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DE29622239U1 - Spezifische Adsorptionsmatrix - Google Patents

Spezifische Adsorptionsmatrix

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Publication number
DE29622239U1
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Authority
DE
Germany
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antibodies
complement
adsorption matrix
activate
bound
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
DE29622239U
Other languages
English (en)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AFFINA IMMUNTECHNIK GmbH
Original Assignee
AFFINA IMMUNTECHNIK GmbH
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Publication date
Application filed by AFFINA IMMUNTECHNIK GmbH filed Critical AFFINA IMMUNTECHNIK GmbH
Priority to DE29622239U priority Critical patent/DE29622239U1/de
Publication of DE29622239U1 publication Critical patent/DE29622239U1/de
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Description

Spezifische Adsorptionsmatrix
Die Neuerung betrifft eine spezifische Adsorptionsmatrix zur Entfernung von unerwünschten Materialien aus biologischen Flüssigkeiten ohne gleichzeitige Komplementaktivierung.
Die üblicherweise in apharetischen Verfahren eingesetzten Matrizes zur Entfernung oder Gewinnung von Immunglobulinen aus Körperflüssigkeiten zu therapeutischen Zwecken bestehen aus unterschiedlichen Trägermaterialen mit kovalent oder adsorptiv fixierten bakteriellen Proteinen, &zgr;. B. Protein A oder Antikörpern, welche gegen die zu entfernenden Materialien gerichtet sind, z.B. Immunglobuline, autoreaktive Antikörper oder Lipoproteine.
Diese Matrizes haben jedoch den Nachteil, daß das Komplementsystem, es besteht aus einer Vielzahl von Proteinen die in den Körperflüssigkeiten enthalten sind, über die Bindung des Komplementproteins Cl aktiviert wird und dadurch weitere aktivierte Komplementfaktoren freigesetzt werden. Die aktivierende Bindung des Komplementproteins erfolgt im Falle der Verwendung der Matrizes des Standes der Technik mit gekoppelten Antikörpern direkt über diese verwendeten Antikörper und gleichzeitig auch über die gebundenen Immunglobuline. Im Falle der Verwendung von bakteriellen Proteinen erfolgt die aktivierende Bindung über die gebundenen Immunglobuline.
Die bekannten Matrizes werden in speziellen Apparaturen mit einem geschlossenen Kreislauf eingesetzt, in denen die entnommene Körperflüssigkeit, meistens Blut der Spender oder Patienten, behandelt und anschließend sofort in den Körper zurückgegeben wird. Enstehen im Laufe einer solchen Behandlung aktivierte Komplementfaktoren, können diese im Körper des Spenders oder Patienten Nebenwirkungen, z. B. inflammatorische Prozesse oder anaphylaktische Reaktionen auslösen. (Ikonomov V, Samtleben W, Schmidt B, Blumenstein M and Gurland HJ, Adsorption profile of commercially available adsorbents: an in vitro evaluation, Int.J.Artif.Organs 1992, 15(5): 312-9; Schröder JO, .Euler HH, Plasmapherese bei Au-
toimmunerkrankungen, Die gelben Hefte 1995, 35: 137-45; AIarabi AA, Nilsson B, Nilsson U, Wikstrom B, Danielson BG, Complement activation during tryptophan immunadsorption treatment Artif.Organs. 1993, 17(9): 782-6; Langone JJ, Das C, Bennett D, Terman DS, Generation of human C3a, C4a, and C5a anaphylatoxins by protein A of Staphylococcus aureus and immobilized protein A reagents used in serotherapy of cancer, J.Immunol. 1984, 133(2): 1057-63; Owen HG, Brecher ME, Atypical reactions associated with use of angiotensin-converting enzyme inhibitors and apharesis, Transfusion 1994, 34(10): 891-4; Richter WO, Jacob BG, Ritter MM, Sühler K, Vierneisel K, Schwandt P, Three-year treatment of familial heterozygous hypercholesterolemia by extracorporeal low-density lipoprotein immunoadsorption with polyclonal Apolipoprotein B antibodies, Metabolism 1993, 42(7): 882-94).
Es sind deshalb Adsorptionsmatrizes zur Entfernung von unerwünschten Materialien, wie z.B. einem Toxin oder low-densitylipoprotein (LDL), aus Körperflüssigkeiten notwendig, die diese Nebenwirkungen vermeiden und nur gering komplementaktivierend sind.
Dieses Problem wird mit einer Adsorptionsmatrix mit den in den Schutzansprüchen aufgeführten Merkmalen gelöst.
Es wird eine neue Adsoptionsmatrix bereitgestellt, die aus einem organischen oder synthetischen Trägermaterial mit daran kovalent oder adsorptiv gebundenen Antikörpern besteht. Diese Antikörper aktivieren entweder durch chemische oder enzymatisehe Vorbehandlung oder in der jeweils angewandten Spezies kein Komplement und besitzen gegebenenfalls gleichzeitig die Eigenschaft, die zu bindenden Immunglobuline über den Fc-Molekülteil zu binden, welcher die Bindungsstelle für das Komplement beinhaltet.
Die Trägermaterialien liegen z.B. als Folien, Membranen in unterschiedlicher Faltung, als Hohlfasern oder als Partikel unterschiedlicher Größe und Porengröße vor. Vorzugsweise sind
sie aus organischen oder synthetischen Polymeren. Bevorzugt werden Silikate, Kohlenhydrate (Agarose, Sepharosen, Zellulosen), Polyacrylat, Polymethacrylat, Polyamid, Polystyrol oder Polystyrol-Co-Pfropf-Polymere (mit Polyethylenglykol als Pfropf-Polymer) eingesetzt. Es kommen auch Derivate dieser Matrizes mit Spacer-Molekülen, die reaktive Gruppen enthalten, zur Anwendung.
Gemäß der Neuerung eingesetzte Antikörper sind
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a) Antikörper oder Antikörperfragmente, die in der Spezies in der sie verwendet werden, kein Komplement aktivieren, so z.B. aus Vögeln, die kein Komplement von Mammaliern aktivieren, vorzugsweise vom Huhn,
b) Fragmente von Antikörpern, die durch Digestion der Antikörper mit Enzymen erhalten werden, so z.B. F(ab')2-Fragmente und F(ab')-Fragmente oder
c) Antikörper, welche durch eine chemische oder enzymatische Vorbehandlung kein Komplement aktivieren. Solche Antikörper sind an sich bekannt (DE-Al-34 30 320).
Die Antikörper werden allein oder in Kombination mit anderen Antikörpern, wie z.'B. auch mit Antikörpern gegen LDL oder anderen Lipoproteinen, Proteinen, Toxinen, Pathogenen sowie Fragmenten oder Derivaten derselben eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante sind die Antikörper über Spacer und Linker, wie z.B, mit Bromcyan, Carbodiimidazol oder Glutaraldehyd an das Trägermaterial gekoppelt,
Mit der Neuerung wird erreicht, daß bei der Entfernung von Immunglobulinen die Koraplementaktivierung unterbleibt. Die Komplikationen, welche bei der Verwendung der zur Zeit üblichen Matrizes auftreten können, werden vermieden. Bevorzugt wird die neue Matrix für die therapeutische Apharese oder zur
• ·«
Gewinnung von therapeutisch nutzbaren Immunglobulinen mittels apharetischer Methoden eingesetzt.
Die Neuerung wird anschließend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert.
Ausführungsbeispiel
Antikörper F(ab')2-Fragmente von Ziegen-Antikörpern, die gegen das ganze Immunglobulin gerichtet sind bzw. nur gegen den Molekülteil, der die Komplementbindungsstelle enthält, wurden an Polystyrol als ein durchsichtiges Trägermaterial in Form einer Mikrotiterplatte zum photometrischen Nachweis des gebundenen Immunglobuiins bzw. des gebundenen Komplementfaktors CIq gebunden.
Nach 3-maligem Spülen der Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit phospatgepufferter, isotoner Kochsalzlösung nach Dulbec1-co, enthaltend 0.05 % Tween 20, wurden in jede Vertiefung 100 &mgr;1 einer Immunglobulinlösung mit unterschiedlichen Immunglobulxnkonzentrationen gegeben, beispielhaft wurde das stark komplementbindende IgG3 des Menschen verwendet. Nach Inkubation der Mikrotiterplatte für 60 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Platte 3 mal mit phosphatgepufferter, isotoner . Kochsalzlösung nach Dulbecco, enthaltend 0*05 % Tween 20, gespült.
Der Nachweis des gebundenen Immunglobuiins erfolgte mittels eines gegen humanes Immunglobulin gerichteten Antiserums, welches mit dem Enzym alkalische Phosphatase konjugiert ist. Der Nachweis des gebundenen Komplementfaktor CIq, erfolgte nach vorheriger Inkubation mit CIq für 1 Stunde bei Raumtemperatur, mittels eines gegen CIq gerichteten Antiserums, welches mit dem Enzym alkalische Phosphatase konjugiert ist. Für die photometrische Messung wurden in jede Vertiefung 100&mgr;1 eines 1 molaren Diethanolaminpuffers pH 9.8, enthaltend 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat, gegeben, und die Substratreakti-
on wurde nach 20 Minuten durch Zugabe einer Stopplösung (IM NaOH) beendet. Die Menge des umgesetzten Substrates korreliert mit -der Menge des detektierbaren Immunglobulins bzw. des Komplementfaktors CIq. Die photometrische Messung erfolgte bei 405 nm. Die Quantifizierung der gebundenen Menge Komplementfaktors CIq erfolgte mittels einer mitgeführten Eichkurve .
Fig. 1 zeigt die Immunglobulin- bzw. der Komplementfaktor Clq-Bindung der neuen Adsorptionsmatrix.
Fig. la stellt ein System mit Antikörpern gegen das ganze Immunglobulin mit einer handelsüblichen Adsorptionsmatrix dar.
Fig. Ib zeigt die neue Adsorptionsmatrix mit Antikörpern gegen den Fc-Teil.
Es wäre zu erwarten gewesen, daß ein vergleichbarer Wert der CIq- Bindung an das Immunglobulin G3, dieses ist etwas größer als Immunglobulin Gl, der bei 2500 jug/ml unter Verwendung von gegen Gesamtmolekül gerichteten Antikörpern erreicht werden würde, dem des Wertes von 833,33 #g/ml im System mit gegen den Fc-Teil gerichteten Antikörpern entspricht.
Überraschend war der beobachtete Effekt wesentlich stärker. Die Clq-Bindungsfähigkeit im System mit gegen den Fc-Teil gerichteten Antikörpern bei 2500 Mg/ml entsprach der Bindung von annähernd 50 &mgr;g/ml im System mit Gesamtmolekül gerichteten Antikörpern.

Claims (4)

Schutzansprüche
1. Ädsorptionsmatrix für apharetische verfahren zur Entfernung von unerwünschten Materialien aus biologischen Fiüssigkeiten ohne gleichzeitige Komplementaktivierung
gekennzeichnet durch
Trägermateriaiien aus organischen oder synthetischen Polymeren mit kovalent oder adsorptiv gebundenen Antikörpern, die entweder durch chemische oder enzymatisch^ Vorbehandlung oder in der verwendeten Spezies kein Komplement aktivieren und die gegebenenfalls gleichzeitig die Eigenschaft besitzen s. die zu bindenden Immunglobuiine über den Fc-Moleküiteil zu binden, weicher die Bindungsstelle für das Komplement beinhaltet.
2. Adsorptionsmatrix gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Antikörper
a) aviäre Antikörper sind,, die kein Komplement von Mammaliern aktivieren,
b) Fragmente von Antikörpern sind, die kein Komplement aktivieren oder
c) Antikörper oder deren Fragmente, die durch eine chemische oder enzymatische Behandlung kein Komplement aktivieren.
3. Adsorptionsmatrix gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet., daß
die Antikörper über Spacer oder Linker an das Trägermaterial fixiert sind.
4. Adsorptionsmatrix gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Antikörper mit anderen Antikörpern kombiniert sind.
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DE29622239U 1996-12-13 1996-12-13 Spezifische Adsorptionsmatrix Expired - Lifetime DE29622239U1 (de)

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