DE29708743U1

DE29708743U1 - Apheresevorrichtung

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Publication number: DE29708743U1
Application number: DE29708743U
Authority: DE
Original assignee: Kuebler Dr GmbH
Current assignee: Kuebler Dr GmbH
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1997-05-16
Publication date: 1998-09-17
Anticipated expiration: 2007-05-17
Also published as: DE29823979U1; WO1998053314A1

Description

Apheresevorrichtung

Die Erfindung betrifft eine tragbare Apheresevorrichtung zur Isolierung und Kultivierung von transformierten Zellen aus Blut.

Es ist bekannt, daß sich transformierte Zellen bzw. Tumorzellen in einem Organismus von einem Tumor absiedeln und in den Blutstrom übertreten können. Über die Bedeutung von im Blutstrom zirkulierenden transformierten Zellen für die Ausbildung von Metastasen berichtet A. J. Salsbury in "Significance of Circulating Cancer Cells"; Wiliam Heinemann Medical Books, New Aspects of Breast Cancer, Bd. 3, S 245 ff., 1977. Dabei können zirkulierende Tumorzellen in den meisten Fällen, d.h. bereits lange bevor der Primärtumor klinisch nachgewiesen werden kann, im Blutstrom auftreten (P. M. GuIlino, Dev. Oncol, 49, 251-271, 1986.

Für die Therapie von Tumorerkrankungen ist es äußerst vorteilhaft, wenn die tumoröse Erkrankung bereits in einem sehr frühen Stadium erkannt wird, d.h. bevor es zur Metastasenbildung gekommen ist. Je früher eine derartige tumoröse Erkrankung diagnostiziert werden kann, um so besser sind die Heilungschancen für den Patienten.

Im Stand der Technik sind Verfahren zur Isolation von transformierten Zellen über eine Dichtegradienten-Zentrifugation bekannt, wie sie üblicherweise zur Isolierung von Lymphozyten unter Verwendung eines Ficoll-Gradienten eingesetzt werden. Dabei sind jedoch große Blutmengen ab 1500 ml Blut erforderlich, was für den Patienten sehr belastend ist. Ferner ist der apparative Aufwand sehr groß, so daß diese Verfahren nicht zu einer routinemäßigen Untersuchung eingesetzt werden können. Weiterhin werden durch dieses konventionelle 5 Zentrifugationsverfahren die meist in sehr geringer Zahl vorhandenen Tumorzellen beschädigt oder verunreinigt.

Gemäß dem der DE 42 28 389 zugrundeliegenden Verfahren wurde festgestellt, daß sich bei Zentrifugation einer Blutprobe in der zwischen den Erythrozyten und dem Blutplasma anordnenden Schicht aus Leukozyten, dem sogenannten Buffy-Coat, auch abgesiedelte transformierte Zellen des Primärtumors befinden. In der DE 42 28 389 wird weiter ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von im Blutstrom eines Individuums zirkulierenden transformierten Zellen beschrieben, wobei man durch Zentrifugation von Blut mittels einer zur Abtrennung von Lymphozyten geeigneten, kontinuierlichen Zentrifuge einen Buffy-Coat, der die transformierten Zellen, Leukozyten und Lymphozyten enthält, über einen der Zentrifuge nachgeschalteten Bypass entnimmt und den Buffy-Coat unter Vermehrung der transformierten Zellen kultiviert.

Nachteilig ist jedoch, daß sich dieses Verfahren nur in Anlagen durchgeführt werden kann, die nur mehrere einzelne, zum Teil sehr zeitaufwendige Arbeitsschritte zuläßt, die dieses Verfahren für eine routinemäßige Analyse nicht geeignet machen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine kleine kompakte Vorrichtung, die eine vereinfachte und schnelle Analyse von Blutproben auf in den Blutproben enthaltene transformierte Zellen ermöglicht, bereitzustellen.

Die vorstehende Aufgabe wird durch eine tragbare Apheresevorrichtung zur Isolierung und Kultivierung von transformierten Zellen aus Blut, wobei die Apheresevorrichtung umfaßt:

0 eine erste Abtrennvorrichtung zur Anreicherung und Abtrennung der Leukozytenfraktion, die Leukozyten und transformierte Zellen umfaßt, aus dem Blut, und mit je einer Zuführ- und Entnahmeeinrichtung,

erste Überführungsmittel zur Überführung der Leukozytenfraktion aus der ersten Abtrennvorrichtung in eine zweite Abtrennvorrichtung,

die zweite Abtrennvorrichtung zur Trennung der

transformierten Zellen und der Leukozyten, mit je einer Zufunrund Entnahmeeinrichtung,

zweite Überführungsmittel zur Überführung der transformierten Zellen aus der zweiten Abtrennvorrichtung in eine Zellkulturvorrichtung,

die Zellkulturvorrichtung mit einer Zuführ- und Entnahmeeinrichtung für transformierte Zellen, wobei die erste Abtrennvorichtung, die ersten Überführungsmittel, die zweite Abtrennvorrichtung, die zweiten Überführungsmittel und die Zellkulturvorrichtung in einer kontinuierlichen Downstreamanordnung miteinander hintereinander verbunden in einer tragbaren Einheit angeordnet sind.

Durch die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung wird ein kompaktes Laborgerät für die Routineuntersuchung auf im Blutstrom zirkulierende transformierte Zellen, d.h. Tumorzellen bereitgestellt. Die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung ist dabei für den Einsatz in kleinen Labors gedachtm, kann platzsparend auf jedem Labortisch angeordnet werden und ist 0 hervorragend zur zur Untersuchung von Mengen an Blut in bereits kleinen Mengen von z.B. 250 ml oder noch geringere Mengen von 10 bis 100 ml geeignet.

Die Zuführung von Blut kann automatisiert werden, indem das zuvor dem Patienten abgenommene und in einem Behälter gelagerte Blut mittels einer Entnahmevorrichtung aus dem Behälter entnommen und in die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung eingebracht wird. Möglich ist aber auch die manuelle Einbringung von Blut in die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung zum Beispiel über die Injektion des Blutes mittels einer Spritze. Weiterhin ist es möglich, das Blut über über einen permanenten venösen Zugang direkt in die Apheresevorrichtung einzuleiten.

5 Unter einer Downstreamanordnung wird im Sinne der Erfindung verstanden, daß die einzelnen Funktionseinheiten der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung von der Einbringung des

Blutes über die Abtrennung der Leukozytenfraktion, die die gegebenenfalls im Blutkreislauf zirkulierenden Tumorzellen umfaßt, bis zur Abtrennung der Tumorzellen von Leukozyten und einer ersten Kultivierung der Tumorzellen kontinuierlich hintereinander angeordnet und miteinander verbunden, d.h. nahezu vollautomatisch arbeiten.

Unter einer tragbaren Einheit wird im Sinne der Erfindung verstanden, daß die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung in einer funktioneilen Einheit ausgebildet ist, d.h., daß die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung zum Beispiel in einem Gehäuse oder in Form eines Standzylinders, die ohne größeren Aufwand von einem Ort an den anderen transportiert werden können, bereitgestellt wird. Es ist erfindungsgemäß selbstverständlich, daß die erfindungsgemäße Aphereseeinrxchtung auch in Form einer Miniaturvorrichtung und/oder in Form beispielsweise einer Wegwerfeinheit ausgeführt werden kann, wobei die einzelnen Funktionseinheiten in kostenkünstiger Bauweise ausgeführt sind.

Im folgenden werden die funktionellen Einheiten der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung beschrieben.

Vorteilhaft umfaßt die erste Abtrennvorrichtung eine kontinuierliche Zentrifuge, die mit einer im Stand der Technik zur Auftrennung von Blut in seine Bestandteile bekannten Drehzahl mittels eines Motors oder Pressluft betrieben wird, mit einem Durchflußrotor. Ein Durchflußrotor, der erfindungsgemäß bevorzugt 60-90 ml Fassungsvermögen aufweist, 0 ermöglicht sehr vorteilhaft eine zügige und zuverlässige, kontinuierliche und schonende Trennung von Erythrozyten, der Leukozytenfraktion (dem sogenannten Buffy-Coat), und des Blutplasmas voneinander. Der Durchflußrotor ist vorteihaft glockenartig oder konisch ausgebildet, so daß die Entnahme der aufgetrennten Blutfraktionen in der Nähe der zentralen Rotorachse erfolgen kann.

Dadurch, daß der Rotor als Durchflußrotor ausgebildet ist, kann die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung kontinuierlich arbeiten. Sehr vorteilhaft ist dabei, daß aufgrund der kontinuierlichen Arbeitsweise die Gefahr von einer Kontamination der erzeugten Zellkulturen minimiert wird. Die Gefahr einer Kontamination der erzeugten Zellkultur mit Bakterien, Hefen oder Pilzen wird um so größer, je mehr Bearbeitungsschritte manuell ausgeführt werden.

Bevorzugt umfaßt die Zentrifuge eine Detektionsvorrichtung zur Messung der Fraktionen, bzw. Bestimmung der Fraktionsgrenzen . Eine Detektionsvorrichtung zur Detektion der in dem Rotor voneinander getrennten Bestandteile des Blutes ermöglicht eine zuverlässige Trennung des Buffy-Coat von den Erythrozyten und dem Blutplasma. Eine derartige Detektionsvorrichtung umfaßt zum Beispiel einen Optiksensor, der die Transmission bzw, die Änderung der Transmission des von einer Lichtquelle ausgestrahlten Lichtes mißt. Dabei kann zum Beispiel in der Rotorachse eine Lichtquelle und in der Zentrifuge der Optiksensor vorgesehen sein. Weiterhin ist umfangsmäßig in der Innen- und Außenwandung des Rotors jeweils ein lichtdurchlässiger Streifen in der Rotorwand vorgesehen, so daß das von der Lichtquelle abgestrahlte Licht durch den Rotor auf den Optiksensor trifft. Sobald die während der Zentrifugation aufgetrennten Fraktionen des Blutes den lichtdurchlässigen Streifen passieren, ändert sich die Transmission, was von dem Optiksensor detektiert wird. Die Transmission ändert sich dabei sprungartig beim Übergang der Plasmafraktion zu der optisch dichteren Leukozytenfraktion und wiederum beim Übergang zu der 0 Erythrozytenfraktion. Die Signale des Optiksensors werden über eine Regeleinheit zur Steuerung der Stellung eines Mehrwegeventils verwendet, um die Lymphocytenfraktion von den übrigen Blutbestandteilen abgetrennt, über die ersten Überführungsmittel abzuführen.

Vorteilhaft umfassen die ersten Überführungsmittel eine zwischen der ersten Abtrennvorrichtung und der zweiten

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Abtrennvorrichtung angeordnete Verbindungsleitung. Die Verbindungsleitungen sind dabei zum Beispiel Schlauchverbindungen oder starre Leitungen.

Sehr vorteilhaft sind eine Steuerungseinrichtung zur Stellungsregelung des Mehrwegeventils über die von der Detektionsvorrichtung empfangenen Signale und mindestens ein Mehrwegeventil mit je einer Verbindungsleitung zu einem Behälter zur Aufnahme aus der Vorrichtung abgeleiteter Flüssigkeit und einer Verbindungsleitung zu einem Vorratsbehälter für physiologische Lösungen und gegebenenfalls mindestens eine Mischkammer vorgesehen.

Die von dem Optiksensor in Form von Transmissionsänderungen aufgenommenen Signale werden dann an eine Steuerungsvorrichtung weitergeleitet, die dann zum Beispiel die Stellung der ansteuerbaren Mehrwegeventilen ändert. Nachdem die Leukozytenfraktion vom Optiksensor detektiert wurde, wird das Mehrwegeventil, gegebenenfalls unter Berücksichtigung des Totvolumens der Verbindungsleitungen, so gestellt, daß die Leukozytenfraktion nicht aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung, sondern in Richtung der zweiten Abtrennmittel geleitet wird. Die zuvor aus der Apheresevorrichtung geleitete Plasmafraktion kann in einen sterilen Behälter, für weitere Untersuchungszwecke, etc., oder aber auch direkt in einen Behälter für Flüssigabfall geleitet werden.

Sobald die Erythrozytenfraktion von dem Optiksensor detektiert wird, wird das Mehrwegeventil erneut, gegebenenfalls unter Berücksichtigung des Totvolumens der Verbindungsleitungen, über die Steuerungsvorrichtung geschaltet, so daß die Erythrozyten entweder in einen sterilen Behälter, für weitere Untersuchungen, etc., oder auch in einen Behälter für Flüssigabfall abgeleitet werden.

Gegebenfalls kann die so abgetrennte Leukozytenfraktion durch

Zugabe einer physiologischen Lösung in einer Mischkammer odervorrichtung verdünnt werden. Die Zugabe der physiologischen Lösung aus einem Vorratsbehälter erfolgt über eine entsprechende Ansteuerung des Mehrwegeventils durch die Steuervorrichtung.

Die abgetrennte Leukozytenfraktion wird mit oder ohne Zugabe der physiologischen Lösung zur Verdünnung/Verflüssigung aus der ersten Abtrennvorrichtung über die Verbindungsleitung in die zweite Abtrennvorrichtung gespült, die besonders vorteilhaft in Form eines Kapillarsiebes oder -bettes oder einer Trennsäule ausgebildet ist.

Wenn ein Kapillarsieb Verwendung findet, kann dieses Kapillarsieb bevorzugt einen der Bodengröße des Rotors in Abhängigkeit von der eingesetzten Blutmenge angepaßten Durchmesser mit einer Porengröße von etwa 7,5 /im aufweisen. Unter einem Kapillarbett werden dabei zueinander parallel angeordnete Kapillaren verstanden, wobei die Leukozytenfraktion am oberen Ende des Kapillarbettes in die Kapillaren eingebracht wird und unter Einwirkung der Schwerkraft und durch nachströmende physiologische Lösung duch die Kapillaren gespült wird. Je größer die Anzahl der Kapillaren ist, um so kürzer ist die Gesamtdauer für die Trennung von Leukozyten und Tumorzellen. Auch die Länge der Kapillaren und der Durchmesser kann ohne weiteres variiert werden. Der Fachmann ist in der Lage, diese Parameter jederzeit an die entsprechenden Anforderungen einzustellen.

Ein Kapillarbett oder -sieb bewirkt aufgrund des kleinen Kapillardurchmessers eine optimale Flußrate der Zellsuspension durch die Kapillaren. Aufgrund dieser optimalen Flußrate können die Leukozyten hervorragend mit den Kapillarinnenwänden, die geeignetereise mit einem Adhäsionssystem für Leukozyten beschichtet sind, in Kontakt treten, was für die Trennung von Leukozyten und Tumorzellen sehr vorteilhaft ist.

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Anstelle des Kapillarbettes kann auch eine Trennsäule verwendet werden, die mit den üblichen Materialien zur Trennung von
Zellen befüllt ist, zum Beispiel auf Basis von Baumwolle oder Nylonwolle, die auch modifiziert sein können.
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Unter einem Adhäsionssystem wird im Sinne der Erfindung jedes System verstanden, daß eine spezifische Wechselwirkung zwischen Zelloberflächenstrukturen auf den Leukozyten und Molekülen, die auf den Innenwänden der Kapillaren bzw. auf dem Säulenmaterial aufgebracht sind. Unter spezifischen Wechselwirkingen v/erden van-der-Waals-Kräfte, hydrophobe Wechselwirkungen und/oder
ionische Wechselwirkungen verstanden.

Ganz besonders bevorzugt umfaßt das Adhäsionssystem für
Leukozyten immobilisierte Moleküle mit einer Affinität für
Zelloberflächenstrukturen der Leukozyten.

Unter Molekülen mit einer Affinität für
Zelloberflächenstrukturen der Leukozyten werden im Sinne der Erfindung alle Moleküle verstanden, die eine spezifische

Wechselwirkung im obigen Sinne mit den Leukozyten ermöglichen. Diese Moleküle werden auf der Innenseite der Kapillaren bzw. auf dem Säulenmaterial durch herkömmliche Techniken
immobilisiert.

Diese Moleküle umfassen insbesondere organische Gruppen, die als Affinitätsgruppe wirken, Rezeptoren und Liganden, d.h.
insbesondere isolierte Zelloberfächenmoleküle, Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle,
Lektine und Glykoproteine, als auch

0 Antikörper. Die Antikörper können monoklonal oder auch

polyklonal sein. Die Verwendung von polyklonalen Antikörpern bzw. eine Mischung aus monoklonalen Antikörpern ist sehr
vorteilhaft, da dann sehr viele verschiedene Epitope auf der Leukozytenoberfläche erkannt werden, was eine zuverlässigere Abtrennung der Leukozyten bewirkt.

Insbesondere werden Antikörper gegen CD45, einem

Leukozytenantigen, bevorzugt. Als Zeiladhäsionsmolekül kann
auch CD22, der Ligand für CD45, auf dem Säulenmaterial bzw. auf der Innenseite der Kapillaren aufgebracht werden.

Vorteilhaft ist die zweite Abtrennvorrichtung als der tragbaren Aphereseeinheit entnehmbare Einheit ausgebildet, die die rasche Wiederinbetriebnahme der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung
ermöglicht. Dabei wird die "verbrauchte" Abtrennvorrichtung
einfach aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung entnommen und entsorgt. Anstelle der "verbrauchten" zweiten

Abtrennvorrichtung wird dann eine neue, gebrauchsfertige zweite Abtrennvorrichtung eingesetzt. Durch Verwendung einer solchen
Einmal-Abtrennvorrichtung wird auch zuverlässig eine
Kontamination bei nachfolgenden Abtrennungsvorgängen

verhindert.

Bevorzugt umfassen zweiten Überführungsmittel eine zwischen der zweiten Abtrennvorrichtung und der Zellkulturvorrichtung
angeordnete Verbindungsleitung. Die Verbindungsleitungen sind

0 dabei zum Beispiel Schlauchverbindungen oder starre Leitungen.

Vorteilhaft ist in der Verbindungsleitung zwischen der zweiten
Abtrennvorrichtung und der Zellkulturvorrichtung oder in der
Zellkulturvorichtung eine Entnahmevorrichtung zur sterilen

Entnahme der physiologischen Lösung vorgesehen, die eine
sterile Entnahme der sich in der Zellkulturvorrichtung
ansammelnden physiologischen Lösung erlaubt. Durch die Entnahme wird zuverlässig ein Überlaufen der erfindungsgemäßen
Apheresevorrichtung verhindert.

Sehr vorteilhaft umfaßt die Zellkulturvorrichtung eine
entnehmbare Zellkulturplatte. Wenn der Flüssigkeitsspiegel der
physiologischen Lösung über Entnahme von Flüssigkeit durch
vorgenannte Entnahmevorrichtung abgesenkt wurde, können die

5 Zellkulturplatten aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung entnommen werden und in einem Inkubator unter
Zellkulturbedingungen weiter inkubiert werden. Sehr vorteilhaft

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ist dabei, daß die erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung somit für einen weiteren Abtrennvorgang wieder zur Verfügung steht. Die schnelle Verfügbarkeit der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung ist insbesondere in einem Routinelabor sehr erwünscht.

Äußerst vorteilhaft ist die Zellkulturvorrichtung mit einer Heizung, einem Befeuchter und/oder einer CO₂-Quelle versehen. Die isolierten Tumorzellen können somit unter optimalen Zellkulturbedingungen gehalten werden, d.h. bei 37°C, einer feuchten Atmosphäre sowie bei zum Beispiel 5% CO₂ und 95 % Luft.

Die isolierten Tumorzellen können somit auch in der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung direkt inkubiert werden. Eine Entnahme der Tumorzellen aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung ist auch dadurch möglich, daß die Tumorzellen über am Boden vorgesehene Einstichkanäle unter Zuhilfenahme einer Kanüle abgesaugt werden können. 20

Weiterhin ist es bevorzugt, wenn vor der ersten Abtrennvorrichtung ein zweites Mehrwegeventil angeordnet ist. Dieses zweite Mehrwegeventil ermöglicht eine erleichterte Spülung der gesamten erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung.

5 Dadurch kann die gesamte Vorrichtung innerhalb einer sehr kurzen Zeit für die nächste Routineanalyse wieder bereit gestellt werden, was sehr vorteilhaft ist.

Sehr vorteilhaft ist es dabei, wenn das zweite Mehrwegeventil 0 wenigstens mit je einer Zuführung für Blut, Spüllösung aus einem Vorratsbehälter und physiologischer Lösung aus weiteren Vorratsbehälter verbunden ist.

Nach einer routinemäßigen Analyse einer Blutprobe, wird das 5 zweite Mehrwegeventil von der Blutzuführung auf die Zuführung einer Spüllösung umgeschaltet. Die Spüllösung wird dann in den Rotor eingebracht und spült das in dem Rotor enthaltene Blut

über die Entnahmeeinrichtung und das erste Mehrwegeventil, daß in Richtung des Behälters für Flüssigabfall geöffnet ist, aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung. Nach dem Spülen mit einer Spüllösung wird das zweite Mehrwegeventil so geschaltet, daß eine Sterilisierungslösung, wie zum Beispiel 70 % Ethanol, durch den Rotor und über die Entnahmevorrichtung und über das erste Mehrwegeventil in den Behälter für Flüssigabfall überführt. Anschließend wird nach einer erneuten Schaltung des zweiten Mehrwegeventils die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung mit einem sterilen physiologischen Puffer auf dem gleichen Wege gespült.

Unter physiologischer Lösung wird im Sinne der Erfindung jede physiologische Salzlösung, physiologische Pufferlösung oder ein Zellkulturmedium verstanden.

Die im folgenden beschriebene Ausführungsform der erfindungsgemäße Apheresevorrichtung ist nur beispielhaft zu verstehen und es sind verschiedene Modifikationen und 0 Abwandlungen dem fachmann aufgrund der detailierten Beschreibung möglich.

Die Abtrennvorrichtung zur Anreicherung und Abtrennung der Leukozytenfraktion aus dem Blut umfaßt eine Zentrifuge mit einem glockenförmigen Rotor wie zum Beispiel nach Art einer sogenannten Latham-Glocke. Die Latham-Glocke wird von der Firma Hemonetics hergestellt und ist in der Gebrauchsanweisung des Multikomp MCS3P beschrieben.

Die grundsätzliche Funktionsweise der Latham-Glocke wird im folgenden beschrieben. Die Latham-Glocke besteht aus einem rotierenden Teil und einem feststehenden Bereich mit Einlaßöffnung, Zulauf- und Ablaufkanal sowie der Auslaßöffnung. Der davon getrennte, rotierende Teil besteht aus der 5 Verarbeitungskammer und der Drehdichtung. Die Drehdichtung ist eine Abdichtung des sterilen Inneren der Glocke gegen die Umgebung und ist der einzige Punkt, wo der feststehende Teil

der Glocke Kontakt mit dem sich drehenden Teil hat.

Das aufzutrennende antikoagulierte Blut tritt durch die Einlaßöffnung in die Glocke ein und wird durch den Zulaufkanal zum Boden der Glocke geleitet. Hier wandert das Blut aufgrund der vorhandenen Zentrifugalkräfte in der sich drehenden Glocke in den äußeren Bereich der Glocke. Während dies geschieht, wird die in der Glocke vorhandene sterile Luft in einen Sammelbeutel abgeleitet. Das Blut wird weiter in die Glocke gepumpt, wo es weiter zentrifugiert wird. Die Blutkomponenten trennen sich entsprechend ihrer jeweiligen Dichte, wobei die schweren Erythrozyten in den Randschichten an der Glocke verbleiben. Der Erythrozytenschicht folgen radial innenwärts Schichten aus Leukozyten, Thrombozyten und Plasma.

Wenn die Glocke vollständig gefüllt ist, fließt das Plasma, welches die leichteste Blutkomponente ist, als erstes durch die Ablauföffnung aus der Glocke ab. Nach dem Plasma können im Anschluß grundsätzlich, wenn gewünscht, fließen dann die 0 Thrombozyten und Leukozyten aus der Glocke ab. Sofern weiter zentrifugiert wird, treten dann auch die Erythrozyten aus der Glocke aus.

Erfindungsgemäß wird jedoch eine Zentrifuge mit einem Durchflußrotor nach Art einer Latham-Glocke wie folgt verwendet. Bei der erfindungsgemäßen Ausführungsform werden unter Rotation des Rotors beispielweise 60-90 ml humanes Vollblut zentral, d.h. entlang der Rotationsachse bzw. durch die hohle Rotorachse, in den Rotor nach Art einer Latham-Glocke 0 eingebracht, wobei das Blut dem Durchmesser des Rotors entsprechend, mit z.B. 4800 UpM zentrifugiert wird.

Am oberen kleineren Umfang der Latham-Glocke wird nach der Auftrennung des Blutes in seine Bestandteile, d.h. in die 5 Erythrozytenfraktion, die Leukozyten- und Thrombozytenschicht (den Buffy-Coat), die die transformierten Zellen, falls vorhanden, enthält, und die Plasmafraktion, dann zunächst das

sich über dem Buffy-Coat (radial innenwärts) angesammelte Blutplasma über den Ablauf/Abführung aus. Durch ein hinter dem Ablauf befindliches Stellventil wird das abgetrennte Blutplasma aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung in einen Behälter für Flüssigabfall geleitet.

Durch einen im oberen Bereich der Latham-Glocke positionierten Optiksensor wird der an der äußeren Wandung innen im Rotor aufsteigende Buffy-Coat aufgrund seiner geringeren Lichttransmission detektiert. Über den Optiksensor wird die Einstellung des Stellventils reguliert. Das zuvor in Richtung des Behälters für Flüssigabfall offene Stellventil, über das das Blutplasma abgeführt wurde, wird, nachdem der Optiksensor den Buffy-Coat detektiert hat, so gestellt, daß die Abführung in den Behälter für Flüssigabfall geschlossen und die Abführung in Fließrichtung der zweiten Abtrennvorichtung geöffnet wird, so daß die sich in dem Buffy-Coat befindlichen Leukozyten und transformierten Zellen in die Abtrennvorrichtung gelangen.

Nachdem mittels des Optiksensors festgestellt wurde, daß die gesamte Menge des Buffy-Coats aus dem Rotor in die Abführleitung zur zweiten Trennvorrichtung geleitet wurde, wird das Stellventil so eingestellt, daß in die Leitung zur zweiten Trennvorrichtung Zellkulturmedium wie zum Beispiel RPMI 164 0, das gegebenenfalls mit fetalem Kälberserum ergänzt wurde, zugeführt und mit den Leukozyten sowie den transformierten Zellen vermischt wird. Die dadurch entstehende verdünnte Zellsuspension wird dann über eine Schlauchverbindung in die zweite Abtrennvorrichtung zur Abtrennung der transformierten Zellen aus der Leukozytenfraktion überführt. Bei der Zugabe des Zellkulturmediums werden in etwa die folgenden Zellzahldichten von 100 bis 1000 eingestellt.

Sobald die Erythrozytenfraktion von dem Optiksensor aufgrund ihrer, verglichen mit dem Buffy-Coat, noch geringeren Lichttransmission detektiert wird, wird das Stellventil wieder so gestellt, so daß die aus der Glocke austretenden

Erythrozyten, gegebenenfalls mit einer Spüllösung, in den Behälter für Flüssigabfall geleitet werden.

Die derart abgetrennten Leukozyten und transformierten Zellen werden in der zweiten Abtrennvorrichtung voneinander getrennt, wobei die zweite Abtrennvorrichtung ein Kapillarsystem oder Kapillarsieb und wobei auf der Innenseite der Kapillaren/Kapillarsiebes monoklonale anti-CD45 Antikörper immobilisiert wurden. Die anti-CD45 Antikörper stammen zum Beispiel aus der der Hybridoma-Zellinie H130 und sind bei der Firma Pharmingen, USA, erhältlich.

Die Abtrennung von CD4 5⁺ Zellen kann jedoch noch wirkungsvoller sein, wenn ein polyklonales anti-CD45 Serum, bzw. eine Mischung von monoklonalen Antikörpern auf der Innenseite der Kapilaren / des Kapillarsiebes immobilisiert wurden. Bei Verwendung eines polyklonalen anti-CD45 Serums oder einer Mischung aus monoklonalen anti-CD45 Antikörpern zur Beschichtung der Innenseite der Kapillaren werden bei dem nachfolgenden Abtrennungsschritt entsprechend mehrere bzw. viele verschiedene Epitope des CD45-Moleküls erkannt und dadurch die Abtrennungseffizienz deutlich verbessert.

Über spezifische Wechselwirkungen, die auf van-der-Waals-Kräften und ionischen Wechselwirkungen beruhen, werden dann die Zellen, die das Zeiloberflächenmolekül CD45 an der Zelloberfläche exprimieren, d.h. insbesondere die Leukozyten, von den anti-CD4 5 Antikörpern gebunden und dadurch in dem Kapillarsystem zurückgehalten. Die CD45" Tumorzellen werden 0 nicht von den Antikörpern gebunden und somit nicht in dem Kapillarsystem zurückgehalten. Die gesamte Apheresevorrichtung ist während des Abtrennvorgangs der Tumorzellen bevorzugt bei 37°C temperiert.

Über das Kapillarsystem erfolgt eine Anreicherung der Tumorzellen, bezogen auf die Leukozyten, von ca 80% Tumrozellen. Die aus dem Kappilarsystem austretenden mit dem

Zellkulturmedium austretenden Tumorzellen fallen durch eine säulenartige Verbindung in das Zellkultursystem.

Das Zellkultursystem besteht aus einer herkömmlichen Zellkulturplatte mit einer gewünschten Anzahl an Vertiefungen die mit herkömmlichem Zellkulturmedium, wie z.B. RPMI 1640 mit 10 % fetalem Kälberserum., befüllt sind. Aufgrund der Schwerkraft sinken die Zellen ab und werden auf herkömmlichen Zellkulturmaterialien, wie zum Beispiel in einer 96-well, 48-well, 24-well, 12-well oder 6-well Zellkulturplatte aus Polystyrol kultiviert. Bedingt durch das über die zweite Abtrennvorrichtung nachströmende Zellkulturmedium steht das Zellkulturmedium in einer Schicht über den Vertiefungen der Zellkulturplatte.

Nach Entnahme des über der Zellkulturplatte überschüssigen Mediums über eine in der säulenartigen Verbindung oberhalb der Zellkulturplatte angeordnetes Entnahmevorrichtung kann die Zellkulturplatte der Apparatur entnommen werden.

Anstelle einer einer Zellkulturplatte mit mehreren Vertiefungen kann auch eine Zellkulturplatte mit nur einer Vertiefung, nach Art einer Petrischale, genommen werden. Vor Entnahme der Petrischale wird dann das überschüssige Medium zum Beispiel über einen vorgesehenen Auslaß am Boden der Platte abgenommen. Anstelle eines vorgesehenen Auslasses kann das überschüssige Zellkulturmedium auch über eine eingestochene Kanüle entfernt werden. Vorteilhaft kann dadurch auch der Spiegel des Zellkulturmediums in der Zellkulturplatte abgsenkt werden, was insbesondere bei der Entnahme der Zellkulturplatte vorteilhaft ist.

Die in der Zellkulturplatte vorhandenen Tumorzellen, sofern vorhanden, werden dann in einem Inkubator unter herkömmlichen Zellkulturbedingungen (z.B.: 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit, 5% CO₂) weiter inkubiert.

Alternativ kann die Zellkulturplatte auch in der Apheresevorrichtung weiter unter optimalen Zellkulturbedingungen inkubiert werden, da die Zellkulturvorrichtung mit einem Befeuchter, einer Heizung in Form eines Peltierelementes und einer CO₂-Quelle versehen ist.

Die Tumorzellen können dann, nachdem sich die Tumorzellen durch Zellteilung vermehrt haben, der Zellkultur entnommen werden, indem der Boden der jeweiligen Vertiefung zum Beispiel mit einer Kanüle durchstochen wird, und die Tumorzellen abgesaugt werden.

Nachdem sich die Zellen mehrfach geteilt haben und somit ausreichende Zellzahlen zur Verfügung stehen, können die Tumorzellen, und damit der Primärtumor, über herkömmlich bekannte Verfahren wie zum Beispiel auf molekularbiologischer Ebene mittels PCR, auf zellbiologischer Ebene mittels Durchflußzytometrie oder auf proteinchemischer Ebene mittels SDS-PAGE und ELISA näher charakterisiert werden.

Die Apheresevorrichtung kann wie folgt wieder für den nächsten Routineablauf bereitgestellt werden:

Nachdem der Buffy-Coat aus der Glocke abgeleitet wurde, wird das vor der Glocke angeordnete zweite Stellventil so gestellt, daß aus dem Behälter mit Spülflüssigkeit die Spülflüssigkeit über die Zuleitung in die Glocke gelangt, die Restmenge an Blut verdrängt, welches dann über das erste Stellventil in den Behälter für Flüssigabfall geleitet wird. Danach wird die Glocke zunächst mit einem Sterilisierungsmittel, wie zum Beispiel 70 % Ethanol, und nachfolgend mit sterilem Puffer oder Zellkulturmedium gespült. Nach Reinigung der Latham-Glocke steht die Zentrifuge für einen neuen Einsatz bereit.

Das Kappilarsystem, mit dem die Leukozyten entfernt wurden, 5 wird der Apheresevorrichtung entnommen und verworfen. Die Schlauchverbindung zur zweiten Abtrennvorichtung kann entsprechend gespült und sterilisiert werden, wenn das erste

Mehrwegeventil auf Durchfluß in Richtung zweiter Abtrennvorrichtung geschaltet ist. Nach Einsatz eines neuen mit z.B mit anti-CD45 Antikörpern beschichteten Kapillarsystems kann dann eine erneute Isolierung von Tumorzellen aus dem Blut des gleichen oder eines weiteren Patienten durchgeführt werden.

Im folgenden wird anhand der beiliegenden einzigen schematischen Zeichnung eine Ausführungsform beispielhaft veranschaulicht:

Über die Einfüllöffnung (20) wird das Blut über das Mehrwegeventil (1) über die Leitung (21) entlang der Rotorachse in die Glocke (2) eingebracht. An der äußeren Wandung der rotierenden Glocke (2) (Antrieb nicht gezeigt) steigt das in seine Bestandteile aufgetrennte Blut empor. Über den Optiksensor (19) werden die aufgetrennten Fraktionen des Blutes detektiert. Der Optiksensor (19) gibt die gemessenen Transmissionen über Datenleitungen (nicht gezeigt) an eine Steuerungseinheit (nicht gezeigt) weiter, die die Stellung des Mehrwegeventils (4) und des Mehrwegeventils (1) regelt. Über die Leitung (3) wird das zuerst aus der Glocke austretende Plasma über das Mehrwegeventil (4) in den Behälter (5) für Flüssigabfall überführt. Sobald der Optiksensor (19) eine Transmissionsänderung an die Steuerungseinheit (nicht gezeigt) weiter gibt, wird das Mehrwegeventil (4) in Richtung des Kapillarbettes (8) geöffnet. Die im Anschluß an die Plasmafraktion aus der Glocke (2) austretende Leukozytenfraktion wird dann über die Leitung (3) und die Leitung (7) in Richtung des Kapillarbettes (8) geleitet. Über 0 das Regelungsventil (4) kann gegebenenfalls physiologischer Puffer aus dem Behälter (6) zugeführt werden, um die Leukozytenfraktion, gegebenenfallls in einer nicht gezeigten Mischkammer, zu verdünnen. Sobald der Optiksensor (19) die Erythrozytenschicht detektiert, wird das Mehrwegeventil (4) erneut in Richtung des Behälters (5) für Flüssigabfall geöffnet, so daß die aus der Glocke austretenden Erythrozyten in den Flüssigabfall geleitet werden. Nachdem die (verdünnte)

Leukozytenfraktion die Leitung (7) verlassen hat, wird die Leukozytenfraktion durch das Kapillarbett (8) geleitet. Im Anschluß an das Kapillarbett (8) gelangen, nach Abtrennung der von den Antikörpern gebundenen Leukozyten, die Tumorzellen durch das Verbindungsstück (9) in die Zellkulturvorrichtung

(22) mit der Zellkulturplatte (10). Die Zellkulturplatte (10) kann nach Lösen der Gewindeschrauben (12) der Zellkulturvorrichtung (22) entnommen werden. Das Kapillarbett (8), das Verbindungsstück (9) und die Zellkulturvorrichtung

(22) mit der Zellkulturplatte (10) werden über die Heizung (14) bei 37⁰C gehalten. Aus dem CO₂-Behälter (13) wird das CO₂ über die Leitung (18) in das verbindungsstück (9) geleitet. Die Entnahmevorrichtung (11) dient zur Entnahme von überschüssiger physiologischer Lösung. Über den Einstichkanal (17) können die Zellen mittels einer eingeführten Kanüle auch abgesaugt werden.

Zur Reinigung der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung wird, nachdem der Optiksensor (19) die Erythrozytenschicht detektiert hat, über die Steuerungsvorrichtung (nicht gezeigt) das Mehrwegeventil (1) so geschaltet, daß aus dem Behälter (15) eine Spüllösung durch die rotierende Glocke (2) über die Leitung (3) und das Mehrwegeventil (4) in den Behälter (5) für Flüssigabfall geleitet. Im Anschluß wird das Mehrwegeventil (1) so geschaltet, daß aus dem Behälter (16) Sterilisierungsmittel durch die Glocke (2) über die Leitung (3) und das Mehrwegeventil (4) in den Behälter (5) für Flüssigabfall überführt. Zum Schluß wird das Mehrwegeventil (1) so eingestellt, daß aus dem Behälter (6) sterile physiologische Pufferlösung durch die Glocke (2) über die Leitung (3) und das Mehrwegeventil (4) in den Behälter (5) für Flüssigabfall geführt.

Claims

Schutzansprüche

1. Eine tragbare Apheresevorrichtung zur Isolierung und Kultivierung von transformierten Zellen aus Blut, wobei die Apheresevorrichtung umfaßt:

eine erste Abtrennvorrichtung zur Anreicherung und Abtrennung der Leukozytenfraktion, die Leukozyten und transformierte Zellen umfaßt, aus dem Blut, und mit je einer Zuführ- und Entnahmeeinrichtung,
erste Überführungsmittel zur Überführung der Leukozytenfraktion aus der ersten Abtrennvorrichtung in eine zweite Abtrennvorrichtung,

die zweite Abtrennvorrichtung zur Trennung der

transformierten Zellen und der Leukozyten, mit je einei" Zuführ- und Entnahmeeinrichtung,

die Zellkulturvorrichtung mit einer Zuführ- und Entnahmeeinrichtung für transformirte Zellen, wobei die erste Abtrennvorichtung, die ersten Überführungsmittel, die zweite Abtrennvorrichtung, die zweiten Überführungsmittel und die Zellkulturvorrichtung in einer kontinuierlichen Downstreamanordnung miteinander hintereinander verbunden in einer tragbaren Einheit angeordnet sind.

2. Tragbare Apheresevorrichtung nach Anspruch 1, wobei die erste Abtrennvorrichtung eine kontinuierliche Zentrifuge mit einem Durchflußrotor umfaßt.

3. Tragbare Apheresevorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Zentrifuge eine Detektionsvorrichtung zur Messung der Fraktionen umfaßt.

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4. Tragbare Apheresevorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die ersten Überführungsmittel eine zwischen der ersten Abtrennvorrichtung und der zweiten

Abtrennvorrichtung angeordnete Verbindungsleitung umfassen.

5. Tragbare Apheresevorrichtung nach Anspruch 4, wobei eine Steuerungseinrichtung zur Stellungsregelung des Mehrwegeventils über die von der Detektionsvorrichtung empfangenen Signale und mindestens ein Mehrwegeventil mit je einer Verbindungsleitung zu einem Behälter zur Aufnahme aus der Vorrichtung abgeleiteter Flüssigkeit und einer Verbindungsleitung zu einem Vorratsbehälter für physiologische Lösungen und gegebenenfalls mindestens eine Mischkammer vorgesehen sind.

6. Tragbare Apheresevorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite Abtrennvorrichtung in Form eines Kapillarbettes oder einer Trennsäule ausgebildet ist.

7. Tragbare Apheresevorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite Abtrennvorrichtung ein Adhäsionssystem für Leukozyten umfaßt.

8. Tragbare Apheresevorrichtung nach Anspruch 7, wobei das Adhäsionssystem für Leukozyten immobilisierte Moleküle mit einer Affinität für Zelloberflächenstrukturen der Leukozyten umfaßt.

9. Tragbare Apheresevorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite Abtrennvorrichtung als der tragbaren Aphereseeinheit entnehmbare Einheit ausgebildet ist.

10. Tragbare Apheresevorrichtung nach einem der vorstehenden

0 Ansprüche, wobei die zweiten Überführungsmittel eine zwischen der zweiten Abtrennvorrichtung und der Zellkulturvorrichtung angeordnete Verbindungsleitung umfassen.

11. Tragbare Apheresevorrichtung nach Anspruch, wobei in der

5 Verbindungsleitung zwischen der zweiten Abtrennvorrichtung und der Zellkulturvorrichtung oder in der Zellkulturvorichtung eine Entnahmevorrichtung zur sterilen Entnahme der physiologischen

Lösung vorgesehen ist.

12. Tragbare Apheresevorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zellkulturvorrichtung eine entnehmbare Zellkulturplatte umfaßt.

13. Tragbare Apheresevorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zellkulturvorrichtung mit einer Heizung, einem Befeuchter und/oder einer CO₂-Quelle versehen ist.

14. Tragbare Apheresevorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei vor der ersten Abtrennvorrichtung ein zweites Mehrwegeventil angeordnet ist.

15. Tragbare Apheresevorrichtung nach Anspruch, wobei das zweite Mehrwegeventil wenigstens mit je einer Zuführung für Blut, Spüllösung aus einem Vorratsbehälter und physiologischer Lösung aus weiteren Vorratsbehälter verbunden ist.