DE29723804U1

DE29723804U1 - Testpatrone zur Bewertung der Blutplättchen-Funktionalität

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Publication number: DE29723804U1
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Authority: DE
Original assignee: Medtronic Inc
Current assignee: Medtronic Inc
Priority date: 1996-04-30
Filing date: 1997-04-30
Publication date: 1999-08-12
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Description

GRÜNECKER, K^K&DEY,·

&ogr; &zgr;

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Testpatrone zur Bewertung der Blutplättchen-Funktionalität

Beschreibung Technisches Anwendungsgebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bewertung der Blutplättchen-Funktionalität (bzw. -Wirksamkeit). Die Erfindung betrifft insbesondere eine verbesserte Multizellen-Patrone für die Verwendung zur Bewertung der Blutplättchen-Funktionalität und ein Verfahren zu ihrer Verwendung.

Technischer Hintergrund

Es wurde festgestellt, daß Blutplättchen (Thrombocyten) eine signifikante Rolle bei der Gerinnung oder Koagulation von Vollblut spielen. Wenn Blutplättchen aktiviert werden, verkürzen sie die Gerinnungszeit des Blutes. Diese Verkürzung bezieht sich auf den Anfangsstatus der Blutplättchen und eine Blutplättchendysfunktion wird als Hauptursache für das postchirurgische Bluten nach einer chirurgischen Herz-Lungen-Bypass-Operation angesehen.

Die Blutplättchen-Funktionalität wird üblicherweise bestimmt durch Mischen von Blut mit einem die Gerinnung fördernden Reagens wie Kaolin in einer Pufferlösung. Dies wird in einer Reihe von Testzellen durchgeführt, die in einer Testpatrone enthalten sind. Nach der Zugabe des Gerinnungs-Reagens wird

die Blut/Kaolin-Lösung in jeder Zelle gerührt (bewegt), um die Blutplättchen zu aktivieren, so daß sie die Gerinnung fördern. Der Grad der Rührung (Bewegung) der Blutprobe in jeder Zelle unterscheidet sich von Zelle zu Zelle. Wie in dem US-Patent Nr. 5 314 826 beschrieben, ist die Gerinnungszeit proportional zum Grad der Rührung (Bewegung). Die Blutplättchen-Funktionalität (bzw. Wirksamkeit) kann bestimmt werden durch Vergleichen der Gerinnungszeiten von aliquoten Anteilen des Blutes als Funktion des Grades der Rührung (Bewegung). Ein solches Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung desselben sind in den US-Patenten Nr. 4 599 219 und 5 314 826 näher beschrieben. Wo es für das nähere Verständnis der vorliegenden Erfindung erforderlich ist, wird auf die Angaben in diesen beiden Patentschriften hier ausdrücklich Bezug genommen.

Chemische Blutplättchen-Aktivatoren oder -Reagentien sind in dem Stand der Technik allgemein bekannt. Ein solcher Aktivator, das 1-O-Alkyl-2-acetyl-snglyceryl-3-phosphorylcholin, ein biologisch aktives Phospholipid, wird von Demopoulos et al. in "J. Biol. Chem.", 1979; 254:9355-8, beschrieben. Dieser ... Blutplättchen-Aktivator oder -Reagens, häufig auch als Blutplättchen-Aktivierungsfaktor bezeichnet, verbessert die Fähigkeit von aktiven Blutplättchen, an der Blutgerinnungs-Reaktion wirksam teilzunehmen und dadurch die Gerinnungszeit des Blutes zu verkürzen. Wenn die Blutplättchen inaktiv sind oder nicht normal funktionieren, hat der Aktivator eine verminderte oder keine Wirkung auf die Gerinnungszeit.

Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine verbesserte Blutplättchen-Funktionalitäts-Testpatrone bereitzustellen, welche die Bewertung (Beurteilung) von funktionellen Blutplättchen in einer Blutprobe erleichtert.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Testpatrone bereitzustellen, die nach der Aufnahme von aliquoten Blutproben-Anteilen in derselben Gerinnungsergebnisse liefert, die eine Voraussage auf die Blutplättchen-Aktivität erlauben.

Beschreibung der Erfindung

Entsprechend den obengenannten Zielen betrifft die vorliegende Erfindung eine Patrone mit einer Vielzahl von Testzellen. Jede Zelle ist geeignet für die Aufnahme eines aliquoten Anteils einer Blutprobe. Eine abgemessene Menge Gerinnungsreagens wird in die Reaktionskammer jeder Zelle gegeben, als eine Trockenfüllung. Die Reagensmenge in jeder Zelle unterscheidet sich von der Reagensmenge in jeder anderen Zelle, wobei mindestens eine der Zellen kein die Blutplättchen aktivierendes Reagens enthält. Außerdem können bestimmte Mengen an Heparin oder Protamin jeder Zelle entweder als flüssige oder getrocknete Füllung zugesetzt werden. Die Zellen enthalten auch ein Gerinnungreagens wie Kaolin, das bei der Verwendung der Patrone in die Reaktionskammer eingeführt und mit dem Blut und dem Blutplättchen-Aktivierungsreagens gemischt wird. Die relativen Gerinnungszeiten der Proben in jeder Zelle werden bestimmt und im Vergleich zu einem Standard und untereinander wird die Blutplättchen-Funktionalität der Blutprobe bestimmt.

Die Patrone und das Verfahren zur Bestimmung der Blutplättchen-Funktionalitat sind nützlich in Verbindung mit der Chirurgie am offenen Herzen und der Herzlungen-Chirurgie, bei der die Blut-Bedingungen des Patienten genau überwacht werden müssen.

Beschreibung der Zeichnungen
25

Fig. 1 zeigt in Form einer Frontaufrißansicht eine einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildende Multizellen-Patrone.

Fig. 2 stellt eine Schnittansicht dar, die im wesentlichen in der Ebene der Linie 2-2 der Fig. 1 aufgenommen wurde.

Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Blutplättchen-Aktivierungsfaktor-Konzentration und der Gerinnungszeit zeigt.

Beste Art der Durchführung der Erfindung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Testpatrone 10 mit einer Vielzahl von Testzellen 11, vorzugsweise sechs derartigen Zellen, die abhängig sind und eine integrale Einheit bilden mit einer Patronenplatte 12, die eine herunterhängende Schürze oder Tafel 14 aufweist. Die Patrone kann in eine Test-Vorrichtung, beispielsweise eine solche, wie sie in dem US-Patent Nr. 4 599 219 dargestellt und im Detail beschrieben ist, eingesetzt werden zur Be-Stimmung der Gerinnungszeit eines Blutproben-Aliquots, das in jede Testzelle 11 eingeführt worden ist, wie in dieser Patentschrift im Detail beschrieben. Jede Zelle wird gebildet durch ein sich nach unten verjüngendes Rohr 15, das einen nach innen vorspringenden ringförmigen Absatz 16 in der Mitte zwischen seinen Enden aufweist und seinerseits eine obere Dichtungs-Oberfläehe 18 und eine untere Versiegelungs-Oberfläche 19 definiert. Ein elastischer, flexibler gleitender Stopfen 20 ist in dem unteren Ende des Rohres 15 angeordnet, während ein Plunger (Kolben) 21, der durch einen Plungerschaft 22 und eine Dichtungs- oder Versiegelungsscheibe 24 definiert ist, in dem oberen Abschnitt des Rohres angeordnet ist. Die Dichtungsscheibe 24 sitzt auf der oberen Dichtungs-Oberfläche 18 des ringförmigen Absatzes und begrenzt zusammen mit dem Stopfen 20 eine untere Gerinnungs-Reagenskammer 25. Das Rohr 15 begrenzt oberhalb der Dichtung 24 eine Blutaufnahme-Reaktionskammer 26. An seinem oberen Ende begrenzt der Plunger 21 einen Anzeiger 28 und steht mit der Testvorrichtung (nicht dargestellt) in Verbindung.

Ein Gerinnungs-Reagens 29, z.B. Kaolin in einer gepufferten bakteriostatischen Lösung, ist in der Gerinnung-Reagenskammer 25 oberhalb des Stopfens 20 und unterhalb der Dichtungsscheibe 24 enthalten. Wenn die Patrone verwendet wird, wird der Plunger 21 jeder Zelle angehoben und der Stopfen wird nach oben gestoßen, wodurch das Gerinnungs-Reagens in die Blutprobe gedrückt wird, die in der oberen Zellen-Reaktionskammer 26 enthalten ist, um die Gerinnung zu initiieren.

Erfindungsgemäß wird eine abgemessene Menge eines chemischen Blutplättchen-Aktivierungsfaktors oder -reagenses 30 in der obersten oder in der oberen Reaktionskammer 26 in Form einer getrockneten Füllung vorgesehen. Diese Blutplättchen-Aktivierungsfaktor-Zusammensetzung wird in der Blutprobe gelöst, wenn die Blutprobe in die Gerinnungskammer 26 eingeführt wird und das Gerinnungs-Reagens 29 zugegeben und damit gemischt wird. Außerdem können ausgewählte Mengen an Heparin oder Protamin als Trockenfüllung in der Reaktionskammer 26 verwendet werden, je nach dem anzuwendenden chemischen Verfahren.

Um eine Reihe von unterschiedlichen Gerinnungszeiten zu erhalten, unterscheidet sich die Menge des Blutplättchen-Aktivierungsfaktors in jeder Zelle von der Menge in jeder anderen Zelle. In den ersten beiden Zellen 11A und 11B (wie in Fig. 1 dargestellt) wird kein Blutplättchen-Aktivierungsfaktor verwendet. In jeder nachfolgenden Zelle 11C, 11D, 11E und 11F werden steigende Mengen an Blutplättchen-Aktivierungsfaktor oder -Reagens verwendet.

Der bevorzugt Blutplättchen-Aktivierungsfaktor ist die Verbindung 1-O-Alkyl-2-acetyl-sn-glyceryl-S-phosphorylcholin, ein biologisch aktives Phospholipid. Andere Faktoren oder Verbindungen, die verwendet werden können, sind Kollagen, Epinephrin, Ristocetin und Arachidonsäure. Füllungen aus dem bevorzugten Blutplättchen-Aktivierungsfaktor 1 -O-Alkyl^-acetyl-sn-glyceryl-S-phosphorylcholin werden hergestellt durch Mischen des Faktors mit einer Kochsalz-Lösung (NaCI), die 0,25 % Rinderserumalbumin enthält, und Verdünnen mit entionisiertem Wasser bis auf die gewünschten Faktor-Konzentrationen. Eine bestimmte Menge jeder Lösung der gewünschten Faktor-Konzentration wird in eine Zelle eingeführt und verdampfen gelassen, wobei ein fester oder trockener Füllungsrückstand der gewünschten Menge an Blutplättchen-Aktivierungsfaktor zurückbleibt. Es können auch die gewünschten Mengen an Heparin und Protamin zugegeben werden und in Form einer Füllung getrocknet werden.

Das Gerinnungs-Reagens, z.B. Kaolin, wird hergestellt als eine 4 gew./vol.-%ige Suspension in einem Hydroxyethylpiperazinethansulfonsäure-Puffer mit 0,5 m Calciumchlorid und Natriumazid als bakteriostatischem Agens. Eine Menge von 0,088 ml dieses Gerinnungs-Reagens wird in die Reagenskammer 25 jeder Zelle 11 der Patrone 10 eingeführt.

Bei der Verwendung werden aliquote Anteile von 0,35 ml pro Zelle einer Blutprobe in jeder Zelle verteilt. Dies führt zu Blutplättchen-Aktivierungsfaktor (PAF)-Blutkonzentrationen, wie sie in der folgenden Tabelle erläuternd angegeben sind.

Tabelle I

Patronen-PAF-Konzentrationen

Menge an PAF in der Blutplättchen-Funktions-PAF-Patrone

Zelle A Zelle B Zelle C Zelle D Zelle E Zelle F

O₁O ng 0,0 ng 23 ng 116 ng 230 ng 2,76

End-Konzentration an PAF in dem Blut

O₁OnM 0,OnM 1,25 nM 6,25 nM 12,5 nM 15OnM

Nach der Einführung der Blutproben in jede Zellen-Reaktionskammer wird das Gerinnungs-Reagens in jede Reaktionskammer eingeführt und die Gerinnungszeit des Blutes in jeder Zelle wird bestimmt. Aus der Gerinnungszeit für jede Zelle wird das Gerinnungs-Verhältnis errechnet. Das Gerinnungs-Verhältnis ist das Verhältnis zwischen den Gerinnungszeiten für die Zellen C, D, E und F im Vergleich zu den durchschnittlichen Kontroll-Gerinnungszeiten in den Zeilen 11A und 11B. Die Blutplättchen-Funktionalität (bzw. -Wirksamkeit) wird ausgedrückt als Prozentsatz der maximalen Gerinnungs-Ansprechempfindlichkeit, die bei der normalen Bevölkerung zu beobachten ist. Dieser Empfindlichkeitswert der normalen Bevölkerung ist bekannt und kann zur Errechnung des Gerinnungs-Prozentsatzes verwendet werden, der seinerseits

ein Anzeichen für die Blutplättchen-Funktionalität (-Wirksamkeit) ist. Es kann irgendeine geeignete erwünschte Berechnung aus den relativen Gerinnungszeiten jeder Zelle vorgenommen werden. Die Blutplättchen-Funktionalität kann ihrerseits dazu verwendet werden, den Blutverlust während der chirurgischen Operation und den Bedarf für eine Bluttransfusion zu bestimmen. Die Blutplättchen-Funktionalität unterstützt ferner die Handhabung der Heparin-Therapie während der chirurgischen Herzoperation.

Beispiel I
10

Herstellung von Blutplättchen-Aktivierunqsfaktor-Lösunqen und Zellen

1. Es werden 62,5 mg Rinderserumalbumin (BSA) abgewogen (Product #A-3803 der Firma Sigma).
2. Es werden 219 mg NaCI abgewogen.

3. Mit entionisiertem Wasser wird auf 25 ml aufgefüllt. Dabei erhält man 0,25 % BSA/0,15 M NaCI. Es wird stehen gelassen, bis das BSA vollständig in Lösung gegangen ist.

4. Unter Verwendung einer Hamilton-Spritze werden 50 &mgr;&Igr; Blutplättchen-Aktivierungs-Faktor i-O-Alkyl^-acetyl-sn-glyceryl-S-phosphorylcholin in eine saubere, mit einem Stopfen verschlossene Phile pipettiert und in einer Absaughaube verdampfen gelassen. Es werden 2 ml BSA/NaCI-Lösung zugegeben und mindestens 1 h lang stehen gelassen. Dieses Arbeits-Ausgangsmaterial hat eine Konzentration von 100 &mgr;&Mgr;.

5. Die Ausgangslösung des Blutplättchen-Aktivierungs-Faktor (PAF) wird in Zehnerpotenzen mit entionisiertem Wasser bis auf 0,1 &mgr;&Mgr; verdünnt. 5 &mgr;&Igr; jeder dieser Lösungen ergeben 1,25 &mgr;&Mgr;, 12,5 &mgr;&Mgr;, 125 &mgr;&Mgr; bzw. 1250 &mgr;&Mgr; in 0,4 ml Blut.
6. Die nachstehend angegebenen Mengen werden den Zellen zugegeben und sie führen zu den angegebenen Blut-Konzentrationen:

Zelle	zuqeqebenes Reaqens	PAF-Konzentration
A	5 &mgr;&Igr; BSA/NaCI	OnM
B	5 &mgr;&Igr; 0,1 pMPAF	1,25 &pgr;&Mgr;
C	5 &mgr;&Igr; 1 &mgr;&Mgr; PAF	12,5 &pgr;&Mgr;
D	5&mgr;&Igr; 10 &mgr;&Mgr; PAF	125 &eegr;&Mgr;
UJ	2&mgr;&Igr; 100 &mgr;&Mgr; PAF	50OnM
F	5 &mgr;) 100 &mgr;&Mgr; PAF	125OnM

7. Das Wasser wird verdampfen gelassen, wobei in jeder Zelle eine Trokkenfüllung zurückbleibt.

8. Unter Verwendung einer Probe von Normalblut von einem freiwilligen Spender und einer Patrone, die nach Beispiel I hergestellt worden ist, wurden 0,4 ml Aliquote Blut zu jeder Zelle zugegeben und die Gerinnungszeit des Blutes in jeder Zelle wurde bestimmt und in Form eines Diagramms wie in Fig. 3 aufgetragen.

Wie oben angegeben, kann die Titrationskurve normalisiert werden durch Umwandlung der Gerinnungszeiten in Verhältnisse. Die Gerinnungszeit der Zelle A, in der kein Blutplättchen-Aktivierungsfaktor vorhanden ist, ist die ZeI-len-Gerinnungszeit, mit der alle anderen Zellen-Gerinnungszeiten verglichen werden. Das Verhältnis wird errechnet durch Dividieren der Gerinnungszeit der Zelle A in Sekunden durch die Gerinnungszeit jeder anderen Zelle in Sekunden. Ein Gerinnungs-Verhältnis wird dann errechnet als 1-Verhältnis zwischen der Gerinnungszeit der Zelle A und den Gerinnungszeiten der übrigen Zellen (1-Zelle A-Gerinnungszeit/Zelle X-Gerinnungszeit). Die Daten können in bezug auf die Blutplättchen-Funktion auch als Prozentsatz des Normalwertes dargestellt werden. Dieser wird errechnet aus dem Gerinnungs-Verhältnis durch Multiplizieren des Gerinnungs-Verhältnisses mit 100 und danach mit dem Faktor 1,97, der bestimmt worden ist durch Messung der maximalen Blutplättchen-Aktivierungsfaktor-Empfindlichkeit bei 22 normalen Spendern. Diese Spender wiesen keine bekannte Blutplättchendysfunktion auf und sie wurden keiner bekannten Arzneimittel-Behandlung unterzogen.

Die Testpatrone und das Verfahren, die hier beschrieben sind, eignen sich zur Durchführung eines einfachen und schnellen Empfindlichkeits-Blutplättchen-Funktions-Tests. Dieser Test identifiziert Patienten mit übermäßig großem Blutverlust nach einer Herz-Lungen-Bypass-Operation für die eine weitere Belut-Behandlung und Blutüberwachung günstig wäre.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend anhand einer bestimmten erläuternden Ausführungsform in den Zeichnungen dargestellt und oben im Detail beschrieben, es ist jedoch klar, daß nicht die Absicht besteht, die Erfindung auf die beschriebene spezifische Form zu beschränken. Die Erfindung umfaßt vielmehr alle Modifikationen, alternativen Konstruktionen und Zusammensetzungen, Äquivalente und Verwendungszwecke, die innerhalb des Rahmens der Erfindung liegen, wie er durch die nachfolgenden Patentansprüche ausgedruckt wird.

Claims

Gebrauchsmusteranmeldung 297 23 804.3. Anmelder: Medtronic, Inc. G 4049-03196/sm Datum: 10.06.1999 5 SCHUTZANSPRÜCHE

1. Vorrichtung zur Bewertung (Beurteilung) der Blutplättchen-Funktionalität (-Wirksamkeit) einer Blutprobe, die eine Patrone umfaßt, die eine Vielzahl von Testzellen aufweist, wobei jede der genannten Zellen ein Gerinnungsreagens und eine vorher festgelegte Menge Blutplättchen-Aktivierungsreagens enthält, wobei mindestens zwei der Zellen unterschiedliche Mengen des Blutplättchen-Aktivierungsreagens enthalten und in der das Blutplättchen-Aktivierungsreagens i-O-Alkyl^-acetyl-sn-glyceryl-S-phosphorylcholin ist.

2. Vorrichtung zur Durchführung eines Blutplättchen-Funktionalitätstests mit einer Blutprobe, wobei die Vorrichtung eine Vielzahl von Testzellen umfaßt, die einen aliquoten Anteil der genannten Probe aufnehmen können, wobei jede der genannten Zellen ein Gerinnungsreagens und eine vorher festgelegte Menge eines Blutplättchen-Aktivierungsreagens umfaßt, wobei mindestens zwei der Testzellen unterschiedliche Mengen des genannten Blutplättchen-Aktivierungsreagens enthalten und wodurch die Gerinnungszeit für jeden der genannten aliquoten Anteile bestimmt wird und die relativen Gerinnungszeiten der genannten aliquoten Anteile in den genannten Zellen bestimmend sind für die Blutplättchen-Funktionalität der genannten Probe und worin das genannte Blutplättchen-Aktivierungsreagens 1 -O-Alkyl^-acetyl-sn-glyceryl-S-phosphorylcholin ist.

3. Vorrichtung zur Bewertung der Gerinnungs-Eigenschaften einer Blutprobe, wobei die Vorrichtung eine Vielzahl von Testzellen umfaßt, die einen aliquoten Anteil der genannten Probe aufnehmen können, wobei jede der ge-

nannten Zellen ein Gerinnungs-Reagens und eine vorher festgelegte Menge eines die Gerinnung beeinflussenden Reagens enthält, wobei mindestens zwei der Testzellen unterschiedliche Mengen des die Gerinnung beeinflussenden Reagens enthalten und wodurch die Gerinnungszeit bestimmt wird für jeden der aliquoten Anteile und die relativen Gerinnungszeiten der genannten aliquoten Anteile in den genannten Zellen bestimmend sind für die Gerinnungs-Eigenschaften der genannten Probe, worin das genannte, die Gerinnung beeinflussende Reagens ein Blutplättchen-Aktivierungsreagens ist und worin das genannte Blutplättchen-Aktivierungsreagens i-O-Alkyl^-acetyl-sn-glyceryl-S-phosphorylcholin ist.