DE2857015A1 - Method for the determination of enzymes by diffusion in a porous matrix or by electrophoresis - Google Patents

Description

rv I ι υ \A/ - Ζ - 4 Düsseldorf, den 9. 8. 1979

Uipl.-lng. Ii. Wangemann - str«.man_n,trae_e 28

Dresdner Bank, DOs.eldorf, Kto. 51-419 655 <G Fernruf 36 35 31 Postscheck-Konroi Köln 1688 12

P 28 57 Ο15.2 Meine Akte Nr. 5836a V/Fe Hans Björne Elwing, Chalmersgatan 5» 411 35 Gothenburg/Schwiadeti.

Verfahren zum Nachweisen von Enzymen.

Die Erfindiong betrifft ein Verfahren zum Nachweisen von Enzymen. Dieses Verfahren beruht auf einem Zweiphasensystem, bei dem eine Enzymschicht auf der Oberfläche einer Feststoff-Phase abgelagert ist und bei dem das Vorhandensein und die Menge eines Enzymes, das mit der auf der Oberfläche der Feststoff-Phase abgelagerten Substanz reagieren kann, dadurch bestimmt und festgestellt wird, daß man von einem Behälter aus das Enzym in eine flüssigkeitsgesättigte und immobilisierte Phase auf der vorerwähnten Oberfläche diffundieren läßt, wobei dann schließlich das Vorhandensein und die Menge des Enzymes auf der Feststoff-Phase in geeigneter Weise bestimmt und festgestellt wird.

Enzymatische Laborverfahren spielen eine zentrale Rolle in der Diagnosetechnik der Medizin, der Mikrobiologie und der allgemeinen angewandten Biochemie. Dies beruht im wesentlichen auf der Tatsache, daß solche Verfahren die Gewähr dafür bieten, daß innerhalb komplexer Systeme kleinere Mengen eines spezifischen Reaktionsmittels bestimmt und festgestellt werden können.

Bei der Diagnose verschiedener Krankheiten finden die enzyma-

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tischen Laborverfahren zur Bestimmung der Enzymtätigkeit im Serum und in anderen biologischen Flüssigkeiten Anwendung, desgleichen für die Bestimmung der Enzymtätigkeit, die durch··-' Mikroorganismen hervorgerufen wird.

Diese enzymetisehen Labor- und Testverfahren werden im allgemeinen durch eine Reihe von Indikator- oder Nachweissystemen beeinträchtigt, darunter Farbänderungen, Zeil-Lösungen als ; Eryzothryten oder Molekularabbau u.dgl. mehr.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von Enzymen zu schaffen.- Sie löst diese Aufgabe durch ein Verfahren aus nachstehend angeführten Einzelschritten:

Zunächst wird eine enzymlösungsempfindliche Substanz als dünne Schicht auf die Oberfläche eines Festkörpers aufgetragen, dann erfolgt ein Aufbringen einer immobilisierten Matrix auf die dünne Schicht aus enzymlösungsempfindlicher Substanz, durch die während einer vorgegebenen Zeit das Enzym auf elektrophoretischem Wege diffundieren kann, schließlich wird die Matrix entfernt und die Untersuchung und Bestimmung des Lösungs-Reaktionsbereiches auf der Festkörper-Oberfläche durch Hinzufügen einer Indikatorsubstanz oder aber auf eine andere dafür geeignete Weise ausgeführt. Die enzymlösungsempfindliche Substanz wird als dünne Schicht in der nachstehend angeführten Weise auf der Oberfläche des Festkörpers abgelagert.

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Zunächst einmal wird eine Flüssigkeit, vorzugsweise auf Wasserbasis, auf die Oberfläche des Festkörpers aufgetragen. Sodann wird eine Lösung, in der die bereits angeführten Substanzen enthalten sind, derart auf die Flüssigkeit gegeben, daß sie in:diese Flüssigkeit diffundieren, worauf man sich die Substanz auf der Festkörperoberfläche ablagern läßt, die sich mit der Oberfläche des Festkörpers so stark verbindet, daß nach Entfernung des wässrigen Mediums diese Oberfläche abgewaschen werden kann» ohne daß dabei die Beschichtung von ihr entfernt wird.

Als Festkörperfläche ist ein transparenter Werkstoff geeignet, beispielsweise Glas oder Kunststoffe, vorzugsweise Polystyrol, Polyakrylnitril, Polyolefine und deren Kopolymeren. In den letzten Jahren ist festgestellt worden, daß Kunststoffoberflächen in vorteilhafter Weise Makromoleküle derart adsorbieren, daß sehr gleichmäßige und wiederholbare Schichten hergestellt werden können.

Ein Verfahren, mit dem Enzymreaktionen sichtbar gemacht und dargestellt werden können, besteht darin, daß auf der Festkörperoberfläche Indium-Partikel im Aufdampfverfahren abgelagert werden. Die Enzymreaktionen werden auf der aus Indium bestehenden Schicht herbeigeführt, woraufhin dann die Reaktionen auf der Indiumschicht als Phänomene der Lichtausbreitung beobachtet und untersucht werden können. Der größte Nachteil, den dieses Verfahren aufzuweisen hat, besteht darin, daß für das Herstellen einer gleichmäßigen und reproduzierbaren Indium-

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schicht auf größeren Flächen komplizierte Apparate erforderlich sind. Das ist ein Hindernis für die Verwendung solcher Flächen. Zudem ist es schwierig, in Grenzfällen eine Reaktion als pop.itive oder als negative Reaktion zu klassifizieren, weil dieses Nachweis- oder Indikatorsystem eine flache Amplitude hat und weil der Nachweis nur subjektiv beurteilt werden kann.

Ein anderes und viel einfacheres Verfahren zum Sichtbarmachen und Darstellen von Enzymreaktionen besteht dagegen darin, daß' die Kondensation von Wasserdampf ausgenutzt wird. Bei diesem Verfahren wird die getrocknete Fläche dem Wasserdampf ausgesetzt, wobei dann die Möglichkeit gegeben ist, anhand des durch den Kondensierungsvorgang entstandenen Musters festzustellen, ob und in welchem Umfang eine Reaktion stattgefunden hat. Das Prinzip dieses Verfahrens ist im Jahre 1936 von Langmuir beschrieben worden. Das Verfahren ist genauso empfindlich wie das Indiumschichtverfahren, es hat aber eine steilere Nachweisoder Indikationsamplitude. Weiterhin ermöglicht dieses Verfahren auch noch eine objektive Analyse durch das Kontaktkopieren des Kondensationsmusters auf Flächen durch Belichtung von Fotopapier und durch die Entwicklung dieses Fotopapleres.

Biologische Oberflächenreaktionen lassen sich somit am besten durch die Wasserdampfkondensation auf Kunststoffoberflächen sichtbar machen und darstellen (Vapour condensation on surface, VCS, Adams Klings, Fisher und Vroman, Journal of Immunological Methods, 3, (1973) Seite 227 - 232), das wegen seiner Einfach-

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heit das bevorzugte Verfahren ist. Andere Verfahren können ebenfalls Verwendung finden, beispielsweise das sogenannte ELISA-Verfahren,(Enzyme-Linked immunosorbent assay, J. Immun. 109:": 129 (1972)) oder aber auch das Partikel-Adsorptionsverfahrer; unter Verwendung einer Bariumsulfat-Schlämme und zahlreiche Färbungsverfahren.

In der dünnen Schicht auf der transparenten Festkörperfläche ist eine Veränderung als Resultat der Wasserdampfkondensation deswegen zu erkennen, weil sich dann, wenn eine Reaktion stattgefunden hat, auf der Fläche das sogenannte Zeta-Potential oder die Oberflächenspannung gegen Wasser verändert. Im Prinzip haben alle hydrophoben Flächen einen Oberflächenspannungswinkel von 90° bis 170°. Zu den Kunststoff-Flächen, die diese Eigenschaften im Normalfall haben, gehören: Polystyrol, Polyakrylnitril, Polyäthylen und den Kopolymeren.

Die mit der Kunststoff-Oberfläche verbundene Substanz ist in der Lage, in selektiver Weise mit einer weiteren Substanz zu reagieren, und zwar entweder in den Teilen der Substanz, die in Reaktion gegangen sind, oder aber in den Teilen der Substanz, die nicht in Reaktion gegangen sind, wobei die in Frage kommende Reaktion in situ selbst auch dann sichtbar gemacht werden kann, wenn es schwierig ist, die Reaktion nach der stattgefundenen Enzymreaktion unmittelbar auf der Schicht sichtbar zu machen.

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Sodann wird die immobilisierte Matrix auf die Oberfläche mit dem darauf abgelagerten Antigen aufgetragen. Solche immobilisierten Matrices, die in der Labortechnik bekannt sind, können enthalten: wässerige Gels oder verschiedene Arten von Sidemäntsubstanzen bzw. faserige Substanzen. Bei dem bekanntesten Verfahren wird ein Gel, insbesondere an Agar-Gel verwendet, dae"_;" in geeigneter Weise eine einprozentige Pufferlösung aus Agar' enthält, die man erstarren läßt. Dann wird in der Matrix ein Becken geformt, in das eine Lösung gegeben wird, die die unbekannte Substanz enthält. Die unbekannte Substanz kann aber auch als Zelluloseplatten od.dgl. zugegeben werden, wobei die Zelluloseplatten bis zur Sättigung mit Lösung getränkt sind. Das System wird dann bei einer geeigneten Temperatur, die zwischen 5° C und 50° C liegen kann, belassen, damit die unbekannte Substanz aus dem Becken heraus in das System eindiffundieren kann.

Im Vergleich mit den bisher bekannten Verfahren zur Herbeiführung von quantitativen Messungen an sehr kleinen Mengen biologischen Materials weist das erfindungsgemäße Verfahren eine noch nicht erreichte Einfachheit auf; damit verbunden sind eine Leistungssteigerung und Kostensenkung. Gleichmäßige und dünne Schichten auf Kunststoffoberflächen lassen sich somit relativ leicht herstellen, wobei die Adhäsion der Schicht an den Kunststoff oberflächen unabhängig von der Konzentration ist, mit der die Substanz, die die Schicht bildet, in der Lösung enthalten ist, die in genügend großer Menge auf die Fläche aufgetragen wurde, und dies im Vergleich mit den Adhäsionskräften, die man

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im Hinblick auf Glasoberflächen erreicht.

Das mit dieser Erfindung geschaffene Verfahren wird somit für-¹-die Enzymanalyse der Substanzen verwendet, für die es sensi+.i-: viert ist. Auf die Kunststoffoberfläche wird eine Enzymschicht und auf die Enzymschicht eine immobilisierte Matrix aufgetragen. Sodann wird eine enzymhaltige Probe auf die Matrix gegeben, die dann in diese eindiffundieren kann. Nach dem Eindiffundieren ' wird die Matrixschicht entfernt, wobei jene Teile der Enzymschicht, die von dem Enzym betroffen worden sind, durch eine Lösung in diesem Bereich erkennbar gemacht werden. Dieses Verfahren ist, verglichen mit den bisher bekannten Verfahren, sehr viel einfacher, weil bei den bisher bekannten Verfahren mit Reaktionen gearbeitet wird, die in Massen und chromatografischen System ablaufen. Es wird ein großes Ausmaß an Empfindlichkeit erzielt, was der Tatsache zuzuschreiben ist, daß die dünne Schicht eine starke Konzentration hat. Das Verfahren liefert Informationen über die Diffundierungseigenschaften des Enzyms, wobei es möglich ist, das Molekulargewicht aus der Diffusionsgeschwindigkeit dann zu bestimmen, wenn die Konzentration und die Temperatur gleichzeitig bekannt sind. Mit dem Verfahren lassen sich die Aktivitäten des extrazellulären Enzymes in einer einfachen und zuverlässigen Weise bestimmen.

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Claims (3)

η»· ι ι LJ \A/ A 4 Düsseldorf, den 9.8.1979 Dipl.-Ing. H. Wangemann J str„.mann,traß. 2β Dresdner Bank, Düsseldorf, Kto. 51-419 655 Fernruf 36 35 31 Postsdiedt-Konto, Köln 1688 12 Hans B.iörne Elving Meine Akte Nr. 5856a W/Lo P 28 57-015.2 Patentansprüche:

1)) Verfahren zum Nachweisen der Enzymtätigkeit, dadurch ge-, kennzeichnet, dass eine dünne Schicht einer enzymlösungsr empfindlichen Substanz auf eine Feststoff-Fläche aufgetragen wird, dass auf diese dünne Schicht eine immobilisierte Matrix aufgebracht wird, dass auf die immobilisierte Matrixschicht eine Menge einer enzymhaltigen Probe aufgegeben wird, die in die immobilisierte Matrix elektrophoretisch diffundiert und mit der enzymlösuKgsempfindlichen Substanz reagiert, worauf zur Bestimmung der Lösung auf der Feststoff-Fläche die Matrix abgenommen wird.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man extrazelluläre Enzyme nach bakterieller Kultivierung durch eine immobilisierte Matrix hindurch diffundieren läßt, die einen Nährboden für Bakterienkultivierung aufweist und dass eine Lösung der auf der Feststoff-Fläche abgelagerten Substanz nach dem Entfernen der Matrix bestimmt wird.

3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feststoff-Fläche aus einem Kunststoffmaterial hergestellt ist, das zur Gruppe Polystyrol, Polyakrylnitril, Polyole-

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fine und deren Kopolymeren gehört.

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Patentanwalt *λ

r.. , , L, ·_Α, */ 4 Düsseldorf, den 10.8.1979

Uipi.-ing. π. wangemann stre_Iemann.traß. 2β

Dresdner Bank, Düsseldorf, Kto. 51-419 655 F.rnruf 36 35 31

Postsdieck-Kontoi KSIn 1688 12

P 28 57 o15 2 Meine Akte Nr. 5836a W/Lo

Hans Björne Elwing

Geänderte Patentansprüche gemäß Artikel 19 PCT:

1) Verfahren zum Nachweisen der Enzymtätigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass eine dünne Schicht einer enzymlösungsempfindlichen Substanz an eine Feststoff-Fläche gebunden wird, da3& auf diese dünne Schicht eine immobilisierte Matrix aufgebracht wird, dass auf die immobilisierte Matrixschicht eirie' Menge einer enzymhaltigen Probe einem begrenzten Bereich dter Matrixschicht aufgegeben wird, die in die immobilisierte Matrix elektrophoretisch diffundiert und mit der enzymlösungs empfindlichen Substanz reagiert, worauf unter Bestimmung der Lösung auf der Feststoff-Fläche die Matrix abgenommen wird.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

ein eine Probe enthaltendes Enzym der immobilisierten Matrix als Bakterienkultur zugeführt wird, die durch bakterielles Wachstum auf der Oberfläche der immobilisierten Matrix extrazelluläre Enzyme bildet, die man durch die einen Nährboden für das bakterielle Wachstum aufweisende immobilisierte Matrixschicht hindurchdiffundieren läßt und dass eine Lösung der mit der Feststoff-Fläche verbundenen Substanz nach dem Entfernen der Matrix bestimmt wird.

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3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feststoff-Fläche aus einem Kunststoffmaterial hergestellt ist, das zur Gruppe Polystyrol, Polyakrylnitril, Polyolefine und deren Kopolymeren gehört.

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