DE29606313U1 - Cell layers and transport system for cell layers - Google Patents
Cell layers and transport system for cell layersInfo
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Description
Die Erfindung betrifft gezüchtete Zellschichten und Amnionpräparate sowie ein Transportsystem für Zellschichten und Amnionpräparate, wie Haut-Transplantationsgewebe, die unter definierten Bedingungen vom Gewinnungs- zum Einsatzort gelangen müssen.The invention relates to cultured cell layers and amniotic preparations as well as a transport system for cell layers and amniotic preparations, such as skin transplant tissue, which must be transported from the place of collection to the place of use under defined conditions.
Seitdem Bell und Mitarbeiter partiell in vitro rekonstruierte Gewebe der Lederhaut gewonnen
hatten (Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 76 (1979) 1274), sind die Verfahren zur Gewinnung von
Hautgewebe ständig weiterentwickelt worden. Zuerst hatten Green und Mitarbeiter auch die
Züchtung von Keratinocyten über einen längeren Zeitraum beschrieben (Green, H. et al., Proc.
Natl. Acad.Sei. 76 (1979) 5665): Die Epidermisschicht entwickelte sich unter Bildung eines drei
bis fünf Zellschichten dicken Gewebes sehr schnell. Diese Gewebe, bei Patienten transplantiert,
differenzierten sich in situ weiter. Patienten mit schweren Verbrennungen konnten mit diesem
Verfahren gerettet werden (G. Gallico et al., New England J. Med., 311 (1984) 448). Mit dem
Green-Verfahren (US-(PS - Patentschrift) 4456687) kann aus einer Biopsie von 2 cm^ innerhalb
von drei bis vier Wochen bis zu einem Quadratmeter Epidermis gewonnen werden.
Embryonalhüllen, auch Eihäute, Fruchthüllen oder Keimhüllen genannt, stellen vom tierischen
und menschlichen Embryo stammende Zellverbände dar, die den Körper umhüllen. Sie reißen
vor der oder bei der Geburt auf. Die Amnionhüllen bestehen aus der inneren (Amnion) und aus
der äußeren (Chorion) Hülle. Die Amnionhöhle ist mit Fruchtwasser zum weitgehenden Schutz
des Embryos gefüllt (Lexikon der Biologie, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg - Berlin Oxford,
1994).Since Bell and colleagues obtained partially reconstructed dermal tissue in vitro (Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 76 (1979) 1274), the methods for obtaining skin tissue have been continuously developed. Green and colleagues were the first to describe the cultivation of keratinocytes over a longer period of time (Green, H. et al., Proc. Natl. Acad.Sei. 76 (1979) 5665): the epidermal layer developed very quickly, forming a tissue three to five cell layers thick. These tissues, transplanted into patients, differentiated further in situ. Patients with severe burns could be saved with this method (G. Gallico et al., New England J. Med., 311 (1984) 448). Using the Green method (US Patent No. 4,456,687), up to one square meter of epidermis can be obtained from a 2 cm^ biopsy within three to four weeks.
Embryonic membranes, also called fetal membranes, amniotic membranes or germinal membranes, are groups of cells from animal and human embryos that surround the body. They rupture before or during birth. The amniotic membranes consist of the inner (amnion) and the outer (chorion) membrane. The amniotic cavity is filled with amniotic fluid to protect the embryo as much as possible (Lexikon der Biologie, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg - Berlin Oxford, 1994).
Amnien werden seit vielen Jahren als Wundabdeckungsmaterialien eingesetzt, insbesondere als
zeitweiliger Hautersatz bei Verbrennungswunden, insbesondere Human-Amnion-Membranen
(z.B. Kucan, J.O. et al., Ann.-Plast-Surg. 1982, 8 (6): 523-527; Lin, SiD. et al., Bums-lncl-Therm-Inj.
1985, 11 (5): 374-378; Gobel, P. et al., Beitr-Orthop-Traumatol. 1990, 37 (9): 495-498), aber
auch in der allgemeinen Chirugie, z.B. als Wundverband bei chronischen Ulzerationen (Shun, A.
et al., Med-J-Aust. 1983, 2 (6): 279-283), in der Orthopädie zur Vermeidung von Infektionen
(Vishwakarma, G.K. et al., J-Bone-Joint-Surg-Br. 1986, 68 (1): 68-74) oder in der rekonstruktiven
Chirugie (Lawson,V.G., Aust-N-Z-Y-Surg. 1986, 56 (2): 163-166; Zohar, Y. et al., Laryngoscope,
1987, 97 (8 Pt 1): 978-980; Fishman, I.J.etal., J-Urol.1987, 138 (5): 1291-4).
Die Verwendung der menschlichen Plazenta als Ausgangsprodukt für die Gewinnung von
Implantaten für die Gefäß- und Hautchirurgie ist Gegenstand der DE-OS (Deutsche Offenlegungsschrift) 3608329 (Bunge, J., 1987). Darin wird auch das Amnion als geeignetes
Hauttransplantat zum Decken von großflächigen Verbrennungen beschrieben (vgl. auch DE-OS
3240909, Fauck, W.P., 1983). Amnion-Membranen sind auch als Substratgewebe zur
Bewertung des Wachstums von Zellen sowie als Wachstumssubstrat für Zeilkulturen beschrieben worden (US-PS (Patentschrift) 4446234, Russo, R. et al. 1984) beschrieben
worden.Amniotic membranes have been used for many years as wound covering materials, especially as temporary skin replacement for burn wounds, especially human amniotic membranes (e.g. Kucan, JO et al., Ann.-Plast-Surg. 1982, 8 (6): 523-527; Lin, SiD. et al., Bums-lncl-Therm-Inj. 1985, 11 (5): 374-378; Gobel, P. et al., Beitr-Orthop-Traumatol. 1990, 37 (9): 495-498), but also in general surgery, e.g. as wound dressing for chronic ulcerations (Shun, A. et al., Med-J-Aust. 1983, 2 (6): 279-283), in orthopedics to prevent infections (Vishwakarma, GK et al., J-Bone-Joint-Surg-Br. 1986, 68 (1): 68-74) or in reconstructive surgery (Lawson,VG, Aust-NZY-Surg. 1986, 56 (2): 163-166; Zohar, Y. et al., Laryngoscope, 1987, 97 (8 Pt 1): 978-980; Fishman, IJetal., J-Urol.1987, 138 (5): 1291-4).
The use of the human placenta as a starting product for the production of implants for vascular and skin surgery is the subject of DE-OS (German laid-open specification) 3608329 (Bunge, J., 1987). This also describes the amnion as a suitable skin transplant for covering large-area burns (see also DE-OS 3240909, Fauck, WP, 1983). Amniotic membranes have also been described as a substrate tissue for evaluating cell growth and as a growth substrate for cell cultures (US-PS (patent specification) 4446234, Russo, R. et al. 1984).
Es ist ferner bekannt, daß eine bevorzugte Methode zur Aufbewahrung von Hauttransplantaten,
z.B. in der Europäischen Haut-Bank, darin besteht, Spender-Haut in Glycerol zu konservieren
(de Backere, A.C.J. : "EURO Skin Bank: large scale skin-banking in Europe based on glycerolpreservation
of doner skin", Burns 1994 20 (1) 4-9; Hettich R. et al. : "The immunogenicity of
glycerol-preserved doner skin", Burn 1994, 20_(1) 71-76. Kürzlich ist auch ein neues Protein,
Kalinin genannt, bekanntgeworden, das die Adhäsion transplantierter Keratinozyten auf eine
Substratunterlage, u.a. auch Amnion, verbessern soll (US-PS 5352668, Burgeson, R.E., 1994).
Die Herstellung des Gewebes und sein Transport zum Einsatzort ist mit einer Reihe technischer
Probleme verbunden. Einen besonderen Raum nehmen dabei die Trägermaterialien ein, die
einen Transport des Gewebes und die Transplantation auf den Patienten ermöglichen müssen.It is also known that a preferred method for storing skin transplants, e.g. in the European Skin Bank, is to preserve donor skin in glycerol (de Backere, ACJ: "EURO Skin Bank: large scale skin-banking in Europe based on glycerolpreservation of donor skin", Burns 1994 20 (1) 4-9; Hettich R. et al.: "The immunogenicity of glycerol-preserved donor skin", Burn 1994, 20_(1) 71-76). Recently, a new protein called kalinin has also been discovered which is said to improve the adhesion of transplanted keratinocytes to a substrate, including amnion (US-PS 5352668, Burgeson, RE, 1994).
The production of the tissue and its transport to the site of use is associated with a number of technical problems. A special role is played by the carrier materials, which must enable the tissue to be transported and transplanted onto the patient.
Deshalb sind vielfältige Trägermaterialien vorgeschlagen worden, auf biologischer und auf synthetischer Grundlage. Gemäß DD 297678 wird ein biologisches Trägermaterial beschrieben, das aus Mischtransplantaten von Plasmaproteinkonzentrat und Caiciumthrombin besteht. Andere Vorschläge bestehen in der Verwendung von Bindegewebszellen (DE 3829183), Mischtransplanten aus Eigenhaut und Leichenhaut (DE 35392709), Kadaver-Allotransplantaten, Xeno-Transpiantaten von Schweinehaut, künstlicher Haut, Koiiagenen oder Kunststoffen, wie thermoplastischen Copolyestem (DE 2651685 ,3716907, 3711699, 4127570; WO 92/06179, 91/16010; US 5282859, 5147401, 4888291, 4883487, 4642118).Therefore, a variety of carrier materials have been proposed, both biological and synthetic. According to DD 297678, a biological carrier material is described that consists of mixed transplants of plasma protein concentrate and calcium thrombin. Other proposals include the use of connective tissue cells (DE 3829183), mixed transplants of autologous skin and cadaver skin (DE 35392709), cadaver allotransplants, xenotransplants of pig skin, artificial skin, collagens or plastics such as thermoplastic copolyesters (DE 2651685, 3716907, 3711699, 4127570; WO 92/06179, 91/16010; US 5282859, 5147401, 4888291, 4883487, 4642118).
Der Lebend-Lagerfähigkeit und der Aufrechterhaltung der koloniebildenden Effektivität von Epithelzellschichten widmet sich die EP 507849 (US 5100676, WO 91/11100, DE 69100748). Darin wird die Aufbewahrung der Zellschicht (z.B. Keratinocyten) in einem physiologisch verträglichen Medium, das Aufbringen der kohäsiven Schicht auf ein nicht anhaftendes Substrat, die Verpackung als Verband für Hautwunden und die Aufbewahrung als Kühlpackung für einen Zeitraum bis zu 26 Stunden beschrieben.EP 507849 (US 5100676, WO 91/11100, DE 69100748) is dedicated to the viable storage capacity and maintenance of the colony-forming effectiveness of epithelial cell layers. It describes the storage of the cell layer (e.g. keratinocytes) in a physiologically compatible medium, the application of the cohesive layer to a non-adherent substrate, packaging as a dressing for skin wounds and storage as a cold pack for a period of up to 26 hours.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Zellschichten und ein Transportsystem für Zellschichten zu entwickeln. Eine weitere Aufgabe besteht darin, Amnionpräparate zur Verfügung zu stellen, die sich in einem gebrauchsfähigen Zustand zur Vorratshaltung eignen. Die Aufgaben wurden dadurch gelöst, daß biologische und / oder nichtbiologische Trägermaterialien als nicht anhaftende Substrate zur Bildung von Zellschichten eingesetzt werden, insbesondere neue kollagenhaltige oder gelartige Träger sowie Amnion oder azelluläre Dermis. Auf diese Träger werden die zur Schichtbildung vorgesehenen Zellen gebracht und in einem Nährmedium gezüchtet. Als Zelltypen finden erfindungsgemäß humane Epithelzellen (Keratinozyten), Knorpelzellen (Chondrozyten), Fibroblasten oder Endothelzellen Anwendung. Geeignete Nährmedien sind vor allem solche Kulturlösungen, die Aminosäuren, Fettsäuren, Puffersalze, Spurenelemente und Vitamine enthalten, ebenso bekannte Nährmedien, wie MEM oder Ham F 12, aber auch das Zellkulturmedium MCDB 153.The invention is based on the task of developing new cell layers and a transport system for cell layers. A further task is to provide amniotic preparations that are suitable for storage in a usable state. The tasks were solved by using biological and/or non-biological carrier materials as non-adherent substrates for the formation of cell layers, in particular new collagen-containing or gel-like carriers as well as amniotic or acellular dermis. The cells intended for layer formation are placed on these carriers and grown in a nutrient medium. According to the invention, human epithelial cells (keratinocytes), cartilage cells (chondrocytes), fibroblasts or endothelial cells are used as cell types. Suitable nutrient media are above all those culture solutions that contain amino acids, fatty acids, buffer salts, trace elements and vitamins, as well as well-known nutrient media such as MEM or Ham F 12, but also the cell culture medium MCDB 153.
Im Fall der Amnionpräparate wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß Embryonalhülien von der
Plazenta abgetrennt, von anhaftenden Bestandteilen befreit, in feuchtem Zustand das Chorion
abgestreift und die verbleibenden Amnien in konservierenden Lösungen aufbewahrt werden. Es
finden insbesondere Embryonalhüllen nach Spontangeburten Verwendung. Humane Amnionpräparate setzen Spenderinnen voraus, die ihre Zustimmung zu einer Befragung über
mögliche Ausschlußkriterien und zu infektionsserologischen Untersuchungen erteilt haben. In
diesem Fall werden die Embryonalhüllen tiefgefroren und bis zur Freigabe durch negative
infektionsserologische Befunde zwischengelagert. Das Abstreifen des Chorions erfolgt auf einer
desinfizierbaren festen Unterlage. Nach der Sterilisierung der zugeschnittenen Amnien werden
die Präparate in konservierenden Agenzien unter Kühlung oder nach Gefriertrocknung
aufbewahrt. Es hat sich herausgestellt, daß die erfindungsgemäßen Amnionpräparate gute
hautverträgliche Eigenschaften zeigen und als Trägermaterial für Zelitypen, die im Laufe des
Zellwachstums mehrschichtige Lagen bilden, wie Keratinozyten, geeignet sind.
Die Aufgabe, ein Transportsystem für Zellschichten zu entwickeln, wurde durch einen
Transportbehälter gelöst, der aus einer bruchsicheren Außenverkleidung und einem Innenraum
besteht, der lose Zwischenböden zur Lagerung der einzelnen, mit Nährmedium gefüllten und die
Zellschichten enthaltenden Transportgefäße - wobei die Zwischenböden durch Stempel fixiert
werden - und Heizquellen zur Temperaturregelung sowie eine steuerbare CO2-Zufuhr enthält.
Die Außenverkleidung besteht vorzugsweise aus rostfreiem Stahlblech oder aus Edelmetall, die
Isolierung des Behälters aus Kunststoff, vorzugsweise aus Polystyrol. Als Heizquellen werden
Batterien bzw. aufladbare Akkumulatoren eingesetzt. Dieses Transportsystem, eine Kombination
aus bekannten und aus neuen Teilen, eignet sich für bekannte wie für die erfindungsgemäßen
Zellschichten, die aus einer Substrat-Zellschicht-Einheit bestehen, wobei als Substrat neue
kollagenhaltige oder gelartige Träger sowie Amnion oder azelluläre Dermis und als zur
Schichtbildung vorgesehene Zelltypen Epithelzellen (Keratinozyten), Knorpelzellen
(Chondrozyten), Fibroblasten, Endothelzellen oder tierische Zellen Anwendung finden. Es hatIn the case of amniotic preparations, the task was solved by separating embryonic membranes from the placenta, removing any adhering components, stripping the chorion while still moist, and storing the remaining amniotic membranes in preservative solutions. Embryonic membranes after spontaneous births are particularly used. Human amniotic membranes require donors who have given their consent to be questioned about possible exclusion criteria and to infection serological tests. In this case, the embryonic membranes are deep-frozen and stored until they are released based on negative infection serological results. The chorion is stripped off on a disinfectable, solid base. After the cut amniotic membranes have been sterilized, the preparations are stored in preservative agents under refrigeration or after freeze-drying. It has been found that the amniotic preparations according to the invention exhibit good skin-compatible properties and are suitable as carrier material for cell types which form multilayers during cell growth, such as keratinocytes.
The task of developing a transport system for cell layers was solved by a transport container that consists of a shatter-proof outer lining and an interior that contains loose intermediate floors for storing the individual transport vessels filled with nutrient medium and containing the cell layers - the intermediate floors being fixed by stamps - and heating sources for temperature control as well as a controllable CO2 supply. The outer lining is preferably made of stainless steel sheet or precious metal, the insulation of the container is made of plastic, preferably polystyrene. Batteries or rechargeable accumulators are used as heating sources. This transport system, a combination of known and new parts, is suitable for known and for the cell layers according to the invention, which consist of a substrate-cell layer unit, with new collagen-containing or gel-like carriers as well as amnion or acellular dermis being used as the substrate and epithelial cells (keratinocytes), cartilage cells (chondrocytes), fibroblasts, endothelial cells or animal cells being used as the cell types intended for layer formation. It has
sich überraschenderweise herausgestellt, daß die mit dem erfindungsgemäßen Transportsystem möglichen Transportbedingungen ein Anwachsen der Zellschichten und die Koloniebiidung der Zellen auf der Wunde in vivo nicht beeintächtigen. Sie ermöglichen lange Transportzeiten und das Einhalten der gewünschten Innentemperatur von 5 bis 40 ° C und für z.B. Epithelzellen aus Keratinozyten von 20 bis 37°C. Das Transportsystem ist zum Transport biologischer Materialien, die lebende Zellen enthalten, geeignet - z.B. patienteneigenen Materials für autologe, von Fremdmaterialien für ailogene Transplantationen wie auch xenogener Materialien.Surprisingly, it has been found that the transport conditions possible with the transport system according to the invention do not affect the growth of the cell layers and the colony formation of the cells on the wound in vivo. They enable long transport times and the maintenance of the desired internal temperature of 5 to 40 °C and, for example, for epithelial cells from keratinocytes, 20 to 37 °C. The transport system is suitable for the transport of biological materials that contain living cells - e.g. the patient's own material for autologous, foreign materials for allogeneic transplants as well as xenogeneic materials.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail using exemplary embodiments.
Beispiel 1: ZellschichtenExample 1: Cell layers
Auf einer Substratschicht in einem Nährmedium wird unter üblichen Bedingungen ein die spätere Zellschicht bildender Zelltyp kultiviert und durch Vermehrung zur Substrat-Zellschicht gebracht. Durch die Kultivierung verschiedener Zelltypen auf einer Substratschicht werden in definierten Nährmedien durch Stimulation der Zellproliferation klinisch und diagnostisch anwendbare und transportable, vitale, geschlossene Zellverbände hergestellt.A cell type that will later form the cell layer is cultivated on a substrate layer in a nutrient medium under normal conditions and brought to the substrate cell layer by proliferation. By cultivating different cell types on a substrate layer in defined nutrient media, vital, closed cell associations that can be used clinically and diagnostically and are transportable are produced by stimulating cell proliferation.
Gem. Beispiel 1 werden auf kollagenbeschichteten Membranen in der Zellkultur unter wachstumsstimulierenden Bedingungen Keratinozyten zu Keratinozyten-Zeüschichten gezüchtet.According to Example 1, keratinocytes are grown on collagen-coated membranes in cell culture under growth-stimulating conditions to form keratinocyte cell layers.
Beispiel 1.2:Example 1.2:
Gem. Beispiel 1 und 1.1 wird aus azellulärer Dermis als Substrat und Keratinozyten ein Dermis-Keratinozyten-Präparat gebildet.According to examples 1 and 1.1, a dermis-keratinocyte preparation is formed from acellular dermis as a substrate and keratinocytes.
Beispiele 1.3 ff.Examples 1.3 ff.
gem. Beispiel 1 bis 1.2 werden gebildet:According to examples 1 to 1.2 the following are formed:
eine kollagenbeschichtete Trägermembran-Chondrozyten-Zelischicht, kollagenbeschichtete Membran-Fibroblasten-Zeilschicht, kollagenbeschichtete-Endothel-Zellschicht, Azellulärdermis-Chondrozyten-Zellschicht, Azellulärdermis-Fibrobasten-Zellschicht, Azeiluiärdermis-Endothel-Zellschicht sowie Gel-Zellschichten: Gel-Keratinozyten-Zellschicht, Gel-Chondrozyten-Zellschicht, Gel-Fibroblasten-Zellschicht oder Gel-Endothel-Zelischicht.a collagen-coated carrier membrane chondrocyte cell layer, collagen-coated membrane fibroblast cell layer, collagen-coated endothelial cell layer, acellular dermis chondrocyte cell layer, acellular dermis fibroblast cell layer, acellular dermis endothelial cell layer and gel cell layers: gel keratinocyte cell layer, gel chondrocyte cell layer, gel fibroblast cell layer or gel endothelial cell layer.
Beispiel 2.1: Allgemeine VorschriftExample 2.1: General rule
Die Anlieferung der Embryonalhüllen erfolgt in gefrorenem bzw. gekühltem Zustand mit der Serumprobe in Beuteln oder anderen Behältern. Dabei beträgt die Aufbewahrungstemperatur bis zur Verarbeitung +4°C bis -8O0C. Zur Verarbeitung wird das Material in einem geeigneten Gefäß in kaltem bis handwarmem Wasser aufgetaut. Nach dem Auftauen wird ein Wasserwechsel vorgenommen.The embryonic membranes are delivered frozen or chilled with the serum sample in bags or other containers. The storage temperature until processing is +4°C to -80 ° C. For processing, the material is thawed in a suitable container in cold to lukewarm water. After thawing, the water is changed.
In diesem Wasserbad wird das Material in Gläsern mit Schraubverschluß geschüttelt, (etwa 3 bis 5 min). Dabei erfolgt das Lösen von Blut und anderen anhängenden Gewebebestandteilen sowie die teilweise Trennung von Amnion und Chorion.The material is shaken in screw-top jars in this water bath (about 3 to 5 minutes). This dissolves blood and other attached tissue components and partially separates the amnion and chorion.
Dann wird das Material auf eine glatte Präparierunteriage (desinfizierbar) gebracht und durch stumpfes Lösen Amnion vom Chorion getrennt (Chorion wird evtl. verworfen).The material is then placed on a smooth preparation surface (can be disinfected) and the amnion is separated from the chorion by blunt dissection (the chorion may be discarded).
Nach Begradigen der Einrißstellen (um ein weiteres Einreißen zu verhindern) wird die Fläche vermessen und gekennzeichnet. Das derart präparierte Amnion wird in ein Spezialgefäß für Amnion gegeben, das durch SpezialÖffnungen für unterschiedliche Medien durchflutbar ist. Nach anschließendem Spülen unter fließendem Wasser erfolgt der Sterilisationsvorgang für 10 bis 240 Minuten unter Schütteln, wobei die Sterilisationslösung aus Glycerol, Peressigsäure (PES), Ethanol und Aqua dest. besteht und die PES-Konzentration zwischen 0,005 und 2 % beträgt.After straightening the tears (to prevent further tearing), the area is measured and marked. The amnion prepared in this way is placed in a special container for amnions, which can be filled with different media through special openings. After rinsing under running water, the sterilization process takes place for 10 to 240 minutes while shaking, whereby the sterilization solution consists of glycerol, peracetic acid (PAS), ethanol and distilled water and the PAS concentration is between 0.005 and 2%.
Nach Ablauf der Sterilisationszeit erfolgen die weiteren Arbeitsgänge unter Reinraumbedingungen (Klasse A), wie z.B. Spülen in einem Gemisch von sterilisierter isotonischer Kochsalzlösung und sterilisiertem Glycerin.After the sterilization period has elapsed, the further operations are carried out under clean room conditions (Class A), such as rinsing in a mixture of sterilized isotonic saline solution and sterilized glycerin.
Danach erfolgt die Entnahme aus dem o.g. Spezialspülgefäß und Qualitätskontrolle des Amnionpräparats, die Sterilprobenentnahme und die Konfektionierung (Endverpackung mit Überführung in sterilisiertes Glycerin und definitiven Verschluß).This is followed by removal from the above-mentioned special rinsing vessel and quality control of the amniotic preparation, sterile sampling and packaging (final packaging with transfer to sterilized glycerine and final closure).
Beispiel 2.2: Humanes AmnionpräparatExample 2.2: Human amniotic preparation
2.2.1. Entnahme2.2.1. Withdrawal
Die Entnahme der Embryonalhüllen von der Nachgeburt (Plazenta) geschieht auf der rechtlichen Basis der schriftlichen Zustimmung der Spenderin, der pharmazeutisch-relevanten Spenderausschlußkriterien und der schriftlichen Erklärung (Entnahmeprotokoll) des behandelnden Arztes zur Eignung des Gewebes für die Herstellung eines klinisch bedenkenlos einsetzbaren Präparates.The removal of the embryonic membranes from the afterbirth (placenta) takes place on the legal basis of the written consent of the donor, the pharmaceutically relevant donor exclusion criteria and the written declaration (removal protocol) of the treating doctor regarding the suitability of the tissue for the production of a preparation that can be used clinically without any concerns.
2.2.2. Zwischenlagerung und Transport2.2.2. Intermediate storage and transport
Die Zwischenkonservierung in der Klinik erfolgtIntermediate preservation in the clinic takes place
- in einer Flasche mit gesättigter Kochsalzlösung und Kühlschrankbedingungen oder- in a bottle with saturated saline solution and refrigerator conditions or
- in einem Plastbeutel verschlossen und gefroren bei mindestens -200C oder darunter oder- sealed in a plastic bag and frozen at at least -20 0 C or below, or
- durch einfache Lagerung in physiologischer Kochsalzlösung und normothermer Lagerung oder Verschluß im Plastbeutel und normothermer Lagerung, wenn die Abholung innerhalb von 12 Stunden nach Entnahme erfolgt.- by simple storage in physiological saline solution and normothermic storage or sealing in a plastic bag and normothermic storage if collection takes place within 12 hours after collection.
Der Transport wird in einer Isolierbox unter Kühlbedingungen vorgenommen. Innerhalb von 12 Stunden nach der Entnahme kann der Transport ohne zusätzliche Kühlung erfolgen. Eine Ausnahme sind Umgebungstemperaturen über 2O0C.Transport is carried out in an insulated box under refrigerated conditions. Transport can take place within 12 hours of collection without additional refrigeration. An exception is ambient temperatures above 20 0 C.
2.2.3. Zwischenlagerung bis zur Präparation2.2.3. Intermediate storage until preparation
Nach Anlieferung des Amnion-Ausgangsmateriais vom "Sammlungsort" (geburtshilfliche Einrichtungen) verbleibt das Gewebe in Quarantänelagerung ( -18°C oder darunter) bis zum Vorliegen der infektionsserologischen Befunde (AIDS, Hepatitis, Lues, Cytomegalie). Diese Zwischenlagerung wird bis zum Beginn der mechanischen Bearbeitung ausgedehnt.After delivery of the amniotic material from the "collection site" (obstetric facilities), the tissue remains in quarantine storage (-18°C or below) until the infection serological findings (AIDS, hepatitis, syphilis, cytomegaly) are available. This interim storage is extended until the start of mechanical processing.
2.2.4. Mechanische Präparation2.2.4. Mechanical preparation
In Vorbereitung auf die mechanische Präparation wird das Gewebe im Wasserbad aufgetaut. Es schließt sich ein Waschvorgang zur Entfernung von anhaftenden Geweben und von Blut an.In preparation for mechanical preparation, the tissue is thawed in a water bath. This is followed by a washing process to remove adherent tissue and blood.
In diesem Wasserbad wird das Gewebe in Gläsern oder Plastflaschen mit Schraubverschluß etwa 3 bis 5 Minuten geschüttelt. Dabei erfolgt das erleichterte Lösen von Blut sowie die bereits teilweise Trennung von Amnion und Chorion.In this water bath, the tissue is shaken in glasses or plastic bottles with screw caps for about 3 to 5 minutes. This facilitates the dissolution of blood and the partial separation of the amnion and chorion.
Auf einer desinfizierbaren festen Unterlage wird dann das Amnion in feuchtem Zustand durch Abstreifen vom Chorion befreit.The amnion is then freed from the chorion by stripping it off while still moist on a disinfectable solid surface.
Es schließt sich eine Begradigung eventueller Einrißstellen - mit Hilfe von Scheren oder anderen mechanischen Schneidinstrumenten - an. Damit verhindert man ein weiteres Einreißen und ein Unbrauchbarwerden des Präparates. Die verbleibende Fläche wird vermessen und das Präparat zur Kennzeichnung mit einer Kontrollmarke versehen.Any tears are then straightened out using scissors or other mechanical cutting instruments. This prevents further tearing and the preparation becoming unusable. The remaining area is measured and the preparation is marked with a control mark.
2.2.5. Sterilisation2.2.5. Sterilization
Das so behandelte und gereinigte Amnion wird nun einem Sterilisationsprozeß unterworfen.
Diese Sterilisation erfolgt mit einem Peressigsäure-Alkoholgemisch. Dazu wird ein Speziaigefäß
verwedet, das sowohl die Vermischung der einzelnen Amnienpräparate verhindert als auch
durch speziell angebrachte Öffnungen leicht mit den verwendeten Lösungen durchflutet
(durchströmt) werden kann.
Die Lösung besteht bevorzugt aus:The amnion treated and cleaned in this way is then subjected to a sterilization process. This sterilization is carried out with a peracetic acid-alcohol mixture. A special container is used for this purpose, which not only prevents the individual amnion preparations from mixing, but also allows the solutions used to flow through it easily through specially designed openings.
The solution preferably consists of:
- Glycerin 375 ml
-Wofasteril 19 ml- Glycerine 375 ml
-Wofasteril 19 ml
- Ethanol 250 ml- Ethanol 250 ml
- Aqua dest. 356 ml.- Distilled water 356 ml.
Den Sterilisationsvorgang führt man bevorzugt über einen Zeitraum von 2 Stunden unter Schütteln durch. Die Sterilisation wird durch einen Spülvorgang zum Auswaschen der Sterilisationslösung mit (bevorzugt) isotonischer steriler Kochsalzlösung und sterilem Glycerin durchgeführt. Nach Ablauf der Sterilisation erfolgen alle weiteren Arbeitsgänge unter Reinraumbedingungen (Reinraumklasse A).The sterilization process is preferably carried out over a period of 2 hours with shaking. Sterilization is carried out by rinsing the sterilization solution with (preferably) isotonic sterile saline solution and sterile glycerin. After sterilization, all further work steps are carried out under clean room conditions (clean room class A).
2.2.6. Sterilkontrolle2.2.6. Sterility control
Als nächster Schritt erfolgt die Entnahme des Amnions aus den o.g. Spezialgefäßen und die Entnahme einer Probe zur Sterilkontrolle.The next step is to remove the amnion from the special vessels mentioned above and to take a sample for sterile control.
2.2.7. Konfektionierung2.2.7. Packaging
Das sterilisierte Amnion wird nun in ein definitiv verschließbares Gefäß, bevorzugt aus Glas oder Kunststoff, welches mit sterilem Glycerin voll gefüllt ist, gebracht. Dies ist die Endverpackung.The sterilized amnion is now placed in a permanently sealable container, preferably made of glass or plastic, which is filled with sterile glycerin. This is the final packaging.
2.2.8. Dokumentation, Label
nach Arzneimittelgesetz.2.2.8. Documentation, labels
according to the Medicines Act.
2.2.9. Endlagerung / Depothaltung2.2.9. Final storage / depot keeping
Bis zur Abgabe an den Besteller wird das Amnionpräparat bei Kühlschranktemperatur oder darunter gelagert.The amniotic fluid preparation is stored at refrigerator temperature or below until it is delivered to the customer.
Die Glycerinkonservierung gestattet auch eine schadensfreie Lagerung bei Minustemperaturen. Dies bedeutet eine Verlängerung der Haltbarkeit und damit Verlängerung der Lagerungszeit.Glycerin preservation also allows for damage-free storage at sub-zero temperatures. This means an extension of the shelf life and thus an extension of the storage time.
Beispiel 2.2.10:Example 2.2.10:
Gem. Beispiel 1 und 1.1 wird eine Amnion-Keratinozyten-Zellschicht gebildet.According to examples 1 and 1.1, an amniotic keratinocyte cell layer is formed.
Beispiel 2.2.11:Example 2.2.11:
Gem. Beispiel 1 und 1.1 wird eine Amnion-Chondrozyten-Zeilschicht gebildet.According to examples 1 and 1.1, an amniotic chondrocyte cell layer is formed.
Beispiel 2.2.12:Example 2.2.12:
Gem. Beispiel 1 und 1.1 wird eine Amnion-Fibroblasten-Zellschicht gebildet.According to examples 1 and 1.1, an amniotic fibroblast cell layer is formed.
Beispiel 2.2.13:Example 2.2.13:
Gem. Beispiel 1 und 1.1 wird eine Amnion-Endothel-Zellschicht gebildet.According to examples 1 and 1.1, an amniotic endothelial cell layer is formed.
Beispiel 2.3: Bovines Amnionpräparat (Fließschema)Example 2.3: Bovine amniotic fluid preparation (flow chart)
Die Embryonalhüllen werden nach Spontangeburten von der Plazenta abgetrennt, tiefgefroren und bei mindestens -18°C bis zur Freigabe durch negative infektionsserologische Befunde zwischengelagert.After spontaneous births, the embryonic membranes are separated from the placenta, deep-frozen and stored at a minimum of -18°C until they are released based on negative infection serological results.
Zur weiteren Aufarbeitung werden die Amnien im Wasserbad aufgetaut.For further processing, the amniotic fluid is thawed in a water bath.
Zur Entfernung von Blut u.a. anhaftenden Bestandteilen werden die Embryonalhüllen mit Wasser gewaschen.To remove blood and other adhering components, the embryonic membranes are washed with water.
Auf einer desinfizierbaren festen Unterlage werden sie in feuchtem Zustand durch Abstreifen vom Chorion befreit. Das Chorion wird verworfen.They are stripped off while still moist on a disinfectable solid surface to remove the chorion. The chorion is discarded.
Das verbleibende Amnion wird nochmals mit Wasser gespült und anschließend auf die gewünschte Größe zugeschnitten.The remaining amnion is rinsed again with water and then cut to the desired size.
Die Sterilisation erfolgt mit 1 %iger Peressigsäure unter Zusatz von Alkohol und Glycerin für 2 Stunden unter Schütteln.Sterilization is carried out with 1% peracetic acid with the addition of alcohol and glycerin for 2 hours while shaking.
Es folgt das Auswaschen der Sterilisationslösung mit isotonischer Kochsalzlösung und die Entnahme der Steriiitätskontrolle.This is followed by washing out the sterilization solution with isotonic saline solution and taking the sterility control.
Es folgen: Konfektionieren des Präparates unter Laminar Air Flow (Reinraumklasse A) in definitiv verschließbaren Gefäßen in Glycerin.The following steps follow: Packaging of the preparation under laminar air flow (clean room class A) in definitely sealable containers in glycerine.
Lagerung bei Kühlschranktemperatur oder darunter. .Store at refrigerator temperature or below.
Abgabe des Präparates auf Anforderung.Delivery of the preparation upon request.
Beispiel 2.4: TrägermaterialExample 2.4: Carrier material
Zelltypen, die im Laufe des Zellwachstums mehrschichtige Zellayer bilden, z.B. Keratinozyten, werden in Kulturgefäßen auf Feederzellen bzw. mit Basalmembranproteinen beschichteten Zellkulturoberflächen gezüchtet, die Zellayer enzymatisch abgelöst und auf verschiedene Trägermaterialien gebracht.Cell types that form multilayered cell layers during cell growth, e.g. keratinocytes, are grown in culture vessels on feeder cells or cell culture surfaces coated with basement membrane proteins. The cell layers are enzymatically detached and placed on various carrier materials.
Die erfindungsgemäßen Amnionpräparate eignen sich in vorteilhafter Weise zur Verwendung solcher Trägermaterialien.The amniotic preparations according to the invention are advantageously suitable for the use of such carrier materials.
Figur 1
Bezugszeichen:Figure 1
Reference number:
1 Außenverkleidung1 Exterior cladding
2 Zwischenboden2 intermediate floor
3 Stempel3 stamps
4 CO2-Zufuhr4 CO2 supply
5 Heizquellen5 heat sources
Der Transportbehälter besteht aus einer bruchsicheren Außenverkleidung und einem
Innenraum, der lose Zwischenboden zur Lagerung der Zellschichten enthält - die durch Stempel
fixiert werden - und der, neben dem Nährmedium, Heizquellen zur Temperaturregelung und eine
steuerbare CO2-Zufuhr enthält. Die Außenverkleidung besteht vorzugsweise aus rostfreiem
Stahlblech, die Isolierung des Behälters aus Kunststoff, vorzugsweise aus Polystyrol. Als
Heizquellen werden Batterien bzw. aufladbare Akkumulatoren eingesetzt.
Dieses Transportsystem, eine Kombination aus bekannten und aus neuen Teilen, eignet sich für
bekannte wie für die erfändungsgemäßen Zelischichten, die aus einer Substrat-Zellschicht-Einheit
bestehen, wobei als Substrat neue kollagenhaltige oder gelartige Träger sowie Amnion
oder azelluläre Dermis und als zur Schichtbildung vorgesehene Zelltypen Epithelzellen
(Keratinozyten), Knorpelzellen (Chondrozyten), Fibroblasten oder Endotheizellen Anwendung
finden.The transport container consists of a shatter-proof outer lining and an interior that contains a loose intermediate floor for storing the cell layers - which are fixed by stamps - and which, in addition to the nutrient medium, contains heating sources for temperature control and a controllable CO2 supply. The outer lining is preferably made of stainless steel sheet, the insulation of the container is made of plastic, preferably polystyrene. Batteries or rechargeable accumulators are used as heating sources.
This transport system, a combination of known and new parts, is suitable for known as well as for the inventive cell layers, which consist of a substrate-cell layer unit, whereby new collagen-containing or gel-like carriers as well as amnion or acellular dermis are used as the substrate and epithelial cells (keratinocytes), cartilage cells (chondrocytes), fibroblasts or endothelial cells are used as the cell types intended for layer formation.
Die Transportbedingungen garantieren ein Anwachsen der Zellschichten und die Koloniebildung der Zellen in vivo auf der Wunde. Sie ermöglichen lange Transportzeiten und das Einhalten der gewünschten Innentemperatur von 5 bis 40 ° C und für z.B. Epithelzellen aus Keratinozyten von 20 bis 370C. Das Transportsystem ist zum Transport biologischer Materialien, die lebende Zellen enthalten, geeignet - z.B. patienteneigenen Materials für autologe, von Fremdmaterialien für allogene Transplantationen wie auch xenogener Materialien.The transport conditions guarantee the growth of the cell layers and the formation of colonies of cells in vivo on the wound. They enable long transport times and the maintenance of the desired internal temperature of 5 to 40 °C and, for example, for epithelial cells from keratinocytes, of 20 to 37 0 C. The transport system is suitable for the transport of biological materials that contain living cells - eg the patient's own material for autologous, foreign materials for allogeneic transplantations as well as xenogeneic materials.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE29606313U DE29606313U1 (en) | 1996-03-29 | 1996-03-29 | Cell layers and transport system for cell layers |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE29606313U DE29606313U1 (en) | 1996-03-29 | 1996-03-29 | Cell layers and transport system for cell layers |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE29606313U1 true DE29606313U1 (en) | 1996-08-08 |
Family
ID=8022226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE29606313U Expired - Lifetime DE29606313U1 (en) | 1996-03-29 | 1996-03-29 | Cell layers and transport system for cell layers |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE29606313U1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105597150A (en) * | 2016-01-27 | 2016-05-25 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | Skin patch for repairing skin burn and preparing method of skin patch |
| CN105617461A (en) * | 2016-01-27 | 2016-06-01 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | Skin patch for treating skin burn and preparation method of skin patch |
-
1996
- 1996-03-29 DE DE29606313U patent/DE29606313U1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105597150A (en) * | 2016-01-27 | 2016-05-25 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | Skin patch for repairing skin burn and preparing method of skin patch |
| CN105617461A (en) * | 2016-01-27 | 2016-06-01 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | Skin patch for treating skin burn and preparation method of skin patch |
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