleinsäure komplementäre einzelsträngige Nucleinsäure durch eine Kopplung, die eine Bindung zwischen einer Thiolgruppe und einer thiolreaktiven Funktionalität sowie eine spaltbare, vorzugsweise eine selektiv spaltbare Linkerkomponente aufweist, an einer Oberfläche immobilisiert.
Linker
Eine Ziel-Nachweisstelle kann über eine reversible oder irreversible Bindung zwischen einer geeigneten Funktionalität (L1) an dem Ziel-Nucleinsäuremolekül (T) und einer geeigneten Funktionalität (L) an dem Einfangmolekül direkt an einen festen Träger gebunden werden. Eine reversible Bindung kann so beschaffen sein, daß sie unter den Bedingungen der Massenspektrometrie aufgespalten wird (d. h. eine photospaltbare Bindung, wie z. B. ein Charge-Transfer-Komplex, oder eine instabile Bindung, die zwischen relativ stabilen organischen Radikalen gebildet wird).
Photospaltbare Linker sind Linker, die bei Belichtung gespalten werden (siehe z. B. Goldmacher et al. (1992) Bio con j . Chem. 3: 104-107), wodurch das ins Auge gefaßte Agens bei Belichtung freigesetzt wird. Photospaltbare Linker, die bei Belichtung gespalten werden, sind bekannt (siehe z. B. Hazum et al. (1981) in Pept. , Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt, K. (Hrsg.), S. 105-110, wo die Verwendung einer Nitrobenzylgruppe als photospaltbare Schutzgruppe für Cystein beschrieben wird/ Yen et al. (1989) Makromol. Chem. 190: 69-82, der wasserlösliche photospaltbare Copolymere beschreibt, zu denen Hydroxypropylmethacrylamid-Copolymer, Glycin-Copolymer, Fluorescein-Copolymer und Methylrhodamin-Copolymer gehören; Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107, der ein Vernetzungsmittel und ein Reagens beschreibt, das bei Belichtung mit Licht in nahem UV-Bereich (350nm) eine photolyti-
&bull; ·
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sehe Zersetzung erfährt; und Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol. 42: 231-237, der Nitrobenzyloxycarbonylchlorid-Vernetzungsmittel beschreibt, die photospaltbare Bindungen erzeugen) , wodurch die Zielsubstanz unter Belichtung freigesetzt wird. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Nucleinsäure unter Verwendung der photospaltbaren Linker-Komponente immobilisiert, die während der Massenspektrometrie gespalten wird.
Außerdem kann die Bindung mit L' als quartärer Ammoniumgruppe ausgebildet werden, in welchem Falle die Oberfläche des festen Trägers vorzugsweise negative Ladungen trägt, welche die negativ geladene Nucleinsäure-Hauptkette abstoßen und auf diese Weise die Desorption erleichtern, die für die Analyse durch ein Massenspektrometer erforderlich ist. Desorption kann entweder durch die von dem Laserimpuls erzeugte Wärme und/oder, in Abhängigkeit von L1, durch spezifische Absorption von Laserenergie auftreten, die mit dem L'-Chromophor in Resonanz ist.
So kann die L-L'-Chemie vom Typ einer Disulfidbindung (chemisch spaltbar, zum Beispiel durch Mercaptoethanol oder Dithioerythrol), eines Biotin/Streptavidin-Systems, eines heterobifunktionellen Derivats einer Tritylethergruppe sein (siehe z. B. Köster et al. (1990) "A Versatile Acid-Labile Linker for Modification of Synthetic Biomolecules", Tetrahedron Letters 31:7095), die unter schwach sauren Bedingungen sowie unter Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten werden können, einer Lävulinylgruppe, die unter nahezu neutralen Bedingungen mit einem Hydrazinium/Acetat-Buffer spaltbar ist, einer Arginin-Arginin- oder Lysin-Lysin-Bindung, die durch ein Endopeptidase-Enzym wie z. B. Trypsin spaltbar ist, oder einer Pyrophosphat-Bindung, die durch eine Pyrophosphatase spaltbar ist, oder einer Ribonucleotid-Bindung zwischen der Oligodesoxynucleotid-Sequenz, die zum Beispiel durch eine Ribonuclease oder Alkali gespalten werden kann.
Die Funktionalitäten L und L1 können auch einen Charge-Transfer-Komplex und dadurch die zeitweilige L-L'-Bindung bilden. Da in vielen Fällen die "Charge-Transfer-Bande" durch Spektrometrie im UV/sichtbaren Bereich bestimmt werden kann (siehe z. B. Organic Charge Transfer Complexes von R. Foster,
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Academic Press, 1969), kann die Laserenergie auf die entsprechende Energie der Charge-Transfer-Wellenlänge abgestimmt werden, und auf diese Weise kann eine spezifische Desorption vom festen Träger eingeleitet werden. Der Fachmann wird erkennen, daß verschiedene Kombinationen diesen Zweck erfüllen können, und daß die Donor-Funktionalität entweder auf dem festen Träger vorhanden sein oder mit dem nachzuweisenden Nucleinsäuremolekül verbunden sein kann, oder umgekehrt.
In einem weiteren Verfahren kann durch homolytische Bildung von relativ stabilen Radikalen eine reversible L-L'-Bindung erzeugt werden. Unter dem Einfluß des Laserimpulses findet in der Position des Radikals eine Desorption (wie oben diskutiert) sowie eine Ionisation statt. Der Fachmann wird erkennen, daß andere organische Radikale ausgewählt werden können, und daß in Bezug auf die Dissoziationsenergien, die zur homolytischen Spaltung der Bindung zwischen ihnen benötigt werden, eine entsprechende Laser-Wellenlänge ausgewählt werden kann (siehe z. B. Reactive Molecules von C. Wentrup, Hohn Wiley & Sons, 1984) .
Bei der Ausführung der Exonuclease-Sequenzierung mit Hilfe der MALDI-TOF MS (Massenspektrometrie) wird ein einzelsträngiges DNA-Molekül, das über sein 5-Ende an einem festen Träger immobilisiert ist, einseitig mit einer 3'-aktiven Exonuclease abgebaut, und anschließend wird das Molekulargewicht des abgebauten Nucleotids bestimmt. Eine umgekehrte. Sanger-Sequenzierung offenbart die Nucleotidsequenz der immobilisierten DNA. Durch Zugabe eines selektiv spaltbaren Linkers kann nicht nur die Masse der freien Nucleotide bestimmt, sondern nach Entfernen der Nucleotide durch Waschen auch die Masse des verbleibenden Fragments mittels MALDI-TOF nach dem Abspalten der DNA vom festen Träger nachgewiesen werden. Unter Verwendung selektiv spaltbarer Linker, wie zum Beispiel der hierin bereitgestellten photospaltbaren und chemisch spaltbaren Linker, kann diese Spaltung so gewählt werden, daß sie während der Ionisations- und Verdampfungsschritte der MALDI-TOF-Masenspektrometrie auftritt. Das gleiche Grundprinzip gilt für einen 5'-immobilisierten Strang einer doppelsträngigen DNA, die im doppelsträngigen Zustand zersetzt wird. Ebenso gilt
dies auch, wenn eine 5'-aktive Exonuclease verwendet und die DNA über das 3'-Ende an dem festen Träger immobilisiert wird.
Wie festgestellt wurde, werden hierin mindestens drei Versionen der Immobilisierung ins Auge gefaßt: 1) die Ziel-Nucleinsäure wird amplifiziert oder gewonnen {die Zielsequenz oder umgebende DNA-Sequenz muß bekannt sein, so daß Primer zum Amplifizieren oder Isolieren hergestellt werden können); 2) die Primer-Nucleinsäure wird an dem festen Träger immobilisiert, und die Ziel-Nucleinsäure wird daran hybridisiert (dies dient zum Nachweis der Gegenwart oder zum Sequenzieren einer Zielsequenz in einer Probe); oder 3) eine doppelsträngige DNA (amplifiziert oder isoliert) wird durch Bindung an einen vorgegebenen Strang immobilisiert, die DNA wird denaturiert, um den Doppelstrangzustand zu beseitigen, und dann wird eine hohe Konzentration eines komplementären Primers oder einer stromaufwärts der Zielstelle identischen DNA zugegeben, und es tritt eine Strangverdrängung auf, und der Primer wird an dem immobilisierten Strang hybridisiert.
In den Ausführungsformen, wo die Primer-Nucleinsäure auf dem festen Träger immobilisiert und die Ziel-Nucleinsäure daran hybridisiert wird, ermöglicht der Einbau des spaltbaren Linkers die Immobilisierung der Primer-DNA am 5'-Ende, so daß eine freie 3'-OH-Gruppe für die Nucleinsäuresynthese (Verlängerung) verfügbar ist und die Sequenz der "hybridisierten" Ziel-DNA bestimmt werden kann, da die hybridisierte Matrize durch Denaturieren entfernt werden kann und die verlängerten DNA-Produkte von dem festen Träger für eine MALDI-TOF MS abgespalten werden können: Entsprechend kann bei 3) der immobilisierte DNA-Strang verlängert werden, wenn er an der Matrize hybridisiert ist, und vom Träger abgespalten werden. So können weiter unten diskutierte Verlängerungsreaktionen zur Sanger-Sequenzierung und zur Primer-Oligo-Basenverlängerung (PROBE = p_rimer oligo base extension) unter Verwendung eines immobilisierten Primers einer bekannten Stromaufwärts-DNA-Sequenz ausgeführt werden, die komplementär zu einem unveränderlichen Bereich einer Zielsequenz ist. Die Nucleinsäure von der Person wird gewonnen, und die DNA-Sequenz eines variablen Bereichs (Deletion, Insertion, Fehlsinnmutation, die genetische Prädis-
&bull; ·&diams;&diams;&diams; ··
t ·
position oder Krankheiten verursachen, oder die Gegenwart einer viralen/bakteriellen oder Pilz-DNA) wird nicht nur nachgewiesen, sondern auch die tatsächliche Sequenz und die Position der Mutation werden bestimmt.
In anderen Fällen müssen die Ziel-DNA immobilisiert und der Primer reassoziiert werden. Dies erfordert die Amplifikation einer größeren DNA, die auf einer bekannten Sequenz basiert, und das anschließende Sequenzieren der immobilisierten Fragmente (d. h. die verlängerten Fragmente werden hybridisiert, aber nicht an dem Träger immobilisiert, wie oben beschrieben) . In diesen Fällen ist der Einbau eines Linkers nicht wünschenswert, da das MALDI-TOF-Spektrum das der hybridisierten DNA ist; es ist nicht notwendig, die immobilisierte Matrize abzuspalten.
Jeder beliebige, dem Fachmann bekannte Linker zum Immobilisieren von Nucleinsäuren an festen Trägern kann hier verwendet werden, um die Nucleinsäure mit einem festen Träger zu verbinden. Die hier bevorzugten Linker sind die selektiv spaltbaren Linker, besonders diejenigen, die hier als Beispie-Ie angegeben wurden. Andere Linker sind unter anderem säurespaltbare Linker, wie zum Beispiel Bismaleinimidothoxypropan, säureempfindliche Trityl-Linker.
Säurespaltbare Linker, photospaltbare und hitzeempfindliche Linker können gleichfalls verwendet werden, besonders wo es unter Umständen notwendig ist, daß Ziel-Agens zu spalten, um es für eine Reaktion leichter zugänglich zu machen. Säurespaltbare Linker schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Bismaleinimidothoxypropan und Adipinsäuredihydrazid-Linker (siehe z. B. Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584-
589) sowie säureempfindliche Transferrin-Konjugate,. die einen ausreichenden Anteil Transferrin enthalten, um den Eintritt in den intrazellulären Transferrin-Kreislauf zu ermöglichen (siehe z. B. Welhörner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:4309-4314) .
Photospaltbare Linker
Es werden photospaltbare Linker bereitgestellt. Insbesondere werden photospaltbare Linker in Form ihrer Phosphora-
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midit-Derivate zur Verwendung in der Festphasensynthese von Oligonucleotiden bereitgestellt. Die Linker enthalten o-Nitrobenzyl-Komponenten und Phosphatbindungen, die unter UV-Bestrahlung innerhalb von Minuten eine vollständige photolytisehe Spaltung der Konjugate zulassen. Die verwendeten UV-Wellenlängen werden so ausgewählt, daß die Bestrahlung die Oligonucleotide nicht schädigt, und liegen vorzugsweise bei etwa 350-380 nm, stärker bevorzugt bei 365 nm. Die hierin bereitgestellten photospaltbaren Linker weisen im Vergleich zu gewöhnlieh verwendeten Phosphoramidit-Monomeren eine vergleichbare Kopplungsleistung auf (siehe Sinha et al. (1983) Tetrahedron Lett. 24: 5843-5846; Sinha et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 4539-4557; Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49: 6123-6194; und Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-
3191) .
In einer Ausführungsform haben die photospaltbaren Linker die Formel I:
(I)
wobei R ein &ohgr;-(4,4'-Dimethoxytrityloxy) alkyl- oder co-
Hydroxyalkylrest ist; R aus einem Wasserstoffatom, Alkyl-, Aryl-, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl- und Carboxy-Rest aus-
gewählt ist; R ein Wasserstoffatom oder ein (Dialkylamino) ( &ohgr;-cyanalkoxy)P-Rest ist; t gleich 0-3 ist und R ein Alkyl-, Alkoxy-, Aryl- oder Aryloxy-Rest ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform haben die photospaltbaren Linker die Formel II:
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(il)
wobei
,20
ein &ohgr;-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl-, &ohgr;-
Hydroxyalkyl- oder Alkyl-Rest ist; R aus einem Wasserstoffatom, Alkyl-, Aryl-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl- und
22
Carboxy-Rest ausgewählt ist; R ein Wasserstoffatom oder ein
20
(Dialkylamino)(&ohgr;-cyanalkoxy)P-Rest ist und X ein Wasser-
20 stoffatom, Alkylrest oder OR ist.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist R eine
3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-, 3-Hydroxypropyl- oder Me-
21
thylgruppe; R ist aus einem Wasserstoffatom, einer Methyl-
22
und Carboxygruppe ausgewählt; R ist ein Wasserstoffatom oder
20
eine (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe; und X ist ein
20
Wasserstoff, eine Methylgruppe oder OR . In einer stärker be-
20
vorzugten Ausführungsform ist R eine 3-(4,4'-Dimethoxy-
21 22
trityloxy)propylgruppe; R ist eine Methylgruppe; R ist ei-
20
ne (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe; und X ist ein
Wasserstoffatom. In einer weiteren, stärker bevorzugten Ausführungsform ist R eine Methylgruppe; R ist eine Methyl-
22
gruppe; R ist eine (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe;
20
und X ist eine 3-(4, 4'-Dimethoxytrityloxy)propoxygruppe.
(IU)
* 1
* i
- 41 -
In einer weiteren Ausführungsform haben die photospaltbaren Linker die Formel III:
NO
(II!)
wobei R
23
ein Wasserstoffatom oder ein(Dialkylamino) ( &ohgr;-
24
cyanalkoxy) P-Rest ist und R aus einem &ohgr;-Hydroxyalkoxy-, co-(4, 4 '-Dimethoxytrityloxy) alkoxy-, co-Hydroxyalkyl- und &ohgr;-4,4'-(Dimethoxytrityloxy)alkylrest ausgewählt und nicht substituiert oder an der Alkyl- oder Alkoxy-Kette mit einer oder mehreren Alkylresten substituiert ist; r und s jeweils unabhängig voneinander 0-4 bedeuten; und R ein Alkyl-, Alkoxy-, Aryl-
24 oder Aryloxyrest ist. In bestimmten Ausführungsformen ist R
ein &ohgr;-Hydroxyalkyl oder &ohgr;-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkylrest und ist an der Alkylkette mit einer Methylgruppe substituiert.
In bevorzugten Ausführungsformen ist R em Wasserstoffatom oder eine (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe;
24
und R ist aus einer 3-Hydroxypropoxy-, 3&mdash;(4,4'&mdash; Dimethoxytrityloxy)propoxy-, 4-Hydroxybutyl-, 3-Hydroxy-lpropyl-, l-Hydroxy-2-propyl-, 3-Hydroxy-2-methyl-l-propyl-, 2-Hydroxyethyl-, Hydroxymethyl-, 4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl-, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-1-propyl-, 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl-, 1-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-propyl-, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-methyl-l-propyl- und 4,4'-Dimethoxytrityloxymethylgruppe ausgewählt.
23
In stärker bevorzugten Ausführungsformen ist R eine (Diisopropylamino)(2-cyanethoxy)P-Gruppe; r und s sind gleich
24
0; und R ist aus einer 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy-,
4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl-, 3-(4,4'-
Dimethoxytrityloxy)propyl-, 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl-,
- 42 -
1-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-propyl-, 3-(4,4'-
Dimethoxytrityloxy)-2-methyl-l-propyl- und 4,4'-
24
Dimethoxytrityloxymethylgruppe ausgewählt. R ist am meisten bevorzugt eine 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxygruppe.
Herstellung der photospaltbaren Linker
A. Herstellung von photospaltbaren Linkern der Formeln
I oder II
Photospaltbare Linker der Formeln I oder II können durch die nachstehend beschriebenen Verfahren, durch geringfügige Modifikationen der Verfahren mittels Auswahl der geeigneten Ausgangsmaterialien oder durch irgendwelche anderen, dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden.
20 Bei den photospaltbaren Linkern der Formel II, wo X
ein Wasserstoffatom ist, können die Linker auf die folgende Weise hergestellt werden. Alkylieren von 5-Hydroxy-2-nitrobenzaldehyd mit einem co-Hydroxyalkylhalogenid, z. B. 3-Hydroxypropylbromid, mit anschließendem Schützen des entstehenden Alkohols, beispielsweise in Form eines Silylethers, liefert ein 5-(&ohgr;-Silyloxyalkoxy)-2-nitrobenzaldehyd. Zugabe einer metallorganischen Verbindung zu dem Aldehyd ergibt einen Benzylalkohol. Verwendbare metallorganische Verbindungen sind
21
u. a. Trialkylaluminiumverbindungen (für Linker, wo R ein Alkylrest ist), wie z. B. Trimethylaluminium; Borhydride (für
21
Linker, wo R ein Wasserstoffatom ist), wie z. B. Natriumbor-
21
hydrid, oder Metallcyanide (für Linker, wo R ein Carboxy- oder Alkoxycarbonylrest ist), wie z. B. Kaliumcyanid. Im Falle der Metallcyanide würde das Reaktionsprodukt, ein Cyanhydrin, dann entweder unter sauren oder unter basischen Bedingungen in Gegenwart entweder von Wasser oder eines Alkohols hydrolysiert werden, um die interessierenden Verbindungen zu liefern.
Die Silylgruppe der Seitenkette der entstehenden Benzylalkohole kann dann durch Desilylieren, beispielsweise mit Tetrabutylammoniumfluorid, gegen eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ausgetauscht werden, um den entsprechenden Alkohol zu ergeben, gefolgt von einer Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid. Reaktion mit beispielsweise 2-Cyanethyldiisopropyl-
&bull;Ifi.f ·;.:.. Hf;
- 43 -
22
chlorphosphoramidit liefert die Linker, wobei R ein (Dialkylamino) ( &ohgr;-cyanalkoxy)P-Rest ist.
Ein spezielles Beispiel einer Synthese eines photospaltbaren Linkers der Formel II ist in dem nachfolgenden Schema dargestellt, das auch die Verwendung des Linkers bei der Oligonucleotid-Synthese demonstriert. Dieses Schema ist lediglich zur Erläuterung gedacht und soll auf keine Weise den Schutzumfang der Erfindung einschränken. Experimentelle Details der synthetischen Umwandlungen werden in den Beispielen angegeben.
&bull; &igr; · ·
- 44 -
Kat. Ki
CHO
tBDMSCl tBDMSO Et,N
14 Q Imidazol
CHO
tBDM
Me1AI
DMTCI
DMAP
DMTO
NO,
CHO
CH
Phosphorylierung
NO.
DMTO
DNA-Synthese
Spacer
NO.
"Oligom er
20 Bei der Synthese der Linker mit der Formel II, wo X
20
gleich OR ist, wird 3,4-Dihydroxyacetophenon selektiv am 4-Hydroxyl-Ende geschützt, z. B. durch Reaktion mit Kaliumcarbonat und einem Silylchlorid. Anstelle des Acetophenons können Benzoesäureester, Propiophenone, Butyrophenone usw. verwendet werden. Das entstehende 4-Silyloxy-3-hydroxyacetophenon wird dann mit einem Alkylhalogenid (für Linker, wo R ein Alkylrest ist) am 3-Hydroxyl-Ende alkyliert und z. B. mit Tetrabutylammoniumfluorid desilyliert, um ein 3-Alkoxy-4-
, &phgr; « &diams;
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hydroxyacetophenon zu liefern. Diese Verbindung wird dann am 4-Hydroxyl-Ende durch Reaktion mit einem &ohgr;-Hydroxyalkylhalogenid, z. B. mit 3-Hydroxypropylbromid, zu einem 4-(&ohgr;-Hydroxyalkoxy)-3-alkoxyacetophenon alkyliert. Der Seitenkettenalkohol wird dann als Ester, z. B. als Acetat, geschützt. Diese Verbindung wird dann in der 5-Position nitriert, z. B. mit konzentrierter Salpetersäure, um die entsprechenden 2-Nitroacetophenone bereitzustellen. Verseifung des Seitenkettenesters, z. B. mit Kaliumcarbonat, und Reduktion des Ketons, beispielsweise mit Natriumborhydrid, in der einen oder der anderen Reihenfolge liefert einen 2-Nitro-4-(&ohgr;-hydroxyalkoxy)-5-alkoxybenzylalkohol.
Dann wird durch Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid ein selektiver Schutz des Seitenkettenalkohols in Form des entsprechenden 4,4'-Dimethoxytritylethers erzielt. Weitere Reaktion, z. B. mit 2-Cyanethyldiisopropylchlorphosphoramidit,
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liefert die Linker, wobei R ein (Dialkylamino) ( cocyanalkoxy)P-Rest ist.
Ein spezielles Beispiel der Synthese eines photospaltbaren Linkers der Formel II ist im nachfolgenden Schema dargestellt. Dieses Schema ist nur zur Erläuterung gedacht und soll in keiner Weise den Schutzumfang der Erfindung einschränken. Ausführliche experimentelle Verfahren für die dargestellten Umwandlungen sind in den Beispielen zu finden.
&Idigr; S
- 46 -
HO
K2CO3
konzentr. HNO, (70%)
AcO
CH3O
NO.
NO
K2CO3 /
J NaBH4
DMTO
NO.
H,C OH JPr2N O
DNA1O-P-O
1 I
O- CH3O
DNA-Synthese
NO.
H1C OH
3 &igr;
-0-P-ODNA.
: i
- 47 -
HO
DMTO
NO
NaBH
AcO
HO
NO
DMTCI
DMAP
H3C OH
Phosphorylierung j
NO
B. Herstellung von photospaltbaren Linkern der Formel
III
Photospaltbare Linker der Formel III können nach den im folgenden beschriebenen Verfahren, durch geringfügige Modifikation der Verfahren mittels Auswahl geeigneter Ausgangsmaterialien oder durch andere, dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden.
Im allgemeinen werden photospaltbare Linker der Formel III aus &ohgr;-Hydroxyalkyl- oder Alkoxyalkyl-Verbindungen hergestellt, insbesondere aus &ohgr;-Hydroxyalkyl- oder Alkoxybenzolen. Diese Verbindungen sind im Handel erhältlich oder können aus einem &ohgr;-Hydroxyalkylhalogenid (z. B. aus 3-Hydroxypropylbromid) und entweder Phenyllithium (für die co-Hydroxyalkylbenzole) oder Phenol (für die co-Hydroxyalkoxybenzole) hergestellt werden. Acylieren der &ohgr;-Hydroxylgruppe (z. B. als Essigsäureester) mit anschließender Friedel-Crafts-Acylierung des aromatischen Rings mit 2-Nitrobenzoylchlorid liefert ein 4-(&ohgr;-Acetoxyalkyl- oder -alkoxy)-2-nitrobenzophenon. Reduktion des Ketons, z. B. mit Natriumborhydrid, und Verseifung des Seitenkettenesters werden in der einen oder anderen Reihenfolge aus-
geführt, um ein 2-Nitrophenyl-4-(hydroxyalkyl- oder -alkoxy) phenylmethanol zu erhalten. Der Schutz der terminalen Hydroxylgruppe in Form des entsprechenden 4,4'-Dimethoxytritylethers wird durch Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid erreicht. Die Benzyl-Hydroxylgruppe wird dann z. B. mit 2-Cyanethyldiisopropylchlorphosphoramidit zur Reaktion gebracht, um Linker
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der Formel II zu erhalten, wobei R ein (Dialkylamino) ( cocyanalkoxy)P-Rest ist. Andere photospaltbare Linker der Formel III können durch Substituieren von 2-Phenyl-l-propanol oder 2-Phenylmethyl-1-propanol für die &ohgr;-Hydroxyalkyl- oder -alkoxybenzole in der obigen Synthese hergestellt werden. Diese Verbindungen sind im Handel erhältlich, können aber auch beispielsweise durch Reaktion von Phenylmagnesiumbromxd oder Benzylmagnesiumbromid mit dem notwendigen Oxiran (d. h. Propylenoxid) in Gegenwart von Kupfer(I)-Ionen als Katalysator hergestellt werden.
Chemisch spaltbare Linker
Zum Einbau einer spaltbaren Bindung zwischen der immobilisierten Nucleinsäure und dem festen Träger können die verschiedensten chemisch spaltbaren Linker verwendet werden. Säureempfindliche Linker sind gegenwärtig bevorzugte chemisch spaltbare Linker für die Massenspektrometrie, insbesondere die MALDI-TOF MS, da die säureempfindliche Bindung beim Konditionieren der Nucleinsäure nach Zugabe der 3-HPA-Matrixlösung gespalten wird. Die säureempfindliche Bindung kann als separate Linkergruppe eingebaut werden, z. B. die säureempfindlichen Tritylgruppen, oder sie kann durch Einbringen einer oder mehrerer Silyl-Internucleosidbrücken unter Verwendung von Diisopropylsilyl in einen synthetischen Nucleinsäure-Linker eingebaut werden, wodurch diisopropylsilyl-gebundene Oligonucleotid-Analoge entstehen. Die Diisopropylsilyl-Brücke ersetzt die Phosphodiester-Bindung in der DNA-Hauptkette und führt unter schwach sauren Bedingungen, wie z. B. 1,5% Trifluoressigsäure (TFA) oder 3-HPA/l% TFA-MALDI-TOF-Matrixlösung, zum Einbau eines oder mehrerer Brüche innerhalb eines Strangs im DNA-Molekül. Verfahren zur Herstellung von diisopropylsilylgebundenen Oligonucleotid-Vorläufern und -Analogen sind dem
* · -a ■
&bull; * * &idigr;
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Fachmann bekannt (siehe z. B. Saha et al. (1993) J. Org. Chem. 58: 7827-7831). Diese Oligonucleotid-Analogen können leicht mit Hilfe von Festphasen-Oligonucleotid-Syntheseverfahren unter Verwendung von diisopropylsilyl-derivatisierten Desoxyribonucleosiden hergestellt werden.
Massemodifikation von Nucleinsäuren
In bestimmten Ausführungsformen können Nucleinsäuren verwendet werden, die in anderen Positionen als dem 3'- oder 5'-Ende modifiziert sind. Die Modifikation der Zuckerkomponente eines Nucleotids in anderen Positionen als der 3'- und 5'-Position ist durch herkömmliche Verfahren möglich. Außerdem können Nucleinsäurebasen z. B. durch Modifikation von C-5 von dT mit einem Linker-Arm modifiziert werden, wie z. B. in F.
Eckstein, Hrsg., "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", IRL Press (1991) beschrieben wird. Ein solcher Linker-Arm kann so modifiziert werden, daß er eine Thiolkomponente aufweist. Alternativ können Nucleinsäuren mit modifizierter Hauptkette (z. B. Phosphoramidat-DNA) verwendet werden, so daß die Thiolgruppe an das StickstoffZentrum angelagert werden kann, das durch die modifizierte Phosphat-Hauptkette bereitgestellt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen beeinträchtigt die Modifikation einer Nucleinsäure, wie z. B. die oben beschriebene, nicht wesentlich die Fähigkeit der Nucleinsäure oder Nucleinsäuresequenz zum Hybridisieren an ihr Komplement. Folglich sollte jede Modifikation vorzugsweise eine wesentliche Modifikation der für die Watson-Crick-Basenpaarung verantwortlichen Funktionalitäten der Nucleinsäure vermeiden. Die Nucleinsäure kann so modifiziert werden, daß eine nicht term'inale Thiolgruppe vorhanden ist, und die auf dem Träger immobilisierte Nucleinsäure ist zu einer selbstkomplementären Basenpaarung fähig, um eine "Haarnadel"-Struktur mit einem Doppelstrangbereich zu bilden.
Feste Träger und Substrate
Beispiele unlöslicher Träger und Substrate zur Verwendung hierin schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Kü-
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gelchen (Silicagel, Glas mit kontrollierter Porosität, Magnetkügelchen, Sephadex-Sepharose-Kügelchen, Cellulosekügelchen usw.), Kapillaren, ebene Träger, wie z. B. Glasfaserfilter, Glasoberflächen, Metalloberflächen (Stahl, Gold, Silber, AIuminium, Silicium und Kupfer), Kunststoffmaterialien einschließlich Mehrkavitätenplatten oder Membranen (z. B. Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid) , Wafer, Kämme, Stifte (z. B. Stiftanordnungen, die sich zur kombinatorischen Synthese oder Analyse eignen) oder Kügelchen in Vertiefungen (Grübchen) von ebenen Oberflächen, wie z. B. von Wafern (z. B. Silicium-Wafern) , mit oder ohne Filterplatten.
Massenspektrometrie
Nach dem Immobilisieren können die Nucleinsäuren durch irgendeines der verschiedensten Mittel analysiert werden, zu denen beispielsweise spektrometrische Verfahren gehören, wie z. B. Spektroskopie im UV-/sichtbaren Bereich, IR-, Fluoreszenz-, Chemolumineszenz- oder NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie oder andere, dem Fachmann bekannte Verfahren oder Kombinationen davon. Zu bevorzugten Massenspektrometerformaten gehören die Ionisationsverfahren (I-Verfahren), wie z. B. matrixunterstützte Laserdesorption MALDI), kontinuierliche oder Impuls-Elektronensprühverfahren (ESI) und verwandte Verfahren (z. B. Ionensprüh- oder Thermosprühverfahren) oder Massivcluster-Stoßverfahren (MCI); diese Ionenquellen können an Nachweisformate angepaßt werden, zu denen das Linear- oder Reflektron-Laufzeitverfahren (TOF), Einzel- oder Mehrfachquadrupel-Verfahren, Einzel- oder Mehrfach-Magnetsektorverfahren, Fouriertransformations-Ionencyclotronresonanz (FTICR), Ionenfallen und Kombinationen daraus gehören, die einen Hybrid-Detektor ergeben (z. B. Ionenfalle/Laufzeit). Zur Ionisation können zahlreiche Matrix/Wellenlängen-Kombinationen (MALDI) oder Lösungsmittelkombinationen (ESI) verwendet werden.
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Herstellung von DNA-Anordnungen
Hierin werden Verfahren und Systeme zur Herstellung von Probenmaterialanordnungen zur Analyse durch ein Diagnosegerät bereitgestellt. Zum Beispiel zeigt Fig. 1 ein System zur Herstellung von Probenmaterialanordnungen zur Analyse durch ein Diagnosegerät. In Fig. 1 ist ein System 10 abgebildet, das einen Datenprozessor 12, eine Bewegungssteuereinrichtung 14, eine Roboterarmeinheit 16, ein Monitorelement 18A, eine zentrale Verarbeitungseinheit 18B, eine Mikrotiterplatte mit Quellenmaterial 20, ein Objektträgergehäuse 22, einen Roboterarm 24, einen Objektträger 26, eine Drucksteuereinrichtung 28, eine Rohrleitung 30, eine Montageeinheit 32, eine Stifteinheit 38 und Substratelemente 34 aufweist. In der in Fig. 1 gezeigten Ansicht ist außerdem dargestellt, daß die Robotereinheit 16 ein bewegliches Trägerelement 40 und eine horizontale Gleitnut 42 aufweisen kann. Der Roboterarm 24 kann wahlweise um einen Zapfen 36 schwenkbar sein, um den Bewegungsbereich des Arms 24 zu vergrößern, so daß der Arm 24 die Stifteinheit 38 oberhalb der Quellenplatte 20 anordnen kann.
Der in Fig. 1 abgebildete Datenprozessor 12 kann ein herkömmliches digitales Datenverarbeitungssystem sein, wie z. B. ein IBM-PC-kompatibles Computersystem, das sich zur Verarbeitung von Daten und zur Ausführung von Programmanweisungen eignet, die Informationen für die Steuerung der Bewegung und des Betriebs der Robotereinheit 16 bereitstellen. Für den Fachmann wird offensichtlich sein, daß die Datenprozessoreinheit 12 ein System von beliebigem Typ sein kann, das sich zur Ausführung eines Programms von Anweisungssignalen eignet, welche die in das Robotergehäuse 16 integrierte Robotereinheit betätigen. Wahlweise kann der Datenprozessor 12 eine mikrogesteuerte Einheit sein, die in das Robotergehäuse 16 integriert ist. In weiteren alternativen Ausführungsformen braucht das System 10 nicht programmierbar zu sein und kann ein Einkartenrechner mit einem Firmware-Speicher zum Abspeichern von Anweisungen für die Betätigung der Robotereinheit 16 sein.
In der in Fig. 1 dargestellten Ausführungsform gibt es eine Steuereinrichtung 14, die elektronisch zwischen den Datenprozessor 12 und die Robotereinheit 16 gekoppelt ist. Die
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abgebildete Steuereinrichtung 14 ist eine Bewegungssteuereinrichtung, welche die Motorelemente der Robotereinheit 16 zur Positionierung des Roboterarms 24 in einer ausgewählten Position steuert. Außerdem kann die Steuereinrichtung 14 Anweisungen an die Robotereinheit 16 übermitteln, um die Drucksteuereinheit 28 anzuweisen, das aus den einzelnen Stiftelementen der abgebildeten Stifteinheit 38 ausgestoßene Fluidvolumen zu steuern. Der Entwurf und die Konstruktion der abgebildeten Bewegungssteuereinrichtung 14 folgen aus Prinzipien, die in der Elektrotechnik bekannt sind, und es kann jedes für die Steuerung der Robotereinheit 16 geeignete Steuerungselement in die Praxis umgesetzt werden, ohne von Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Die in Fig. 1 abgebildete Robotereinheit 16 ist mit der Steuereinrichtung 14 elektronisch gekoppelt. Die abgebildete Robotereinheit 16 ist ein Gerüst- bzw. Portalsystem, das einen XY-Tisch zum Bewegen des Roboterarms über eine XY-Ebene aufweist und das ferner einen Z-Achsen-Stellantrieb zum Bewegen des Roboterarms senkrecht zu dieser XY-Ebene aufweist. Die in Fig. 1 abgebildete Robotereinheit 16 weist einen Arm 24 auf. der an dem XY-Tisch angebracht ist, welcher den Arm innerhalb einer Ebene bewegt, die durch die XY-Achsen definiert ist. In der abgebildeten Ausführungsform ist der XY-Tisch am Z-Stellantrieb montiert, um den gesamten Tisch entlang der Z-Achse senkrecht zur XY-Ebene zu bewegen. Auf diese Weise bietet die Robotereinheit drei Freiheitsgrade, wodurch die Stifteinheit 38 in jeder beliebigen Position oberhalb der Substrate 34 und der Quellenplatte 20 angeordnet werden kann, die in Fig. 1 auf dem Objektträger 26 aufsitzend dargestellt sind, der an der Robotereinheit 16 montiert ist.
Die abgebildete Robotereinheit 16 ergibt sich aus Prinzipien, die in der Elektrotechnik bekannt sind, und ist nur ein Beispiel einer Robotereinheit, die sich zum Bewegen einer Stifteinheit in Positionen eignet, die einem Substrat und einer Quellenplatte benachbart sind, wie z. B. dem abgebildeten Substrat 34. Dementsprechend wird für den Fachmann offensichtlich sein, daß nach den hier gegebenen Beschreibungen alterna-
tive Robotersysteme in die Praxis umgesetzt werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
In Fig. 1 ist eine Ausführungsform einer Robotereinheit 16 abgebildet, die eine Drucksteuereinheit 28 aufweist, die über eine Rohrleitung 30 an die Halterung 32 angeschlossen ist, die mit der Stifteinheit 38 verbunden ist. In dieser Ausführungsform weist die Halterung 32 einen inneren Kanal zur Fluidkopplung der Rohrleitung 30 mit der Stifteinheit 38 auf. Dementsprechend stellt die Rohrleitung 30 eine Fluidverbindung zwischen der Drucksteuereinrichtung 28 und der Halterung 32 der Stifteinheit 38 her. Auf diese Weise kann die Steuereinrichtung 14 Signale an die Drucksteuereinrichtng 28 senden, um einen an die Stifteinheit 38 angelegten Fluiddruck selektiv zu steuern.
In Fig. 2 ist eine Ausführungsform einer Stifteinheit 50 abgebildet, die sich für die praktische Ausführung zusammen mit dem in Fig. 1 abgebildeten System eignet, das die Drucksteuereinrichtung 28 aufweist. In der dargestellten Ausführungsform weist die Stifteinheit 50 ein Gehäuse auf, das aus einem oberen Abschnitt 52 und einem unteren Abschnitt 54 geformt ist, die durch die Schrauben 56A und 56B miteinander verbunden sind, um ein inneres Kammervolumen 58 abzugrenzen. Ferner ist in Fig. 2 dargestellt, daß das Gehäuse zur Fluidabdichtung des inneren Kamme rvol urne ns 58 ein in Fig. 2 dargestelltes Dichtungselement aufweisen kann, wie z. B. eine O-Ring-Dichtung 60, die zwischen dem oberen Block und dem unteren Block 54 sitzt und den Umfang des inneren Kamme rvol urne ns 58 vollständig umgibt". In Fig. 2 ist ferner dargestellt, daß die Stifteinheit 50 mehrere Vesikeln bzw. Bläschen 62A-62D aufweist, deren jede eine durchgehende Axialbohrung aufweist, um die abgebildeten Aufnahmekammern 64A-64D zu bilden. Jede der abgebildeten Vesikeln erstreckt sich durch eine entsprechende Öffnung 68A-68D hindurch, die im unteren Block 54 des Gehäuses angeordnet ist.
Wie ferner in der abgebildeten Ausführungsform dargestellt, weist jede der Vesikeln 62A-62D einen oberen Flanschabschnitt auf, der an einem Dichtungselement 70A-70D anliegt, um eine fluiddichte Abdichtung zwischen der Vesikel und dem
unteren Block 54 zu bilden und den Durchgang von Fluid durch . die Öffnungen 68A-68D zu verhindern. Um die Dichtung dicht zu halten, weist die abgebildete Stifteinheit 50 ferner einen Satz von Vorspannelementen 74A-74D auf, die in Fig. 2 als Federn abgebildet sind, die sich in den dargestellten Ausführungsformen im zusammengedrückten Zustand befinden, um das Flanschelement der Vesikeln 62A-62D an ihre entsprechenden Dichtungselemente 70A-70D anzudrücken. Wie in Fig. 2 dargestellt, erstrecken sich die Vorspannelemente 74A-74D zwischen den Vesikeln und dem oberen Block 52. Jede der Federn 74A-74D kann fest in einer Montageunterlage 7 6A-7 6D montiert werden, wobei die Federelemente an dem oberen Block 52 befestigt sein können. Der obere Block 52 weist ferner eine in Fig. 2 abgebildete Öffnung 78 als zentral angeordnete Öffnung auf, die eine Gewindebohrung zur Aufnahme einer Durchführungsschraube (Swagelok) 80 aufweist, die innerhalb der Öffnung 78 drehbar montiert werden kann.
Wie ferner in Fig. 2 dargestellt, ist die Durchführungsschraube 80 durch eine Rohrleitung an einem Ventil 82 befestigt, das die Durchführungsschraube 80 mit einer Rohrleitung 84 verbinden kann, die sich mit einer Druckquelle koppeln läßt oder alternativ die Durchführungsschraube 80 mit einer Rohrleitung 8 6 verbinden kann, die für die Belüftung der inneren Kammer 58 sorgt. Eine zentrale Bohrung 88 erstreckt sich durch die Durchführungsschraube 80 hindurch und ist mit dem Rohrleitungselement verbunden, das weiter mit dem Ventil 82 verbunden ist, um dadurch eine selektive Fluidverbindung zwischen dem inneren Kammervolumen 58 und entweder einer Druckquelle oder einem Belüftungsauslaß herzustellen.
Die oben beschriebene und in Fig. 2 abgebildete Stifteinheit 50 ist über einem Substratelement 90 angeordnet, das mehrere Vertiefungen bzw. Kavitäten 92 aufweist, die in die obere Fläche des Substrats 90 eingeätzt sind. Wie durch Fig. 2 dargestellt, ist der Abstand der Vesikeln 62A-62D so gewählt, daß jede Vesikel von den benachbarten Vesikeln um eine Distanz beabstandet ist, die ein ganzzahliges Vielfaches des Teilungsabstandes zwischen den Kavitäten 92 ist, die in die obere Fläche des Substrats 90 eingeätzt sind. Wie man aus
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der folgenden Beschreibung erkennen wird, erleichtert dieser Abstand die parallele Abgabe von Fluid, so daß Fluid in einer einzigen Operation in mehrere Kavitäten abgegeben werden kann. Jede der Vesikeln kann aus rostfreiem Stahl, Siliciumdioxid, polymerem Material oder irgendeinem anderen, für die Aufnahme einer Fluidprobe geeigneten Material bestehen. In einem Beispiel werden in der Einheit 16 Vesikeln verwendet, die aus gehärtetem, goldplattiertem Berylliumkupfer über Nickelblech bestehen. Sie sind 43,2 mm lang, und der Schaft der Vesikel ist auf einen Außendurchmesser von 0,4 6 mm mit einer konkaven Spitze abgestuft. Ein solcher Stift wurde gewählt, da die Zielgenauigkeit etwa 501 pm betragen kann. Es wird jedoch offensichtlich sein, daß jede geeignete Stiftausführung für das Gerät verwendet werden kann, einschließlich, aber nicht beschränkt auf flache, sternförmige, konkave, spitz massive, spitz halbhohle, auf einer oder beiden Seiten winklige oder andere derartige Geometrien.
Fig. 3 zeigt aus einer seitlichen Perspektive den unteren Block 54 der in Fig. 2 abgebildeten Stifteinheit 50. Fig.
3 zeigt angenäherte Abmessungen für eine Stifteinheit. Gemäß der Darstellung weist der untere Block 54 eine Bodenplatte 98 und eine umgebende Schulter 100 auf. Die Bodenplatte 98 hat eine Dicke von etwa 3 mm, und die Schulter 100 ist. etwa 5 mm dick.
Fig. 4 zeigt, von oben- gesehen, die allgemeine Konstruktion und die Abmessungen für einen unteren Block 54, der sich zur Verwendung mit der in Fig. 2 dargestellten Stifteinheit 50 eignet. Wie in Fig. 4 dargestellt, weist der untere Block 54 eine 4 &khgr; 4-Matrix von Öffnungen 68 auf, um·16 Öffnungen bereitzustellen, die jeweils zur Aufnahme einer Vesikel geeignet sind. Wie oben unter Bezugnahme auf Fig. 2 beschrieben, ist der Abstand zwischen den Öffnungen 68 typischerweise ein ganzzahliges Vielfaches des Abstandes zwischen Kavitäten auf einer Substratoberfläche sowie zwischen den Kavitäten einer Quellenplatte. Dementsprechend kann eine Stifteinheit mit dem unteren Block 54, wie in Fig. 4 abgebildet, Fluid in bis zu 16 Kavitäten gleichzeitig abgeben. Fig. 4 zeigt außerdem allgemeine Abmessungen eines unteren Blocks 54, der so be-
schaffen ist, daß jede Seite des Blocks 54 im allgemeinen 22 mm lang ist und der Abstand zwischen den Öffnungen 68 annähernd 4,5 mm beträgt. Ein solcher Abstand eignet sich zur Verwendung bei einem Substrat, wo Fluid in Positionen abzugeben ist, die etwa 500 &mgr;&idiagr;&eegr; voneinander entfernt sind, wie durch das Substrat 90 von Fig. 2 veranschaulicht. Fig. 4 zeigt außerdem, daß der untere Block 54 eine optionale O-Ring-Nut 94 aufweisen kann, die für die Aufnahme eines O-Ring-Dichtungselements angepaßt ist, wie z. B. des in Fig. 2 abgebildeten Dichtungselements 60. Es versteht sich, daß ein solches Nutenelement 94 die durch das Dichtungselement 60 gebildete Fluiddichtung verstärken und verbessern kann.
Der Stiftblock kann aus rostfreiem Stahl hergestellt werden, da dieses Material mit einer Genauigkeit von etwa +25 &mgr;&pgr;&igr; gebohrt werden kann/ es können aber auch die verschiedensten Sondenmaterialien verwendet werden, wie z: B. GlO-Laminat, Polymethylmethacrylat (PMMA) oder ein anderes geeignetes Material. Der Stiftblock kann jede beliebige Anzahl von Öffnungen enthalten und ist mit 16 Aufnahmeöffnungen dargestellt, die 16 Stifte in Position halten. Zum Erhöhen der Zielgenauigkeit jedes Stifts kann unterhalb des Blocks ein wahlfreier Ausrichtungsplatz angeordnet werden, so daß etwa 6 mm der Stiftspitze frei bleiben, um das Eintauchen in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte zu ermöglichen. Die Anordnung der Sonden in dem abgebildeten Werkzeug ist so ausgelegt, daß sie mit einer Mikrotiterplatte mit 384 Kavitäten koordiniert ist, so daß der Mittenabstand der Sonden 4,5 mm beträgt. Eine Anordnung von 4x4 Sonden wurde gewählt, da sie eine Anordnung erzeugt, die in weniger als einen Quadratzoll paßt, der den Bewegungsbereich eines XY-Tisches eines vom Zessionar verwendeten MALDI-TOF-Massenspektrometers bildet. Die Stiftwerkzeugeinheit wird durch einen Deckel aus rostfreiem Stahl an der Oberseite des Geräts vervollständigt, die dann am Z-Arm des Roboters angebracht wird.
Wie aus Fig. 5 erkennbar, verwendet die Robotereinheit 16 eine Stiftwerkzeugeinheit 38, die ähnlich wie die in Fig. 2 abgebildete Stiftwerkzeugeinheit 50 konfiguriert ist. Die Drucksteuereinrichtung 28 steuert selektiv den Druck innerhalb
der Kammer 58. Bei dieser Ausführungsform läuft im Datenprozessor 12 ein Steuerprogramm, um die Robotereinheit 16 so zu steuern, daß die Einheit 16 eine Elementanordnung auf die Substrate 34 aufdruckt.
In einem ersten Schritt, Fig. 5A, kann das Programm die Robotereinheit 16 anweisen, die Stifteinheit 38 so zu verschieben, daß sie oberhalb der Quellenplatte 20 angeordnet ist. Die Robotereinheit 16 taucht dann die Stifteinheit in die Quellenplatte 20 ein, die eine DNA-Quellenplatte mit 384 Kavitäten sein kann. Wie in Fig. 4 dargestellt, kann die Stifteinheit 16 verschiedene Stifte aufweisen, so daß die Stifteinheit 50 16 Stifte in 16 verschiedene Kavitäten der DNA-Quellenplatte 20 mit 384 Kavitäten eintaucht. Als nächstes weist der Datenprozessor 12 die Bewegungssteuereinrichtung 14 an, die Robotereinheit 16 so zu betätigen, daß die Stifteinheit in eine Position über der Oberfläche des Substrats 34 bewegt wird. Das Substrat 34 kann irgendein Substrat sein, das für die Aufnahme einer Materialprobe geeignet ist, und kann aus Silicium, Kunststoff, Metall oder irgendeinem anderen geeigneten Material dieser Art bestehen. Wahlweise weist das Substrat eine ebene Oberfläche auf, kann aber alternativ eine mit Grübchen versehene Oberfläche, eine Oberfläche mit eingeätzten Kavitäten oder irgendeine andere geeignete Oberflächentopographie aufweisen. Das im Datenprozessor 12 ablaufende Programm kann dann die Robotereinheit anweisen, über die Bewegungssteuereinrichtung 14 die Drucksteuereinrichtung 28 anzuweisen, innerhalb des inneren Kammervolumens 58 einen Überdruck zu erzeugen. Bei dieser praktischen Ausführung drückt der innere Überdruck Fluid aus den Aufnahmekammern der Vesikein 62 heraus, um das Fluid aus den Vesikeln in eine entsprechende Vertiefung 92 des Substrats 90 auszustoßen.
Das im Datenprozessor 12 ablaufende Programm kann auch die Steuereinrichtung 14 anweisen, die Drucksteuereinrichtung 28 so zu steuern, daß sie das Füllen der Aufnahmekamraern mit Quellmaterial von der Quellenplatte 20 steuert. Die Drucksteuereinrichtung 28 kann innerhalb des inneren Kammervolumens 58 der Stifteinheit 38 einen Unterdruck erzeugen. Dadurch wird das Ansaugen von Fluid in die Aufnahmekammern der Vesikeln
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62A-62D veranlaßt. Die Drucksteuereinrichtung 28 kann den Druck entweder durch Regelung ohne Rückführung oder durch Regelung mit Rückführung regeln, um ein zu starkes Ansaugen von Fluid durch die Aufnahmekammern und ein Überlaufen in das innere Kammervolumen 58 zu vermeiden. Regelkreissysteme zur Druckregelung sind dem Fachmann bekannt, und es kann jeder geeignete Regler verwendet werden. Ein solches Überlaufen könnte eine Kreuzverunreinigung verursachen, besonders wenn das von der Quellenplatte 20 angesaugte Quellenmaterial von Kavität zu Kavität variiert.
Bei einer alternativen praktischen Ausführung der Erfindung ist jede der Aufnahmekammern 64A-64D klein genug, um das Füllen der Kammern durch Kapillarwirkung zu ermöglichen. Bei einer solchen praktischen Ausführung kann die Stifteinheit aus siner Anordnung von Nadeln mit enger Bohrung bestehen, wie z. B. von Nadeln bzw. Kanülen aus rostfreiem Stahl, die durch die Öffnungen des unteren Blocks 54 hindurchgehen. Die in Quellenlösungen eingetauchten Nadeln werden durch Kapillarwirkung gefüllt. Bei einer praktischen Ausführungsform ist die Länge der Kapillare, die bei Atmosphärendruck zu füllen ist, angenähert durch die folgende Beziehung bestimmt:
H = 2ji
PGR
wobei H die Höhe, &ggr; die Oberflächenspannung, P die Dichte der Lösung, G die Schwerkraft und R den Nadelradius bezeichnen.
Auf diese Weise kann das Volumen des von jeder Vesikel aufgenommenen Fluids durch Auswahl der Abmessungen der inneren Bohrung gesteuert werden. Es versteht sich, daß Wasser bei Raumtemperatur eine Länge von 15 cm einer Kapillare mit einem Radius von 100 pm füllt. Auf diese Weise wird sich eine Nadel mit Nanolitervolumen und kurzer Bohrung bis zur vollen Kapazität füllen, dürfte aber nicht überlaufen, da es sich versteht, daß die Kapillarkraft zu gering ist, um am oberen Ende der Nadelöffnung einen Meniskus zu bilden. Dadurch wird eine Kreuzverunreinigung infolge Überlaufen verhindert. In einer Ausführungsform können die Vesikeln der Stifteinheit . mit inneren
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Kammern von verschiedener Größe versehen werden, um verschiedene Fluidvolumina aufzunehmen und abzugeben.
Bei einer alternativen praktischen Ausführung kann zur Verringerung des Flüssigkeitsvolumens, das in die Aufnahmekammern der Vesikeln angesaugt wird, durch die Drucksteuereinrichtung 28 ein geringer Überdruck im inneren Kammervolumen 58 angelegt werden. Die durch den Überdruck erzeugte, abwärtsgerichtete Kraft kann dazu dienen, der aufwärtsgerichteten Kapillarkraft entgegenzuwirken. Auf diese Weise kann das Fluidvolumen gesteuert werden, das durch Kapillarkraft in die Aufnahmekammern der Vesikeln angesaugt wird.
Fig. 5B zeigt, daß Fluid innerhalb der Aufnahmekammern der Nadel durch einen geringen Überdruck abgegeben werden kann, der durch die zentrale Bohrung 88 angelegt wird, die durch eine Durchführungsschraube (Swagelok) 80 hindurchgeht. Durch Regulieren des Druckimpulses, der dem inneren Kammervolumen 58 zugeführt wird, kann Fluid entweder als Sprühnebel oder durch Tröpfchenbildung an der Nadelspitze ausgestoßen werden. Es versteht sich, daß die Abgabegeschwindigkeit bei Tröpfchen im Vergleich zu Sprühnebel teilweise von dem Druck abhängt, der durch die Drucksteuereinrichtung 28 angelegt wird. Bei einer praktischen Ausführungsform wird ein Druck im Bereich von 10 bis 1000 Torr (Ü) angelegt.
Zu diesem Zweck kann der Datenprozessor 12 ein Computerprogramm ausführen, welches das Volumen des abgegebenen Fluids steuert und reguliert. Das Programm kann die Steuereinrichtung 28 anweisen, ein definiertes Fluidvolumen auszustoßen, entweder durch Erzeugen eines Sprühnebels oder durch Ausbildung eines Tröpfchens, das am Ende der Vesikel sitzt und mit der Substratoberfläche in Kontakt gebracht werden kann, um das Fluid an diese abzugeben.
Die Figuren 5C und 5D zeigen, daß die in den Figuren 5A-5B dargestellten früheren Schritte nochmals ausgeführt werden können, diesmal in einer Position auf der Substratoberfläehe, die gegenüber der früheren Position versetzt ist. Bei dem abgebildeten Verfahren wird das Stiftwerkzeug um eine Distanz versetzt, die gleich dem Abstand zwischen zwei Kavitäten 92
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ist. Offensichtlich können andere Offsetdruckverfahren angewandt werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Man wird erkennen, daß mit der in Fig. 2 abgebildeten Stifteinheit verschiedene Vorteile erzielt werden. Zum Beispiel ist das Spülen zwischen Abgabevorgängen einfach und erfordert nur einmalige oder mehrmalige Füll- und Entleerungsvorgänge mit einer Spüllösung. Da außerdem alle Aufnahmekammern bis zum vollen Fassungsvermögen gefüllt werden, variiert die Genauigkeit der abgegebenen Volumina nur entsprechend den Innenabmessungen der Nadeln, die bei der Stiftherstellung sorgfältig kontrolliert werden können. Ferner ist das Gerät kosteneffektiv, wobei die größten Kosten auf die Nadeln entfallen; da jedoch kein Kontakt mit einer Oberfläche erforderlich ist, sind die Nadeln einer geringen mechanischen Deformation oder Beanspruchung ausgesetzt, wodurch ein seltenes Auswechseln und eine lange Lebensdauer gewährleistet sind.
Als Alternative kann das' Aufbringen von Probenmaterial auf die Substratoberfläche Verfahren einschließen, bei denen Stiftwerkzeugeinheiten verwendet werden, die von einem Block ausgehende massive Stiftelemente aufweisen, wobei eine Robotereinheit die massiven Stiftelemente der Stifteinheit in eine Probenmaterialquelle taucht, um die distalen Enden der Stifte mit den Probenmaterialien zu benetzen. Anschließend kann die Robotereinheit die Stifteinheit zu einer Position oberhalb des Substrats bewegen und dann die Stifteinheit auf die Substratoberfläche absenken, um die einzelnen benetzten Stifte mit der Oberfläche in Kontakt zu bringen und Material auf die Substratoberfläche aufzutupfen.
In den Figuren 6A und 6B ist eine weiteres alternatives System zur Abgabe von Material auf oder an die Oberfläche des Substrats abgebildet. Im einzelnen zeigt Fig. 6A eine Strahldruckvorrichtung 110, die ein Kapillarelement 112, ein Wandlerelement 114 und eine Öffnung (nicht dargestellt) 118, eine Fluidrohrleitung 122 und eine Halterung 124 aufweist, die mit einer Roboterarmeinheit verbunden ist, wie z. B. dem in Fig. 1 abgebildeten Roboterarm 24. Wie weiter in Fig. 6A dargestellt, eignet sich die Strahleinheit 110 zum Ausstoßen einer Reihe
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von Tröpfchen 120 eines Probenmaterials aus der Öffnung 118, um Probenmaterial auf die Oberfläche 128 abzugeben.
Die Kapillare 112 der Strahleinheit 110 kann eine Glaskapillare, eine Kunststoffkapillare oder irgendeine andere geeignete Aufnahmeeinrichtung sein, die eine Fluidprobe befördern kann und das Ausstoßen der Fluidprobe durch die Wirkung eines Wandlerelements ermöglicht, wie z. B. des Wandlerelements 114. Das in Fig. 6A abgebildete Wandlerelement 114 ist ein piezoelektrisches Wandlerelement, das rund um den äußeren Umfang der Kapillare 112 ausgebildet ist und einen elektrischen Impuls, den es von dem Impulsgenerator innerhalb einer Robotereinheit 16 empfängt, umwandeln kann, um das Ausstoßen von Fluid aus der Öffnung 118 der Kapillare 112 zu bewirken. Eine solche Strahleinheit mit einem piezoelektrischen Wandlerelement wird von MicroFab Technology, Inc., Deutschland, hergestellt. Hierin kann jedoch jede Strahleinheit verwendet werden, die sich zur Abgabe definierter und kontrollierter Fluidvolumina eignet, einschließlich derjenigen, die piezoelektrische Wandler, elektrische Wandler, elektrostriktive Wandler, magnetostriktive Wandler, elektromechanische Wandler oder irgendein anderes geeignetes Wandlerelement verwenden. In der abgebildeten Ausführungsform weist die Kapillare 112 eine Fluidröhre 122 zur Aufnahme von Fluidmaterial auf. In einer wahlfreien Ausführungsform kann Fluid durch die Wirkung eines Unterdrucks in die Kapillare angesaugt werden, der Fluid durch die Öffnung 118 ansaugt, wenn die Öffnung 118 in eine Fluidmaterialquelle eingetaucht wird. Bei der Erfindung können andere Ausführungsformen der' Strahleinheit 110 in die Praxis umgesetzt werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Fig. 6B veranschaulicht eine weitere alternative Einheit, die sich zum Transport auf dem Roboterarm einer Robotereinheit eignet, wie z. B. der in Fig. 1 abgebildeten Einheit 16. Fig. 6B zeigt vier miteinander verbundene Strahleinheiten 130A-130D. Ähnlich der Stifteinheit in Fig. 2 kann die in Fig. 6B abgebildete Strahleinheit zur parallelen Abgabe von Fluidmaterial verwendet werden. Für den Durchschnittsfachmann der Elektrotechnik wird offensichtlich sein, daß jede der Strahleinheiten 130A-130D unabhängig von den anderen betrieben
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werden kann, um die selektive Abgabe von Fluid aus ausgewählten Strahleinheiten zu ermöglichen. Außerdem kann jede der Strahleinheiten 130A-130D unabhängig gesteuert werden, um das Fluidvolumen zu wählen, das aus der jeweiligen Einheit 130A-130D abgegeben wird. Weitere Modifikationen und Änderungen können an der in Fig. 6B abgebildeten Einheit vorgenommen werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Verfahren zur Schnellanalyse von Probenmaterialien werden gleichfalls bereitgestellt. Zu diesem Zweck können auf einer Substratoberfläche nach irgendeinem der oben beschriebenen Verfahren Probenanordnungen ausgebildet werden. Die Probenanordnungen werden dann durch Massenspektrometrie analysiert, um spektrale Daten zu sammeln, die repräsentativ für die Zusammensetzung der Proben in der Anordnung sind. Es versteht sich, daß die obigen Verfahren Prozesse liefern, die eine schnelle Abgabe definierter und gesteuerter Volumina des Analytenmaterials ermöglichen. Insbesondere gestatten diese Prozesse die Abgabe von Fluidvolumina im Subnanoliter- bis zum unteren Nanoliterbereich. Diese Aufbringungsverfahren für kleine VoIumina erzeugen Probenanordnungen, die sich gut für die Analyse durch Massenspektrometrie eignen. Zum Beispiel liefern die kleinen Volumina Reproduzierbarkeit der Fleck- bzw. Spot-Eigenschaften, wie z. B. der Verdampfungsgeschwindigkeiten, und eine geringere Abhängigkeit von atmosphärischen Bedingungen, wie z. B. der Umgebungstemperatur und dem Licht.
Um mit dem in Fig. 5 dargestellten Beispiel fortzufahren, die Anordnungen können durch Einfüllen von Oligonucleotiden (0,1-50 ng/&mgr;&idiagr;) verschiedener Sequenzen oder Konzentrationen in die Kavitäten einer Quellen-Mikrotiterplatte 20 mit 96 Kavitäten hergestellt werden; die erste Kavität kann für die Aufnahme einer Matrixlösung reserviert werden. Ein Substrat 34, wie z. B. ein mit Grübchen versehenes Siliciumchip-Substrat, kann auf den Objektträger 26 der Robotereinheit 16 aufgelegt und von Hand so ausgerichet werden, daß die Matrix der Kavitäten um einen Satz von Bezugsachsen herum orientiert ist. Das im Datenprozessor 12 ablaufende Steuerprogramm kann die Koordinaten der ersten Kavität der Quellenplatte 20 empfangen. Der Roboterarm 12 kann die Stifteinheit 38 in die Quellenplat-
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te 20 eintauchen, so daß jeder der 16 Stifte in eine der Kavitäten eingetaucht wird. Jede Vesikel kann sich durch Kapillarwirkung so füllen, daß das volle Volumen der Aufnahmekammer Fluid enthält. Wahlweise kann das im Datenprozessor 12 ablaufende Programm die Drucksteuereinrichtung anweisen, die innere Kammer 58 der Stifteinheit 38 mit einem Vorspannungs-Überdruck zu füllen, der teilweise der Kapillarkraft entgegenwirkt, um das in die Aufnahmekammer angesaugt Fluidvolumen zu begrenzen oder zu verringern.
Wahlweise kann die Stifteinheit 38 in die gleichen 16 Kavitäten der Quellenplatte 20 eingetaucht und auf ein zweites Zielsubstrat aufgetupft werden. Dieser Zyklus kann auf so vielen Zielsubstraten wie gewünscht wiederholt werden. Als nächstes kann der Roboterarm. 12 die Stifteinheit 38 in eine Waschlösung und danach in 16 andere Kavitäten der Quellenplatte 20 eintauchen und um eine Distanz gegen den anfänglichen Satz von 16 Punkten versetzt auf das Zielsubstrat auftupfen. Dies kann wiederum für so viele Zielsubstrate wie gewünscht wiederholt werden. Der gesamte Zyklus kann wiederholt werden, um von jeder Vesikel eine 2 &khgr; 2-Anordnung herzustellen und eine Anordnung (bzw. Matrix) von 8x8 Punkten zu erzeugen (2 &khgr; 2 Elemente/Vesikel &khgr; 16 Vesikeln = insgesamt 64 aufgetupfte Elemente). Für den Durchschnittsfachmann wird jedoch offensichtlich sein, daß bei der vorliegenden Erfindung irgendein geeignetes Verfahren zur Ausbildung von Anordnungen ausgeführt werden kann, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Oligonucleotide verschiedener Sequenzen oder Konzentrationen können in die' Kavitäten von bis zu 3 verschiedenen Quellen-Mikrotiterplatten mit 384 Kavitäten eingefüllt werden; ein Satz von 16 Kavitäten kann für eine Matrixlösung reserviert werden. Die Kavitäten von zwei Platten werden mit Waschlösung gefüllt. Auf den Tisch bzw. Objektträger der Robotereinheit 16 können 5 Mikrotiterplatten geladen werden. Mehrere Zielsubstrate können angrenzend an einen wahlfreien Satz von Anschlag- oder Paßstiften aufgelegt werden, die auf dem Objektträger 26 angeordnet und zum Ausrichten der Zielsubstrate entlang einem Satz von Bezugsachsen vorgesehen sind. Wenn die Matrix und das Oligonucleotid nicht vorgemischt sind, kann
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die Stifteinheit verwendet werden, um zuerst Matrixlösung auf alle gewünschten Zielsubstrate aufzutupfen. In einem anschließenden Schritt kann die Oligonucleotidlösung in das gleiche Muster wie das Matrixmaterial getupft werden, um die Matrix wiederaufzulösen. Als Alternative kann eine Probenanordnung hergestellt werden, indem zunächst die Oligonucleotidlösung auf den Wafer aufgebracht wird, gefolgt von der Matrixlösung, oder indem die Matrix- und die Oligonucleotidlösungen vorher vermischt werden.
Nach dem Aufbringen der Probenanordnungen auf die Oberfläche des Substrats können die Anordnungen unter Anwendung irgendeines der verschiedensten Mittel analysiert werden (z. B. spektrometrische Verfahren, wie z. B. Spektrometrie im UV-/sichtbaren Bereich, IR-Spektrometrie, Fluoreszenz-, Chemilumineszenz-, NMR-Spektrometrie oder Massenspektrometrie). Zum Beispiel können anschließend an das eine oder das andere Abgabeverfahren mit Proben beladene Substrate auf eine MALDI-TOF-Quellenplatte aufgelegt und dort mit einem Satz abgeschrägter, mit Schrauben befestigter Polycarbonat-Halterungen festgehalten werden. In einer Ausführungsform kann die Platte dann auf das Ende einer Sonde übertragen werden, die auf einen XY-Tisch (Newport) mit 1 &mgr;&tgr;&agr; Auflösung und 1" Bewegungsbereich im Quellenbereich eines Laufzeit-Massenspektrometers aufgenommen wird. Für den Durchschnittsfachmann wird offensichtlich sein, daß bei der vorliegenden Erfindung jedes geeignete Massenspektrometriegerät verwendet werden kann, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Bevorzugte Massenspektrometerformate zur Verwendung bei den hier beschriebenen Anordnungen sind u. a. Ionisationsverfahren (I), einschließlich, aber nicht beschränkt auf matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI), kontinuierliche oder Impuls-Elektronensprühverfahren (ESI) und verwandte Verfahren (z. B. Ionensprüh- oder Thermosprühverfahren) oder Massivcluster-Stoßverfahren (MCI); diese Ionenquellen können an Nachweisformate angepaßt werden, zu denen lineare oder nichtlineare Reflektron-Laufzeit-(TOF) , Einzel- oder Mehrfach-Quadrupel-, Einzel- oder Mehrfach-Magnetsektorverfahren, Fouriertransformations-Ionencyclotronresonanz (FTICR), Ionenfallen
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und Kombinationen daraus (z. B. Ionenfalle/Laufzeit) gehören. Zur Ionisation können zahlreiche Matrix/Wellenlänge-Kombinationen (MALDI) oder Lösungsmittelkombinationen (ESI) verwendet werden. Subattomol-Proteinkonzentrationen (atto =
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10 ) sind z. B. unter Anwendung von ESI (Valaskovic, G. A.
et al. (1996) Science 273: 1199-1202) oder MALDI-Massenspektrometrie (Li, L. et al. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 1662-1663) nachgewiesen worden.
Man wird folglich erkennen, daß in hier beschriebenen Verfahren eine völlig kontaktfreie Tröpfchenbildung durch Hochdrucksprühen oder eine Niederdruck-Tröpfchenbildung mit teilweisem Kontakt verwendet werden kann. Bei der letzteren tritt der einzige Kontakt zwischen dem Tröpfchen und den Wänden der Kavität oder einer hydrophilen ebenen Oberfläche des Substrats 34 auf. Bei keiner der beiden Ausführungsformen braucht irgendein Kontakt zwischen der Nadelspitze und der Oberfläche aufzutreten.
Bevorzugte Ausführungsformen
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Nucleinsäuremolekül auf einem Siliciumdioxid-Träger kovalent immobilisiert werden, indem der Träger mit einer Amino-Funktionalität funktionalisiert wird (z. B. durch Derivatisieren des Trägers mit einem Reagens, wie z. B. 3-Aminopropyltriethoxysilan (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)/ -siehe Fig.
7). Es können andere funktionalisierte Oxysilane oder Orthosilikate verwendet werden, die im Handel erhältlich sind (z. B. von Gelest, Inc. T&mgr;llytown, PA) . Zum Beispiel kann 3-Mercaptopropyltriethoxysilan zum Funktionalisieren einer SiIiciumoberflache mit Thiolgruppen verwendet werden. Das aminofunktionalisierte Siliciumdioxid kann mit einem heterobifunktionellen Reagens zur Reaktion gebracht werden, wie z. B. mit N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat (SIAB) (Pierce, Rockford, IL) . Weitere homo- und heterobifunktionelle Reagenzien, die verwendet werden können, sind im Handel erhältlich, z. B.
von Pierce. Schließlich wird eine Nucleinsäure, die mit einer Thiolgruppe (z. B. am 5'-Ende) funktionalisiert ist, durch Reaktion der Thiol-Funktionalität des Nucleinsäuremoleküls mit
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der Iodacetyl-Funktionalität des Trägers kovalent an den derivatisierten Siliciumdioxidträger gebunden.
In bestimmten Ausführungsformen kann die Nucleinsäure mit dem Vernetzungsmittel zur Reaktion gebracht werden, um ein Vernetzungsmittel/Nucleinsäure-Konjugat zu bilden, das dann mit einem funktionalisierten Träger zur Reaktion gebracht wird, um eine immobilisierte Nucleinsäure zu bilden. Als Alternative kann das Vernetzungsmittel in einer Einstufenreaktion mit der Nucleinsäure und einem funktionalisierten festen Träger kombiniert werden, um eine im wesentlichen gleichzeitige Umsetzung des Vernetzungsmittels mit der Nucleinsäure und dem festen Träger zu bewirken. In dieser Ausführungsform wird im allgemeinen die Verwendung eines heterobifunktionellen Vernetzungsmittels notwendig sein, d. h. eines Vernetzungsmittels mit zwei verschiedenen reaktiven Funktionalitäten, die zur selektiven Reaktion mit der Nucleinsäure bzw. dem funktionalisierten festen Träger fähig sind.
Die hier bereitgestellten Verfahren sind verwendbar zum Erzeugen von räumlich adressierbaren Anordnungen von Nucleinsäuren, die auf unlöslichen Trägern immobilisiert sind. Zum Beispiel können die Verfahren angewandt werden, um Anordnungen verschiedener Nucleinsäuren bereitzustellen, die auf Stifte immobilisiert sind, welche in einer Anordnung bzw. Matrix angeordnet sind. In einer weiteren Ausführungsform kann eine photospaltbare Schutzgruppe auf dem unlöslichen Träger selektiv gespalten werden (z. B. durch Photolithographie), um Abschnitte einer Oberfläche bereitzustellen, die für die Immobilisierung einer Nucleinsäure aktiviert sind. Zum Beispiel kann eine Siliciumoberflache, die durch Behandlung mit 3-Mercaptopropyltriethoxysilan zur Bildung von Thiolgruppen modifiziert ist, mit einer photospaltbaren Schutzgruppe blockiert werden (Beispiele photospaltbarer Schutzgruppen siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO 92/10092 oder McGray et al. (1989) Ann.
Rev. Biophys. Chem. 18: 239-270) und durch Bestrahlen ausgewählter Bereiche der Oberfläche, z. B. unter Verwendung einer Photolithographiemaske, selektiv deblockiert werden. Eine Nucleinsäure, die so modifiziert ist, daß sie eine thiolreaktive Gruppe enthält, kann dann direkt an dem Träger fixiert
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werden, oder alternativ kann ein thiolreaktives Vernetzungsmittel mit dem thiolmodifizierten Träger zur Reaktion gebracht werden, gefolgt von (oder im wesentlichen gleichzeitig mit) einer Reaktion mit einer Nucleinsäure zur Bildung immobilisierter Nucleinsäuren. Eine Nucleinsäurebase oder -sequenz kann nach der Immobilisierung auf einem Träger gemäß den hierin beschriebenen Verfahren weiter nach bekannten Verfahren modifiziert werden. Zum Beispiel kann die Nucleinsäuresequenz durch Ausführen einer Festphasen-Nucleinsäuresynthese nach herkömmlichen Verfahren einschließlich kombinatorischer Verfahren verlängert werden.
Hierin werden unlösliche Träger bereitgestellt, die Nucleinsäuren aufweisen. Vorzugsweise sind die Nucleinsäuren über mindestens ein Schwefelatom kovalent an eine Oberfläche des unlöslichen Trägers gebunden, d. h. die Nucleinsäuren sind über eine Linker-Komponente, die mindestens ein Schwefelatom aufweist, kovalent an die Oberfläche gebunden. Solche kovalent gebundenen Nucleinsäuren lassen sich leicht nach den hier beschriebenen Verfahren herstellen. Die unlöslichen Träger können in den verschiedensten Anwendungen verwendet werden, einschließlich derjenigen, die mit Hybridisierung und Sequenzierung verbunden sind. Beispielhafte Anwendungen werden in den Beispielen dargestellt.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die kovalent gebundenen Nucleinsäuren in einer Dichte von mindestens etwa 20
2 2
fmol/mm , stärker bevorzugt von mindestens etwa 75 fmol/mm ,
noch stärker bevorzugt von mindestens etwa 85 fmol/mm , noch
stärker bevorzugt von mindestens etwa 100 fmol/mm und am
stärksten bevorzugt von mindestens etwa 150 fmol/mm auf der Oberfläche des unlöslichen Trägers vorhanden.
Nach einem anderen Aspekt werden kombinatorische Banken von immobilisierten Nucleinsäuren bereitgestellt, die kovalent an einen festen Träger gebunden sind, wie oben beschrieben.
Nach einem weiteren Aspekt wird ein Kit für immobilisierte Nucleinsäuren auf einem festen Träger bereitgestellt. In einer Ausführungsform weist der Kit eine geeignete Menge i) eines thiolreaktiven Vernetzungsmittels und ii) eines oberflächenmodifizierenden Mittels zur Modifikation einer Oberfläche
mit einer Funktionalität auf (vorzugsweise einer anderen als der Thiol-Funktionalität), die mit dem thiolreaktiven Vernetzungsmittel reagieren kann. Der Kit . kann wahlweise einen unlöslichen Träger, z. B. eine feste Oberfläche, z. B. magnetisehe Mikrokügelchen, zur Verwendung bei immobilisierten Nucleinsäuren aufweisen. Der Kit kann außerdem ein Reagens zur Modifikation einer Nucleinsäure mit einer Thiol-Funktionalität aufweisen.
In einer anderen Ausführungsform weist der Kit ein Reagens zur Modifikation der Oberfläche eines Trägers mit einer Thiolkomponente und ein thiolreaktives Vernetzungsmittel auf, das mit einer Thiolkomponente eines Trägers reagieren kann. In bestimmten Ausführungsformen weist der Kit außerdem einen unlöslichen Träger auf, z. B. eine feste Oberfläche, beispielsweise magnetische Mikrokügelchen, zur Verwendung beim Immobilisieren von Nucleinsäuren.
Die hierin beschriebenen Kits können auch wahlweise geeignete Puffer; Behälter zur Aufnahme der Reagenzien und/oder Gebrauchsanweisungen enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform können die unlöslichen Träger mit kovalent gebundenen Nucleinsäuren, z. B. die gesamte Oberfläche oder räumlich adressierbare oder voradressierbare Anordnungsformate, in den verschiedensten Festphasen-Nucleinsäurechemie-Anwendungen verwendet werden, einschließlieh, aber nicht beschränkt auf Nucleinsäuresynthese (chemisch oder enzymatisch) Hybridisierung und/oder Verlängerung, sowie bei diagnostischen Verfahren, die auf Nucleinsäurenachweis und Polymorphismus-Analysen basieren (siehe z. B. die US-Patentschrift Nr. 5 605 798) . Dementsprechend werden hierin ferner Verfahren zur Umsetzung von Nucleinsäuremolekülen bereitgestellt, bei denen die Nucleinsäuremoleküle entweder durch Reaktion eines thiolhaltigen Derivats des Nucleinsäuremoleküls mit einem unlöslichen Träger, der eine thiolreaktive Gruppe enthält, oder durch Reaktion eines thiolhaltigen unlöslichen Trägers mit einem Derivat des Nucleinsäuremoleküls, das eine thiolreaktive Gruppe enthält, auf einer Oberfläche immobilisiert werden und danach die immobilisierten Nucleinsäuremoleküle weiter umgesetzt werden.
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In einer besonderen Ausführungsform wird die immobilisierte Nucleinsäure weiter umgesetzt, indem sie mit einer Nucleinsäure hybridisiert wird, die zu der immobilisierten Nucleinsäure oder zu einem Abschnitt davon komplementär ist. In einer weiteren Ausführungsform wird die immobilisierte Nucleinsäure durch Verlängern einer Nucleinsäure weiter umgesetzt, die an die immobilisierte Nucleinsäure oder einen Abschnitt davon hybridisiert ist. Verlängerungsreaktionen wie diese können z. B. bei Verfahren zum Sequenzieren von DNA-Molekülen verwendet werden, die mit Hilfe der hierin beschriebenen Verfahren an einem unlöslichen Träger immobilisiert sind. Folglich werden hier auch Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines DNA-Moleküls auf einem Substrat bereitgestellt, bei denen ein thiolhaltiges Derivat des DNA-Moleküls auf der Oberfläche eines unlöslichen Trägers immobilisiert wird, der thiolreaktive Gruppen enthält, und vor der Ausführung der DNA-Synthese in Gegenwart eines oder mehrerer Dadesoxynucleotide mit einer einzelsträngigen Nucleinsäure hybridisiert wird, die zu einem Abschnitt der immobilisierten DNA komplementär ist.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht, die lediglich zur näheren Erläuterung gedacht sind und nicht als einschränkend ausgelegt werden sollten. Der gesamte Inhalt aller Quellen (einschließlich Literaturstellen, erteilte Patente, veröffentlichte Patentanmeldungen und gleichzeitig anhängige Patentanmeldungen) , die in der gesamten vorliegenden Anmeldung zitiert werden, wird hiermit ausdrücklich zur Bezugnahme einbezogen.
Beispiel 1
Fixierung von DNA in hoher Dichte an Silicium-Wafern
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Materialien und Methoden
Alle Reagenzien wurden, wenn nicht anders angegeben, von Aldrich Chemical, Milwaukee, WI, bezogen.
Vorbereitung der Siliciumoberflache
Silicium-Wafer wurden mit Ethanol gewaschen, über einem Bunsenbrenner abgeflammt und 3 Stunden in eine wasserfreie Lö-
sung von 25 Vol.-% 3-Aminopropyltriethoxysilan in Toluol eingetaucht. Dann wurde die Silanlösung entfernt, und die Wafer wurden dreimal mit Toluol und dreimal mit Dimethylsulfoxid (DMSO) gewaschen. Die Wafer wurden dann in einer wasserfreien 10 mM Lösung von N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat (SIAB) (Pierce Chemical, Rockford, IL) in wasserfreiem DMSO inkubiert. Nach der Reaktion wurde die SIAB-Lösung entfernt, und die Wafer wurden dreimal mit DMSO gewaschen.
Da es unmöglich war, die Kondensation des SIAB und der Aminogruppe auf dem festen Träger des Wafers zu überwachen, wurde die Reaktion in Lösung ausgeführt, um die optimale Reaktionsdauer zu bestimmen. Durch Anwendung der Dünnschichtchromatographie (TLC) (Siliciumdioxidplatten mit Glasunterlage mit einem 254 nm-Fluoreszenzindikator) (Baker, Phillipsburg, NJ) mit Verwendung von Chloroform:Methanol im Verhältnis von 95:5 (Baker, Phillipsburg, NJ) wurde die Trennung der beiden Ausgangsmaterialien ermöglicht. Das SIAB-Ausgangsmaterial konnte unter langwelligem Ultraviolettlicht (302 nm) sichtbar gemacht werden; 3-Aminopropyltriethoxysilan war unter ultraviolettem Licht nicht aktiv, daher wurde die Platte mit einer Lösung von Ninhydrin besprüht, das mit primären Aminen reagiert und bei Erhitzen einen purpurfarbenen Fleck erscheinen läßt. Unter Verwendung eines leichten molaren Überschusses von SIAB gegenüber 3-Aminopropyltriethoxysilan wurde eine Mikroreaktion in Chloroform/DMSO ausgeführt und unter den obenerwähnten TLC-Bedingungen überwacht.
Oligonucleotid^Modifikationen
Die Reduktion des Disulfids von 3'- oder 5'-disulfidhaltigen Oligodesoxynucleotiden (Operon Technologies, Alameda, CA, oder Oligo Etc., Wilsonville, OR) wurde mittels Umkehrphasen-FPLC (Pharmacia, Piscataway, NJ) überwacht; in der Verweilzeit des Oligodesoxynucleotids nach Abspaltung des Disulfids ist eine Verschiebung zu erkennen. Es wurden verschiedene Reduktionsverfahren untersucht, um die optimalen Bedingungen zu ermitteln. In einem Fall wurde das disulfidhaltige Oligodesoxynucleotid (31,5 nmol, 0,5 mM) mit Dithiothreitol (DTT) (Pierce Chemical, Rockford, IL) (6,2 mmol, 100 mM) bei pH 8,0
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und 370C inkubiert. Nachdem die Spaltungsreaktion im wesentlichen abgeschlossen war, wurde das freies Thiol enthaltende Oligodesoxynucleotid unter Verwendung einer Chromaspin-10-Säule (Clontech, PaIo Alto, CA) isoliert, da DTT in der nachfolgenden Reaktion konkurrieren kann. Als Alternative ist Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) (Pierce Chemical, Rockford, IL) zum Spalten des Disulfids verwendet worden. Das disulfidhaltige Oligodesoxynucleotid (7,2 nmol, 0,36 mM) wurde mit TCEP in Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bei 370C inkubiert. Das Produkt braucht nach der Reaktion nicht isoliert zu werden, da TCEP nicht konkurrierend mit der Iodacetamido-Funktionalität reagiert. Es wurden verschiedene Konzentrationen von TCEP für die Spaltungsreaktion verwendet, um die optimalen Bedingungen für die Konjugationsreaktion zu ermitteln.
Sondenkopplung
Jedem Wafer, der gemäß der obigen Beschreibung so derivatisiert worden war, daß er die Iodacetamido-Funktionalität enthielt, wurde eine wäßrige 10 mM-Lösung des freies Thiol enthaltenden Oligodesoxynucleotids in 100 mM Phosphatpuffer, pH 8, zugesetzt; man ließ die Reaktion mindestens 5 Stunden bei Raumtemperatur in 100% relativer Feuchte ablaufen. Anschließend an die Reaktion wurde die Oligodesoxynucleotid-Lösung entfernt, und die Wafer wurden zweimal in 5 X SSC-Puffer (75 mM Natriumeitrat, 750 mM Natriumchlorid, pH 7) mit 50% Formamid (USB, Cleveland, OH) bei 650C jeweils eine Stunde gewaschen.
Radiochemische Bestimmung der Sondendichte
Um die Menge der kovalent an eine Oberfläche gebundenen DNA oder die Menge einer hybridisierten komplementären Sequenz zu bestimmen, wurden radioaktiv markierte Sonden verwendet. In Fällen, wo ein 5'-disulfidhaltiges Oligodesoxynucleotid zu immobilisieren war, wurde das 3'-Ende unter Verwendung von terminalem Transferase-Enzym und eines radioaktiv markierten Didesoxynucleosidtriphosphats radioaktiv markiert; in einer Standardreaktion wurden 15 pmol (0,6 &mgr;&Mgr;) des 5'-disulfidhaltigen Oligodesoxynucleotids mit 50 \iCi (16,5 pmol, 0,66 &mgr;&Mgr;) [&agr;-
P]-Didesoxyadenosin-5'-triphosphat (ddATP) (Amersham, Ar-
lingtom Height, IL) in Gegenwart von 0,2 mM 2-Mercaptoethanol inkubiert. Nach Zugabe von 40 Einheiten des terminalen Desoxynucleotidyltransferase-Enzyms (USB, Cleveland, OH) ließ man die Reaktion eine Stunde bei 370C ablaufen. Nach dieser Zeit wurde die Reaktion angehalten, indem das Fläschchen 10 Minuten in ein Wasserbad mit 750C eingetaucht wurde, und das Produkt wurde unter Verwendung einer Chromaspin-10-Säule (Clontech, PaIo Älto, CA) isoliert. Auf ähnliche Weise wurde ein 5'-disulfidhaltiges Oligodesoxynucleotid mit S radioaktiv markiert.
In Fällen, wo ein 3'-disulfidhaltiges Oligodesoxynucleotid zu immobilisieren war, wurde das 5'-Ende mit Hilfe von T4-Polynucleotidkinase und eines radioaktiv markierten Nucleosidtriphosphats radioaktiv markiert. Zum Beispiel wurden 15 pmol (0,6 &mgr;&Mgr;) des 3'-disulfidhaltigen Oligodesoxynucleotids
mit 50 &mgr;&agr; (16,5 pmol, 0,66 &mgr;&Mgr;) [&lgr;32&Rgr;] -Adenosin-5' -triphosphat (ATP) (Amersham, Arlingtom Height, IL) in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-Mercaptoethanol inkubiert. Nach Zugabe von 40 Einheiten T4-Polynucleotidkinase ließ man die Reaktion 1 Stunde bei 370C ablaufen. Die Reaktion wurde angehalten, indem das Fläschchen 10 Minuten in ein Wasserbad von 750C eingetaucht wurde, dann wurde das Produkt mit Hilfe einer Chromaspin-10-Säule (Clontech, PaIo Alto, CA) isoliert.
Zur Bestimmung der Dichte der kovalent. immobilisierten Sonde wurde das gewählte disulfidhaltige Oligodesoxynucleotid einer Spurenmenge der gleichen Spezies zugesetzt, die gemäß der obigen Beschreibung radioaktiv markiert worden war. Das Disulfid wurde gespalten, die Sonde wurde auf iodacetamidofunktionalisierten Wafern immobilisiert, die Wafer wurden gewaschen und dann einem Leuchtstoffabbildungsschirm (phosphorimager screen) (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) ausgesetzt. Für jedes verwendete, unterschiedliche Oligodesoxynucleotid wurden Vergleichs-Spots auf Polystyrol hergestellt, bei denen der molare Anteil des Oligodesoxynucleotids bekannt war. Diese Vergleichs-Spots wurden gleichfalls dem Leuchtstoffabbildungsschirm ausgesetzt. Beim Abtasten des Schirms wurde die Menge
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(in mol) des an jeden Chip gebundenen Oligodesoxynucleotids durch Vergleich der Zähleranzeigen mit den spezifischen Aktivitäten der Vergleichsproben bestimmt.
Hybridisierung und Ausbeute
Einem Wafer, der mit einer immobilisierten Sonde funktionalisiert worden war, wurde eine Lösung einer komplementären Sequenz (10 &mgr;&Mgr;) in IM NaCl und TE-Puffer zugesetzt. Der Wafer und die Lösung wurden auf 750C erhitzt, wonach man sie 3 Stunden lang auf Raumtemperatur abkühlen ließ. Nach dieser Zeit wurde die Lösung entfernt, und der Wafer wurde zweimal mit TE-Puffer gewaschen.
Zur Bestimmung der Menge des hybridisierten Oligonucleotids wurde zunächst gemäß der obigen Beschreibung die Immobilisierung der Sonde ausgeführt, wobei aber die Sonde mit
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S statt mit P markiert wurde. Die Dichte der immobilisierten Sonde wurde mit dem Leuchtstoffabbildungsschirm (phosphorimager) bestimmt. Als nächstes wurde der gleiche Wafer in TE-Puffer, IM NaCl und ihrem (der Sonde) komplementären Strang
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(10 &mgr;&Mgr;) inkubiert, der mit P radioaktiv markiert worden war.
Die Hybridisierung wurde ausgeführt, wie weiter oben beschrieben. Nach einem Waschvorgang zum Entfernen unspezifischer Bindungen wurden der Wafer und die Vergleichsprobe einem Leuchtstoffabbildungsschirm ausgesetzt, wobei ein Stück Kupferfolie zwischen den Schirm und dem Wafer gelegt wurde. Die Kupferfolie dient zum Blockieren des Signals von S, während sie das
P-Signal durchläßt. Dann wird der molare Anteil des hybridisierten Oligonucleotids bestimmt, wodurch sich der prozentuale Anteil der kovalent immobilisierten Sonde ermitteln läßt, die zur Hybridisierung verfügbar ist.
Massenspektrometrische MALDI-TOF-Analyse
Wie oben beschrieben, wurden Wafer synthetisiert, die
nicht radioaktiv markiertes Oligodesoxynucleotid enthielten (Name: TCUC; Sequenz: GAATTCGAGCTCGGTACCCGG; Molekulargewicht:
6455 Da; Seq.-ID-Nr. 1), und eine komplementäre Sequenz (Name:
MJM6; Sequenz: CCGGGTACCGAGCTCGAATTC; Molekulargewicht: 6415 Da, Seq.-ID-Nr. 2) wurde hybridisiert. Die Wafer .wurden zum
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Kationenaustausch in 50 mM Ammoniumcitratpuffer gewaschen, um Natrium- und Kaliumionen an der DNA-Hauptkette zu entfernen (Pieles, U. et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21: 3191-3196). Eine Matrixlösung von 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA, 0,7 M in 50% Acetonitril, 10% Ammoniumeitrat; (Wu, K.J., et al. (1993) Rapid Commun. Mass Spectrom. 7: 142-14 6) wurde auf den Wafer getupft und bei Umgebungstemperatur trocknen gelassen. Die Wafer wurde unter Verwendung eines leitfähigen Bandes direkt an der Probensonde eines Vision 2000 Reflectron-TOF-Massenspektrometers von Finnigan MAT (Bremen, Deutschland) befestigt. Das Reflectron besitzt eine 5 keV-Ionenquelle und eine 20 keV-Nachbeschleunigung; es wurde ein Stickstofflaser verwendet, und alle Spektren wurden im positiven Ionenmodus aufgenommen.
Ergebnisse
Oberflächenchemie
Unter Anwendung der normalen Siliciumdioxid-Modifikationschemie wurde ein Silicium-Wafer mit 3-Aminopropyltriethoxysilan zur Reaktion gebracht, um auf der Oberfläche eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminogruppen zu erzeugen.
Wie in Fig. 7 dargestellt, wurde die Oberfläche dann einem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel ausgesetzt, wodurch Iodacetamido-Gruppen auf der Oberfläche entstanden. Die optimale Reaktionsdauer dieser Reaktion konnte in Lösung mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie (TLC) bestimmt werden. Das SIAB-Vernetzungsmittel wurde unter langwelligem ultraviolettem Licht (302 nm) sichtbar gemacht und zeigte einen Fleck mit einem Rf-Wert von 0,58,. 3-Aminopropyltriethoxysilan war unter ultraviolettem Licht nicht aktiv, daher wurde Ninhydrin verwendet, um einen purpurfarbenen Fleck sichtbar zu machen, der die Gegenwart eines primären Amins an der Bezugslinie anzeigte. Unter Verwendung eines leichten molaren Überschusses von SIAB gegenüber 3-Aminopropyltriethoxysilan wurde eine Mikroreaktion ausgeführt; die TLC-Analyse nach etwa einer Minute zeigte einen neuen, unter langwelligem Ultraviolettlicht sichtbaren Fleck mit einem Rf-Wert von 0,28. Nach Besprühen mit Ninhydrin wurde kein purpurfarbener Fleck nachgewiesen, folglich war das gesamte 3-Aminopropyltriethoxysilan-Ausgangs-
&iacgr;&udigr;-ÜH-OO
material in der Reaktion verbraucht worden. UV-Licht zeigte auch das überschüssige SIAB an, das nach der Reaktion zurückblieb. Aus diesen Ergebnissen wurde festgestellt, daß die Reaktion nach etwa einer Minute abgeschlossen ist. In allen Fällen wurden die iodacetamido-funktionalisierten Wafer sofort verwendet, um die Hydrolyse der instabilen Iodacetamido-Funktionalität zu minimieren. Außerdem wurden alle weiteren Wafer-Manipulationen im Dunklen ausgeführt, da die Iodacetamido-Funktionalität lichtempfindlich ist.
Die Disulfid-Reduktion des modifizierten Oligonucleotids wurde überwacht, indem eine Verschiebung der Verweilzeit bei der Umkehrphasen-FPLC beobachtet wurde. Es wurde festgestellt, daß nach fünf Stunden in Gegenwart von DTT (100 mM) oder TCEP (10 mM) das Disulfid vollständig zu freiem Thiol reduziert war. Wenn man die DTT-Reaktion längere Zeit weiterlaufen ließ, bildete sich ein Oligonucleotid-Dimer, in welchem Paare von freien Thiolen miteinander reagiert hatten. Eine solche Dimerisierung wurde auch beobachtet, wenn das DTT nach Beendigung der Spaltungsreaktion entfernt wurde. Diese Dimerisierung wurde nicht beobachtet, wenn TCEP als Spaltreagens verwendet wurde, da diese Reaktion bei pH 4,5 ausgeführt wird, so daß die freien Thiole vollständig protoniert wurden und die Dimerisierung gehemmt wurde.
Unmittelbar nach der Disulfidspaltung wurde das modifizierte Oligonucleotid mit den iodacetamido-funktionalisierten Wafern inkubiert. Um eine vollständige Thiol-Deprotonierung sicherzustellen, wurde die Kopplungsreaktion bei pH 8,0 ausgeführt. Die durch diese Chemie von Silicium-Wafern erzielte Sonden-Oberflächendichte wurde mit Hilfe radioaktiv markierter Sonden und eines Leuchtstoffabbildungsschirms (phosphorimager) analysiert. Die Sonden-Oberflächendichte wurde außerdem als Funktion der TCEP-Konzentration überwacht, die bei der Disulfidspaltungsreaktion verwendet wurde (Fig. 8) . Unter Verwendung von 10 mM TCEP zur Spaltung des Disulfids sowie der anderen, oben beschriebenen Reaktionsbedingungen war es möglich,
reproduzierbar eine Oberflächendichte von 250 fmol pro mm Oberfläche zu erhalten. Es wurden die gleichen Experimente wie oben beschrieben ausgeführt, außer daß die Oligonucleotid-
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Sonde keine Thiolmodifikation aufwies; Oberflächendichten von weniger als 5 fmol pro mm Oberfläche bewiesen, daß die unspezifische Bindung minimal ist und die Sondenkopplung sehr wahrscheinlich so auftrat, wie in Fig. 7 vorgeschlagen.
5
Hybridisierung
Nach dem Fixieren von S-markierten Sonden an der Oberfläche von Wafern und der Bestimmung der Konjugationsdichte gemäß der obigen Beschreibung wurde die Hybridisierung von
P-markierten Oligonucleotiden ausgeführt; die Hybridisierungsausbeute und -dichte wurden mit Hilfe des Leuchtstoffabbildungsschirms (phosphorimager) und einer Kupferfolie bestimmt. Es wurde experimentell ermittelt, daß Kupferfolie 98,4% eines S-Signals blockiert, während sie ein nachzuwei-
32
sendes P-Signal vollständig durchläßt. Die komplementäre Sequenz hybridisierte reproduzierbar mit einer Ausbeute von 105 fmol pro mm Oberfläche; dies entspricht etwa 40% der für die Hybridisierung verfügbaren konjugierten Sonden. Auf ähnliche Weise wurde in diesem Schema eine nichtkomplementäre Sequenz
verwendet, die weniger als 5 fmol pro mm Oberfläche bei unspezifischer Bindung ergab.
Es wird vermutet, daß die sterische Hinderung zwischen dem dichtgepackten Oligonucleotid auf der ebenen Oberfläche höhere Hybridisierungsausbeuten als 40% verhindert. Unter Berücksichtigung dessen wurde zwischen dem Ende des Hybridisierungsbereichs des Oligonucleotids und dem Träger ein Spacer-Molekül eingebaut. Die gewählten Spacer waren eine Serie von Poly-dT-Sequenzen mit'Längen im Bereich von 3 bis 25. Bei Untersuchung dieser Proben mit radioaktiven Markierungen und dem Leuchtstoffabbildungsschirm wurde festgestellt, daß die erzielbare maximale Hybridisierung immer noch 40% betrug
MALDI-TOF MS-Analyse
Wafer wurden mit Sonden funktionalisiert, komplementäre Sequenzen wurden hybridisiert, und die Proben wurden unter normalen MALDI-Bedingungen analysiert, wie oben beschrieben. Die Analyse zeigte, daß nur der reassoziierte bzw. wieder verbundene Strang (MJM6) im Massenspektrum mit einem experimen-
i H. r$U - fifi
teilen Masse/Ladungs-Verhältnis von 6415,4 beobachtet wurde; das theoretische Masse/Ladungs-Verhältnis beträgt 6415 (Fig. 9) . Da bei einem Masse/Ladungs-Verhältnis von 6455 kein Signal vorhanden war, wurde festgestellt, daß der wafer-konjugierte Strang (TCUC) nicht desorbiert wurde; folglich war die Iodacetamido-Bindung stabil genug, um dem Laser zu widerstehen und intakt zu bleiben. Ein zusätzliches Signal wurde bei einem Masse/Ladungs-Verhältnis von 6262.0 beobachtet. Dieses Signal ergibt sich aus einer Depurinierung von Guanosinen, da DNA bekanntlich anfällig für den Verlust von Purinbasen während des MALDI-Verfahrens ist (Nordoff, E. et al. (1992) Rapid Commun. Mass Spectrom. 6: 771-776). Die Probenkristalle auf dem Wafer waren nicht homogen verteilt, daher mußte ein guter Spot aufgespürt werden. Wegen dieser Inhomogenität schwankte die Masseauflösung, lag aber in den Massenspektren im allgemeinen im Bereich von 200-300 für das desorbierte Oligonucleotid. In einer Gruppe von Experimenten wurden nichtkomplementäre Sequenzen an den Wafer hybridisiert; nach einem Waschvorgang, wie weiter oben beschrieben, zeigte die Analyse mittels MALDI-TOF MS, daß eine minimale unspezifische Anlagerung stattgefunden hatte, da kein Signal nachgewiesen wurde.
Beispiel 2
Immobilisierung von amplifizierten DNA-Zielen auf Silicium-Wafern
Die SIAB-konjugierten Silicium-Wafer wurden gleichfalls zur Analyse spezifischer, freies Thiol enthaltender DNA-Fragmente einer bestimmten amplifizierten DNA-Zielsequenz verwendet.
Wie in Fig. 10 dargestellt, wurde ein 23-mer-Oligodesoxynucleotid, das eine 5'-Disulfidbindung enthält [bezogen von Operon Technologies; Seq.-ID-Nr.: 3], die zum 3'-Bereich einer 112 bp-Humangenom-DNA-Matrize [Genbank-Zugriffsnummer: Z52259; Seq.-ID-Nr.: 4] komplementär ist, in Verbindung mit einem im Handel erhältlichen 49-mer-Primer, der zu einem Abschnitt des 5'-Endes der genomischen DNA komplementär ist [bezogen von Operon Technologies; Seq.-ID-Nr.: 5], in PCR-Reaktionen als Primer zur Amplifikation eines 135bp-DNA-Produkts verwendet,
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das eine 5' -Disulfidbindung enthält, die nur an einem Strang des DNA-Doppelstrangs [Seq.-ID-Nr.: 6] fixiert ist.
Die PCR-Amplifikationsreaktionen wurden unter Verwendung eines Amplitaq GoldKit [Perkin Eimer, Katalog-Nr. N808-024 9] ausgeführt. Kurz gesagt, 200 ng einer 112bp-Humangenom-Matrize wurden mit 10 &mgr;&Mgr; 23-mer-Primer und 8 &mgr;&Mgr; des im Handel erhältlichen 4 9-mer-Primers, 10 mM dNTPs, 1 Einheit Amplitaq Gold DNA-Polymerase in dem vom Hersteller gelieferten Puffer inkubiert, und die PCR (Polymerasekettenreaktion) wurde in einer Temperaturwechseleinrichtung (Thermocycler) ausgeführt.
Die 5'-Disulfidbindung des entstehenden PCR-Produkts wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von 10 mM TCEP vollständig reduziert, um eine freie 5'-Thiolgruppe zu erzeugen. Der die freie Thiolgruppe enthaltende DNA-Strang wurde über den SIAB-Linker an die Oberfläche des Silicium-Wafers konjugiert, wie im wesentlichen in Fig. 7 skizziert.
Der mit der thiolhaltigen 135bp-DNA konjugierte Silicium-Wafer wurde mit einem komplementären 12-mer-Oligonucleotid [Seq.-ID-Nr.: 7] inkubiert, und spezifisch hybridisierte DNA-Fragmente wurden mittels MALDI-JOF MS-Analyse nachgewiesen. Das Massenspektrum zeigte ein Signal mit einem beobachteten experimentellen Masse/Ladungs-Verhältnis von 3618,33; das theoretische Masse/Ladungs-Verhältnis der 12-mer-Oligomersequenz beträgt 3622,4 Da.
Folglich kann ein spezifisches DNA-Zielmolekül amplifiziert werden, das eine 5'-Disulfidbindung enthält. Die Moleküle werden unter Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren auf einem SIAB-derivatisiertem Silicium-Wafer immobilisiert, und an diese Zielmoleküle können spezifische komplementäre Oligonucleotide hybridisiert und mittels MALDI-TOF MS-Analyse nachgewiesen werden.
Beispiel 3 Spectrochip-Mutantennachweis im ApoE-Gen
Dieses Beispiel beschreibt die Hybridisierung einer immobilisierten Matrize, Primerverlängerung (primer extension) und Massenspektrometrie zum Nachweis des Wildtyp- und Mutanten-Apolipoprotein &Egr;-Gens für diagnostische Zwecke. Dieses
Beispiel zeigt, daß immobilisierte DNA-Moleküle, die eine spezifische Sequenz enthalten, mittels Primerverlängerung von nichtmarkierten allelspezifischen Primern und Analyse der Verlängerungsprodukte durch Massenspektroraetrie nachgewiesen und unterschieden werden können.
Eine synthetische 50-Basen-DNA-Matrize, die komplementär zu der codierenden Sequenz von Allel 3 des Wildtyp-Apolipoprotein &Egr;-Gens ist:
5'-GCCTGGTACACTGCCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAG-S'
[Seq.-ID-Nr.: 17],
oder ein Komplement zu dem Mutanten-Apolipoprotein &Egr;-Gen, das eine G&mdash;»&Agr;-Transition am Codon 158 trägt:
5'-GCCTGGTACACTGCCAGGCACTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAG-S'
[Seq.-ID-Nr.: 18]
das eine freie 3'-Thiolgruppe enthält, wurde mit separaten SIAB-derivatisierten Silicium-Wafern gekoppelt, wie im wesentlichen in Fig. 7 skizziert und in den Beispielen 1 und 2 beschrieben .
Ein 21-mer-Oligonucleotid-Primer:
5'-GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3' [Seq.-ID-Nr.: 19] wurde an jede der immobilisierten Matrizen hybridisiert, und der Primer wurde mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Kits [z. B. Sequenase oder Thermosequenase, U.S. Biochemical Corp.] verlängert. Die Zugabe von Sequenase-DNA-Polymerase oder Thermosequenase-DNA-Polymerase in Gegenwart von drei Desoxyribonucleosidtriphosphaten (dNTPs; dATP, dGTP, dTTP) und Didesoxyribonucleosidcytosintriphosphat (ddCTP) in Puffer nach den vom Hersteller gegebenen Anweisungen ergab eine Verlängerung um eine Base des 21-mer-Primers, der an die immobilisierte Matrize gebunden ist, die das Wildtyp-Apolipoprotein &Egr;-Gen codiert, und eine Verlängerung um drei Basen des 21-mer-Primers, der an die immobilisierte Matrize gebunden ist, welche die Mutantenform des Apolipoprotein &Egr;-Gens codiert.
Die Wafer wurden mittels Massenspektrometrie analysiert, wie hierin beschrieben. Die Wildtyp-Apolipoprotein E-Sequenz ergibt ein Massenspektrum, das den Primer mit einbasiger Verlängerung (22-mer) mit einem Masse/Ladungs-Verhältnis von 6771,17 Da (das theoretische Masse/Ladungs-Verhältnis be-
&bull; ·
&bull; ·
trägt 6753,5 Da) von dem ursprünglichen 21-mer-Primer mit einem Masse/Ladungs-Verhältnis von 6499,64 Da unterscheidet. Die Mutanten-Apolipoprotein &Egr;-Sequenz ergibt ein Massenspektrum, das den Primer mit dreibasiger Verlängerung (24-mer) mit einem Masse/Ladungs-Verhältnis von 7386,9 (das theoretische Masse/Ladungs-Verhältnis beträgt 7386,9) von dem ursprünglichen 21-mer-Primer mit einem Masse/Ladungs-Verhältnis von 6499,64 Da unterscheidet.
Beispiel 4
Herstellung von DNA-Anordnungen unter Verwendung von seriellen und parallelen Abgabewerkzeugen
Robotergesteuerte serielle und parallele pL-nL-Abgabewerkzeuge wurden zur Herstellung von DNA-Anordnungen von 10 bis 10 Elementen auf quadratischen Chips von < 1 Zoll Seitenlänge mit ebenen oder geometrisch veränderten Oberflächen (z. B. mit Kavitäten) für die massenspektrometrische Analyse mit matrixunterstützter Laserdesorption/Ionisation verwendet. Bei den ersteren gibt eine "piezoelektrische Pipette" (Kapillare von 70 &mgr;&pgr;&agr; Innendurchmesser) ein oder mehrere Tröpfchen von -0,2 nl der Matrix und danach des Analyten auf den Chip ab; Spektren von so geringen Mengen wie 0,2 fmol einer 36-mer-DNA sind mit Hilfe dieses Verfahrens erfaßt worden. Trotz der schnellen Verdampfung (<5 s) werden routinemäßig Mikrokristal-Ie der 3-Hydroxypicolinsäure-Matrix erzeugt, die den Analyten enthält, woraus sich eine höhere Reproduzierbarkeit ergibt, als man routinemäßig bei Präparaten mit größerem Volumen erzielt; alle 100 Spots von jeweils 5 fmol eines 23-mers in 800 &mgr;&idiagr;&eegr;-Kavitäten ergaben leicht interpretierbare Massenspektren mit 99/100 Ausgangsionensignalen mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von >5. In einem zweiten Verfahren werden Sonden von einer Mikrotiterplatte mit 384 Kavitäten in Gruppen zu je 16 in Chip-Kavitäten oder auf ebene Oberflächen gegeben, wobei eine Anordnung von federgespannten Stiften verwendet wird, die -20 nl durch Oberflächenkontakt auf den Chip übertragen; die MS-Analyse von Anordnungselementen, die mit dem Parallelverfahren aufgebracht wurden, ist hinsichtlich der Empfindlich-
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keit und der Auflösung mit den Elementen vergleichbar, die nach dem seriellen Verfahren aufgebracht werden.
Beschreibung der piezoelektrischen seriellen Abgabeeinrichtung.
Das experimentelle System wurde aus einem System entwickelt, das von der Microdrop GmbH, Norderstedt, Deutschland, bezogen wurde, und kann aufweisen: einen Treiber für piezoelektrische Elemente, der ein Impulssignal an ein piezoelektrisches Element sendet, das an eine Glaskapillare angeklebt ist und diese umgibt, welche die abzugebende Lösung enthält; einen Druckwandler zum Füllen (durch Unterdruck) oder Entleeren (durch Überdruck) der Kapillare; einen XYZ-Robotertisch und Robotertreiber zum Manövrieren der Kapillare zum Beladen, Entladen, zur Abgabe und zum Reinigen, ein Stroboskop mit Treiber, das mit der Frequenz des Piezoelements impulsgesteuert wird, um das Betrachten der Eigenschaften von schwebenden Tröpfchen zu ermöglichen; separate Tische bzw. Objektträger für Quellen- und Zielplatten oder Zielproben (d. h. einen Si-Chip); eine am Roboterarm montierte Kamera zum Betrachten des Beladens der Zielplatte und eine Datenstation, welche die Druckeinheit, den XYZ-Roboter und den piezoelektrischen Treiber steuert.
Beschreibung der parallelen Abgabeeinrichtung
Das Roboter-Stiftwerkzeug besteht aus 16 Sonden, die in einem Sondenblock untergebracht und auf einem XYZ-Robotertisch montiert sind. Der Robotertisch ist ein Portalsytem, das die Anordnung von Probentabletts unter den Armen des Roboters ermöglicht. Die Portaleinheit selbst besteht aus X- und Y-Arrnen, die sich über 250 bzw. 400 mm bewegen, geführt von bürstenlosen Linearservomotoren mit Positionsrückführung durch lineare optische Codierer. Eine leitspindelgetriebene Z-Achse (50 mm Vertikalhub) ist auf dem XY-Schlitten der Portaleinheit montiert und wird durch einen Reihen-Drehservomotor mit Positionsrückführung durch einen am Motor montierten optischen Drehcodierer gesteuert. Der Arbeitsbereich des Systems ist mit einer herausziehbaren Bestückungsplatte ausgestattet, die fünf Mikrotiterplatten (am häufigsten zwei Platten mit Waschlösung
und drei Probenplatten für maximal 1152 verschiedene Oligonucleotid-Lösungen) und bis zu zehn 20 &khgr; 20 mm-Wafer aufnimmt. Die Wafer werden in der Platte genau an zwei Anschlagstiften angeordnet und mittels Unterdruck festgehalten. Das gesamte System ist zur Sicherheit in ein Plexiglasgehäuse eingeschlossen und zur Wärme- und Schwingungsdämpfung auf einem Stahltragrahmen montiert. Die Bewegungssteuerung erfolgt unter Verwendung einer handelsüblichen Bewegungssteuereinrichtung, die eine 3-Achsen-Servosteuerung darstellt und in einen Computer integriert ist; das Programm für spezielle Anwendungen wird nach Bedarf geschrieben.
Proben wurden mit dem seriellen System auf verschiedene Oberflächen abgegeben, die bei der MALDI-TOF-Analyse als Ziele dienten, zu denen gehörten: [1] ein ebenes Probenziel aus rostfreiem Stahl, wie es zur Routine-Anwendung in einem Thermo Bioanalysis Vision 2000 verwendet wird; [2] ein Ziel aus rostfreiem Stahl von gleicher Konstruktion mit mikrobearbeiteten Nano-Grübchen; [3] ebene Silicium-Wafer (Si-Wafer); [4] polierte ebene Si-Wafer; [5] Si-Wafer mit rauhen Grübchen (Merkmale von 3-&bgr; &mgr;&tgr;&eegr; Größe), [6] (a) Si-Chips von 12 &khgr; 12 (oder 18 &khgr; 18 mm mit Anordnungen von 10 &khgr; 10 (oder 16 &khgr; 16) chemisch geätzten Vertiefungen bzw. Kavitäten von jeweils 800 &khgr; 800 &mgr;&pgr;&igr; Seitenlänge, mit Tiefen von 99-400 &mgr;&idiagr;&eegr; (oder (b) 120 &mgr;&idiagr;&eegr;) , Abstand (a) 1,0 (oder (b) 1,125) mm; [7] Si-Chips von 15 &khgr; 15 mm mit Anordnungen von 28 x" 28 chemisch geätzten Kavitäten von jeweils 450 &khgr; 450 &mgr;&tgr;&agr; Seitenlänge, mit Tiefen von 48-300 &mgr;&pgr;\, Abstand 0,5 mm; [8] ebenes Polycarbonat oder andere Kunststoffe; .[9] Gold und andere Metalle; [10] Membranen; [11] mit Gold oder anderen leitfähigen Materialien gesputterte Kunststoffoberflachen. Das abgegebene Volumen wird durch Einstellen der Anzahl der abgegebenen Tröpfchen von 10 bis 10 1 gesteuert.
Probenherstellung und Abgabe
1. Seriell
Oligonucleotide (0,1-50 ng/&mgr;&idiagr;) mit unterschiedlicher Sequenz oder unterschiedlichen Konzentrationen wurden in Kavitäten einer 96-Kavitäten-Mikrotiterplatte eingefüllt; die er-
ste Kavität wurde für Matrixlösung reserviert. Ein mit Grübchen versehener Chip (Ziel 6a im obigen Abschnitt über MALDI-Ziele) wurde auf den Tisch aufgelegt und von Hand ausgerichtet. In die Roboter-Steuersoftware (auf Windows-Basis) wurden die Koordinaten der ersten Kavität, die Größe der Anordnung (d. h. die Anzahl der Spots in x- und y-Richtung) und der Abstand zwischen den Elementen sowie die Anzahl von 0,2 Nanoliter-(nl-)Tröpfchen pro Anordnungselement eingegeben. Die Kapillare wurde mit ~10 &mgr;&idiagr; H2O zum Spülen gefüllt, automatisch im Blickfeld einer Kamera mit Stroboskop-Beleuchtung bewegt, um im Dauerimpulsbetrieb die Unversehrtheit und Sauberkeit der Spitze zu kontrollieren, und dann entleert. Dann wurde die Kapillare mit Matrixlösung gefüllt, wieder unter dem Stroboskop geprüft und dann zum Auftupfen einer Anordnung auf ebene oder mit Grübchen versehene Oberflächen verwendet. Für Reproduzierbarkeitsuntersuchungen in verschiedenen Massenspektrometrie-(MS-)Betriebsarten wurde typischerweise eine 10 &khgr; 10-Anordnung von 0,2-20nl-Tröpfchen abgegeben. Die Kapillare wurde durch Anlegen von Überdruck entleert, wahlweise mit H2O gespült und zur Quellen-Oligonucleotid-Platte geführt, wobei ~5 &mgr;&idiagr; synthetische 0,05-2,OmM Oligonucleotide angesaugt wurden. Dann wurde die Kapillare rasterartig der Reihe nach über jeden der Matrix-Spots bewegt, wobei jedem Spot 0,2 bis 20 nl wäßrige Lösung zugesetzt wurden.
2. Parallel
Es wurden Parallelprogramme geschrieben, um die Herstellung von Anordnungen durch Offsetdruck zu steuern; zur Herstellung einer Anordnung von 64 Elementen auf 10 Wafern wurde zum Beispiel das Werkzeug in 16 Kavitäten einer DNA-Quellenplatte mit 384 Kavitäten eingetaucht, zum Ziel (z. B. Si, Kunststoff, Metall) bewegt, und die Probe wurde durch Oberflächenkontakt aufgetupft. Das Werkzeug wurde dann in die gleichen 16 Kavitäten eingetaucht und auf das zweite Ziel aufgetupft; dieser Zyklus wurde auf allen zehn Wafern wiederholt. Als nächstes wurde das Werkzeug in Waschlösung getaucht, dann in 16 andere Kavitäten der Quellenplatte getaucht und um 2,25 mm gegen die ursprüngliche Gruppe von 16 Spots versetzt auf
das Ziel aufgetupft; dies wurde wiederum auf allen 10 Zielen wiederholt; der gesamte Zyklus wurde wiederholt, urn eine 2 &khgr; 2-Anordnung von jedem Stift herzustellen und eine 8x8 Spot-Anordnung (2x2 Elemente/Stift &khgr; 16 Stifte = insgesamt 64 aufgetupfte Elemente) zu erzeugen.
Zur Herstellung von Anordnungen für die massenspektrometrische Analyse (MS-Analyse) wurden Oligonucleotide mit unterschiedlichen Sequenzen oder Konzentrationen in die Kavitäten von bis zu drei verschiedenen 384-Kavitäten-Mikrotiterplatten eingefüllt; eine Gruppe von 16 Kavitäten wurde für Matrixlösung reserviert. Die Kavitäten von zwei Platten wurden mit Waschlösung gefüllt. Die fünf Mikrotiterplatten wurden auf die ausziehbare Bestückungsplatte geladen. Zehn Wafer wurden angrenzend an die Anschlagstifte auf der Bestückungsplatte angeordnet, und das Vakuum wurde eingeschaltet. In Fällen ohne Vormischen der Matrix und des Oligonucleotids wurde das Stiftwerkzeug benutzt, um zuerst Matrixlösung auf alle gewünschten Anordnungselemente der zehn Wafer aufzutupfen. Für dieses Beispiel wurde eine 16 &khgr; 16-Anordnung erzeugt, folglich mußte das Werkzeug jeden der zehn Wafer 16 mal betupfen, mit einer Versetzung von jeweils 1,125 mm. Als nächstes wurde die Oligonucleotidlösung im gleichen Muster aufgetupft, um die Matrix wieder aufzulösen. Auf ähnliche Weise konnte eine Anordnung hergestellt werden, indem zuerst die Oligonucleotxdlösung auf den Wafer aufgebracht wurde, gefolgt von der Matrixlösung, oder durch Vormischen der Matrix- und der Oligonucleotidlösung.
Massenspektrometrie
Anschließend an das eine oder das andere Abgabeprogramm wurden beladene Chips mit einem Satz abgeschrägter, mit Schrauben befestigter Polycarbonat-Halterungen auf einer MAL-DI-TOF-Quellenplatte festgehalten. Die Platte wurde auf das Ende einer Sonde übertragen, die auf einem XY-Tisch mit &Igr;&mgr;&pgr;&igr; Auflösungsvermögen und 1" Bewegungsbereich (Newport) im Quellenbereich eines Laufzeit-Massenspektrometers fixiert werden sollte. Das Gerät, das normalerweise mit 18-26 kV Saugspannung betrieben wird, konnte im Reflectron-Betrieb mit linearem oder
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gekrümmtem Feld und im kontinuierlichen oder verzögerten Saugbetrieb gefahren werden.
Ergebnisse Serielle Abgabe mit der piezoelektrischen Pipette
Während die Abgabe einer gesättigten 3-HPA-Lösung zum Verstopfen der Spitze führen kann, da das Lösungsmittel an der Grenzfläche zwischen Kapillare und Luft verdampft, "wird die Matrix durch Vormischen von DNA und Matrix ausreichend verdünnt, so daß sie in Lösung bleibt, wobei beständige Sprühnebei erzielt wurden, die bis zur Entleerung der Kapillare aufrechterhalten werden konnten; mit einer im Verhältnis von 1:1 (in H2O) verdünnten Matrixlösung war ein kontinuierliches Sprühen über >> 10 Minuten möglich. Abschalten des piezoelektrischen Elements, so daß die Kapillare über > 5 Minuten deaktiviert war, und Reaktivieren des piezoelektrischen Elements führte ebenfalls nicht zum Verstopfen der Kapillare.
Bei ersten Experimenten unter Verwendung von Probenzielen aus rostfreiem Stahl, wie sie durch das Finnigan Vision 2000 MALDI-TOF-System bereitgestellt werden, das im Reflectron-Betrieb gefahren wird, wurde eine Lösung verwendet, die vor der Abgabe auf das Probenziel aus der Matrix und DNA vorgemischt wurde. In einer einzelnen Mikrotiterplatte wurden 50 &mgr;&idiagr; gesättigte Matrixlösung, 25 &mgr;&idiagr; einer 5^1-Lösung des 12-mers (ATCG) 3 und 25&mgr;1 einer 5^1-Lösung des 28-mers (ATCG) 7 vermischt. Eine Menge von 10 &khgr; 10-Anordnungen von 0, &bgr;&mgr;&idiagr;-Tröpfchen wurde direkt auf eine Finnigan Vision 2000-Probenzielscheibe abgegeben; ein MALDI-TOF-Massenspektrum wurde von einem einzelnen Anordnungselement aufgenommen, das 750 Attomol jedes der beiden Oligonucleotide enthielt. Unter An-Wendung dieses Verfahrens erhielt man interpretierbare Massenspektren für so große DNAs wie ein 53-mer (350 amol geladen, nicht dargestellt).
Es wurden auch Massenspektren von DNAs gewonnen, die in die Kavitäten eines Siliciumchips mikrodosiert wurden. Fig. 11 zeigt einen 12 &khgr; 12 mm-Siliciumchip mit 100 chemisch geätzten Kavitäten; Maskenabmessungen und Ätzdauer wurden so eingestellt, daß pyramidenstumpfförmige Kavitäten (d. h. mit der
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Geometrie eines umgekehrten Pyramidenstumpfs) mit Abmessungen von 800 &khgr; 800 &mgr;&pgr;&igr; (obere Fläche) und &Igr;&Ogr;&Ogr;&mgr;&iacgr;&eegr; Tiefe erzielt wurden. Wahlweise können die Kavitäten aufgerauht oder mit Grübchen versehen sein. Wie oben beschrieben, wurde der Chiprand an einer erhöhten Fläche auf dem Tisch ausgerichtet, um die x- und y-Koordinatensysteme bezüglich der Kapillare festzulegen. (Alternativen sind unter anderem eine optische Ausrichtung, Mustererkennungsroutinen durch künstliche Intelligenz und eine manuelle Ausrichtung mittels Paßstiften). In jede Kavität wurden 20 Tröpfchen (~5 nl) 3-HPA-Matrixlösung ohne Analyten abgegeben; für die verwendete 50%ige CH3CN-Lösung lagen die Verdunstungszeiten für jedes Tröpfchen in der Größenordnung von 5-10 Sekunden. Nach dem Verdunsten des Lösungsmittels erschien jedes mikrodosierte Matrixtröpfchen bei der Betrachtung unter einem 120X-Steromikroskop im allgemeinen als amorphe und 'milchige' flache Scheibe/ ein solches Aussehen stimmt mit dem der Tröpfchen überein, von denen das in Fig. 3b gezeigte Spektrum gewonnen wurde. Nach dem Entleeren der Spitze, Spülen und Nachfüllen mit 1,4&mgr;&Mgr; wäßriger Lösung einer 23-mer-DNA (Mr (berechn.) = 6967 Da) wurde die Kapillare über jeden der 100 Matrix-Spots gelenkt, wo 5 nl der wäßrigen DNA-Lösung direkt auf die Matrixtröpfchen abgegeben wurden. Durch Sichtbarmachen mit einer CCD-Kamera zeigte sich, daß die Analytenlösung sich mit der Matrix vermischte und wiederauflöste (die vollständige Verdunstung dauerte -10 Sekunden bei Umgebungstemperatur und normaler Feuchtigkeit). Die amorphen Matrixoberflächen wurden in echte mikrokristalline Oberflächen mit kristallinen Merkmalen in der Größenordnung von <1&mgr;&eegr;&agr; umgewandelt.
In Übereinstimmung mit der durch das Matrix-Wiederauflösungsverfahren erzielten besseren Kristallisation ergab sich eine bessere Reproduzierbarkeit der Erfassung des Massenspektrums als bei vorgemischten Matrix-Analyt-Lösungen; jeder der 100 Spots von jeweils 5 fmol des 23-mers lieferte interpretierte Massenspektren (Fig. 12) mit 99/100 Ausgangsionensignalen mit Signal-Rausch-Verhältnissen von >5; eine solche Reproduzierbarkeit wurde auch mit den ausprobierten ebenen Silicium- und Metalloberflächen (nicht dargestellt) erreicht. Die
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Spektren von Fig. 12 wurden an einem linearen Laufzeitgerät (TOF) aufgenommen, das mit 26 kV betrieben wurde. Bei interner Eichung des oberen linken Spektrums (Kavität 'kl') mittels einfach und doppelt geladener Molekülionen und Anwendung dieser Eichdatei auf alle anderen 99 Spektren als externe Eichung (Fig. 13) erhielt man eine Standardabweichung von <9 Da vom mittleren Molekulargewicht, was einer relativen Standardabweichung von -0,1% entspricht.
Parallelabgabe mit dem Roboter-Stiftwerkezug
Es wurden Anwendungen mittels Offsetdruck hergestellt, wie oben beschrieben. Die Geschwindigkeit der X- und Y-Tische beträgt 35 Zoll/s (88,9 cm/s), und die Geschwindigkeit des Z-Tischs beträgt 5,5 Zoll/s (14 cm/s). Die X- und Y-Tische können mit Höchstgeschwindigkeit bewegt werden, um die Zykluszeiten zu verkürzen, jedoch muß die Geschwindigkeit des Z-Tischs vor dem Oberflächenkontakt mit dem Wafer verringert werden, um dessen Beschädigung zu vermeiden. Bei solchen Achsengeschwindigkeiten beträgt die ungefähre Zykluszeit für das Auftupfen von 16 Elementen (ein Werkzeugeindruck der gleichen Lösungen) auf alle zehn Wafer 20 Sekunden, so daß die Herstellung einer Anordnung von 256 Elementen -5,3 Minuten dauert. Wenn verschiedene Oligonucleotidlösungen auf die Anordnung aufgebracht werden, muß vor dem Eintauchen in eine andere Lösung ein zusätzlicher Waschschritt zum Reinigen der Stiftspitze eingefügt werden, so daß die Zykluszeit auf 25 Sekunden oder auf 6,7 Minuten für die Herstellung von 10 Wafern zunehmen würde.
Die Probenabgabe durch das Werkzeug wurde unter Verwendung radioaktiv markierter Lösungen und des Leuchtstoffabbildungsschirms, wie weiter oben beschrieben, überprüft; es wurde festgestellt, daß jeder Stift annähernd 1 nl Flüssigkeit abgibt. Die Reproduzierbarkeit von Spot zu Spot ist hoch. Unter Verwendung des Stiftwerkzeugs wurde eine Anordnung von 256 Oligonucleotidelementen von unterschiedlicher Sequenz und Konzentration auf ebenen Silicium-Wafern hergestellt, und der Wafer wurde mittels MALDI-TOF-MS analysiert.
- 88 -Beispiel 5
Anwendung der Immobilisierung von Nucleinsäuren in hoher Dichte zum Erzeugen von Nucleinsäure-Anordnungen
Unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Fixierverfahren mit hoher Dichte wurde auf einem Silicium-Wafer mit mehreren Positionen, d. h. Vertiefungen oder Flecken, auf seiner Oberfläche eine Anordnung von DNA-Oligomeren erzeugt, die für die massenspektrometrische MALDI-TOF-Analyse zugänglich waren. Zum Erzeugen der Anordnung wurde ein freies Thiol enthaltender Oligonucleotid-Primer nur in den ausgewählten Positionen des Wafers immobilisiert [siehe z. B. Fig. 14]. Jede Position der Anordnung enthielt eines von drei verschiedenen Oligomeren. Um zu zeigen, daß die unterschiedlich immobilisierten Oligomere getrennt nachgewiesen und unterschieden werden konnten, wurden drei verschiedene Oligomere von unterschiedlicher Länge, die zu einem der drei Oligomere komplementär sind, an die Anordnung auf dem Wafer hybridisiert und mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert.
Oligodesoxynucleotide
Es wurden drei Sätze von komplementären Oligodesoxynucleotid-Paaren synthetisiert, in denen ein Element des komplementären Oligonucleotid-Paars eine 3'- oder 5'-Disulfidbindung enthält [bezogen von Operon Technologies oder Oligos Etc.]. Zum Beispiel enthält das Oligomer 1 [d(CTGATGC-GTCGGATCATCTTTTTT-SS); Seq.-ID-Nr.: 8] eine 3'-Disulfidbindung, während das - Oligomer 2 Jd(SS-CCTCTTGGGAACTGTGTAGT-ATT); ein 5'-Disulfid-Derivat von Seq.-ID-Nr.: 3] und das Oligomer 3 [d(SS-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG); ein 5'-Disulfid-Derivat von Seq.-ID-Nr.: 1] jeweils eine 5'-Disulfidbindung enthalten. Die zu den Oligomeren 1-3 komplementären Oligonucleotide wurden so konstruiert, daß sie verschiedene Längen aufwiesen, die sich bei der MALDI-TOF MS-Analyse leicht voneinander trennen lassen. Zum Beispiel wurde ein 23-mer-Oligonucleotid [Seq.-ID-Nr.: 9] komplementär zu einem Abschnitt von Oligomer 1 synthetisiert, ein 12-mer-Oligonucleotid [Seq.-ID-Nr.: 7] wurde komplementär zu einem Abschnitt von Oligomer 2 syntheti-
siert, und ein 21-mer [Seq.-ID-Nr.: 2/ Sequenz wurde in Beispiel 1 mit "MJM6" bezeichnet] wurde komplementär zu einem Abschnitt von Oligomer 3 synthetisiert. Außerdem wurde ein viertes 2 9-mer-Oligonucleotid [Seq.-ID-Nr.: 10] synthetisiert, das zu keinem der drei Oligomere komplementär ist. Dieses vierte Oligonucleotid wurde als negative Kontrolle verwendet.
Silicium-Oberflächenchemie und DNA-Immobilisierung
(a) 4 &khgr; 4-Anordnung (16 Positionen)
Ein Silicium-Wafer von 2 &khgr; 2 cm mit 256 Einzelvertiefungen oder Kavitäten in Form einer Anordnung von 16 &khgr; 16 Kavitäten wurde von einem kommerziellen Lieferanten bezogen [Accelerator Technology Corp., College Station, Texas]. Die Kavitäten hatten Abmessungen von 800 &khgr; 800 pm , 120 pm Tiefe, auf einem Abstand von 1,125 mm. Der Silicium-Wafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan zur Reaktion gebracht, um auf der Oberfläche eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminen zu erzeugen, und dann dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel SIAB ausgesetzt, wodurch auf der Oberfläche Iodacetamido-Funktionalitäten entstanden [siehe z. B. Fig. I].
Um die Oligomere zur Bindung an die verschiedenen Positionen der Silicium-Anordnung herzustellen, wurde die Disulfidbindung jedes Oligomers unter Verwendung von 10 mM TCEP vollständig reduziert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und die DNA wurde mit einer Endkonzentration von 10 &mgr;&Mgr; in einer Lösung von 100 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, resuspendiert. Unmittelbar nach der Reduktion der Disulfidbindung wurde die freie Thiolgruppe des Oligomers in 16 Positionen auf dem Wafer an die Iodacetamido-Funktionalität gebunden, wobei im wesentlichen die in Fig. 7 beschriebenen Sondenbindungsbedingungen angewandt wurden. Um die getrennte Bindung in 16 verschiedenen Positionen des Wafers zu bewerkstelligen, wurde nicht die gesamte Oberfläche des Wafers mit einer Oligonucleotidlösung überspült, sondern statt dessen wurde in jede von 16 Positionen (d. h. Vertiefungen) von den 256 Kavitäten auf dem Wafer ein Aliquot von ~30 nl eines vorgegebenen modifizierten Oligomers gegeben, um eine 4 &khgr; 4-Anordnung von immobilisierter DNA zu erzeugen, wobei ein hierin beschriebenes Stiftwerkzeug ver-
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wendet wurde (siehe &zgr;. B. die Ausführliche Beschreibung und das hierin angegebene Beispiel.4).
So wurde, wie in Fig. 14 dargestellt, in jeder der 16 separaten Kavitäten von den 256 Kavitäten auf dem Silicium-Wafer eines der modifizierten Oligomere 1-3 kovalent immobilisiert, wodurch eine 4 &khgr; 4-Anordnung von immobilisierter DNA erzeugt wurde. Zum Beispiel wurde das Oligomer 1 in einer Kavitätenposition in der oberen linken Ecke der 4 &khgr; 4-Anordnung konjugiert, und das Oligomer 2 wurde in der benachbarten Position konjugiert, und so weiter. Fig. 14 zeigt eine Darstellung der vollständigen Anordnung.
Beim Ausführen der Hybridisierungsreaktion wurden die drei komplementären Oligonucleotide und das Oligonucleotid für die negative Kontrolle in einer Endkonzentration von 10 mM jedes Oligonucleotids in 1 ml TE-Puffer [10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA] vermischt, mit 1 M NaCl ergänzt, und die Lösung wurde 10 min auf 650C erhitzt. Unmittelbar danach wurde die gesamte Oberfläche des Silicium-Wafers mit 800 &mgr;&idiagr; der erwärmten Oligonucleotidlösung überspült. Die komplementären Oligonucleotide wurden an die immobilisierten Oligomere angelagert, indem die Silicium-Anordnung 1 Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert und anschließend mindestens 10 Minuten bei 40C inkubiert wurde. Alternativ kann die Oligonucleotidlösung dem Wafer: zugesetzt werden, den man dann erhitzt und zum Hybridisieren abkühlen läßt. Fig. 15 zeigt eine Darstellung der komplementären Oligonucleotide, die an die in jeder Position kovalent immobilisierten spezifischen Oligomere angelagert sind.
Die hybridisierte Anordnung wurde dann zum Kationenaustausch mit einer Lösung von 50 mM Ammoniumeitratpuffer gewasehen, um Natrium- und Kalium-Ionen aus der DNA-Hauptkette zu entfernen (Pieles, U. et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21: 3191-3196) . Ein 6 nl-Aliquot einer Matrixlösung von 3-Hydroxypicolinsäure [0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure - 10% Ammoniumeitrat in 50% Acetonitril; siehe Wu et al. Rapid Commun. Mass. Spectrom.
7: 142-146] wurde unter Verwendung der hier beschriebenen piezoelektrischen Pipette in jede Position der Anordnung gegeben. Die Lösung ließ man bei Umgebungstemperatur trocknen, und danach wurde mit einer piezoelektrischen Pipette ein 6 nl-
Aliquot Wasser in jede Position gegeben, um den getrockneten Matrix-DNA-Komplex zu resuspendieren, so daß nach dem Trocknen bei Umgebungstemperatur der Matrix-DNA-Komplex an der Bodenfläche jeder Position eine gleichmäßige kristalline Oberfläche bildet.
MALDI-TOF MS-Analyse
Die MALDI-TOF MS-Analyse wurde der Reihe nach in jeder der 16 Positionen der in Fig. 15 dargestellten Hybridisierungsanordnung ausgeführt, wie im wesentlichen in Beispiel 1 beschrieben. Das resultierende Massenspektrum der Oligonucleotide, die spezifisch an jede der 16 Positionen der DNA-Hybridisierungsanordnung hybridisiert waren, ist in Fig. 16 dargestellt. Das Massenspektrum zeigte ein spezifisches Signal in jeder Position, welches das beobachtete experimentelle Masse-Ladungs-Verhältnis darstellt, das der spezifischen komplementären Nucleotidsequenz entspricht.
Zum Beispiel zeigte das Massenspektrum in den Positionen, an die nur das Oligomer 1 konjugiert ist, ein vorherrsehendes Signal mit einem beobachteten experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnis von 7072,4, das annähernd gleich dem des 23-mers ist; das theoretische Masse-Ladungs-Verhältnis des 23-mers ist gleich 7072,6 Da. Entsprechend wurde die spezifische Hybridisierung des 12-mer-Oligonucleotids an die Anordnung, mit einem beobachteten experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnis von 3618,33 Da (theoretisch 3622,4 Da) nur in den mit dem Oligomer 2 konjugierten Positionen nachgewiesen, während die spezifische Hybridisierung von MJM6 (beobachtetes experimentelles Masse-Ladungs-Verhältnis von 6415,4) nur in den mit dem Oligomer 3 (theoretisch 6407,2 Da) konjugierten Positionen nachgewiesen wurde.
Keine der Positionen der Anordnung wies ein Signal auf, das dem 29-mer-Oligonucleotid zur negativen Kontrolle (theoretisches Masse-Ladungs-Verhältnis 8974,8) entspricht, was darauf schließen läßt, daß spezifische DNA-Zielmoleküle mit Oligomeren hybridisiert werden können, die kovalent in spezifischen Positionen auf der Oberfläche der Silicium-Anordnung im-
mobilisiert sind, und daß mehrere Hybridisierungstests individuell mittels MALDI-TOF MS-Analyse überwacht werden können.
(b) 8 &khgr; 8-Anordnung (64 Positionen)
Ein Silicium-Wafer von 2 &khgr; 2 cm mit 256 einzelnen Vertiefungen oder Kavitäten die eine 16 &khgr; 16-Kavitätenanordnung bilden, wurde von einem kommerziellen Lieferanten bezogen [Accelerator Technology Corp., College Station, Texas]. Die Kavi-
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täten hatten Abmessungen von 800 &khgr; 800 pm , 120 &mgr;&tgr;&eegr; Tiefe, in einem Abstand von 1,125 mm. Der Silicium-Wafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan zur Reaktion gebracht, um auf der Oberfläche eine gleichmäßige Schicht aus primären Aminen zu erzeugen, und dann dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel SIAB ausgesetzt, wodurch auf der Oberfläche Iodacetamido-Funktionalitäten entstanden [siehe z. B. Fig. 7].
Im Anschluß an die oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung einer DNA-Anordnung von 16 Positionen wurden die Oligomere 1-3 in 64 Positionen immobilisiert, die auf dem Silicium-Wafer mit 256 Positionen eine 8 &khgr; 8-Anordnung bildeten, mit komplementären Oligonucleotiden hybridisiert und mittels MALDI-TOF MS-Analyse analysiert. Fig. 17 zeigt das Massenspektrum der DNA-Anordnung von 64 Positionen, die der Reihe nach mittels MALDI-TOF-Analyse analysiert wurden. Wie für die Anordnung von 16 Positionen dargestellt, wurde in jeder Position der DNA-Anordnung eine spezifische Hybridisierung des komplementären Oligonucleotids an jedes der immobilisierten thiolhaltigen Oligonucleotide beobachtet.
Beispiel 6
Verlängerung von hybridisierten DNA-Primern, die an DNA-Matrizen gebunden sind, welche auf einem Silicium-Wafer immo bilisiert sind
Die SIAB-derivatisierten Silicium-Wafer können auch für
Primer-Verlängerungsreaktionen der immobilisierten DNA-Matrize verwendet werden, wobei die im wesentlichen in der US-Patentschrift Nr. 5 605 798 beschriebenen Verfahren angewandt werden.
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Wie in Fig. 18 dargestellt, wurde ein 27-mer-Oligonucleotid [Seq.-ID-Nr.: 11], das eine freie 3'-Thiolgruppe enthielt, mit einem SIAB-derivatisierten Silicium-Wafer verbunden, wie oben z. B. in Beispiel 1 beschrieben. Ein 12-mer-5 Oligonucleotid-Primer [Seq.-ID-Nr.: 12] wurde an das immobilisierte Oligonucleotid hybridisiert, und der Primer wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits [z. B. Sequenase oder ThermoSequenase, U.S. Biochemical Corp.] verlängert. Die Zugabe von Sequenase-DNA-Polymerase oder ThermoSequenase-DNA-Polymerase in Gegenwart von drei Desoxyribonucleosidtriphosphaten (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP) und von Didesoxyribonucleosidthymidintriphosphat (ddTTP) in Puffer entsprechend den vom Hersteller gegebenen Anweisungen führte zu einer 3-Basen-Verlängerung des 12-mer-Primers, der immer noch an den Silicium-Wafer gebunden war. Der Wafer wurde dann mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert, wie oben beschrieben. Wie in Fig. 18 dargestellt, unterscheiden die Ergebnisse des Massenspektrums klar das 15-mer [Seq.-ID-Nr.: 13] von dem ursprünglichen, nicht verlängerten 12-mer, und lassen folglich darauf schließen, daß auf der Oberfläche eines Silicium-Wafers eine spezifische Verlängerung ausgeführt und mittels MALDI-TOF MS-Analyse nachgewiesen werden kann.
Beispiel 7
Effekt der Linker-Länge auf die Polymerase-Verlängerung von hybridisierten DNÄ-Primern, die an DNA-Matrizen gebunden sind, welche auf einem Silicium-Wafer immobilisiert sind
Es wurden der Effekt des Abstands zwischen der SIAB-konjugierten Siliciumoberflache und der Doppelstrang-DNA, die durch Hybridisieren der Ziel-DNA an der immobilisierten Oligomer-Matrize gebildet wird, sowie die Auswahl des Enzyms untersucht [siehe z. B. Fig. 19].
Zwei SIAB-derivatisierte Silicium-Wafer wurden an das 3'-Ende von zwei freies Thiol enthaltenden Oligonucleotiden konjugiert, deren DNA-Sequenz mit Ausnahme einer am 3'-Ende eingebauten 3-Basen-Poly-dT-Spacersequenz identisch war [Seq.-ID-Nrn.: 8 & H]. Diese beiden Oligonucleotide wurden synthetisiert, und jedes wurde separat über das SIAB-Vernetzungsmit-
tel an der Oberfläche eines Silicium-Wafers immobilisiert [siehe z. B. Fig. 7]. Jeder Wafer wurde durch Denaturieren bei 75°C und langsames Abkühlen des Silicium-Wafers mit einem 12-mer-Oligonucleotid [Seq.-ID-Nrn.: 12, 14 und 15], das zu Abschnitten der beiden Oligonucleotiden gemeinsamen Nucleotidsequenzen komplementär ist, inkubiert. Die Wafer wurden dann, wie oben beschrieben, mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert.
Wie früher in Fig. 18 gezeigt, wurde eine spezifische 3-Basen-Verlängerung des gebundenen 12-mer-Oligonucleotids unter Verwendung des Oligomer-Primers beobachtet, wobei zwischen dem Doppelstrang und der Oberfläche ein 9-Basen-Spacer auftritt [Seq.-ID-Nr.: 12]. Wie in Fig. 19 dargestellt, wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet, wenn die DNA-Spacer-Längen zwischen der SIAB-Komponente und dem DNA-Doppelstrang 0, 3, 6 und 12 Basen betrugen. Die Ergebnisse der massenspektrometrischen MALDI-TOF-Analyse der Wafer sind in Fig. 20 dargestellt. Außerdem zeigt Fig. 19 auch, daß die Verlängerungsreaktion unter Verwendung der verschiedensten DNA-Polymerasen ausgeführt werden kann. So kann der SIAB-Linker direkt mit der DNA-Matrize verbunden werden oder kann eine Linker-Sequenz aufweisen, ohne eine Primer-Verlängerung der hybridisierten DNA zu bewirken.
Beispiel 8
Nachweis von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen mittels Strangverdrängung und Hybridisieren einer immobilisierten komplementären Nucleinsäure
Dieses Beispiel beschreibt die Immobilisierung eines 24-mer-Primers und die spezifische Hybridisierung eines Strangs eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, wodurch die Amplifikation eines ausgewählten Zielmoleküls in der Lösungsphase und der Nachweis des Doppelstrangmoleküls ermöglicht werden.
Ein 24-mer-DNA-Primer CTGATGCGTC GGATCATCTT TTTT [Seq.-ID-Nr.: 8], der eine freie 3'-Thiolgruppe enthielt, wurde an einen SIAB-derivatisierten Silicium-Wafer gebunden, wie im we-
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sentlichen in Fig. 7 skizziert und in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.
Ein synthetischer 18-mer-Primer 5'-CTGATGCGTCGGATCaTC-3' [Seq.-ID-Nr.: 16] wurde mit einem 12-mer-Oligonucleotid 5'-GATGATCCGACG-S' [Seq.-ID-Nr.: 12] vorgemischt, das eine zum 12-Basen-Abschnitt des 18-mer-Oligonucleotids komplementäre Sequenz aufweist. Das Oligonucleotid-Gemisch wurde auf 750C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um die Bildung eines Doppelstrangmoleküls zu erleichtern:
5'-CTGATGCGTCGGATCATc-S' [Seq.-ID-Nr.: 16]
3'-GCAGCCTAGTAg-S1 [Seq.-ID-Nr.: 12]
Die spezifische Hybridisierung des 12-mer-Strangs des Doppelstrangmoleküls an den immobilisierten 24-mer-Primer wurde durch Mischen von &Igr;&mgr;&Mgr; des Doppelstrangmoleküls unter Anwendung der in Beispiel 6 beschriebenen Hybridisierungsbedingungen ausgeführt.
Die Wafer wurden mittels Massenspektrometrie analysiert, wie oben beschrieben. In einem Massenspektrum des 12-mers wurde eine spezifische Hybridisierung mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 3682,78 Da nachgewiesen.
Beispiel 9
1-(2-Nitro-5-(3-0-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)-diisopropylaminophosphin)ethan
A. 2-Nitro-5-(3-hydoxypropoxy)benzaldehyd
3-Brom-l-propanol (3,34 g, 24 mmol) wurde in 80 ml wasserfreiem Acetonitril^ mit 5-Hydroxy-2-nitrobenzaldehyd (3,34 g, 20 mmol), K2CO3 (3,5 g) und KI (100 mg) über Nacht (15 h) unter Rückflußkühlung erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und es wurden 150 ml Methylenchlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde filtriert, und der feste Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die kombinierte organische Lösung wurde bis zur Trockne eingedampft und in 100 ml Methylenchlorid wiederaufgelöst. Die entstehende Lösung wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum erhielt man 4,31 g (96%) des gewünschten Produkts.
Rf = 0,33 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 313, 240 (Schulter), 215 nm/ Minimum: 266 nm
1H NMR (DMSO-d6) &dgr; 10,28 (s, IH), 8,17 (d, IH), 7,35 (d, IH), 7,22 (s, IH), 4,22(t, 2H), 3,54 (t, 2H), 1,90 (m, 2H).
13C NMR (DMSO-d6) &dgr; 189,9, 153,0, 141,6, 134,3, 127,3, 118,4, 114,0, 66,2, 56,9, 31,7.
B. 2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd
2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)benzaldehyd (1 g, 4,44 mmol) wurde in 50 ml wasserfreiem Acetonitril aufgelöst. Dieser Lösung wurden 1 ml Triethylamin, 200 mg Imidazol und 0,8 g (5,3 mmol) tBDMSCI zugesetzt. Das Gemisch wurde 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Zum Anhalten der Reaktion wurde Methanol (1 ml) zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der feste Rückstand wurde in 100 ml Methylenchlorid wiederaufgelöst. Die entstandene Lösung wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das Rohgemisch wurde mit Methylenchlorid durch eine schnelle Silicagelsäule geschickt und ergab 1,44 g (96%) 2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd.
Rf = 0,67 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
UV (Methanol), Maximum: 317, 243, 215 nm; Minimum: 235, 267 nm 1H NMR (DMSO-d6) &dgr; 10,28 (s, IH), 8,14 (d, IH), 7,32 (d, IH), 7,20 (s, IH), 4,20(t, 2H), 3,75 {t, 2H), 1,90 (m, 2H), 0,85 (s, 9H), 0,02 (s, 6H).-13C
NMR (DMSO-d6) &dgr; 189,6, 162,7, 141,5, 134,0, 127,1, 118,2, 113,8, 65,4, 58,5, 31,2, 25,5, -3,1, -5,7.
C. 1-(2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)-phenyl)ethanol
Im Hochvakuum getrockneter 2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd (1,02 g, 3 mmol) wurde in 50 ml wasserfreiem Methylenchlorid aufgelöst. 2 M Trimethylaluminium in Toluol (3 ml) wurden innerhalb von 10 min tropfenweise zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtempe-
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ratur gehalten. Es wurde weiter 10 min gerührt, und das Gemisch wurde in 10 ml eisgekühltes Wasser gegossen. Die Emulsion wurde von der Wasserphase getrennt und über 100 g Natriumsulfat getrocknet, um das restliche Wasser zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und das Gemisch wurde in eine Silicagelsäule mit einem Methanol-Gradienten in Methylenchlorid eingebracht. 0,94 g (86%) des gewünschten Produkts wurden isoliert.
Rf = 0,375 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
UV (Methanol), Maximum: 306, 233, 206 nm; Minimum: 255, 220 nm.
1H NMR (DMSOd6) &dgr; 8.00 (d, IH), 7,36 (s, IH), 7,00 (d, IH), 5,49 (b, OH), 5,31 (q, IH), 4,19 (m, 2H), 3,77 (t, 2H), 1,95 (m, 2H), 1,37 (d, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,04 (s, 6H).
13C NMR (DMSOd6) 6 162,6, 146,2, 139,6, 126,9, 112,9, 112,5, 64,8, 63,9, 58,7, 31,5, 25,6, 24,9, -3,4, -5,8.
20 25 30
D. 1- (2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol
1-(2-Nitro-5-(3-0-t-butyldimethylsilylpropoxy)phenyl)-ethanol (0,89 g, 2,5 mmol) wurde in 30 ml THF aufgelöst, und 0,5 mmol nBu4NF wurden unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch wurde 5 h bei Raumtemperatur gerührt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der verbleibende Rückstand wurde in eine Silicagelsäule mit einem Methanol-Gradienten in Methylenchlorid eingebracht. Man erhielt 0,6 g (99%) 1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol.
Rf = 0,17 (Dichlormethan/Methanol), 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 304, 232, 210 nm; Minimum: 255, 219 nm.
1H NMR (DMS(Od6) &dgr; 8.00 (d, IH), 7,33 (s,
5,50 (d, OH), 5,28(t, OH), 4,59 (t, IH),
(m, 2H) , 1,36 (d, 2H) .
IH), 7,00 (d, IH), 4,17 (t, 2H), 3,57
(m, 2H), 1,89
13C NMR (DMSO-d6) &dgr; 162,8, 146,3, 139,7, 127,1, 113,1, 112,6, 65,5, 64,0, 57,0, 31,8, 25,0.
35
i *·
E. 1-(2-Nitro-5-(3-0-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)-phenyl)ethanol
1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol (0,482 g, 2mmol) wurde zusammen mit wasserfreiem Pyridin zweimal eingedampft und in 20 ml wasserfreiem Pyridin wiederaufgelöst. Die Lösung wurde im Eiswasserbad abgekühlt, und es wurden 750 mg (2,2 mmol) DMTCl zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und zum Anhalten der Reaktion wurden 0,5 ml Methanol zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zusammen mit Toluol zweimal eingedampft, um Pyridinspuren zu entfernen. Der Endrückstand wurde in eine Silicagelsäule mit Methanol-Gradient in Methylenchlorid eingebracht, das Tropfen von Triethylamin enthielt, und ergab 0,96 g (89%) des gewünschten Produkts 1-(2-Nitro-5-(3-0-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-ethanol.
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 350 (Schulter), 305, 283, 276 (Schulter), 233, 208 nm; Minimum: 290, 258, 220 nm.
1H NMR (DMSO-d6) 6 8.00 (d, IH), 6,82-7,42 (ArH), 5,52 (d, OH), 5,32(m, IH), 4,23 (t, 2H), 3,71 (s, 6H), 3,17 (t, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) &dgr; 162,5, 157,9, 157,7, 146,2, 144,9, 140,1,, 139,7, 135,7, 129,5, 128,8, 127,6, 127,5, 127,3, 126,9, 126,4, 113,0, 112,8, 112,6, 85,2, 65,3, 63,9, 59,0, 54,8, 28,9, 24,9.
F. 1- (2-Nitro-5-(3-0-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl) -1-0-((2-cyanethoxy)-diisopropylaminophosphin)-ethan
1- (2-Nitro-5-(3-0-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-ethanol (400 mg, 0,74 mmol) wurde im Hochvakuum getrocknet und in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid aufgelöst. Dieser Lösung wurden 0,5 ml N,N-Diisopropylethylamin und 0,3 ml (1,34 mmol) 2-Cyanethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, und zum Anhalten der Reaktion wurden 0,5 ml Methanol zugesetzt. Das Gemisch wurde mit gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, und eine schnelle Silicagelsäule mit 1% Methanol in Methylenchlorid, das Tropfen von Triethylamin enthielt, lieferte 510 mg (93%) des gewünschten Phosphoramidits.
Rf = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
Beispiel 10
1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)S-methoxy-e-nitrophenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)diisopropylaminophosphin)ethan A. 4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon
3-Brom-l-propanol (53 ml, 33 mmol) wurde in 100 ml wasserfreiem Acetonitril mit 4-Hydroxy-3-methoxyacetophenon (5 g, 30 mmol), K2CO3 (5 g) und KI (300 mg) über Nacht (15 h) unter Rückflußkühlung erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde dem Reaktionsgemisch Methylenchlorid (150 ml) zugesetzt.
Das Gemisch wurde filtriert, und der feste Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigte organische Lösung wurde bis zur Trockne eingedampft und in 100 ml Methylenchlorid wiederaufgelöst. Die entstandene Lösung wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum erhielt man 6,5 g (96,4%) des gewünschten Produkts.
Rf = 0,41 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 304, 273, 3H), 1,88 (m, 2H). Minimum (d : 291,
244 , 214 nm. NMR (DMSO-d6) &dgr; 196,3, 152,5, 2H)
1H NMR (DMSO-d6) &dgr; 7,64 (d, IH), ,3, 65,4, 57,2, 55,5, 31,9, 26, 7,0.4 , IH),
4,58 (b, OH), 4,12(t,s 2H), 3,80 . 277, 210 nm; (t, 1, , 2,54
(s,
13C 7,46 (s, IH), 123, 111,5,
110 (s, 3H), 3,56
B. 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon ·
148,6, 129,7,
.3.
4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,5 g, 15,6 mmol) wurde getrocknet und in 80 ml wasserfreiem Acetonitril aufgelöst. Diesem Gemisch wurden 6 ml Triethylamin und 6 ml Essigsäureanhydrid zugesetzt. Nach 4 h wurden 6 ml Methanol zugesetzt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml Dichlormethan aufgelöst, und die Lö-
- 100 -
sung wurde mit verdünnter Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der feste Rückstand wurde in eine Silcagelsäule mit Methylenchlorid eingebracht und ergab 4,1 g 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (98,6%).
Rf = 0,22 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 303, 273, 227, 210 nin; Minimum: 290, 243, 214 nm.
1H NMR (DMSO-d6) &dgr; 7,62 (d, IH), 7,45 (s, IH), 7,08 (d, IH), 4,12 (m, 4H), 3,82(s, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,04 (m, 2H), 2,00 (s, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) &dgr; 196,3, 170,4, 152,2, 148,6, 130,0, 123,0, 111,8, 110,4, 65,2, 60,8, 55,5, 27,9, 26,3, 20,7.
C. 4-(3-Acetoxypropoxy)-S-methoxy-e-nitroacetophenon
4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,99 g, 15 mmol) wurden portionsweise 15 ml 70%ige HNO3 im Wasserbad zugesetzt, und die Reaktionstemperatur wurde auf Raumtemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, und 30 g zerkleinertes Eis wurde zugegeben. Dieses Gemisch wurde mit 100 ml Dichlormethan extrahiert, und die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das Rohgemisch wurde in eine Silicagelsäule mit Methanol-Gradient in Methylenchlorid eingebracht und ergab 3,8 g (81,5%) des gewünschten Produkts 4-(3-Acetoxypropoxy)-S-methoxy-ö-nitroacetophenon und 0,38 g (8%) des selbstsubstituierten Produkts 5-(3-Acetoxypropoxy)-4-methoxy-l,2-dinitrobenzol.
Selbstsubstituiertes Nebenprodukt: 5-(3-Acetoxypropoxy) -4-methoxy-l,2-dinitrobenzol:
Rf = 0,47 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 334, 330, 270, 240, 212 nm; Minimum:
310, 282, 263, 223 nm.
1H NMR (CDCI3) &dgr; 7,36 (s, IH), 7,34 (s, IH), 4,28 (t, 2H), 4,18 (t, 2H), 4,02 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
- 101 -
13C NMR (CDCl3) &dgr; 170,9, 152,2, 151,1, 117,6, 111,2, 107,9, 107,1, 66,7, 60,6, 56,9, 28,2, 20,9.
Gewünschtes Produkt 4-(3-Acetoxypropoxy)-S-methoxy-e-nitroacetophenon:
Rf = 0,29 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 246, 213 nm; Minimum: 320, 270, 227 nm.
1H NMR (CDCl3) &dgr; 7,62 (s, IH), 6,74 (s, IH), 4,28 (t, 2H), 4,20 (t, 2H), 3,96(s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
13C NMR (CDCl3) &dgr; 200,0, 171,0, 154,3, 148,8, 138,3, 133,0, 108,8, 108,0, 66,1, 60,8, 56,6, 30,4, 28,2, 20,9.
D. 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-
ethanol
4-(3-Acetoxypropoxy)-S-methoxy-o-nitroacetophenon (3,73 g, 12 mmol) wurden 150 ml Ethanol und 6,5 g B^CO3 zugesetzt. Das Gemisch wurde 4 h bei Raumtemperatur gerührt, und TLC mit 5% Methanol in Dichlormethan zeigte die Beendigung der Reaktion an. Diesem gleichen Reaktionsgemisch wurden 3,5 g NaBH4 zugesetzt, und das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Aceton (10 ml) wurde zugesetzt, um mit dem restlichen NaBH4 zu reagieren. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 50 g Silicagel aufgenommen. Das Silicagel-Gemisch wurde mit 5% Methanol in Methylenchlorid von oben in eine Silicagelsäule gegeben und lieferte 3,15 g (97%) des gewünschten Produkts 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol. *
Zwischenprodukt 4-(3-Hydroxypropoxy)-S-methoxy-ö-nitroacetophenon nach Entfernung der Schutzgruppe:
Rf = 0,60 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
Endprodukt 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl) ethanol:
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 243, 219 nm; Minimum: 317, 264, 233 nm.
- 102 -
1H NMR (DMSO-d6) 6 7,54 (s, IH), 7,36 (s, IH), 5,47 (d, OH), 5,27 (m, IH), 4,55 (t, OH), 4,05 (t, 2H), 3,90 (s, 3H) , 3,55 (q, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) &dgr; 153,4, 146,4, 138,8, 137,9, 109,0, 108,1, 68,5, 65,9, 57,2, 56,0, 31,9, 29,6.
E. 1- (4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-S-
nitrophenyl)ethanol
1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol (0,325 g, 1,2 mmol) wurde zusammen mit wasserfreiem Pyridin zweimal eingedampft und in 15 ml wasserfreiem Pyridin aufgelöst. Die Lösung wurde im Eiswasserbad abgekühlt, und es wurden 450 mg (1,33 mol) DMTCl zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und zum Anhalten der Reaktion wurden 0,5 ml Methanol zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zusammen mit Toluol zweimal eingedampft, um Spuren von Pyridin zu entfernen. Der Endrückstand wurde in eine Silicagelsaule mit Methanol-Gradient in Methylenchlorid eingebracht, das Tropfen von Triethylamin enthielt, und ergab 605 mg (88%) des gewünschten Produkts 1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy) -3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol.
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 354, 302, 282, 274, 233, 209 nm; Minimum: 322, 292, 263, 222 nm.
1H NMR (DMSO-d6) 5 7,54 (s, IH), 6,8-7,4 (ArH), 5,48 (d, OH), 5,27 (m, IH), 4,16 (t, 2H), 3,85( s, 3H), 3,72 (s, 6H), 3,15 (t, 2H), 1,98 (t, 2H)/ 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) &dgr; 157,8, 153,3, 146,1, 144,9, 138,7, 137,8, 135,7, 129,4, 128,7, 127,5, 127,4, 126,3, 112,9, 112,6, 108,9, 108,2, 85,1, 65,7, 63,7, 59,2, 55,8, 54,8, 29,0, 25,0.
F. 1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-S-
nitrophenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)-diisopropylaminophosphin)ethan
1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol
(200 mg, 3,5 mmol) wurde unter Hochvakuum getrocknet und in 15 ml wasserfreiem Methylenchlorid aufge-
löst. Dieser Lösung wurden 0,5 ml &Ngr;,&Ngr;-Diisopropylethylamin und 0,2 ml (0,89 mmol) 2-Cyanethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, und zum Anhalten der Reaktion wurden 0,5 ml Methanol zugesetzt. Das Gemisch wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und eine schnelle Silicagelsäule mit 1% Methanol in Methylenchlorid, das Tropfen von Triethylamin enthielt, lieferte 247 mg (91,3%) des gewünschten Phosphoramidits 1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)-diisopropylaminophosphin)ethan.
Rf = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
Beispiel 11
Oligonucleotid-Synthese
Die Oligonucleotid-Konjugate, die einen photospaltbaren Linker enthielten, wurden durch Festphasen-Nucleinsäuresynthese (siehe: Sinha et al. Tetrahedron Lett. (1983) 24, 5843-5846; Sinha et al., Nucleic Acids Res. (1984) 12, 4539-4557; Beaucage et al., Tetrahedron (1993) 49, 6123-6194; und Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. (1981) 103, 3185-3191) unter Standardbedingungen hergestellt. Außerdem wurde eine längere Kopplungszeitspanne für den Einbau der photospaltbaren Einheit und der 5'-terminalen Aminogruppe verwendet. Die Kopplungsausbeute wurde durch Messen des Absorptionsvermögens des freigesetzten DMT-Kations nachgewiesen, und die Ergebnisse zeigten eine Kopplungsausbeute von Phosphoramidit 1-(2-Nitro-5-(3-0-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)-diisopropylaminophosphin)ethan oder 1-(4-(3-0-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-0-((2-cyanethoxy)-diiso-
propylaminophosphin)ethan an, die mit der von gewöhnlichen Nucleosid-Phosphoramiditen vergleichbar war. Die Entfernung des Basenschutzes und die Freisetzung der Konjugate vom festen Träger wurde über Nacht bei 550C mit konzentriertem Ammonium ausgeführt. Die Entfernung des Basenschutzes anderer Konjugate erfolgte durch schnelle Schutzentfernung mit AMA-Reagenzien. Die Reinigung der MMT-on-Konjugate erfolgte durch HPLC (Tri-
:: J·: Mi :: &iacgr;
tyl-on) unter Verwendung von 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7,0, und eines Acetonitril-Gradienten (5% bis 25% in 20 Minuten) . Das gesammelte MMT- oder DMT-geschützte Konjugat wurde volumenreduziert, mit 80%iger wäßriger Essigsäure (40 min, 00C) detrityliert, entsalzt, bei -2O0C gelagert.
Beispiel 12 Phot&ogr;Iyse-Untersuchung
In einem typischen Fall wurden 2 nmol Oligonucleotid-Konjugat, das photospaltbaren Linker enthielt in 200 &mgr;&idiagr; destilliertem Wasser mit einer langwelligen UV-Lampe (Blak Ray XX-15 UV-Lampe, Ultraviolet Products, San Gabriel, CA) aus einer Entfernung von 10 cm bestrahlt (Emissionsmaximum 365 nm,
2
Intensität der Lampe =1,1 mW/cm in einem Abstand von 31 cm).
Das entstehende Gemisch wurde durch HPLC (Trityl-off) unter Verwendung von 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7,0, und eines Acetonitril-Gradienten analysiert. Die Analyse zeigte, daß das Konjugat bei UV-Bestrahlung innerhalb von Minuten vom Linker abgespalten wurde.
Äquivalente
Der Fachmann wird erkennen oder unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten zahlreiche Äquivalente für die hier beschriebenen spezifischen Verfahren feststellen können. Derartige Äquivalente sind als innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegend anzusehen und sind durch die folgenden Patentansprüche erfaßt.
- 105 -Sequenzprotokoll
(1) Allgemeine Informationen (i) Anmelder:
(A) Name: SEQUENOM, INC. (B) Straße: 11555 Sorrento Valley Road
(C) Stadt: San Diego
(D) Staat: Kalifornien
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl (ZIP): 92121 (i) Erfinder/Anmelder:
(A) Name: Maryanne J. O'Donnell
(B) Straße: 3855 Nobel Drive
(C) Stadt: San Diego
(D) Staat: Kalifornien (E) Land: USA
(F) Postleitzahl (ZIP): 92122 (i) Erfinder/Anmelder:
(A) Name: Charles A. Cantor
(B) Straße: 11 Bay State Road (C) Stadt: Boston
(D) Staat: Massachusetts
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl (ZIP): 02215 (i) Erfinder/Anmelder:
(A) Name: Daniel P. Little
(B) Straße: 393 Glendale Lake Rd.
(C) Stadt: Patton
(D) Staat: Pennsylvania
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl (ZIP): 18668
(i) Erfinder/Anmelder:
(A) Name: Hubert Röster
(B) Straße: 8636 Via Mallorca Drive
(C) Stadt: La Jolla
(D) Staat: Kalifornien
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl (ZIP): 92037
&bull; · &bull;«·
- 106 -
(ii) Titel der Erfindung: Verfahren zu Immobilisierung von Nucleinsäuren in hoher Dichte und Systeme und Methoden zur Herstellung und Analyse von Analyten-Anordnungselementen mit geringem Volumen
(iii) Anzahl der Sequenzen: 15 (iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: Brown, Martin, Haller & McClain
(B) Straße: 1660 Union Street
(C) Stadt: San Diego (D) Staat: CA
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl: 92102-2926 (v) Computerlesbare Form:
(A) Datenträgertyp: Diskette
(B) Computer: IBM-kompatibel
(C) Betriebssystem: DOS
(D) Software: keine
(vi) Gegenwärtige Anmeldedaten:
(A) Anmeldungsnummer: Anwalts-Listennummer 7352-2001PC
(B) Einreichungsdatum: 06. November 1997
(C) Klassifikation: (vii) Frühere Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: Anwalts-Listennummer 7352-2001B
(B) Einreichungsdatum: 08. Oktober 1997
(C) Klassifikation: (vii) Frühere 'Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: 08/746
(B) Einreichungsdatum: 06.11.96 (vii) Frühere Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: 08/786
(B) Einreichungsdatum: 23.01.97 (vii) Frühere Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: 08/787
(B) Einreichungsdatum: 23.01.97 (viii) Informationen über Anwalt/Agenten: (A) Name: Seidman, Stephanie L.
- 107 -
(B) Registriernummer: 33
(C) Referenz-/Listennummer: 7352-2001PC (ix) Telekommunikations-Informationen:
(A) Telefon: 619-238-0999
(B) Telefax: 619-238-0062
(C) Telex:
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 1: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 1: GAATTCGAGC TCGGTACCCG G
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 2: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-(D) Topologie: unbekannt
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.:2: CCGGGTACCG AGCTCGAATT C
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 3: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
&idigr;&udigr;·&ugr;:·&igr;·
(C) Strangform: unbekannt
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschrexbung: Seq.-ID-Nr.: 3: CCTCTTGGGA ACTGTGTAGT ATT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 4: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 112 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure (C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschrexbung: Seq.-ID-Nr.: 4:
AGGCTGTCTC TCTCCCTCTC TCATACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACA-CACAC ACACACACAC TCACACTCAC CCACANNNAA ATACTACACA GTTCCCAAGA GG
112
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 5: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 4 9 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
- 109 -
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 5: TAATACGACT CACTATAGGG CGAAGGCTGT CTCTCTCCCT CTCTCATAC 4
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 6: (i) Sequenzeigenschaften: (A) Länge: 135 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iü) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.:
TAATACGACT CACTATAGGG CGAAGGCTGT CTCTCTCCCT CTCTCATACA CACACA-CACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACTCACACT CACCCACANN NAAA-TACTAC ACAGTTCCCA AGAGG
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 7: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-(D) Topologie: unbekannt
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 7: AATACTACAC AG
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 8: (i) Sequenzeigenschaften:
- 110 -
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: unbekannt
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 8: CTGATGCGTC GGATCATCTT TTTT 2
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 9: (i) Sequenzeigenschaften: (A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (üi) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 9: GATGATCCGA CGCATCAGAA TGT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 10: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 29 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: unbekannt
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
&bull; &bull;«■I ··· *···
- Ill -
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 10: GATCTAGCTG GGCCGAGCTA GGCCGTTGA
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 11:
(i) Sequenzeigenschaften: (A) Länge: 27 Basenpaare
(B) Typ: ^Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iü) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 11: CTGATGCGTC GGATCATCTT TTTTTTT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 12: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 12: GATGATCCGA CG
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 13: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-(D) Topologie: unbekannt
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 13: GATGATCCGA CGCAT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 14: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: AAAAAAGATG AT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 15: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-(D) Topologie: unbekannt
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 15: GATCCGACGC AT
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 16: (i) Sequenzeigenschaften:
- 113 -
(A) Länge: 18 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 16: CTGATGCGTC GGATCATC
(2) Informationen zu.Seq.-ID-Nr.: 17: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 50 Basenpaare (B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ: (vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 17: GCCTGGTACA CTGCCAGGCG CTTCTGCAGG TCATCGGCAT CGCGGAGGAG
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 18: (i) . Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 50 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-(D) Topologie: unbekannt
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 18: GCCTGGTACA CTGCCAGGCA CTTCTGCAGG TCATCGGCAT CGCGGAGGAG
- 114 -
(2) Informationen zu Seq.-ID-Nr.: 19: (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzel-
(D) Topologie: unbekannt (ii) Molekültyp: cDNA (iii) hypothetisch: nein (iv) Antisense: nein (v) Fragment-Typ:
(vi) Originalquelle:
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID-Nr.: 19: GATGCCGATG ACCTGCAGAA G

Claims (15)

1. Ein Substrat mit einer Oberfläche, die an diskreten Positionen darauf aufgebrachtes Probenmaterial aufweist, das aus Matrix-Material für die massenspektrometrische Analyse oder einer Mischung aus Matrix-Material und Analyt ausgewählt wird, wobei das Matrix-Material an jeder Position eine kristalline Struktur ausbildet und eine Menge aufweist, die von dem Aufbringen eines das Material enthaltenden Nanolitervolumens auf der Oberfläche resultiert.
2. Substrat nach Anspruch 1, das auf der Oberfläche angeordnete Vertiefungen aufweist, wobei das Probenmaterial in den Vertiefungen aufgebracht wird.
3. Substrat nach Anspruch 2, wobei die Oberfläche mit Grübchen versehen ist.
4. Substrat nach Anspruch 2, wobei die Vertiefungen eine rauhe Innenfläche aufweisen.
5. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Kapillaren, einer Kapillare, ebenen Trägern und Membranen besteht.
6. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die diskreten Positionen eine Anordnung aufweisen.
7. Substrat nach Anspruch 1, wobei die diskreten Positionen hydrophil sind.
8. Substrat nach Anspruch 1, das Vertiefungen mit Kügelchen darin aufweist.
9. Substrat nach Anspruch 1, das eine Stiftanordnung aufweist, wobei das Probenmaterial an dem Stiftende aufgebracht wird.
10. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das ein Material aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Silicagel, Glas mit kontrollierter Porosität, magnetischen Kügelchen, vernetzten Dextranen, Agarose, Cellulose, Glas, Metall, Kunststoff, polymerem Material und einem Metall- Pfropfpolymer besteht.
11. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Probe eine Nukleinsäure aufweist.
12. Substrat nach Anspruch 1, das Silicium aufweist.
13. Substrat nach Anspruch 12, das ein Silicium-Wafer ist.
14. Substrat nach Anspruch 1, wobei die Oberfläche des Substrats chemisch funktionalisiert, mit Kügelchen funktionalisiert oder mit Dendritstrukturen aus eingefangenem Material funktionalisiert ist.
15. System zur Analyse von auf einem Substrat aufgebrachten Proben, das aufweist:
eine Roboterarmeinheit;
eine Datenverarbeitungseinheit zur Steuerung des Betriebs der Roboterarmeinheit;
eine Abgabevorrichtung, die auf operable Weise mit der Roboterarmeinheit verbunden ist, um definierte und kontrollierte Volumina von Probenmaterial auf diskreten Positionen auf der Substratoberfläche abzugeben; und
ein Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
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