DE2815510B2 - Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer spezifisch bindenden Substanz - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer spezifisch bindenden Substanz in einem flüssigen Medium. Die Erfindung betrifft somit immunologische Bindungsbestimmungen zur Bestimmung von Antigenen und Haptenen oder ihren Antikörpern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung radioinimunologische Bestimmungen (RIA) und die Bestimmung von Hepatitis-B-Oberfläehenantigen (HB₅) in Serum- und Plasmaproben,

Es besteht ein ständig zunehmendes Interesse an einer Verbesserung der Verfahren der spezifischen Bindungsbestimmungen und der dafür angewandten Prüfmittel. Klassische RIA-Verfahrcn umfassen die Konkurrenz zwischen dem Antigen der Probe und einem radioaktivmarkierten Antigen um die Bindung mit einem spezifischen Antikörper. Die Radioaktivitätsmenge, die sich mit dem Antikörper verbindet, ist eine Funktion

der Antigenkonzentration in der Probe und kann bestimmt werden durch Ausfällen und anschließendes Abtrennen des radioaktiven Antigen-Antikörper-Komplexes oder bequemer durch Anwendung einer unlöslichen Form des Antikörpers, wie eines Antikörpers, der an feste Teilchen oder Matrizes gekuppelt ist In letzter Zeit ist über verschiedene alternative Markierungssubstanz?7i berichtet worden zum Ersatz der Radioisotopen, wie Enzyme, Coenzyme, Enzymsubstrate, fluoreszierende Moleküle, Moleküle, die imstande sind, an lichterzeugenden Reaktionen teilzunehmen, und Enzymmodulatoren.

Es besteht ein spezieller Bedarf an einem vorteilhafteren spezifischen Bindungsverfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Hepatitis-B-Qberflächen-Antigen (HB₅) in Proben von Serum oder Plasma. Es ist bekannt, daß ein Patient nach einer Transfusion von Blut, das HB_S-Antigen enthält, Hepatitis entwickeln kann. Bis vor kurzem wurde eine Vielzahl von Techniken routinemäßig in Krankenhauslaboratorien und Blutbanken angewandt, um HB_S-Antigen im 31ut nachzuweisen, das für Transfusionszwecke verwendet werden sollte. Derartige Verfahren umfaßten die Immunodiffusion, Komlementfixierung, Gegenelektrophorese, Latexagglutination, Hämagglutination und RIA. In letzter Zeit haben die Vereinigten Staaten die Forderung gestellt, daß Blut, das für Transfusionszwecke angewandt werden soll, mit Hilfe des empfindlichsten zur Verfügung stehenden Bestimmungsverfahrens auf Hepatitis untersucht werden muß. Seitdem sind RIA-Verfahren am verbreitetsten zum Nachweis von HB₅-Antigen.

Es wurden verschiedene spezifische Bindangsbestimmungsverfahren entwickelt, die nichtspezifische Bindemittel oder Adsorbentien anwenden. Derartige spezifische Bindungsbestimmungen mit Hilfe von Adsorbentien zerfallen in zwei verschiedene Gruppen.

1. Anwendung von Adsorbentien zur Abtrennung der freien von der gebundenen Markierungssubstanz

Beispiele für dieses Verfahren sind die in den US-PS 34 14 383,39 37 799 und 39 38 953 angegeben und diese Verfahren werden üblicherweise angewandt zum Nachweis von kleinen Molekülen, wie Hormonen, besonders Thyroxin. Bei diesen Verfahren wcd die Konkurrenz bzw. Kompetition in Lösung zwischen dem Liganden der Probe und dem markierten Liganden um einen spezifischen Bindungspartner, wie ein hormonbindendes Protein oder einet' Antikörper, eingeleitet Nach Beendigung der Konkurrenzreaktion wird der freie markierte Ligand von dem markierten Liganden abgetrennt, der an den Bindungspartner gebunden ist, durch Zugabe eines unspezifischen Adsorbens für den freien Liganden.

2. Anwendung von Adsorbentien, um den Liganden aus der Probe vorher zu extrahieren

Bei diesem Verfahren wird ein unspezifisches Adsorbens zu der Probe zugesetzt, um den interessierenden Liganden zu extrahieren. Das Adsorbens wird dann von der Probe entfernt, der adsorbierte Ligand von dem Adsorbens eluiert, und der freigesetzte Ligand kann mit einem markierten Liganden um einen spezifischen Bindungspartner in Konkurrenz treten. Dieses Verfahren ist beispielhaft in den US-PS 37 76 698, 38 16 076 und 39 47 564 angegeben. Eine Variation dieses Verfahrens ist in der US-PS 36 59 104 beschrieben zum Nachweis von Thyroxin, wobei die Probe und das radioaktivmarkierte Thyroxin durch eine Säule eines Adsorbens geleitet werden und anschließend ein löslicher Bindungspartner, thyroxinbindendes Globulin. Die Menge an radioaktivmarkiertem Thyroxin, die aus der Säule ί eluiert wird, ist proportional zu der Menge an Thyroxin in der Probe.

Unspezifische Adsorbentien wurden auch angewandt als Stellen, um die der Ligand der Probe und der markierte Ligand in Konkurrenz treten, besonders beim

ίο Nachweis von Hormonaufnahmewerten. Die Anwendung dieser Verfahren zur Bestimmung von Trijodthyronin (T-3) Aufnahmewerten ist in den US-PS 34 51 777, 37 10 117 und 38 23 001 beschrieben.

In dem Bericht Nr. PB 241 333 des United States Departement of Commerce, National Technical Information Service (NTIS) vom 27. Januar 1975 und in der US-PS 40 20 151 sind immunologische Bestimmungsmethoden zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern auf einer festen Oberfläche !?eschriebea

Eine weitere Möglichkeit bezüglich der Anwendung von nichtspezifischen Adsorbentien bei analytischen Verfahren und insbesondere für spezifische Bindungsbestimmungen ist angegeben in Principles of Competitive Protein-Binding Assays. Herausg. Odell und Daughaday, Kap. IX und XI, J. B. Lippincott Company (1972) und Clinical Chemistry 19 (2): 146-186 (1973). In der DE-OS 26 07 149 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Immunstoffen beschrieben, bei dem die zu bestimmende Substanz zunächst an einer festen Phase adsorbiert und anschließend durch immunochemische Verfahren bestimmt wird.

Alle der zur Zeit verfügbaren RIA-Verfahren zum Nachweis von HB_S-Antigen wenden ein zwei-Stellen — radioimmunologisches oder sogenanntes »Sandwich«- Verfahren an. Bei diesem Verfahren wird die zu untersuchende Serumprobe mit einem unlöslich gemachten Antikörper gegen HB_S-Antigen (AnIi-HB₅), z. B. in Form von AnU-HB₅, das auf die Innenseite von Reagenzgläsern oder auf die Oberfläche von Plastikperlen aufpebracht ist, inkubiert Ein Teil des unlöslich gemachten Anti-HB₅ wird durch das HB₅-Antigen der Probe, soweit solches vorhanden ist, gebunden. Das unlöslich gemachte Material wird dann gewaschen und radioaktivmarkiertes Anti-HB₅ zugegeben. Nach einem weiteren Waschvorgang wird die Radioaktivitätsmenge gemessen, die mit dem unlöslich gemachten Anti-HB, verbunden ist Beispiele für ein derartiges RIA-Verfahren sind die in den US-PS 38 68 517 und 39 49 064 angegebenen Verfahren.

so Obwohl sie verhältnismäßig spezifisch und empfindlich gegenüber HB₅-Antigen sind, können die bekannten »Sandwiche-RIA-Verfahren noch bezüglich ihrer Handhabung und Anwendung bzw. Herstellung der Prüfmittel weiter verbessert werden. Die Sicherung der gleichmäßigen Herstellung und Qualität des unlöslich gemachten Anti-HB_S ist verhältnismäßig kostspielig und zeitraubend. Ferner erfordert das Bestimmungsverfahren zwei längere Inkubationsstufen von 30 min oder mehr, und zwar eine für die Wechselwirkung zwi-

M) sehen dem HbrAntigen der Probe und dem unlöslich gemachten Anti-HB,, und die zwciie für die Wechselwirkung mit dem markierten Anti-HB,. Ferner ist das unlöslich gemachte Anti-HB_N verhältnismäßig instabil und erfordert spezielle Bedingungen beim Versenden

hi und der Lagerung.

Ein weiterer Nachteil dieser bekannten RIA-Verfah· ren ist ihre Unfähigkeit. HB_S-Antigen in Form seines Immunkomplcxes mit Anti-HB, in der zu untersuchen-

den Probe nachzuweisen. Die Art des bei den bekannten Verfahren angewandten unlöslich gemachten Anti-HB, ist so, daß es nur freies ΗΒ,-Antigen bindet, das freie Antigertdeterminanten besitzt und nicht einen HBs-Antigen-Antikörper-Komplex. Dadurch bliebe die Gefahr von Hepatitis nach einer Transfusion aufgrund des Vorhandenseins eines ΗΒ,-lmmun-Komplexes in dem übertragenen Blut uneni.deckt bei Anwendung der üblichen Bestimmungsveriahren.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes spezifisches Bindungsverfahren zu entwickeln, welches ausgeht von einem Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer spezifisch binden den Substanz in einem flüssigen Medium, durch a) Zusammenbringen der zu untersuchenden flüssigen Probe mit einem testen Adsorbens und mit einem spezifischen Bindungspartner zu der zu bestimmenden Substanz, wobei der Bindungspartner markiert ist und das Aclsor-

Bindungen eingeht, und b) Bestimmung entweder der Menge an Markierungssubstanz, die durch Bindung an die adsorbierte zu bestimmende Substanz mit dem AcI sorbens verbunden ist oder der Menge an Markierungssubstanz, die nicht mit dem Adsorbens verbunden ist.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man (I) einen solchen markierten Piindungspartner auswählt. dessen pl-Wert von demjenigen der zu bestimmenden Substanz verschieden ist; (2) als Adsorbens ein lonenaustauschermaterial verwendet, und zwar einen Anionenaustauscher, wenn der pi-Wert der zu bestimmenden Substanz niedriger liegt als derjenige des Bindungsparttiers, oder einen Kationenaustauscher. wenn der pl-Wert der zu bestimmenden Substanz höher liegt als der des markierten Bindungspartners und (3) die Stufe (a) bei einem pH-Wert zwischen dem pl-Wert der zu bestimmenden Substanz und demjenigen des BinduiiL'spartners durchführt.

Unter unspezifischer Bindung ist eine allgemeine physikalisch-chemische Anziehung zu verstehen, wie eine ionische oder hydrophobe (van der Waals) Bindung, die zwischen dem Adsorbens und der zu bestimmenden Substanz auftritt.

Es ist bevorzugt, daß die Stufe (a) durchgeführt wird. indem man (i) die Probe mit dem Adsorbens zusammenbringt, (ii) gegebenenfalls das Adsorbens von dem nichtadsorbierten Teil der Probe abtrennt und (iii) anschließend das Adsorbens mit dem markierten Bindungspartner zusammenbringt. Das Adsorbens kann jedoch auch, wenn das erwünscht wird, mit der Probe und dem markierten Bindungspartner im wesentlichen gleichzeitig zusammengebracht werden.

Die Stufe b) kann durchgeführt werden, indem man von dem Adsorbens im wesentlichen den gesamten markierten Bindungspartner abtrennt, der nicht durch Bindungen mit der zu bestimmenden adsorbierten Substanz daran gebunden ist und die Menge an Markierungssubstanz mißt, die entweder an dem Adsorbens verbleibt oder davon abgetrennt wird. Dieses Verfahren ist besonders günstig, wenn die Markierungssubstanz eine radioaktive Substanz ist. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet die Möglichkeit einen Konzentrationseffekt zu erzielen, indem man das Volumen des Adsorbens mit einem Volumen der Probe mehrmals, vorzugsweise zweimal, zusammenbringt Das Verfahren ist anwendbar auf eine Vielzahl von Substanzen und ist besonders geeignet zum. Nachweis von ΗΒ,-Antigen und Anti-HB_S.

Die Anwendung eines Ionenaustauschermaterials als Adsorbens ergibt ein Bestimmungsveriahren. das besonders geeignet ist zur Bestimmung von wasserlöslichen Substanzen mit einer positiven oder negativen elektrischen Ladung. Der ausgewählte, markierte Bin-". dungspartner besitzt einen isoelektiischen Punkt (pl-Wert), der sich von demjenigen der zu bestimmenden Substanz unterscheidet. Das lonenaustauschcrmaterial und die pH-Bedingungen können dann ausgewählt werden, wobei das Adsorbens imstande ist. den markierten

U. Bindungspartner unspezifisch zu binden. Die pH-Bedingungen werden so gewählt, daß sie /wischen dem pl-Wcrt der zu bestimmenden Substanz und demjenigen des markierten Bindungspartners liegen. Dann wird, wenn drr pl-Wert der zu bestimmenden Substanz nied-

: . riger ist als derjenige des markierten Bindungspartners. ein loncnaustauschermaterial vom anionischen Typ ausgewählt. Wenn die Beziehung zwischen den pl-Werten umgekehrt ist, wird ein kaiionischer loncn-

Bei Anwendung auf den Nachweis von Hepi<iiiüs-B-Oberflächen (HB_S)-Antigen, das eine negative ladung und einen pl-Wert von weniger als ungefähr 5 besitzt, umfaßt cm bevorzugtes Bestimmungsverfahren die folgenden Stufen:

a) Zusammenbringen der zu untersuchenden Probe mit einem festen Anionenaustauschcrmatcrial bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8:

b) V. ,ischen des Anionenaustauschermaterials mit einer Flüssigkeit mit einem pH-Wert zwischen 5

^;" und 8;

c) Zusammenbringen des Anionenaustauschermaterials bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 mit Anti-HB,. das markiert ist und einen pl-Wert von mehr als ungefähr 8 besitzt und

d) Bestimmung der Menge an markierte·- Substanz, die entweder (i) mit dem Anionenaustauschermate rial verbunden ist durch Bindung des markierten Anti-HB, an adsorbiertes HB^-Antigen oder (ii) nicht an das Anionenaustauscherharz gebunden ist.

Vorzugsweise ist das Anionenaustauschermateri;il ein Diäthanolaminoäthy! substituiertes Polymer, we DEAE-Cellulose. vorzugsweise in Form von Teilchen und besonders günstig in einer Durchlaufsäule. 4-, Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis von HBs-Antigen in Form seines immunologischen Komplexes mit Anti-HB,. Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Stufen:

a) Zusammenbringen der zu untersuchenden Probe '" mit einem Mittel, das immunochemische Bindungen schwächt, vorzugsweise einem chao.ropen Mittel, wie Harnstoff und mit einem solchen Ionenaustauscher, der imstande ist, HB_S-Antigen unspezifisch zu binden und unter solchen Bedingungen,

" diL eine solche Bindung begünstigen, vorzugsweise

mit einem Anionenaustausch^:

b) Abtrennen des gebundenen Mittels, das die Bindungen lockert von dem Adsorbens und

c) Bestimmung des an das Adsorbens gebundenen *"" H Bs-Antigens, vorzugsweise nach den oben beschriebenen Verfahren.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert. Dabei ist

_b5 F i g. 1 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens beispielhaft zum Nachweis eines Antigens (Ag);

F i g. 2 eine auseinandergezogene, perspektivische

Ansicht eines säulenförmigen Prüfmillcls, das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. und

F i g. 3 eine graphische Darstellung der Affinität ver schiedener Adsorbentien für flB_s-Antigen unter verschiedenen pH-Bedingungen.

Der bevorzugte Mechanismus, nach dem das erfindungsgflmäße Verfahren durchgeführt werden kann, ist schematisch in F i g. I der Zeichnungen dargestellt. Diese Figur bezieht sich nur beispielhaft auf den Nachweis (bzw. Bestimmung) eines Antigens (Ag) unter Anwendung eines markierten Antikörpers (Ab*). Die in dem Diagramm angegebene physikalische Form des Ionenaustauschers (Ad) ist nur illustrativ, da er eine Vicl/ahl verschiedener Formen annehmen kann, wie später näher erläutert wird.

Entsprechend Fig I wird eine Probe, von der angenommen wird, daß sie ein interessierendes Antigen (Ag) enthält, mit dem Ionenaustauscher (Ad) zusammengebracht, wie durch die Stufen a) und b) angegeben ist. Fin Anteil des in der Probe enthaltenen Antigens wird an diesen gebunden. Dann wird ein Überschuß an markiertem Antikörper (Ab*) mit dem Ionenaustauscher zusammengebracht, wie durch die Stufen c) und d) angegeben ist, wobei eine Verbindung (Assoziation) des markierten Antikörpers mit den Ionenaustauscher durch Bindung an das adsorbierte Antigen eintritt. Wie in Stufe e) angegeben, wird der Überschuß an markiertem Antikörper von dem Ionenaustauscher abgetrennt, wobei die Menge an markiertem Antikörper, die daran gebunden bleibt, eine direkte Funktion der Antigenmenge ist, die in der zu untersuchenden Menge vorhanden war Dieses Verfahren kann auch zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Antikörpern angewandt werden, wobei anstelle des markierten Antikörpers in den Stufen c) bis e) ein markiertes Antigen verwendet wird und entsprechende Ionenaustauscher und Bestimmungsbedingungen ausgewählt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren muß die nachzuweisende Substanz einen isoelektrischen Punkt (pl-Wert) besitzen, der sich von demjenigen des markierten spezifischen Bindungspartners unterscheidet. Der Unterschied zwischen den pl-Werten der zu bestimmenden Substanz und des markierten Bindungspartners sollte üblicherweise mindestens 0,5 und vorzugsweise mehr als 2,0 betragen. Der isoelektrische Punkt einer Substanz ist der pH-Wert, bei dem die Substanz keine nach außen wirksame elektrische Ladung besitzt. In Lösung hängt die wirksame Ladung einer solchen Substanz von dem pH-Wert der Umgebung ab. In einer Lösung mit einem pH-Wert oberhalb des pl-Wertes einer Substanz nimmt eine derartige Substanz eine negative Ladung an. Umgekehrt nimmt eine solche Substanz insgesamt eine positive Ladung an in einer Lösung mit einem pH-Wert unter dem pl-Wert Die geladene Substanz in Lösung besitzt eine Affinität für ein Ionenaustauschermaterial, das die entgegengesetzte Ladung trägt. So wird eine negativ geladene Substanz von einem Anionenaustauschermaterial angezogen und eine positiv geladene Substanz von einem Kationenaustauschermaterial. Daher wird bei Durchführung des erfindungsgemäßens Verfahrens die zu bestimmende Substanz von einem Ionenaustauschermaterial adsorbiert, während der markierte Bindungspartner nicht adsorbiert wird, wenn man ein lonenaustauschermateriai auswählt, das (i) anionisch ist, wenn der pi-Wert der zu bestimmenden Substanz niedriger ist als derjenige des markierten Bindungspartners oder (ii) kat-

ionisch ist, wenn der pl-Wert der zu bestimmenden Substanz größer ist als derjenige des markierten Bindungspartners und die Bestimmung unter pH-Bedingungen durchführt zwischen den pl-Werten der zu bestimmenden Substanz und des markierten Bindungspartners.

Im folgenden sind verschiedene lonenaustauschermaterialien angegeben, die erfindungsgemäß angewandt werden können.

A nionenau stauschermateria lien

Diä thylaminoäthy 1-(DEA n)-cellulose /.. B. Whatman Arten DE·]®, Flocken DE-11®, Pulver DE-22®, Fasern DE-23®, Fasern DE-32®, trocken, mikrokörnig DE-52®. naß. mikrokörnig DE-81®, Papier ■/.. B. Bio-Rad Art Cellex» D, faserig

Diäthylaminoäthyl-(DEAE) agarose z. B. Bio-Rad Art DEAE Biogel® A

Diäthy!aminoäthyl-(DEAE)-dextran /.. B. Pharmacia Art DEAE Sephadcx®, Perlen

\minohexyl-Sepharose® 4B (Pharmacia)

ECTEOLA-cellulose

z. B. Whatman Arten ET-II®. Pulver ET-41®, Pulver (hohe Reinheit)

ET-81®. Papier z. B. Bio-Rad Art Cellex® E, Fasern

Triäthylaminoäthyl-(TEAE)-cellulose z. B. Bio-Rad Art Cellex® T, Fasern

Diäthy!-(2-hydroxypropyl)-amino-(QAE)-cellulose z. B. Bio-Rad Art Cellex® QAE, Fasern

Diät hyl-(2-hydroxypropyl)-amino-(QAE)-dex trän z. B. Pharmacia Art QAE-Sephadex®

Benzoylierte Diä thylaminoäthy !cellulose z. B. Bio-Rad Art Cellex® BD, Fasern

Kationenaustauschermaterialien

Cellulosephosphat

z. B. Whatman Arten P-1®, Flocken P-11®, Pulver P-41®, Pulver (hohe Reinheit) P-81^S, Papier

Carboxymethylcellulose z. B. Whatman Arten CM-1», Flocken CM-11«, Pulver CM-22®, Fasern CM-23*, Fasern CM-32®, trocken, mikrokörnig CM-52® naß, mikrokörnig

CM-82*, Papier z. B. Bio-Rad Art Cellex® CM, Fasern

Carboxymethyl-dextran

z. B. Pharmacia Art CM-Sephadex®

Phosphoryl-cellulose

z. B. Bio-Rad Art Cellex* P, Fasern

ίο

Carboxymethyl-agarose

ζ. B. Bio-Rad Art CM Biogel® A

z. B. Pharmacia Art CH-Sepharose® 4B

Siilfopropyl-der'ran

z. B. Pharmacia Art SP-Sephadex® '

Eine Tabelle, die verschiedene Paare von spezifisch bindenden Substanzen mit unterschiedlichen pl-Werten auf zählt, ist im folgenden angegeben.

Liste Substanz	Pl	Zweite Substanz	pi
11B.,-Antigen	3.5-5	Anti-f IBs	7-8
Thyroxin-bindendes Cilobiilin	4.5	Anti-'ΠΚ;	7-8
(TBCi)
Albumin	4.5	Anti-Albumin	7-8
IgCi	7-«	Carbamyliertcs Anti-IgG	5
Thyroic1-stimulierendes Hormon	4,5	C'arbamylicrtcs Anti-TSII	5
(TSH)
lenitin	5.4	Anti-Fcrritin	7-8
Alkalische Phosphatasc (Al')	4J-5	Anti-AP	7-8
Fibrinogen	5,5	Anti-Fibrinogen	7-8
FoI Ii kel-sli mutierendes Hormon	3,0	Anti-FSH	7-8
(FSH)
Insulin	5,6	Anti-Insulin	7-8
l.yso/.ym	10-11	Anli-Lysozym	7-8
Plasminogen	6,5-8	C'arbamyliertes Anti-Plasminogen	5
Pro'.hronibin	4.6	Anti-Prothrombin	7-8
Thyroglobulin	4,5	Anti-Thyroglobulin	7-8
Transcobalamin	6.2	Anti-Transcobalamin	7-8
Thyroxin	7,5	Thyroxin-bindendes	4,5
		Globulin (TBG) oder
		Anti-Thyroxin	7-8
l.uteinisierencles Hormon (LH)	5	Anti-LH	7-8

Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar auf den Nachweis bzw. die Bestimmung der ersten und/ oder zweiten Substanz durch entsprechende Auswahl von anionischen bzw. kationischen Ionenaustauschermaterialien nach den oben angegebenen Richtlinien.

Der Ionenaustauscher kann irgendeine physikalische Form annehmen, die eine Wechselwirkung zwischen den Austauscherstellen und den entsprechenden nichtspezifischen Bindungsstellen der nachzuweisenden Substanz erlaubt und die ferner eine Wechselwirkung der adsorbierten zu bestimmenden Substanz mit dem markierten Bindungspartner ermöglicht. Er kann eine Vielzahl von Formen von festen unlöslichen Materialien, üblicherweise polymerer Natur, annehmen. Teilchen, wie z. B. Pulver, Perlen, Fäden und Kristalle, sind bevorzugt aufgrund der verhältnismäßig großen verfügbaren Oberfläche. Es können jedoch auch Schwämme, Folien, Streifen, Kissen u. a. Matrizes und Gitterstrukturen angewandt werden, und die Bestimmung kann auch in 5s einem Gefäß, wie einem Reagenzglas oder auf einer Tüpfelplatte durchgeführt werden, wobei das Gefäß oder die Platte ganz oder teilweise aus dem Ionenaustauscher besteht Neben der großen Oberfläche kann ein teilchenförmiges Produkt bequem in ein Reaktionsgefäß oder eine Reaktionskammer eingebracht werden und leicht in einer Säule, durch die die Reagentien hindurchfließen, angewandt werden.

Ein Beispiel für ein säulenförmiges Prüfmittel, wie es erfindungsgemäß bevorzugt angewandt wird, ist in F i g. 2 der Zeichnungen angegeben. Dieses säulenförmige Prüfmittel umfaßt einen zylindrischen rohrförmigen Körper 11, der an einem Ende eine konische Spitze

12 besitzt. Der Körper besteht aus Polypropylen oder einem anderen geeigneten Material und ist mit Ventilen (Verschlußvorrichtungen) versehen, wie einer Kappe

13 am unteren Ende, die über den Spitzenbereich 12 paßt und diesen verschließt. Ein Bett 14 aus ^etn lonenaustauschermaterial in Teilchenform, wird zwischen zwei porösen Polyäthylenscheiben 15 und 16 im unteren Teil des Körpers 11 festgehalten. Oberhalb der Scheibe 15 ist in dem Körper 11 ein Reservoir 17 vorgesehen. In F i g. 2 ist eine Menge eines flüssigen Puffers innerhalb des Reservoirs 17 angegeben. Eine abnehmbare obere Kappe 18 ist vorgesehen, um das obere Ende des Körpers 11 abzuschließen, wobei man eine integrale, geschlossene Einheit für den Versand und die Lagerung erhält. Das Volumen des gepackten Bettes beträgt vorzugsweise zwischen 0,25 und 2,0 ml. Der Körper 11 besitzt vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 5 und 30 mm und eine Höhe zwischen 50 und 150 mm.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, daß der Ionenaustauscher mit der zu untersuchenden Probe in Berührung gebracht, von nichtadsorbierten Teilen der Probe abgetrennt und dann mit dem markierten Bindungspartner in Berührung gebracht wird. Das Abtrennen der nichtadsorbierten Teile der Probe von den am Ionenaustauscher adsorbierten stellt eine Entfernung von möglicherweise störenden Substanzen aus der Probe sicher, die, wenn sie während des Zusammenbringens mit dem markierten Bindungspartner in der Probe blieben, die Reproduzierbarkeit negatrv beeinflussen könnten, indem sie zu einer unspezifischen Bindung der markierten Substanz führen wurden oder auf andere Weise. Diese Abtren-

nung wird bequemerweise erreich: durch Waschen des Ionenaustauscherharzes mit einem Puffer mit einem pH-Wert zwischen den pl-Werter, der zu bestimmenden Substanz und des markierten Bindungsparinecs.

Die Bestimmung der Menge an markierter Substanz, die entweder (i) mit dem Ionenaustauscher verbunden ist durch Bindung des markierten Bindungspartners an die adsorbierte zu bestimmende Substanz oder (ii) nicht mit dem Ionenaustauscher verbunden ist, kann auf zwei verschiedene Arten erreicht werden. Erstens kann, wenn die Bindung des markierten Bindungspartners an die adsorbierte zu bestimmende Substanz meßbare t:ige^r,schaften der Markierungssubstan/ meßbar ändert, das Ausmaß dor Änderung dieser Eigenschaft direkt in dem Gemisch bestimmt werden, das bei Zugabe des markierten Bindungspartners zu dem Ionenaustauscher entsteht, und zwar im wesentlichen entsprechend der »homogenen« Bindungsbestimmung, wobei die »gebundene« von der w'reien« Form der Markierungssubstanz nicht getrennt werden muß. Eine solche Situation kann auftreten, wenn die Markierungssubstanz ein Enzym oder Coenzym oder eine andere Substanz ist, die überwachbare Eigenschaften besitzt und die Bindung des markierten Bindungspartners und der adsorbierten zu bestimmenden Substanz, entweder durch Hemmung oder durch Verstärkung die enzymatische oder coenzymatische Aktivität oder eint· andere Eigenschaft der Markierungssubstanz beeinflußt.

Bei der /weiten Arbeitsweise /ird die Trennung zwirchen dem Ionenaustauscher und irn wesentlichen dem gesamten, nicht mit ihm über Bindungen mit der adsorbierten zu bestimmenden substanzverbundenen markierten Bindungspartner durchgeführt und die Menge oder eine veränderliche Eigenschaft der Markierungssubstanz entweder in Verbindung mit dem Ionenaustauscher oder in der abgetrennten Menge bestimmt. Dieses Verfahren ist erforderlich, wenn die Markierungssubstanz durch die Bindung zwischen dem markierten Bindungspartner und der zu bestimmenden adsorbierten Substanz nicht beeinflußt wird. Es kann jedoch auch angewandt werden, wenn Eigenschaften der Markierungssubstanz angegriffen werden. Beispiele für die erste Art von Markierung, die besonders für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist, sind radioaktive Substanzen, wie ³H, ¹³¹J und ¹²⁵J. Es kann jedoch irgendeine der bekannten Markierungssubstanzen angewandt werden, wie sie üblicherweise bei Bindungsbestimmungen angewandt werden. Die bei diesem Verfahren erforderliche Abtrennung wird bequemerweise durchgeführt, indem man den Ionenaustauscher wie oben angegeben wäscht. Die Menge an Markierungssubstanz, die mit dem gewaschenen Ionenaustauscher verbunden bleibt oder in den Waschflüssigkeiten enthalten ist, kann in Zusammenhang gebracht werden mit dem Vorhandensein oder der Menge der zu bestimmenden Substanz in der untersuchten Probe durch einen Vergleich mit einer negativen Probe bzw. einer Standardkurve. Es können auch andere Verfahren angewandt werden, um die gewünschte Trennung zu erzielen, wie ein Zentrifugieren oder Filtrieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet zum Nachweis von Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HB₅) in flüssigen Proben, wie Serum oder Plasma. Der pl-Wert für HB₅-Antigen fällt grob gesagt in den Bereich von 3,5 bis 5 und liegt für Anti-HB_S etwa bei 8. Die Bestimmungsbedingungen werden daher so gewählt, daß ein pH-Wert zwischen 5 und 8, vorzugsweise zwischen 6 und 8 angewandt wird und ein Ionenaustauschermaterial als Adsorbens verwendet wird. Geeignete lonenaustauschermateriaüen sind u. a. diäthylaminoäthylsubstituierte Polymere, besonders solche mit einem Polysaccharid- z. B. Cellulose- oder Dextran-

■, Rückgrat. DEAE-Cellulose ist besonders geeignet als Adsorbens für ΗΒ,-Antigen. Es wird auch in Betracht gezogen, daß ein Kationenaustauschermaterial, wie Carboxymethylcellulose, als Adsorbens angewandt werden kann, wenn der pl-Wert des markierten Anti-HB₅ auf einen Wert unter demjenigen von HB_S-Antigen verändert würde.

Ein besonders günstiges Verfahren zum Nachweis von HB^-Antigen in einer Serum- oder Plasmaprobe mit Hilfe eines Anionenaustauschermaterials in Tcilchcn-

i-, form in einer Säule umfaßt die folgenden Stufen:

a) Einbringen der Probe in eine Säule, enthaltend ein Anionenaustauschermaterial in Teilchenform, das in einer Flüssigkeit wie einen¹. Puffer mit cincrn pH-Wert zwischen 5 und 8. vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 äquilibriert ist.

b) Durchleiien einer Flüssigkeit, wie eines Puffers mit einem pH-Wert zwischen 5 und 8, vorzugsweise zwischen 6,i und 7,5 durch die Säule, um im wesentlichen das Ganze nicht an das Anionenaus-

'' tauschermatenal adsorbierte HB_S-Antigen zu ent

fernen;

c) Zugabe eines vorher bestimmten Volumens einer Lösung von radioaktivmarkiertem Anti-HB_S mit einer vorbestimmten Radioaktivität zu dem Anionenaustauschermaterial;

d) Inkubieren der Lösung aus radioaktivmarkiertem Anti-HBs im Kontakt mit dem Anionenaustauschermaterial. und zwar 0,5 bis 18, vorzugsweise 1 bis 3 hbei einer Temperatur zwischen 4 und 50⁰C.

^!> vorzugsweise zwischen 40 und 50^cC:

e) Durchleiten einer Flüssigkeit, wie eines Puffers mit einem pH-Wert zwischen 5 und 8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 durch die Säule, um im wesentlichen das gesamte, nicht mit dem Anionen-

austauschermaterial über Bindungen an adsorbiertes HB_S-Antigen verbundene radioaktiv markie-te Anti-HBs zu entfernen:

f) Messung der Radioaktivität des Anioi~nai:stauschermaterials oder des Eluats aus der vorigen

⁴' Stufe und

g) Vergleich der gemessenen Radioaktivität in der vorigen Stufe mit derjenigen, die nach dem gleichen Verfahren gemessen worden ist unter Verwendung einer flüssigen Probe, enthaltend keine

nennenswerten Mengen an HB_S-Antigen anstelle der Serum- oder Plasmaprobe.

Beispiele für Puffer, wie sie in den Stufen a), b) und e) angewandt werden können, sind Phosphatpuffer. Bar bitalpuffer, Citratpuffer, Tris-(hydroxymethyl)-amino- methan-(TRIS)-Puffer, 4-(2-Hydroxyäthyi)-1 -päperazinäthansu!fonsäure(HEPES)-Puffer und 1,4-Piperazin-bis-(äthansulfonsäureXPIPES)-Puffer.

Die speziellen Vorteile des erfindungsgemäßen Ver-

fahrens zum Nachweis von H B₅-Antigen gegenüber bekannten Verfahren umfassen die Herstellungsvor teile, indem kein unlöslich gemachtes Anti-HB_S erforderlich ist, das ein wesentlicher Kosten- und Stabilitätsfaktor bei den meisten bekannten Verfahren ist und die Anwendungsvorteile, daß nur eine einzige Inkubationsstufe und weniger einzelne Verfahrensschritte notwendig sind, die Ionenaustauscher besser lagerfähig sind, die Empfindlichkeit erhöht wird und das Verfahren

auch zum Nachweis von HB₅-Antigen in Form seines Immunkomplexes geeignet ist.

Neben dem Nachweis von HBs-Antigen kann das erfindungsgemäße Verfahrein leicht angewandt werden (geeignet gemacht werden) zum Nachweis von HBs-Antigen ir. Form seines Immunkomplexes mit Anti-HB_S und auf den Nachweis von Anti-HB_S selbst

Der Nachweis von HB₅-Antigen, das an Anti-H B₅ gebunden ist, d. h. in Form des Immunkomplexes vorliegt, wird folgendermaßen durchgeführt:

a) Zusammengeben der zu untersuchenden Probe eines die immunochemische Bindung schwächenden Mittels (»Lockerungsmittel«) und eines festen Ionenaustauschers, der imstande ist unter entsprechenden, dafür günstigen Bedingungen, das HB₅-Antigen unspezifisch zu binden;

b) Abtrennung des gebundenen »Lockerungsmittels« von dem Ionenaustauscher, z. B. durch Waschen und

c) Bestimmung des ΗΒ,-Antigens, das an dem Ionenaustauscher gebunden ist.

Unter einem die »immunochemische Bindung schwächenden bzw. Lockerungsmittel« ist eine Substanz zu versehen, die imstande ist, die Affinität von ArUi-HB₅ gegenüber H B₅-Antigen in Gegenwart des Adsorbens herabzusetzen, so daß mindestens eine antigene Determinante an dem H B₁-Antigen verfügbar ist nach Abtrennen des gebundenen, die Bindung schwächenden Mittels vor dem Ionenaustauscher. Ein solches die Bindung schwächendes Mittel kann eine Säure oder ein Alkali oder eine andere Substanz sein, die für diesen Zweck bekannt ist, wie solche, die als »Chaotrope Mittel« bezeichnet werden, z.B. Harnstoff, Guanidin oder Thiocyanat (Immunochem. 1:289—293 (1964), Bio ehem. Biophys. Acta 107: 593—596 (1965) und Arch. Biochem. Biophys. 116:82—91 (1966)). Die Anwendung eines Ionenaustauschermaterials wie DEAE-Cellulose und einer Harnstofflösung, vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 2 und 8 m, ist besonders wirksam für dieses Verfahren zum Nachweis des ΗΒ,-Antigen-Immunkomplexes. Die an den Ionenaustauscher gebundene Menge an HB,-Antigen kann nach irgendeinem bekannten Verfahren bestimmt werden. Sie wird jedoch vorzugsweise bestimmt durch Zugabe von markiertem Anti-HB, und Messung der Menge an Markierungssubstanz, die mit dem Ionenaustauscher verbunden wird, wie oben beim Nachweis von HB,-Antigen angegeben.

Anti-HB, kann entsprechend dem oben abgegebenen, allgemeinen Verfahren bestimmt werden, d.h. indem man die zu untersuchende Probe mit einenn Ionenaus· tauscher zusammenbringt, anschließend mit markiertem HB,-Antigen und die Menge an Markierungssubstanz bestimmt, die entweder mit dem Ionenaustauscher verbunden wird oder in freier Form vorliegt.

Im allgemeinen umfassen die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Prüfmittel — üblicherweise in Form eines Testsystems oder einer Analyseneinheit — a) einen festen Ionenaustauscher der imstande ist, ufsspezifisch mit der zu bestimmenden Substanz Bindungen einzugehen und b) eine markierte Form «ines spezifischen Bindungspartners zu der zu bestimmenden Substanz. Das Prüfmitte! kann zusätzlich einen flüssigen Puffer zur Durchführung von einem oder mehreren Waschschritten enthalten, wie sie bei der Durchführung des Bcstim mungsverfahrens bevorzugt sind. Die Art des Ionenaustauschers, der Charakter, d. h. pH-Wert des Puffers und die Art der Markierungssubstanz werden nach den oben im Zusammenhang mit den Bestimmungsverfahren diskutierten Kriterien ausgewählt Wenn das Prüfmittel zum Nachweis von HB₅-Antigen-Immunkomplex angewandt werden soll, enthält es zusätzlich eine Lösung des entsprechenden Mittels, das die immunochemische Bindung lockert

πι Der Ionenaustauscher befindet sich vorzugsweise in einer Säule und liegt dort vorzugsweise in Form einzelner Teilchen vor, wie oben näher erläutert Die Säule ergibt nicht nur ein bequemes System zum Zugeben der Probe und des markierten Bindungspartners zu dem Ionenaustauscher, zum Waschen und zur Messung der Radioaktivität, wenn die Markierungssubstanz eine radioaktive Substanz ist sondern auch eine Möglichkeit, die zu bestimmende Substanz aus der Probe in dem Prüfmittel zu konzentrieren. Die Säule ermöglicht es, ein verhältnismäßig großes Volumen der Probe durch den Ionenaustauscher hindurch oder an ihm vorbeizuleiten, wodurch die zu bestimmende Substanz im Verhältnis zu einem später aufzubringenden, markierten Bindungspartner wirksam konzen- triert wird.

Zusätzlich kann die wirksame Konzentration an zu bestimmender Substanz erhöht werden, indem man die Probe zunächst zur Ausfällung der zu bestimmenden Substanz behandelt, den Niederschlag gewinnt und erneut in einem kleineren Volumen Lösungsmittel löst Die entstehende Lösung der zu bestimmenden Substanz kann dann auf dem Ionenaustauscher aufgebracht werden und das Bestimmungsverfahren, wie oben angegeben, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann man

)') zum Nachweis von HB₅-Antigen Polyäthylenglykol zu einer Serumprobe geben, um H B,- Antigen auszufällen, dieses Gemisch zentrifugieren oder nitrieren und das HB_S-Antigen in einem kleinen Volumen Puffer lösen. Die entstehende Lösung enthält eine wesentlich höhere Konzentration an HB_S-Antigen als in der ursprünglichen Serumprobe vorhanden war.

Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann angewandt werden für den qualitativen Nachweis oder die quantitative Bestimmung irgendeiner Substanz, für

4> die ein natürlicher oder synthetischer spezifischer Bindungspartner existiert, z. B. Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, Glykoproteine, Steroide, antigene Teilchen usw. Zum Beispiel können die folgenden Substanzen mit Hilfe des erfindunftsgemäßen Bestimmungs-

Ki Verfahrens und Prüfmittels nachgewiesen bzw. bestimmt werden: Hormone, wie Tetrajodthyronin (Thyroxin) und Trijodthyronin; Enzyme, wie Milchsäuredcihydrogenase und alkalische Phosphatase; therapeutische Mittel, wie Gentamicin und Diphenylhydan- toin, Virusteilchen, wie HBi-Antigen und Bakteriophagen; ganze Bakterienzellen und Nucleinsäuren, wie Desoxyribonucleinsäure (DNS) und Ribonucleinsäure (RNS), um nur einige wenige zu nennen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet zum Nachweis und zur Bestimmung von Antigenen und Haptenen und deren Antikörpern, besonders HBs-Antigen und AnIi-HB,. Verschiedene flüssige Proben können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden, besonders physiologische oder biologische

h"> Flüssigkeiten, wie Sera, Plasma, Urin, Speichel und amniotische, Cerebral- und Spinalflüssigkeitcn.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel I

B. Bestimmungsverfahren

1. Die obere Kappe wurde entfernt und die Säule in ein Gestell zum Ablaufen gegeben;

2. 200 μ! der zu untersuchenden Serum- oder Plasmaprobe oder einer negativen Vergleichsprobe wurden zu dem Puffer in dem Reservoir über dem DEAE-Cellulose-Harz-Bett gegeben. Die Säule wurde leicht geschüttelt, um die Probe und den Puffer zu vermischen und dann durch Entfernen der unteren Kappe die Flüssigkeit abgezogen;

3. Das Harzbett wurde nacheinander mit zweimal je 4 ml 0,02 m Phosphatpuffer (pH 6,8) gewaschen;

4. Nach vollständigem Ablaufen wurden 200 μΙ ¹²⁵J-AMi-HB₅ (spezifische Aktivität des markierten Anti-HB,= 14-20 vC\l\Lg (Gesamtaktivität = ungefähr 50 000 Zählung pro Minute (cpm)) auf das obere Ende des Harzbettes gegeben und konnten nach erneutem Aufsetzen der Bodenkappe in das Harz eindringen. (Das angewandte Anti-HB, war gebildet worden gegen ΗΒ,-Antigen und gereinigt nach dem Verfahren von Ling und Overby, J. Immunol. 109: 834 (1972) und markiert nach dem Chloramin-T-Verfahren nach Hunter und Greenwood, Nature 194: 495 (1962));

5. Die Säule wurde dann entweder (i) zwei Stunden bei 45"C inkubiert (»2 h/45°C«-Bestimmung) oder (ii) über Nacht bei Raumtemperatur, d. h. 22°C, inkubiert (»Übernacht/RT«-Bestimmung);

6. Die untere Kappe wurde entfernt und das Harzbett nacheinander mit zweimal 4 ml 0.02 m Phosphatpuffer (pH 6,8) gewaschen;

15

Radioimmunologische Adsorbtionsbestimmung
(RI-Ad™) für Hepatitis-B-Oberflächenantigen

Dieses Beispiel beschreibt ein Bestimmungsverfahren zum Nachweis von HB_S-Antigen mit Hilfe eines lonenaustauschermaterials als unspezifisches Adsorbens. Die Genauigkeit des RI-Ad-Verfahrens wurde gegenüber dem United States Bureau of Biologies (BOB) Reference Panel Nr. 3 nachgewiesen. Die Empfindlichkeit des RI-Ad-Verfahrens wurde bestimmt gegenüber dem »Ausria® II radioimmunoassay test kit« der Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois USA.

A. Herstellung der Säulen

Die Säulen bestanden aus 0,5 ml abgesetztem lonenaustauscherharz, DEAE-Cellulose Typ DE-52 (Whatman Inc, Clifton, New Jersey USA.), das zwischen zwei porösen Polyäthylenscheiben in einer Polyäthylensäule von 9,5 χ 75 mm festgehalten wurde. Die Säulen waren am oberen und unteren Ende mit Kappen verschlossen, nachdem sie mit einem Volumen 0,02 m einbasischem Natriumphosphat: zweibasischem Natriumphosphat-Puffer (im folgenden als »Phosphatpuffer« bezeichnet) bei pH 6,8 äquilibriert worden waren. Das Puffervolumen reichte aus, um das Harzbett zu sättigen und ungefähr 1 ml Puffer in dem Reservoir über dem Bett zu ergeben. Die Geometrie der Säule war so gewählt, daß die Messung der von dem Harzbett abgegebenen Strahlung leicht mit üblichen Gammastrahlen-Zählvorrichtungen (wie dem Gammacord der Arnes Company Division der Miles Laboratories, Ina, Elkhart, Indiana USA.) gemessen werden konnte. Die allgemeine Form der vollständigen Testsäule war ähnlich der in F i g. 2 der Abbildungen angegebenen.

25

30

v,

-to

7. Nachdem die Säule vollständig abgelaufen war, wurde die Bodenkappe erneut aufgesetzt und die Säule in die öffnung eines Gammazählgerätes, wie des obengenannten Gammacord, gegeben und die Radioaktivität gezählt (bei einem alternativen Verfahren wurden die Waschflüssigkeiten der obigen Stufe 6) gesammelt und ihre Gesamtradioaktivität gemessen;

8, Eine positive Probe wurde bestimmt als eine solche, die eine Radioaktivität des Harzbettes von mehr als (oder eine Radioaktivität der Waschflüssigkeiten von weniger als) dem Bezugswert ergab, der als Mittel der Zählungen der Gammastrahlung des Harzbettes (cpm, gebunden) (oder der Waschflüssigkeiten bei dem Alternativerfahren) aus mindestens 7 Versuchen einer negativen Vergleichsprobe plus (oder minus bei dem Alternativverfahren) der vierfachen Standardabweidr--<ig berechnet worden war. Ein Beispiel für eine Berechnung eines Bezugswertes, bei dem die Radioaktivität des Harzbettes gemessen wurde, ist folgende:

Es wurden sieben Parallelproben eines negativen Vergleichs getrennt nach dem Eestimmungsverfahren untersucht und die Zählungen pro Minute (cpm) an radioaktiver Strahlung in dem Harzbett (cpm, gebunden) für jeden Ansatz notiert.

Ansatz Nr.	cpm gebunden
I	1459
2	1488
3	1398
4	1444
5	1543
6	1487
7	1 387
Gesamt	10 206
Mittel	1458
Standard-Abweichung	±54
Bezugswert (cut-off)	1458 + (4x54)=1 678
Daher ist jede untersuchte Probe mit cpm ge
bunden, >1678 als positiv für HB5-Antigen anzu
sehen.

C. Genauigkeit
Durchführung mit dem BOB-Panel

Jede BOB-Panel-Probe wurde nach Hern 2 h/45°C und Über-Nacht/RT-Verfahren untersucht. Die Ergebniss'ü sind in Tabelle 1 angegeben. In der Tabelle stehen die IJOß-Codes für die folgenden Bedeutungen.

BOB-Code Bedeutung

A Enthält verhältnismäßig viel ΗΒ,-Antigen,

das nach allen gängigen Methoden nachweisbar ist.

B Enthält weniger H B₅-Antigen, nachweisbar

durch Gegenelektrophorese, umgekehrte passive Latexagglutination, umgekehrte passive Hämagglutination und radioimmunologische Bestimmung.

C Enthält noch weniger HB> Antigen, nach

weisbar zuverlässig nur durch umgekehrte passive Hämagglutination und radioimmunologische Bestimmung.

Fortsetzung

18

BOB-Code Bedeutung

(C) Enthält wenig HB_S-Antigen, gelegentlich

nachweisbar durch radioimmunologische Bestimmung.

D Enthält sehr wenig HB_S-Antigen, nach

gängigen Verfahren nicht nachweisbar.

N Enthält tatsächlich kein HB₅-Antigen.

D^:e Berechnungen der Bezugswerte für die 2 h/45°C und Ober-Nacht/RT-Verfahren ergaben folgende Werte:

Tabelle 1

Bezugswertberechnung 2 h/45°C Über-Nacht/RT

Mittel der cpm 3374 5404

gebunden für die negativen Vergleichsansätze

Standardabweichung ±117 ±

(S.D.)

Prozentualer Variations- 3,46 2,27

koeffizient (% CV.)

Bezugswert (cpm) 3842 5896

Proben-Nummer

BOB
Code

Cpm (2 h/45°C) Probe Probe-CO*)

Cpm (über Nacht/RT)

Probe Pnbe-CO*)

302
303
304
306
311
312
315
317
318
319
320
323
326
327
330
331
332
333
336
337
338
343
344
349
350

(C)

(C)

3 403 3 48!

8 160 22 377

3 680 21 122

3411

3 325 21 570 18 378 24 730

5 569

18 589

2 776 21 360

3 182

9 993 9 891

21 471

19 724

4 793 4 606 4 388 3 625

22 265

Neg
Neg
+ 4318
+ 18 535
Neg
+ 17 280
Neg
Neg
+ 17 738
+ 14 536
+ 20 888
+ 1 727
+ 14 747
+ 23 934
+ 17518
Neg
+ 6 151
+ 6 049
+ 17 629
+ 15 882
+ 951
+ 754
+ 546
Neg
+ 18 423

4 960 -!478

12 100 24 197

4 202

24 095

5 853 4 970

25 8SO

22 731 30 057

7 721 21 773 32 403 25 155

4 838 16 709

13 684 29 233

23 139

6 672 6 236 6 939 6 446

28 162

Neg Neg + 6 + 18 Neg + 18 Neg Neg + 19 + 16 + 24 + 1825 + 15 + 26 + 19 Neg

+ 10813 + 7 + 23 + 17 + + I + 1 + + 22

*) cpm gebunden der Probe minus Bezugswert (CO).

Das RI-Ad-Verfahren gab bei beiden Inkubationsbedingungen korrekt jede BOB-Panel-Probe mit einem Code von A, B oder C wieder. Es traten keine falschen positiven Werte auf, da jede als N bezeichnete BOB-Pcnel-Probe ein negatives Ergebnis lieferte. Weiter stellte sich die BOB-Panel-Probe Nr. 343, die als (C) bezeichnet war, nach dem RI-Ad-Verfahren bei beiden Inkubationsbedingungen als positiv heraus und selbst eine als D bezeichnete Panel-Probe, nämlich die Nr. 349, ergab bei dem Über-Nacht/RT-Verfahren einen positiven Wert.

D. Empfindlichkeit

Vergleich mit Ausria Il

Drei positive BOB-Panel-Proben (Proben 312, und 336) und eine negative Probe (317) wurden ausgewählt Es wurden jeweils Verdünnungen zwischen 1 : und 1 :64 000 hergestellt. Die ausgewählten Verdünnun-

55 gen wurden nach dem RI-Ad-Verfahren unter beiden Inkubationsbedingungen, d. h. 2 h/45"C und Über-Nacht/RT (ON) untersucht mit Hilfe von Ausria-II-kits (Abott Laboratories, North Chicago, Illinois U.S.A.) nach dem in dem Produktprospekt angegebenen Ver-

60 fahren (der Prospekt gibt an, daß ein »P/N-Verhältnis« von 2,1 oder darüber ein positives Ergebnis bedeutet). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Die Berechnungen der positiven Bezugswerte für das RI-Ad-Verfahren sind am Ende der Tabelle angegeben. »N.C.«

b5 bedeutet das Mittel für cpm gebunden für die negativen Vergleichsansätze; »S.D.« Standardabweichung und »% C.V.« prozentualer Variationskoeffizient. Das RI-Ad-Verfahren erwies sich unter beiden Inku-

bationsbedingungen als mindestens ebenso empfindlich wie das Ausria Η-Verfahren und unter bestimmten Umständen zeigt es eine größere Empfindlichkeit. Zum Beispiel wurde die 1 :64 000 Verdünnung der Panel

Nr. 312 (Code A) mit Hilfe des 2 h RI-Ad-Verfahrens als positiv, aber nach dem Ausria Il-Verfahren als negaiiv bewertet.

Tabelle 2	BOB #315 (A)	O. N.	Ausria I! P/M	BOB#	326 (C)	Ausria Il P/KJ	BOB ff	33b (B)	Ausrta Il p/ki	BOB*	317 (N)
Verdünnung	Rl-Ad, cpm		Γ/ IN Ratio	R!-Ad,	cpm	if IN Ratio	Rl-Ad,	cpm	r/IN Ratio	Rl-Ad,	cpm
	2h	—		2h	O. N.	8,3	2h	O. N.		2h	O N.
		—	—	5954	8235	4,1	_	_	—
1/50	—	—	—	4454	5280	2,2	—	—	—	—	—
1/100	—	—	—	4454	5280	Neg	-	—	10,0	—	—
1/100	—	9385	—	3983	4220	Neg	3880	5352	4.8	Neg	Neg
1/200	—	—	58,3	3377	3719	—	3166	4161	—	Neg	Neg
1/400	6238	7836	—	—	—	Neg	—	—	2,5	—	—
1/500	—	—	43.7	3066	3351	—	3090	3607	—	Neg	Neg
1/800	62i0	6590	—	—	—	Neg	-	—	Neg	—	—
!/!000	—	—	313	J940	Neg	—	2924	3385	—	Neg	Neg
1/1600	5275	5346	—	...	—	Neg	—	—	Neg	—	—
1/2000	—	—	21,1	Neg	Neg	—	Neg	Neg	—	Neg	Neg
1/3200	4390	4288	—	—	—	Neg	—	—	Neg	—	—
1/4000	—	—	10,6	—	—	—	Neg	Neg	—	Neg	Neg
1/6400	3725	3774	—	—	—	—	—	—	Neg	—	—
1/8000	—	3459	5,7	-	—	—	Neg	Neg	—	Neg	Neg
1/12800	3349	Neg	3,0	—	—	—	—	—	—	—	—
1/16000	3102	J010	Neg	—	—	—	—	—	—	—	—
1/32000	2979	±97		-	-		-	-		-	-
1/64000	2571	U		2571	3010		2571	3010		2571	3010
N.C-Mitlel	±90	3398		±90	±97		±90	±97		±90	±97
S.D.	3,5			3,5	3.2		3.5	3,2		3,5	32
% C. V.	2931			2931	3398		2931	3398		2931	3398
Bezugswert

Auch die Verdünnungen 1 :200 und darüber der Panel-Probe 326 (Code C) wurden nach beiden RI-Ad-Verfahren als positiv bewertet, während mit Ausria II nur die Verdünnung von 1 :100 und darunter nachgewiesen werden konnte. Bei der gleichen Panel-Nr. ergab des RI-Ad-Verfahren bei 2 h positive Ergebnisse bis herab zu einer Verdünnung von 1 :1600(16fach größere Empfindlichkeit als Ausria H) und das RI-Ad-Verfahren über Nacht positive Ergebnisse bis herunter zu einer Verdünnung von 1 :800 gefach größere Empfindlichkeit als Ausria II). Außerdem erhielt man bei der Panel-Probe 33o (Code B) bei beiden RI-Ad-Verfahren positive Ergebnisse bis herunter zu der 1 :1600 Verdünnung, während positive Ergebnisse mit Ausria Il bei I :800 aufhörten (2fach größere Empfindlichkeit als Ausria II). Alle untersuchten Verdünnungen der negativen Panel-Probe (317) erwiesen sich auch hier als negativ.

Beispiel 2

Radioimmunologisi'he Adsorptionsbestimmung

(Rl-Ad™) für Hepatiti«B-Oberflächenantigen in Form

des Immunkomplexes mit dem Antikörper

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von ΗΒ,-Αη«. gen, das mit Anti-HB_S einen Koutplex gebildet hat, & h. in Form des Immunkomplexes vorliegt In diesem Beispiel wird die Möglichkeit HBs-Antigen in Serumproben, enthaltend Anti-HB* nachzuweisen sowie die Möglichkeit, HB₅ in Form seines Immunkomplexes in künstlich hergestellten Proben nachzuweisen, gezeigt

A. Herstellung der Säulen

so Die Säulen wurden entsprechend Beispiel 1 hergestellt.

B. Bestimmungsverfahren

1. Bei aufgesetzter, unterer und abgenommener oberer Kappe wurde der Phosphatpu/fer aus der Säule ausgegossen und durch 1 ml 3 m Harnstofflösung in 0,02 m Phosphatpuffer (pH 6,8) ersetzt

2. 200 μΙ der zu untersuchenden Serium- oder Plasmaprobe oder eiiier negativen Vergleichsprobe wurden zu dem Harnstoff-Puffer in dem Reservoir gegeben. Die Säulen wurden leicht geschüUelt, um die Probe mit dem Puffer-Harnsloft'lu vermischen und 10 min stehengelassen, bevor die Lösung durch

h5 Entfernen der unteren Kappe abgelassen wurde.

3. Nach dem Abziehen der Flüssigkeit wurde, wie in Teil B von Beispiel I gearbeitet, beginnend mit Stufe 3).

C. Nachweis von HB.-Antigen in Serum mit endogenem Anti-HI}.,

Ein negatives Vergleichsscrum und ein im Hnndel erhältliches (comm.) Serum, enthaltend eine geringe Menge ΗΒ,-Antigen und An:i-HB„ wurden nach dem

wie üben modifizierten Rl-Ad-Verfahrcn mit einer Inkubation 2 h/45'C". nach dem Ausria 11-Verfahren, das in dem vorigen Beispiel erwähnt ist. und dem Ausab*- Vci fahren (Abbott Laboratories. North Chicago. Illinois U.S.A. — radioimmunoassay for anti-IIB,) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

IVoK

iIiMi. Serum
) epm üchim

modifiziertes Kl V:	I. ι pm	Ausn.i Il
IV. .he	1'!..Ih- ( O)	I" N Wrli.i
331 i	N ei:	Neu
4") 74	* >2 I	N eg

der PmK- minus Hc^s/iii's-.\ ι ri Aus,ih

Kl Λ I min-'

Die Daten /eigen, daß das modifizierte Rl-Ad-Verfahrcn geeignet ist. HB,-Antigen in Gegenwart von endogenem Anti-HB, (verifiziert durch die Ansah Ir gebnisse) nachzuweisen, während das Ausria II-Verfahren hierzu nicht geeignet ist.

Um das Vorhandensein von ΗΒ,-Aniigen in dem im Handel erhältlichen Serum m bestätigen, wurde ein Zentrifugationsversuch durchgeführt. Eine Probe des im Handel erhältlichen Serums wurde in Glycinpuffer (pH 2,0) equilibriert und .auf einen Saccharosegradienten von 5 bis 20 Gew.-% aufgebracht. Das Gemisch aus Probe und Gradienten wurde 3 h mit 36 000 UpM zentrifugiert. Fraktionen, die sich im unteren Teil des Zentrifugenglases befanden, erwiesen sich nach dem Ausria Il-Verfahren als HB,-Antigen positiv. Das bestätigt das Vorhandensein von HB -Ami gen in dem im Handel erhältlichen Serum und bestätigt deutlich, daß ΗΒ,-Antigen, wenn es durch Zentrifugieren von Anti-HB, abgetrennt ist. durch das Ausria 11- Verfahren nachgewiesen werden kann, während es in dem im Handel erhältlichen Serum, in dem es mit Anti-HB, einen Komplex gebildet hat. nicht nachweisbar war.

D. Nachweis von ΗΒ,-Antigen in Form seines Immunkomplexes

Es wurde eine Reihe künstlicher Testproben hergestellt durch Zugabe von zunehmenden Volumina HB.-Antigen positiven Serum /.u einem konstanten Volumen von Humanserum mit einem honen Anti-HB, Titcr. Die Fndvolumina wurden mit normalem Serum, das si)vv(\il in Beziehung auf HB,-Antigcn als auch auf Ami-! IB negativ war. ausgeglichen. Nach 20 Ii langer Inkubation wurde ein eventuell entstandener Niederschlag ab/enirifugiert und die überstehende Flüssigkeit als Probe gewonnen. |ede dieser Proben wurde nach dem m .-difizierten RI-Ad-Verfahren mit 2 h/45°C Inkubation, den Ausria Il-Verfahren und dem Ausab-Verfahren untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Die »Ag/Ab-Verhältnisse« sind die Volumenverhältnisse von HBvAntigen positivem Serum, das /u dem Volumen von Anti-HB. positivem Serum zugegeben worden war.

Mit Hilfe des modifizierten Rl-Ad-Verfahrcns konnte ΗΒ,-Antigen in Gegenwart von Anti-HB, bis auf den geringsten Gehalt an HB,-Antigen, der zugesetzt worden war (Ag/Ab-Verhältnis = 0.2). nachgewiesen werden. An dem Punkt, an dem Anti-HB, im Überschuß vorlag (Ag/Ab-Verhältnis ■ 0.·1). war es mit dem Ausria Il-Verfahren nicht mehr möglich, die Gegenwart von ΗΒ,-Antigen nachzuweisen. Das Vorhandensein von Anti-HB, konnte andererseits in den Proben mit einem Ag/Ab-Verhältnis von .veniger als oder gleich I.O mit dem Ausab-Verfahren nachgewiesen werden. Mit dem Ausab-Verfahren war es jedoch nicht möglich. Anti-HB, in Gegenwart von überschüssigem HB,-Antigen (Ag/Ab-Verhältnis ^-2.0) nachzuweisen.

Tabelle 4	modifiziertes R	!-Ad. cpm	Ausria Il	Ausab
Ag/Ab	Probe	Probe-CO·)	P/N Verhältnis	RIA Einheiten
Verhältnis (V/V)	34 654	+ 30 755	107.4	Neg
4.0	34 348	+ 30 449	127.9	Neg
3.0	29 902	+ 26 003	1465	Neg
2.0	9 143	+ 5 272	IU	16
!.0	5 337	+ 1 438	Neg	54 χ 10-
0.4	5 707	+ 1 808	N eg	512x10-'
0.2	3515	Nee	Neg	512x10-
0.0

*) cpm gebunden der Probe minus Bezugswert.

Beispiel 3

Untersuchung der Adsorptionscharakteristika

verschiedener Anionenaiistauschermaterialien für

HB,-Antigen

Die Fähigkeit der folgenden Anionenaustauschermaterialien HB_S-Antigen zu adsorbieren, wurde über einen nH-Bereich von 5,0 bis 8,0 untersucht.

(1) DEAE-Cellulose (Typ DE-52 - Whatman Inc., Clifton, New Jersey, U.S.A.)

(2) DEAE-Sephadex® (Pharmacia Fine Chemicals. Piscataway, New Jersey, U.S.A.)

(3) QAE-Sephadex® (Pharmacia)

(4) DEAE-Biogel® A (Bio-Rad Laboratories. Richmond. California, U.S.A.)

200 μΙ Volumina '»J-HB<-Antigen (25 ng/ml) wurden zu jeder von mehreren Säulen, enthaltend die verschiedenen Anionenaustauschermaterialien bei verschiedenen bekannten pH-werten zugegeben. Jede Säule wurde dann mit zweimal 4.0 ml Phosphatpuffer mit dem entsprechenden pH-Wert gewaschen. Die radioaktive Strahlung der Säulen wurde dann in einer Gammastrahlen-Zählvorrichtung gemessen. Die Ergebnisse sind graphisch in F i g. 3 angegeben.

Eine optimale Adsorption wurde für jedes der untersuchten Harze bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 beobachtet. DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex und QAE-Sephadex zeigten ähnliche maximale Adsorptionsaffinitäten gegenüber ΗΒ,-Antigen während DEAE-Biogel A eines etwas geringere Affinität für das Antigen besaij. Insgesamt zeigte es sich, daß DEAE-Cellulose das bevorzugte Harz für ein Säulenverfahren darstellte aufgrund seiner günstigen Durchflußgeschwindigkeit und minimalen Neigung ^l25J-Anti-HB, zu adsorbieren.

Beispiel 4

Radioimmunologische Adsorptionsbestimmung

(Rl-Ad™) von Hepatitis-B-Oberflächenamigen

(Alternativverfahren)

Dieses Beispiel beschreibt ein alternatives Rl-Ad-Verfahren zum Nachweis von HB_S-Antigen, wobei der Waschschritt zwischen dem Aufbringen der Probe und der Zugabe von markiertem AnU-HB₅ weggelassen wird. Die Genauigkeit dieses alternativen RI-Ad-Verfahrens wurde gegenüber dem BOB Reference Panel Nr. 3 (Beispiel 1) abgeschätzt.

Jede Panel-Probe wurde nach dem RI-Ad-Verfahren mit einer Inkubation von 2h/45°C, wie in Beispiel 1 beschrieben (unter Verwendung eines unterschiedlichen Ansatzes von ^l25J-Anti-HB_s), untersucht und nach dem gleichen Verfahren ohne die Waschstufe 3. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Die Berechnung di»r Bezugswerte für zwei Verfahren, d. h. »mit Waschstufo« und»nhne Waschstufe« sind am Ende der Tabelle angegeben. Die Abkürzungen sind die gleichen wie in Beispiel I. Ein negatives Ergebnis, d.h. wenn cptn gebunden geringer war als der Bezugswert, ist durch ein Minuszeichen angegeben. Der Unterschied in den Daten für cpm gebunden nach diesem Beispiel unter Anwendung der Waschstufe (Tabelle 5) und den in Beispiel 1 (Tabelle I) erhaltenen, beruht auf der Anwendung eines unterschiedlichen Ansatzes von '"JAnti-HB,.

211

Tabelle 5

Proben
Nr.

N.C. Mittel

% CV.

Bezugswert

BOB
Code

(C)

(C)

cpm, gebunden

mit Waschstiifc

I 865 (-) 1 84« ( - ) 8 010 17 136

1 734 ( -) 21 200

2 133 ( — )

1 934 ( -) 17 647

19 705

17 745 4 210

19 427

20 541

18 369

! 876 (-)

8 821

9 502 16319 18811

3 631 3 650

2 894

2 146 (-) 16417

1 814 ±86

4.7

2 158

ohne Waschstufe

1 784 (-)

I673(-J

3 360 6 963

1 760 ( -)

6 933

I 644 ( -)

1 734 (-) 8517

6 600

4 586

2 508 8 927 6718 6 132

1 821 (-)

3 339

4 371

5 605 11 807

2 841 2 802 2 722 2 482 5 251

1 939 ±98

5,05

2 331

Diese Daten zeigen, daß das Weglassen der ersten Waschstufe keinen Einfluß hat auf die Fähigkeit des RI-Ad-Verfahrens, eine positive Probe dieser BOB Panel-Proben mit einem Code von A. B oder C nachzuweisen.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (20)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer spezifisch bindenden Substanz in einem flüssi- s gen Medium, durch

a) Zusammenbringen der zu untersuchenden flüssigen Probe mit einem festen Adsorbens und mit einem spezifischen Bindungspartner zu der zu bestimmenden Substanz, wobei der Bindungspartner markiert ist und das Adsorbens mit der zu bestimmenden Substanz unspezifische Bindungen eingeht, und

b) Bestimmung entweder der Menge an Markierungssubstanz, die durch Bindung an die adsor- biene zu bestimmende Substanz mit dem Adsorbens verbunden ist oder der Menge an Markierungssubstanz, die nicht mit dem Adsorbens venbimden ist, _7Q

dadurch gekennzeichnet, daß man (1) einen solchen markierten Bindungspartner auswählt, dessen pl-Wert von demjenigen der zu bestimmenden Substanz verschieden ist; (2) als Adsorbens ein Ionenaustauschermaterial verwendet, und zwar einen Anionenaustauscfier, wenn der pl-Wert der zu bestimmenden Substanz niedriger liegt als derjenige des Bindungspartners, oder einen Kationenaustauscher, wenn der pl-Wert der zu bestimmenden Substanz höher liegt als der des markierten Bindungspartners und (3) die Stufe (a) bei einem pH-Wert zwischen dem pl-Wer. der zu bestimmenden Substanz und demjenigen des Bindungspartners durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man Stufe (a) durchführt, indem man

(i) die Probe zuerst mit dem Adsorbens zusammenbringt und (ii) anschließend das Adsorbens mit dem markierten Bindungspartner in Berührung bringt

3. Verfahren nach Anspruch ?, dadurch gekennzeichnet, daß man zwischen den Stufen (i) und (ii) das Adsorbens von dem nicht adsorbierten Teil aer flüssigen Probe abtrennt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Adsorbens bei einem pH- Wert zwischen dem pl-Wert der zu bestimmenden Substanz und dem des markierten Bindungspartners wäscht

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Adsorbens im wesentlichen gleichzeitig mit der Probe und dem markierten Bindungspartner zusammenbringt

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (b) zunächst den nicht über Bindungen mit der zu bestimmenden Substanz mit dem Adsorbens verbundenen Teil des markierten Bindungspartners von dem Adsorbens abtrennt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierung eine radioaktive Markierung verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Unterschied zwischen den pl-Werten der zu bestimmenden Substanz und des markierten Bindungspartners mehr als 0,5, vorzugsweise bs mehr als 2,0, beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch I bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz ein Antigen oder Hapten und der spezifische Bindungspartner ein Antikörper dazu ist

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HB_S-Antigen) ist

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet daß die zu bestimmende Substanz ein Antikörper zu Hepatitis-B-Oberflächtnantigen ist

IZ Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens in Teilchenform in einer Säule verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet daß das Adsorbens ein anionisches Ionenaustauschermaterial, insbesondere ein diäthylamirsoäthylsubstituiertes Polymer ist

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet daß das Polymer ein Polysaccharid ist

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das lonenaustauschermaterial eine diäthylaminoäthylsubstituierte Cellulose (DEAE-Cellulose) ist

16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der pl-Wert des markierten Antikörpers höher als 8,0 ist und die Stufen (a) und (b) bei einem pH-Wert zwischen ungefähr 6 und 8 durchgeführt werden.

17. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet daß man bei Vorliegen des HB_S-Antigens in Form seines Immunokomplexes mit einem Antikörper die Probe mit einem eine immunochemische Bindung schwächenden Mittel und dem Adsorbens für HB_S-Antigen zusammenbringt und darauf das die Bindung schwächende Mittel von dem Adsorbens abtrennt, bevor man das adsorbierte Antigen mit dem markierten spezifischen Bindungspartner zusammenbringt

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als die Bindung schwächendes Mittel ein chaotropes Mittel verwendet.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als chaotropes Mittel Harnstoff, Guanidin oder Thiocyanat verwendet.

20. Verfahren nach Anspruch 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man das die immunochemische Bindung schwächende Mittel in einer Konzentration von 2 bis 8 m verwendet