DE2848051A1 - Synthetische dna und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

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Genentech, Inc., San Francisco, California, V.St.A. Synthetische DNA und Verfahren zu ihrer Herstellung

Zusammenfassung

1. Mikrobielle Rekombinations-Clonbildungsträger aus heterologer DNA, die den Code für die Expression von Säugerhormon (zum Beispiel Somatostatin) liefert, und anderen Polypeptiden einschließlich Plasmiden für die Transformation von bakteriellen Wirten. Letzere umfassen ein Regulort, das zu dem des Wirts in seinem untransformierten Zustand homolog ist, in Lesephase mit dem Strukturgen für die heterologe DNA,

2. Clonbxldungsträger, die den Code für die mikrobielle Expression eines Proteins aus (a) einem Polypeptidhapten und zusätzlichem Protein von zur Übertragung von Immunogenität auf das Produkt der Expression ausreichender Größe, wobei das Produkt zur Weiterbildung von Antikörpern zum Hapten für Prüfzwecke oder bei der Herstellung von Vaccinen verwendet werden kann, und (b) einem angestrebten Polypeptidprodukt und zusätzlichem Protein, von welchem das angestrebte Produkt gespalten werden kann, liefern.

3. Verfahren zur Herstellung von synthetischen Strukturgenen, die den Code für die Expression von Säugerpolypeptidsn in mikrobiellen Clonbildungssytemen liefern.

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Genetische Information befindet sich auf dem Desoxyribonucleinsäure-Doppelstrang ("DNA" oder "Gene") in Form der Reihenfolge, in der der eine spezifische Information, den Code, liefernde DNA-Strang die charakteristischen Basen seiner sich wiederholenden Nucleotidbestandteile darbietet. Die "Merkmalsauslösung" oder "-ausbildung" der spezifischen oder codierten Information zur Bildung von Polypeptiden erfolgt in einem zweiteiligen Prozeß. Entsprechend den Befehlen bestimmter Regulationsbereiche (Regulationsgene oder "Regulone") im Gen kann RNA-Polymerase zur Bewegung entlang dem den Code liefernden Strang veranlaßt werden, wobei Matrizen-RNA (m-RNA) oder Messenger-RNA (Ribonucleinsäure) in einem als Transkription oder "Herstellung einer Arbeitskopie" bezeichneten Prozeß gebildet wird. In einer anschließenden Translations"-Stufe verwandeln die Ribosomen der Zelle in Verbindung mit der im Cytoplasma löslichen Ribonucleinsäure, der t-RNA oder Transfer-RNA, die Botschaft oder Information der m-RNA in Polypeptide. Zu der Information, die m-RNA von DNA transkribiert, gehören auch Signale für den Beginn und die Beendigung der Ribosomenübertragung sowie für die Identität und Sequenz der Aminosäuren, aus denen das Polypeptid besteht. Der codierende DNA-Strang enthält lange Sequenzen von Nucleotid-Tripletts, die als Codierungseinheiten oder "Codone" bezeichnet werden, weil die charakteristischen Basen der Nucleotide in jedem einzelnen Triplett oder Codon spezifische Informationsbits zum Code beitragen. Beispielsweise ergeben 3 als ATG (Adenin-Thymin-Guanin) bezeichnete Nucleotide ein m-RNA-Signal, das als "beginne mit der Übertragung" verstanden wird, während Beendigungscodone TAG, TAA und TGA als "beendige die Übertragung" verstanden werden. Zwischen den Beginn- und Beendigungscodonen liegen die sogenannten Strukturgene, deren Codone die schließlich übertragene Aminosäuresequenz bestimmen oder definieren. Diese Definition verläuft nach dem allgemein gesicherten "genetischen Code" (vgl. z.B. J. D. Watson, Molecular Biology of the Gene, W. A. Benjamin Inc., N.Y., 3. Aufl. 1976), der die Codone für die verschiedenen Aminosäuren umschreibt. Der genetische Code ist in dem

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Sinn degeneriert, daß verschiedene Condone die gleiche Aminosäure ergeben können, aber insofern genau als es für jede Aminosäure ein Codon oder mehrere Codone für diese Säure und keine andere gibt. So beinhalten beispielsweise alle der Codone TTT, TTC, TTA und TTG, wenn als solche gelesen, die Information für Serin und keine andere Aminosäure. Während der Transkription muß die richtige Reihenfolge oder der richtige Ableserahmen aufrecht erhalten werden. In diesem Zusammenhang ist zum Beispiel zu bedenken, was geschieht, wenn die die Arbeitskopie erzeugende RNA-Polymerase verschiedene Basen als den Anfang eines Codons (unterstrichen) in der Sequenz ....GCTGGTTGTAAG.... liest:

. . . GCT GGT TGT AAG . . . —> . . . Ala-Gly-Cys-Lys . . ... G CTG GTT GTA AG ... —4 . . · Leu-Val-Leu . . .

... GC TGG TTG TAA A ... —^ . . . Trp-Leu-(STOP) .

Das schließlich erzeugte Polypeptid hängt dann in ausschlaggebender Weise von der räumlichen Beziehung des Strukturgens zu dem Regulon ab.

Ein besseres Verständnis des Prozesses der genetischen Expression oder Merkmalsausbildung soll durch die Definition bestimm ter Genbestandteile gefördert werden:

Operon - ein Gen aus Strukturgen oder -genen für die PoIypeptidsynthese und dem Regulationsbereich ("Regulon"), der diese Synthese regelt.

Promoter - ein Gen innerhalb des Regulons, womit RNA-Polymerase eine Verbindung zum Beginn der Transkription eingehen muß.

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Operator - ein Gen, mit dem Repressorprotein eine Verbindung eingeht und dadurch die Bindung von RNA-Polymerase an dem benachbarten Promoter verhindert.

Induktor - eine Substanz, die Repressorprotein entaktiviert, indem sie den Operator freisetzt und eine Verbindung der RNA-Polymerase mit dem Promoter ermöglicht und damit den Beginn der Transkription einleitet.

Catabolitaktivatorprotein ("CAP")-Bindungsstelle - ein Gen, das zyklisches Adenosinmonophosphat("c AMP")- vermitteltes CAP bindet und üblicherweise gleichfalls für die Einleitung der m-Trankription erforderlich ist. Die CAP-Bindungsstelle kann in besonderen Fällen unnötig sein. Beispielsweise beseitigt eine Promotermutation in dem Laktoseoperon des Phagen Ti. plac UV5 die Notwendigkeit von cAMP und CAP für die Expression; J. Beckwith et al, J. Mol. Biol. 69, ISS-16O (1972).

Promoter-Operator-System - wie hier gebraucht, ein brauchbarer Regelbereich eines Operon hinsichtlich des Vorhandenseins oder Fehlens einer CAP-Bindungsstelle oder der Fähigkeit, Information für Repressorproteinexpression zu liefern.

Zur Definition und für den Gebrauch in der nachfolgenden Erörterung von Rekombinations-DNA werden noch folgende Begriffe erläutert:

Clonbildungsträger - nicht aus Chromosomen stammende doppelsträngige DNA enthaltend ein intaktes "Replicon", so daß der Träger verdoppelt wird, wenn es durch einen Prozeß der "Transformation" in einen einzelligen Organismus ("Mikrobe") eingebracht wird. Ein so transformierter

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Organismus wird als "Transformant" bezeichnet.

Plasmid - für die vorliegenden Zwecke ein Clonbildungsträger, der aus Viren oder Bakterien stammt, wobei es sich bei den letzteren um "bakterielle Plasmide" handelt.

Komplementärität - durch die Basensequenzen von DNA-Einzelsträngen, die die Bildung von doppelsträngiger DNA durch Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen auf den betreffenden Strängen ermöglichen, übertragene Eigenschaft. Adenin (A) paßt komplementär zu Thymin (T), während Guanin (G) komplementär zu Cytosin (C) ist.

Die Fortschritte auf dem Gebiet der Biochemie in den letzten Jahren haben zu der Konstruktion von "Rekombinations"-Clonbildungsträgern geführt, worin beispielsweise Plasmide, die exogene DNA enthalten, gebildet werden. In besonderen Fällen kann der Rekombinationspartner "heterologe" DNA enthalten, worunter DNA verstanden wird, die Informationen für Polypeptide liefert, die normalerweise von dem Organismus nicht erzeugt werden, der einer Transformation durch den Rekombinationsträger zugänglich ist. So werden Plasmide unter Bildung von linearer DNA mit verbindbaren Enden oder Termini gespalten. Diese werden mit einem exogenen Gen mit verbindbaren Termini unter Bildung einer biologisch funktionsfähigen Gruppe mit einem intakten Replicon und einer angestrebten phänotypischen Eigenschaft verbunden. Die Rekombinationsgruppe wird durch Transformation in einen Mikroorganismus eingebracht, und Transformanten werden isoliert und mit dem Ziel zur Clonbildung gebracht, große Populationen zu erhalten, die zur Expression der neuen genetischen Information fähig sind.

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Methoden und Mittel zur Ausbildung von Rekombinationsclonbildungsträgern und zur Transformation von Organismen mit denselben sind in der Literatur ausführlich beschrieben, vgl. z.B. H. L. Heynecker et al, Nature 263, 748-752 (1976); Cohen et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 69, 2110 (1972); ibid., 70, 1293 (1973); ibid., 70, 3240 (1973); ibid., 71, 1030 (1974); Morrow et al, Proc. Nat. Acad. Sei, USA 71, 1743 (1974); Novick, Bacteriological Rev., 33, 210 (1969); Hershfield et al, Proc. Soc. Nat. Acad. Sei. USA 71, 3455 (1974) and Jackson et al, ibid. 69, 2904 (1972). Eine verallgemeinerte Darstellung dieses Gegenstands gibt S. Cohen in Scientific American 233, 24 (1975). Außerdem wird auf den DTV-Atlas zur Biologie, 2. Auflage, Deutscher Taschenbuchverlag, München, 1968, Nachr. Chem. Tech. Lab. 26, 349 (1978) und die dort genannten Literaturstellen, Molekular-Biologie, Umschau-Verlag Frankfurt a. M., 1967, Pflanzenphysiologie von Dieter Hess, VTB, E. Ulmer GmbH Stuttgart, 1976 und Grundlagen der Biochemie, Otto Müller, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1978, verwiesen. Alle diese Veröffent-. lichungen bilden Teil der vorliegenden Beschreibung.

Es gibt verschiedene bekannte Arbeitsweisen für die DNA-Rekombination, wobei aneinander angrenzende Enden einzelner DNA-Bruchstücke oder Fragmente auf die eine oder andere Weise zur Erleichterung der Bindung zugeschnitten werden. Der Ausdruck Bindung oder Verbindung bezieht sich auf die Ausbildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen angrenzenden Nucleotiden, meist mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase. So können unempfindliche Enden direkt miteinander verbunden werden. Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren angrenzenden Enden können stattdessen aber auch durch Wasserstoffbindung aktiviert werden, die die jeweiligen Enden für eine anschließende Verbindung in eine geeignete Lage bringt. Solche Einzelstränge, die als Bindeenden oder Cohäsivtermini bezeichnet werden, können durch das Anfügen von Nucleotiden an unempfindliche Enden unter Verwendung von terminaler Transferase und manchmal einfach durch

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Abzwicken eines Strangs eines unempfindlichen Endes mit einem Enzym, wie /^--Exonuclease, ausgebildet werden. Wiederum kann man sich, und dies ist das Üblichste, Restriktionsendonucleasen bedienen, die Phosphodiesterbindungen in und um bestimmte Sequenzen von Nucleotiden mit einer Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren spalten. Viele Restriktionsendonucleasen und ihre Erkennungsstellen sind bekannt, wobei die sogenannte EcoRI-Endonuclease die am häufigsten angewandte ist. Restriktionsendonucleasen, die doppelsträngige DNA bei rotationssymmetrischen "Palindromen" spalten, lassen Cohäsivtermini zurück. Somit kann ein Plasmid oder ein anderer Clonbildungsträger unter Bildung von Termini gespalten werden, die jeweils die Hälfte der Erkennungsstellen der Restrxktionsendonuclease aufweisen. Ein mit der gleichen Restrxktionsendonuclease erhaltenes Spaltprodukt von exogener DNA weist zu den Plasmidtermini komplementäre Enden auf. Wie weiter unten noch gezeigt, kann synthetische DNA mit Cohäsivtermini stattdessen auch für den Einbau in den gespaltenen Träger vorgesehen werden. Zur Unterdrückung der Wiedervereinigung der Cohäsivtermini des Trägers während der Einfügung von exogener DNA können die Termini mit alkalischer Phosphatase aufgeschlossen werden, was zu einer Molekularselektion von Enden für den Einbau des exogenen Fragments führt. Der Einbau eines Fragments mit einer bezüglich anderer Merkmale des Trägers richtigen Orientierung kann eine Unterstützung erfahren, wenn sich das Fragment auf Träger-DNA befindet, die durch zwei verschiedene Restriktionsendonucleasen herausgeschnitten worden ist und selbst Termini aufweist, die jeweils die Hälfte der Erkennungssequenz der verschiedenen Endonucleasen darstellen.

Weitgespannte Bemühungen auf dem Gebiet der Rekombinations-DNA-Forschung in den letzten Jahren haben nur zu wenigen Ergebnissen geführt, die sich direkt praktisch verwerten lassen. Dies hat sich besonders im Fall mißglückter Versuche gezeigt, durch "synthetische DNA" codierte Polypeptide und dergleichen auszu-

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bilden, unabhängig davon, ob die synthetische DNA in üblicher Weise Nucleotiden Nucleotid aufgebaut oder durch Rücktranskription aus isolierter in-RNA (komplementäre oder "cDNA") erhalten worden ist. In dieser Beschreibung wird angegeben, was allem Anschein nach die erste Expression eines funktioneilen Polypeptidprodukts aus einem synthetischen Gen darstellt, wobei auch damit zusammenhängende Entwicklungen mitgeteilt werden, die allgemeinere Anwendbarkeit verheißen. Das Produkt, auf das Bezug genommen wird, ist Somatostatin (US-PS 3 904 594), ein Inhibitor der Sekretion von Wachstumshormon, Insulin und Glucagon, dessen Wirkungen seine Anwendung bei der Behandlung von Acromegalie, akuter Pankreatitis und von insulinabhängigem Diabetes begründen (vgl. R. Guillemin et al, Annual Rev. Med. 27, 379, 1976). Das Somatostatinmodell läßt eindeutig die Anwendbarkeit der hier beschriebenen neuen Entwicklungen auf mehreren wichtigen Gebieten erkennen, wie dies auch aus den beigefügten Zeichnungen und der weiteren Beschreibung hervorgeht.

Die beigefügten Zeichnungen erläutern Zusammenhänge, in welchen bevorzugte Ausfuhrungsformen der Erfindung Anwendung finden, d.h. die Expression des Hormons Somatostatin durch bakterielle Transformanten mit Rekombinationsplasmiden, sowie die Erzeugung von Humaninsulin.

Figur 1

Schematische Darstellung des Prozesses: Das durch chemische DNA-Synthese hergestellte Gen für Somatostatin wird an das ß-Galactosidase-Gen von E. coli auf dem Plasmid pBR322 angelagert. Nach Transformation in E. coli dirigiert das Rekombinationsplasmid die Synthese eines Vorläuferproteins, das in vitro durch Bromcyan spezifisch an den Methioninresten unter Bildung von aktivem Säugerpolypeptxdhormon gespalten werden kann. Mit A, T, C und G werden die charakteristischen Basen (Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin) der Desoxyrxbonucleotxde in dem codierenden Strang des Somatostatingens bezeichnet.

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-45- ^Δο'· °

Figur 2

Schematische Struktur eines synthetischen Gens, dessen Codierstrang (d.h. der "obere" Strang) Codone für die Aminosäuresequenz von Somatostatin (wie angegeben) aufweist.

Figur 3

Schematische Erläuterung der bevorzugten Methode zum Aufbau von Nucleotidtrimeren, die zum Aufbau von synthetischen Genen eingesetzt werden. Bei der angewandten üblichen Bezeichnung für die Darstellung von Nucleotiden in Figur 3 befindet sich das 5'-0H links und das 3'-0H rechts, zum Beispiel

HO.

N.

OH

Figur 4

Fließschema für den Aufbau eines Rekombinationsplasmids (zum Beispiel pS0M11-3), das zur Ausbildung eines Somatostatin ("SOM") enthaltenden Proteins fähig ist, ausgehend von dem Stammplasmid pBR322. Das ungefähre Molekulargewicht eines jeden Plasmids wird in Dalton ("d") angegeben. Ap bzw. Tc bezeichnen Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz, und Tc^S bedeutet Tetracyclinempfxndlichkext infolge der Herausnahme eines Teils des Tc^r-Gens. Die Verhältnisse der Orte der verschiedenen, für Restrxktionsendonuclease spezifischen Spaltstellen auf den Plasmiden zueinander sind angegeben (zum Beispiel EcoRI, Baml, etc.).

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Figuren 5A und 5B

Es sind die Nucleotidsequenzen der Schlüsselteile von zwei Plasmiden dargestellt sowie die Richtung der Messenger-RNA-("mRNA")-Transkription, die stets von dem 5'-Ende des Codierstrangs ausgeht. Die Restriktionsendonuclease-Substratstellen sind wie dargestellt. Jede wiedergegebene Sequenz enthält sowohl die Steuerelemente des Iac-(Lactose)-Operons, als auch Codone zur Expression der Aminosäuresequenz von Somatostatin (kursiv). Die Aminosäuresequenzzahlen für ß-Galactosidase ("ß-gal") stehen in Klammern.

Figuren 6 bis 8

Wie weiter unten noch näher ausgeführt, sind in diesen Figuren die Ergebnisse vergleichender Radioimunprüfungsversuche dargestellt, die die Somatostatinaktivität des durch die Rekombinationsplasmide ausgebildeten Produkts zeigen.

Figur 9

Schematische Struktur von synthetischen Genen, deren codierende Stränge Codone für die Aminosäuresequenz des A- und B-Strangs von Humaninsulin aufweisen.

Figur 10

Fließschema für den Aufbau eines Rekombinationsplasmids, das zur Expression der. B-Kette von Humaninsulin fähig ist»

1. Herstellung von Genen, die den Code für heterologe Polypeptide liefern

Deft Code für ein beliebiges Polypeptide mit bekannter Aminosäuresequenz liefernde DNA kann durch Auswahl der Codone nach dem genetischen Code hergestellt werden. Zur Erleichterung der Reinigung und dergleichen werden Oligodesoxyribonucleotidfragmente aus beispielsweise etwa 11 bis 16 Nucleotiden gesondert zubereitet und dann in der gewünschten Reihenfolge

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angeordnet. Man bereitet also erste und zweite Reihen von Oligodesoxyribonucleotidfragmenten von zweckmäßiger Größe. Die Verbindung der ersten Reihen in der richtigen Sequenz führt zu einem DNA-Codierstrang zur Polypeptidexpression (vergleiche z. B. Figur 2, Fragmente A, B, C und D). Die zweiten Reihen führen nach entsprechender Verbindung in der richtigen Reihenfolge zu einem Strang, der zu dem Codierstrang komplementär ist (zum Beispiel Figur 2, Fragmente E, F, G und H). Die Fragmente der jeweiligen Stränge überlappen vorzugsweise derart, daß die Komplementarität ihre Selbstanordnung über Wasserstoffbindung der Cohäsivtermini von Fragmentblöcken begünstigt. Nach dieser Anordnung bzw. diesem Aufbau wird das Strukturgen durch Verbinden oder Verknüpfen in der üblichen Weise fertiggestellt.

Die Degeneration oder Entartung des genetischen Codes ermöglichst beträchtliche Freiheit bei der Wahl von Codonen für eine gegebene Aminosäuresequenz. Für die erfindungsgemäßen Zwecke wird jedoch die Codonwahl durch drei Überlegungen erleichtert. Erstens werden Codone und Fragmente ausgewählt, und die Zusammenstellung der Fragmente erfolgt stufenweise, um eine unzulässige Komplementarität der Fragmente untereinander zu vermeiden, abgesehen von den Fragmenten, die in dem angestrebten Gen nebeneinander liegen. Zweitens werden an AT-Basenpaaren (ζ. B. etwa fünf oder mehr) reiche Sequenzen vermieden, insbesondere, wenn ihnen eine an GC-Basenpaaren reiche Sequenz vorangeht, wodurch eine vorzeitige Beendigung der Transkription vermieden wird. Drittens besteht wenigstens ein größerer Teil der gewählten Codone aus solchen, die für die Expression von mikrobiellen Genomen (vgl. zum Beispiel W. Fiers, et al, Nature 260, 500, 1976) bevorzugt sind. Als für die Expression von mikrobiellen Genomen bevorzugte Codone werden die folgenden bezeichnet:

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Tabelle

	Bevorzugte Bedeutung von Codonen	Stellung C	(von links A	nach rechts) G	dritte Stellung (3'-Ende) (von oben nach unten)
erste Stellung (5'-Ende) (von oben nach unten)	zweite T			cys	T
	phe	ser	tyr		C
T	phe		Stop	Stop	A
	leu	ser	' Stop	trp	G
		pro	his	arg	T
	leu ·	pro	his	arg ·	C
	leu	pro	gin		A
	leu	pro	gin		G
C		thr	asn		T
	ile	thr	asn	ser	C
	ile				A
		thr	lys	_■····	G
A	met (Start)	ala	asp	gly	T
	val		asp		C
	val		glu		A
	val	ala	glu		G
G	val

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Im Fall von Somatastin am stärksten bevorzugt sind folgende Aminosäure-(Codon)-beziehungen des Strukturgens: gly (GGT); cys (TGT); Iys (AAG; trp (TGG); ala (GCT, GCG); asn (AAT, AAC); phe (TTC, TTT); thr (ACT, ACG); und ser (TCC, TCG).

Wenn das Strukturgen eines angestrebten Polypeptids in einen Clonbldmwsträger zur Expression als solches eingeführt werden soll, wird dem Gen ein "Start"-Codon (zum Beispiel ATG) vorangestellt, und ihm folgen unmittelbar ein oder mehrere Beendigungs- oder Stop-Codone (vergleiche Figur 2). Die Aminosäuresequenz eines bestimmten Polypeptids kann jedoch, wie unten beschrieben, mit weiterem Protein ausgebildet werden, das ihr vorangeht und/oder folgt. Wenn der Verwendungszweck des Polypeptids Spaltung des weiteren Proteins erfordert, werden entsprechende Spaltstellen neben der Polypeptid-weiteres Protein-Codon-Bindung eincodiert. So ist beispielsweise in Figur 1 das Produkt der Expression ein Vorläufer-Protein aus Somatostatin und dem größten Teil des ß-Galactosidase-Polypeptids. In diesem Fall ist ATG zum Codieren für den Start der Translation nicht erforderlich, weil die Ribosomenkonstruktion des zusätzlichen ß-gal-Proteins das Somatostatinstrukturgen durchliest. Der Einbau des ATG-Signals ergibt jedoch den Code für die Erzeugung von Methionin, eine Aminosäure, die durch Bromcyan spezifisch gespalten wird, woraus sich eine einfache Methode zur Umwandlung von Vorläuferprotein in das erstrebte Polypeptid ergibt.

Figur 2 erläutert ein weiteres bevorzugtes Merkmal für heterologe DNA, die zur Rekombination verwendet werden soll, d.h. daß Cohäsivtermini vorgesehen sind, die vorzugsweise einen der beiden Stränge einer Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle umfassen. Aus den oben erörterten Gründen werden die Termini vorzugsweise dazu bestimmt, nach Rekombination einzelne verschiedene Erkennungsstellen hervorzurufen.

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Nachdem die beschriebenen Entwicklungen als in Verbindung mit dem Somatostatinmodell erfolgreich verlaufend nachgewiesen wurden, wird anerkannt werden, daß eine heterologe DNA-Codierung für praktisch jede bekannte Aminosäuresequenz mutatis mutandis angewandt werden kann. So sind die beschriebenen und noch zu beschreibenden Arbeitsweisen mutatis mutandis auf die Erzeugung von Polyaminosäuren, wie Polyleucin und Polyalanin, Enzymen, Serumproteinen und anaigetischen Polypeptiden, wie ß-Endorphinen anwendbar, die Schmerzschwellen ect. beeiflussen können. Die erzeugten Polypeptide sind vorzugsweise als solche Säugerhormone oder Zwischenprodukte dafür. Zu solchen Hormonen gehören u. a. Somatostatin, Humaninsulin, Human- und Rinderwachstumshormon, Iuteinisierendes Hormon, ACTH und Pankreaspolypeptid. Zu den Zwischenprodukten gehören u. a. Humanvorproinsulin, Humanproinsulin und die A- und B-Ketten von Humaninsulin. Außer in vitro hergestellter DNA kann die heterologe DNA cDNA enthalten, die bei der Rücktranskription von mRNA gebildet wird, vergleiche z. B. Ullrich et al, Science 196, 1313, 1977.

2. Rekombinationsstoffe mit einem Code für die Expression von Vorläuferprotein

Bei dem in Figur 1 schematisch dargestellten Prozeß liefert die Expression ein Vorläuferprotein, das durch ein spezifisches heterologes Strukturgen (Somatostatin) codiertes Polypeptid und außerdem Protein (das einen Teil des ß-Galactosidaseenzyms enthält) umfaßt. Eine selektive Spaltstelle neben der Somatostatin-Aminosäuresequenz ermöglich eine nachfolgende Abtrennung des angestrebten Polypeptids von überflüssigem Protein. Der erläuterte Fall ist für eine große Gruppe von Arbeitsweisen repräsentativ, die durch die Erfindung erschlossen worden sind.

In den meisten Fällen wird die Spaltung außerhalb der replikativen Umgebung des Plasmids oder anderen Trägers, beispielsweise nach Gewinnung der mikrobiellen Kultur bewirkt. Auf

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ORlGlNAC

diese Weise kann eine temporäre Konjugation von kleinen Polypeptiden mit überflüssigem Protein erstere, zum Beispiel gegen einen in vivo erfolgenden Abbau durch endogene Enzyme, schützen. Gleichzeitig bringt das zusätzliche Protein gewöhnlich das angestrebte Polypeptid um seine Bioaktivität während der extracellulären Spaltung, wodurch die biologische Gefahrlosigkeit des Vorgangs erhöht wird. In besonderen Fällen ist es natürlich zweckmäßig, die Spaltung innerhalb der Zelle zu bewirken. Beispielsweise können mit DNA mit einem Code für Enzyme, die Insulinvorläufer in die aktive Form überführen, Clonbildungsträger ausgebildet werden, die mit einer anderen DNA mit einem Code für die Expression der Vorläuferform zusammenarbeiten.

In einem bevorzugten Fall fehlen dem bestimmten angestrebten Polypeptid innere Spaltstellen entsprechend demjenigen, das zum Abwerfen von überflüssigem Protein verwendet wird, doch können, wie ohne weiteres ersichtlich, auch dann, wenn diese Bedingung nicht erfüllt ist, konkurrierende Reaktionen das angestrebte Produkt liefern, wenn auch in geringerer Ausbeute. Wenn das angestrebte Produkt methioninfrei sein soll, dann erweist sich eine Bromcyanspaltung beim Methionin neben der angestrebten Sequenz als hoch wirksam. In entsprechender Weise können arginin- und lysinfreie Produkte, zum Beispiel mit Trypsin oder Chymotrypsin bei arg-arg, lys-lys oder ähnlichen Spaltstellen neben der angestrebten Sequenz enzymatisch gespalten werden. Falls bei der Spaltung beispielsweise unerwünschtes Arginin an das angestrebte Produkt gebunden bleibt, kann es durch CarboxypeptidaseaufSchluß entfernt werden. Bei Verwendung von Trypsin zur Spaltung bei arg-arg können Lysinstellen innerhalb des angestrebten Polypeptids vorher geschützt werden, beispielsweise mit Maleinsäure- oder Citraconsäureanhydrid. Die beispielsweise erörterten Spaltarbeitsweisen sind lediglich repräsentative Varianten der vielen verschiedenen Möglichkeiten, die für den Fachmann aufgrund der hier angegebenen Lehre offensichtlich sind.

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Abspaltbares Protein kann am C- oder N-Ende eines bestimmten Polypeptids oder sogar innerhalb des Polypeptids selbst ausgebildet werden, wie dies bei der Einschlußsequenz, durch die sich Proinsulin und Insulin voneinander unterscheiden, der Fall ist. Wiederum kann der verwendete Träger den Code für die. Expression von Protein mit sich wiederholenden Sequenzen des angestrebten Polypeptids liefern, die jeweils durch selektive Spaltstellen voneinander getrennt sind. Es ist jedoch besonders bevorzugt, wenn Codone für überflüssiges Protein vor dem Strukturgen des angestrebten Produkts übertragen werden, wie bei dem in den Figuren erläuterten Fall. In allen Fällen soll für die Aufrechterhaltung des passenden Ableserahmens in Bezug auf das Regulon gesorgt werden.

3. Expression von Immumogenen

Die Fähigkeit, sowohl ein spezifisches Polypeptid als auch überflüssiges Protein auszubilden, ergibt ein brauchbares Mittel für die Erzeugung von immunogenen Substanzen. Polypeptid- "Haptene" (d.h. Substanzen, die spezifisch durch Antikörper und ähnliche Stoffe gebundene Determinanten enthalten, aber gewöhnlich zu klein sind, um eine Immunwirkung hervorzurufen) können als Konjugate mit zusätzlichem Protein ausreichender Größe für eine Immunogenität ausgebildet werden. Das ß-gal-Somatostatin-Konjugat, dessen Herstellung hierin beschrieben ist, ist tatsächlich von immunogener Größe und kann deshalb Antikörper erzeugen, die das Somatostatxnhapten binden. Proteine mit mehr als 100 Aminosäuren, meist mit mehr als 200 Aminosäuren, zeigen immunogenen Charakter.

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Wie vorstehend beschrieben hergestellte Konjugate können zur Bildung von Antikörpern verwendet werden, die sich in Radioimmun- oder anderen Prüfungen auf das Hapten und auch für die Erzeugung von Vaccinen eignen. Im folgenden wird ein Beispiel für die letztgenannte Anwendung gegeben. Bromcyan- oder andere Spaltprodukte von viralem Mantelprotein ergeben Oligopeptide, die sich an Antikörper binden, der selbst zu dem Protein wird. Erhält sie die Aminosäuresequenz eines solchen Oligopeptxdhaptens, kann daher heterologe DNA als Konjugat mit weiterem Protein ausgebildet werden, das Immunogenität beisteuert. Solche Konjugate können als Vaccinen verwendet werden, die geringere Nebenwirkungen zeigen, als sie mit der Verwendung von Mantelprotein selbst zur Erzielung von Immunität verbunden sind.

4. Die Kontrollelemente

In Figur 1 ist ein Prozeß dargestellt, bei welchem ein Transformantorganismus ein Polypeptidprodukt aus heterologer DNA ausbildet, die unter die Kontrolle eines Regulons "homolog" zu dem Organismus in seinem nicht umgewandelten oder untransformierten Zustand gebracht worden ist. Chromosomen-DNA von lactoseabhängigem E. coli enthält als ein Lactose- oder "lac"-Operon, das den LactoseaufSchluß u.a. durch Bildung des Enzyms ß-Galactosidase vermittelt. In dem erläuterten Fall werden die lac-Kontrollelemente aus einem Bakteriophagen, Λ. plac 5, erhalten, der für E. coli infektiös ist. Das lac-Operon des Phagen war seinerseits durch Überführung aus der gleichen bakteriellen Species erhalten worden, daher die "Homologie". Homologe Regulone, die sich zur Verwendung in dem beschriebenen Verfahren eignen, können stattdessen auch aus für den Organismus nativer Plasmid-DNA stammen.

Die Einfachheit und Wirksamkeit des lac-Promoter-Operator-Systems begründen seine Verwendung in dem beschriebenen System genauso wie seine Fähigkeit, von IPTG (Isopropylthio-ß-D-galactosid) induziert zu werden. Selbstverständlich können

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auch andere Operone oder Teile davon verwendet werden, zum Beispiel /^-Promoter-Operator, Arabinose-Operon (phi 80 dara) oder die Colicin El-, Galactose-, alkalische Phosphatase- oder Tryptophan-Operone. Aus dem letzteren, (d. h. "Tryp-Operon") stammende Promoter-Operatoren können 100-prozentige Repression während der Induktion (mit Indolacrylsäure) und Gewinnung vermitteln.

5. Plasmidaufbau, allgemein

Die Einzelheiten des in Figur 4 schematisch erläuterten Prozesses ergeben sich aus dem weiter unten folgenden experimentellen Teil. Bei diesem Punkt ist es jedoch von Nutzen, einige der zum Aufbau des Rekombinationsplasmids der bevorzugten Ausführungsform angewandten Arbeitsweisen kurz zu erörtern.

Bei der Clonbildung und Expression des synthetischen Somatostatingens werden zwei Plasmide verwendet. Jedes Plasmid hat eine EcoRI-Substrat-Stelle bei einem anderen Bereich des ß-Galactosidase-Strukturgens (vgl. Figur 4 und 5). Die Einfügung des synthetischen Somatostation-DNA-Fragments in die EcoRI-Stellen dieser Plasmide bringt die Expression der genetischen Information in das Fragment ein, das sich unter der Kontrolle der lac-Operon-Kontrollelemente befindet. Nach der Einfügung des Somatostatxnfragments in diese Plasmide sollte die Translation zu einem Somatostatinpolypeptid führen, dem entweder 10 Aminosäuren (pSOM1) oder praktisch die gesamte ß-Galactosidase-Untereinheitsstruktur (pS0M11-3) vorangestellt ist.

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Das Schema des Plasmidaufbaus beginnt mit dem Plasmid pBR322, einem wohldefinierten Clonbildungsträger. Die Einführung der lac-Elemente in dieses Plasmid erfolgt durch Einfügung eines Haelll-Restriktions-Endonucleasefragments (203 Nucleotide), das den lac-Promoter, die CAP-Bindungsstelle, den Operator, die Ribosomenbindungsstelle und die ersten 7 Aminosäurecodone des ß-Galactosidase-Strukturgens aufweist. Das Haelll-Fragment stammt aus A- plac5 DNA. Das EcoRI-gespaltene pBR322-Plasmid, dessen Termini mit T4 DNA-Polymersase und Desoxyribonucleotidtriphosphaten wieder hergestellt worden waren, wird stumpfendig mit dem Haelll-Fragment verbunden, wodurch EcoRI-Termini an den Einfügungspunkten erzeugt werden. Durch Verbinden dieser Haelll- und wiederhergestellten EcoRI-Termini werden die EcoRI-Restriktionsstellen (vergleiche Figur 4 und 5) an jedem Terminus erzeugt. Transformanten von E. coli RR1 mit dieser DNA werden auf einem 5~Brom-4-chlor-incolylgalactosid-(X-gal)-Madium auf Resistenz gegen Tetracyclin (Tc) und Ampicillin (Ap) selektioniert. Auf diesem Indikatormedium können Kolonien, die für die Synthese von ß-Galactosidase aufgrund der erhöhten Anzahl von lac-Operatoren, die Repressor titrieren, verantwortlich sind, diirch ihre blaue Farbe identifiziert werden. Zwei Orientierungen des Haelll-Fragments sind möglich, aber sie werden aufgrund der asymmetrischen Lage einer Hha-Restriktionsstelle in dem Fragment unterschieden. Das Plasmid pBH1O wird weiter modifiziert, wodurch die zu dem lac-Operator(pB2O) distale EcoRI-Endonuclease-Stelle eliminiert wird.

Die acht chemisch synthetisierten Olxgodesoxyribonucleotide

32

(Figur 2) werden an den 5'-Termini mit /_ P_/-gamma-ATP durch Polynucleotidkinase markiert und mit T4 DNA-Lignase verbunden. Durch Wasserstoffbindung zwischen den überlappenden Fragmenten erfolgt eine Selbstanordnung des Somatostatingens und schließlich eine Polymerisation zu großen Molekülen infolge der cohäsiven Restriktionsstellentermini. Die Ligaturprodukte werden mit EcoRI-BamHI-Restriktionsendonucleasen behandelt, wodurch das Somatostatingen, wie in Figur 2 dargestellt, erzeugt wird.

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Das synthetische Soraatostatingenfragment mit EcoRI- und Baml-Termini wird an das pBH20-Plasmid gebunden, das mit den EcoRI- und BamHI-Restriktxonsendonucleasen und alkalischer Phosphatase vorbehandelt worden ist. Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase führt zu einer Molekularselektion von Plasmiden mit dem eingefügten Fragment. Mit dieser gebundenen DNA erhaltene ampicillinresistente Transformanten werden hinsichtlich Tetracyclinempfindlichkeit aussortiert, und mehrere werden bezüglich der Einfügung eines EcoRI-BamHI-Fragments passender Größe untersucht.

Beide Stränge der EcoRI-BamHI-Fragmente von Plasmiden aus zwei Clonen werden einer Nucleotidsequenzanalyse, beginnend mit den BamHI- und EcoRI-Stellen, unterworfen. Die Sequenzanalyse wird bis in die Iac-Regelelemente ausgedehnt. Die lac-Fragmentsequenz erweist sich als intakt, und in einem Fall werden die Nucleotidsequenzen pSOM1 beider Stränge unabhängig voneinander bestimmt, wobei jede die in Figur 5A angegebene Sequenz ergibt.

Das EcoRI-Pst-Fragment des pSGM1-Plasmids mit dem lac-regelnden Element wird entfernt und durch das EcoRI-Pst-Fragment von pBR322 ersetzt, wodurch das Plasmid pSOM11 erzeugt wird. Das EcoRI-Fragment von s\ plac , das den lac-Operonkontrollbereich und den größten Teil des ß-Galactosidase-Strukturgens aufweist, wird in die EcoRI-Stelle von pSOM11 eingefügt. Zwei Orientierungen des EcoRI-lac-Fragments von /V plac sind zu erwarten. Eine davon würde den richtigen Ableserahmen bis in das Somatostatingen hinein behalten und die andere nicht. Die Analyse von für sich allein isolierten Clonen auf Somatostatinaktivität ergibt dann Clone, die das richtig orientierte Gen enthalten, und einer dieser Clone wird als pSOM11-3 bezeichnet.

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6. Der Mikroorganismus

Als mögliche Organismen für die Transformation sind verschiedene einzellige Mikroorganismen vorgeschlagen worden, beispielsweise Bakterien, Fungi und Algen. Dabei handelt es sich um solche einzelligen Organismen, die in Kulturen oder durch Fermentation gezüchtet werden können. Bakterien sind größtenteils die für das Arbeiten damit am besten geeigneten Organanismen. Zu einer Transformation zugänglichen Bakterien gehören Enterobacteriaceae, zum Beispiel Stämme von Escherichia coli und Salmonella; Bacillaceae, wie Bacillus subtitis; Pneumococcus; Streptococcus und Haemophilus influenzae.

Der für die im folgenden beschriebenen experimentellen Arbeiten gewählte Organismus ist E. coli, Stamm RR1, Genotyp: Pro Leu Thi R₁₃ M_n rec A Str^r Lac y . E. coli RR1 wird aus E. coli HB101 (H. W. Boyer et al, J. Mol. Biol. (1969) 41, 459-472) durch Paarung mit E. coli K12 Stamm KL16 als Hfr-Donor, vgl. J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972) /Kulturen von Coli RR1 und E. Coli RR1 (pBR322) sind bei der American Type Culture Collection ohne irgendwelche Beschränkung hinsichtlich der Zugänglichkeit hinterlegt worden und haben die ATCC-Nummern 3/343 und 3/344 erhalten/.

Der Somatostatin erzeugende Organismus ist gleichfalls hinterlegt worden (ATCCNr. 31447).

Im Fall von Humaninsulin werden A- und B-Ketten-Gene in E. coli K-12 Stamm 294 (Ende A, thi", hsr", hsm,⁺), ATCC Nr. 31446 ge-

Jv

clont, und dieser Organismus wird zur Expression der A-Kette E. coli K-12 Stamm 294 /pIAV, ATCC Nr. 31448 verwendet. Die B-Kette von Humaninsulin wird zuerst in einem Derivat von HBIOt, d. h. E. coli K-12 Stamm D1210, ein lac⁺ (i^Qo⁺z y ), ausgebildet, und dieser B-Gen enthaltender Organismus ist gleichfalls hinterlegt worden (ATCC Nr. 31449). Das B-Gen kann aber auch in den zuerst genannten Organismus, d. tu Stamm 294, eingeführt und davon ausgebildet werden-.

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-25-

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.

Beispiel 1 I. Somatostatin

1. Aufbau von Somatostatingenfragmenten

Zuerst werden acht Oligodesoxyribinucleotide, die in Figur 2 mit A bis H bezeichnet sind, nach der modifizierten Triestermethode von K. Itakura et al, J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975) aufgebaut. Im Fall der Fragmente C, E und H wird jedoch eine verbesserte Arbeitsweise angewandt, wobei zunächst vollständig geschützte Trimere als Grundeinheiten für den Aufbau längerer Olxgodesoxyrxbonucleotide hergestellt werden.. Die verbessserte Arbeitsweise ist schematisch in Figur 3 dargestellt, worin B Thymin, N-benzoyliertes Adenin, N-benzoyliertes Cytosin oder N-isobutyraliertes Guanin bedeutet. Unter Bezugnahme auf Figur 3 verläuft mit einem Überschuß von I (2 mmolar) die Kupplungsreaktion II (1 mmolar) mit Hilfe eines starken Kupplungsreagens

2, 4, 6-Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid (TPSTe, 4 mmolar; 2} in 60 Minuten nahezu vollständig. Nach Entfernung der 5'-Schutzgruppe mit einer 2-prozentigen Benzolsulfonsäurelösung kann das 5'-Hydroxydimere V durch einfache Lösungsmittelextraktion mit wäßriger NaHCO_-Lösung in CHCT_ von einem Überschuß des 3'-Phosphodiestermonomeren IV abgetrennt werden. Der vollständig geschützte Trimerblock wird danach aus dem 5'-Hydroxydimeren V, I (2 mmolar) und TPSTe (4 mmolar) hergestellt und durch Chromatographie an Kieselgel nach B. T. Hunt et al₇ Chem= and Ind* 1868 (1967) isoliert. Die Ausbeuten der nach der verbesserten Arbeitsweise hergestellten Trimeren sind in Tabelle II angegeben,,

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Tabelle II

Ausbeute an vollständig geschützten Trimeren

Sequenz

Ausbeute Sequenz

Ausbeute

TTT

81 % ATG

69 %

TTT

75 % GCC

61 %

GGA

41 % CCA

72 %

AGA

49 % CAA

72 %

ATC

71 % TTA

71 %

CCT

61 % CAT

52 %

ACA

63 % CCC

73 %

ACC

65 % AAC

59 %

CGT

51 % GAT

60 %

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Die acht Olxgodesoxyrxbonucleotide werden nach der Entfernung aller Schutzgruppen durch Hochdruckflüssigchromatographie an Permaphase AAX (R.A. Henry et al J. Chrom. Sei. II, 358 (1973)) gereinigt. Die Reinheit jedes Oligomeren wird durch Homochromatographie an Dünnschicht-DEAE-Cellulose und auch durch Gelelektrophorese in 20-prozentiger Acrylamidplatte nach Markieren der Oligomeren

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mit /gamma- P_/-ATP in Gegenwart von Polynucleotid-Kinase kontrolliert. Aus jedem DNA-Fragment wird ein markiertes Hauptprodukt erhalten.

2. Verknüpfung und Acrylamidgelanalyse von Somatostatin-DNA

Die 5 ^Λ -OH-Termini der chemisch synthetisierten Fragmente A bis H werden getrennt mit T4-Polynucleotid-Kinase phosphory-

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liert. Zur Phosphorylierung wird /_ P_/-gamma-ATP verwendet, wodurch die Reaktionsprodukte autoradiographisch verfolgt werden können, obwohl, wie ersichtlich, auch unmarkiertes ATP verwendet werden kann, wenn eine Autoradiographie weggelassen wird.

32

Unmittelbar vor der Kinasereaktion werden 25 uCi /gamma- P/ATP (etwa 1500 Ci/mmolar) (Maxam and Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74, 1507 (1977)) in 0,5 ml Eppendorf-Rohren zur Trockne eingedampft. 5 Mikrogramm Fragment werden mit zwei Einheiten T4-DNA-Kinase (Hydroxylapatitfraktion, 2500 Einheiten/ml; 27) in 70 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl₂, 5 mm Dithiothreitol in einem Gesamtvolumen von 15Ο μΐ 20 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert. Zur Gewährleistung maximaler Phosphorylierung der Fragmente für Verknüpfungszwecke werden 10 μΐ einer Mischung aus 70 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl₂, 5 mm Dithiothreitol, 0,5 mm ATP und zwei Einheiten DNA-Kinase zugegeben, und die Inkubation noch weitere 20 Minuten bei 7 ⁰C fortgesetzt. Die Fragmente (250 ng/μΐ) werden ohne weitere Behandlung bei -20 ⁰C aufgehoben. Jeweils 1,25 μg der mit Kinase versehenen Fragmente A₇ B, E und F werden in einem Gesamtvolumen von 50 μΐ in 2O mm Tris-HCl pH 7„6, 1O mm MgCl_, 10 mm Dithiothreitol, O,5 mm ATP und 2 Einheiten T4 DNA-Ligase {Hydroxylapatitfraktion, 4ΌΟ Einheiten/ml-; 27} während 3£ Stunden bei 4 *C

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verknüpft. Die Fragmente C, D, G und H werden unter vergleichbaren Bedingungen verknüpft. Proben von jeweils 2 ml werden zur Analyse durch Elektrophorese auf einem 10-prozentigen PoIyacrylamidgel und anschließend durch Autoradiographie (H. L. Heyneker et al, Nature 263, 748 (1976) entnommen, wobei nicht umgesetzte DNA-Fragmente durch rasch wanderndes Material dargestellt werden und die monomere Form der verknüpften Fragmente mit Bromphenolblau (BPB) wandert. Aufgrund der kohäsiven Enden der verknüpften Fragmente A, B, E und F sowie der verknüpften Fragmente C, D, G und H erfolgt auch eine gewisse Dimerisierung. Diese Dimeren stellen das am langsamsten wandernde Material dar und können durch Restriktionsendonuclease Eco RI bzw. Bam HI gespalten werden. Die zwei Halbmoleküle (verknüpftes Ä + B + E + F und verknüpftes C + D + G + H) werden in einer weiteren Verknüpfungsstufe verbunden, die 16 Stunden bei 4 ⁰C in einem Endvolumen von 150 μΐ durchgeführt wird. Zur Analyse wird 1 Mikroliter entnommen. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten auf 65 ⁰C erwärmt, wodurch die T4-DNA-Ligase entaktiviert wird. Die Wärmebehandlung hat auf das Wanderungsbild der DNA-Mischung keinen Einfluß. Dem Reaktionsgemisch wird für die Spaltung der multimeren Formen der Somatostatin-DNA in 3O Minuten bei 37 ° ausreichende Restriktionsendonuclease BamHI zugesetzt. Nach Zugabe von NaCl auf 100 mMol wird die DNA mit EcoRI-Endonuclease aufgeschlossen. Der Restriktionsendonucleaseaufschluß wird durch Phenol-Chloroform- Extraktion der DNA beendet. Das Somatostatin-DNA-Fragment wird durch präparative Elektrophorese auf einem 10-prozentigen Polyacrylamidgel von nichtumgesetzten und teilweise verknüpften DNA-Fragmenten befreit. Die das Somatostatin-DNA-Fragment enthaltende Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA wird durch Zerschneiden des Gels in kleine Stücke und Extraktion mit Elutionspuffer (0,5 m Ammoniumacetat, 10 mm MgCl₂, 0,1 mm EDTA, O,1 % SDS) über Nacht bei 26 ⁰C eiuiert. Die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol gefällt, zentrifugiert , in 200 ,al 10 mm Tris-HCl pH 7*5 wieder gelöst und gegen den gleichen Puffer täislysierfc, uocliirch sine Somatostetin-DNA-Konsentration ~ron 4 ug/sü erhalten vird,

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3. Aufbau von Rekombinationsplasmiden

In Figur 4 ist schematisch die Art und Weise dargestellt, in der das Somatostatingen enthaltende Rekombinafcionsplastimde aufgebaut werden, weshalb in Ve rbindung mit der folgenden Erörterung darauf Bezug genommen wird.

A. Das Stammplasmid pBR 322

Das für die experimentelle Somatostatxnclonbxldung gewählte Plasmid ist pBR322, ein kleines Plasmid (Molekulargewicht etwa 2,6 Megadalton) mit gegen die Antibiotika Ampicillin (Ap) und Tetracyclin (Tc) resistenten Genen. Wie in Figur 4 angegeben, weist das ampicillinresistente Gen eine Spaltstelle für die Restriktionsendonuclease Pst I und das tetracyclinresistente Gen eine entsprechende Stelle für Restriktionsendonuclease Bam HI auf, und eine Eco RI-Stelle befindet sich zwischen den Ap^r und TC^r-Genen. Das Plasmid pBR322 stammt aus pBR313, einem 5,8 Megadalton Ap^rTc^rCol^lmm-Plasmid (R. L. Rodriquez et al, ICM-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology 5, 471-77 (1976), R. L. Rodriques et al, Construction and Characterization of Cloning Vehicles, in Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, S. 471-77, Academic Press, Inc. (1976). Das Plasmid pBR322 und die Art seiner Gewinnung sind ausführlich in F. Bolivar et al, "Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multipurpose Cloning System", Gene (November 1977) beschrieben.

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A INSPECTED^J

B. Aufbau des Plasmids pBHIO

5 Mukrogramm Plasmid ΡΒΈ322-ΏΉΆ werden mit 1O Einheiten

der Mestrikitioiiseiidonuclease EcoRI in 100 millimolarer Tris-HCl pH 7,6, 100 mill!molare» HaCl, 6 millimolarem MgCl₂ bei 37 ⁰C 3O Minaiten laaag aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch Phenol-■ßhloroform-Extraktion beendet; die DMA wird dann mit 2 1/2 Volumina Etiaanol gefällt und in 5O μΐ T4 D$3Ä Polymerase-Puffer wieder suspendiert (67 mn Tris-HCl pH 8,8, 6,7 mm MgCl₃₇ 16,6 mm ₂SCK, 167 jig/ml Rinderserumalbumin, je 5O μπι der einzelnen

Ά. Panet et al, Biochem. 12, 5Ο45 (1973)). Die Reaktion wird durch Zugabe von zwei Einheiten T4 DNA-Polymerase eingeleitet. Nach 3O Minuten langem Inkubieren bei 37 ⁰C wird die Reaktion durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion der DNA beendet, worauf mit Ethanol gefällt wird. 3 Mikrogramm Λ. plac DNA (Shapiro et al Nature 224, 768 (1969)) werden 1 Stunde bei 37 ⁰C mit dem Restriktionsenzym Haelll (3 Einheiten) in

6 mm Tris-HCl pH 7,6, 6 mm MgCi„, 6 mm ß-Mercaptoethanol in einem Gesamtvolumen von 20 μΐ aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65 ⁰C abgebrochen. Die pBR322-behandelte DNA wird mit der Haelll-aufgeschlossenen /V. plac -DNA vermischt und in einem Gesamtvolumen von 30 ml mit 1,2 Einheiten T4 DNA-Ligase (Hydroxylapatitfraktion; A. Panet et al, supra) in 20 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl_?, 10 mm Dithiothreitol, 0,5 mm ATP in 12 Stunden bei 12 ⁰C stumpfendig verknüpft. Die verknüpfte DNA-Mischung wird gegen 10 mm Tris-HCl pH 7,6 dialysiert und zur Transformation von E. coli Stamm RRl verwendet. Transformanten werden hinsichtlich Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenz auf Minimalmediumplatten ausgewählt, die 40 μg/ml S-Bronv-^-chlor-incolylgalactosid- (X-gal) Medium (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) enthalten. Zur Synthese von ß-Galactosidase fähige Kolonien werden durch ihre blaue Farbe identifiziert. Nach der Durchsicht von 45 unabhängig voneinander isolierten blauen Kolonien erweisen sich drei davon als zwei EcoRI-Stellen enthaltende Plasmid-ENA, die durch etwa 200 Basenpaare voneindaner getrennt sind. Die Lage eines

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asymmetrisch angeordneten Hhal-Fragments in dem HaeIII-lac-Kontrollfragment, b.p. 203, (W. Gilbert et al, in Protein-Ligand Interactions, H. Sand und G. Blauer, Herausgeber (De Gruyter, Berlin (1975) S. 193-210) ermöglicht die Bestimmung der Orientierung des Haelll-Fragments, nun ein EcoRI-Fragment, in diesen Plasmiden. Es zeigt sich, daß das Plasmid pBH1O das Fragment in der angestrebten Orientierung trägt, d. h. die lac-Transkription geht in das Tc^r Gen des Plasmids ein.

C. Aufbau des Plasmids pBH2O

Plasmid pBH1O wird dann modifiziert, um die zu dem lac-Operator distale EcoRI-Stelle zu eliminieren. Dies wird durch die bevorzugt verlaufende EcoRI-Endonucleasespaltung an der distalen Seite unter teilweisem Schutz durch RNA-Polymerase der anderen EcoRI-Stelle bewirkt, die sich zwischen dem Tc^r- und dem lac-Promoter befindet, zwischen denen nur etwa 40 Basenpaare angeordnet sind. 5 μg DNA werden nach Bindung der RNA-Polymerase mit einer Einheit EcoRI in einem Gesamtvolumen von 10 μΐ 10 Minuten bei 37 ⁰C aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65 ⁰C abgebrochen. Die EcoRI-Cohäsivtermini werden mit S1 Nuclease in 25 mm Na-acetat pH 4,5, 300 mm NaCl, 1 mm ZnCl« 5 Minuten lang bei 25 °C aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA bis 10 mm und Tris-HCl pH 8 (bis 50 mm) abgebrochen. Die DNA wird mit Phenol-Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 100 μΐ T4-DNA-Verknüpfungspuffer wieder suspendiert. Nach Zugabe von 1 μΐ T4 DNA-Ligase wird die Mischung 12 Stunden bei 12 ⁰C inkubiert. Die verknüpfte DNA wird in E. coli Stamm RR1 transformiert und Ap Tc^r-Transformanten werden auf X-gal-Antibiotikummedium selektioniert. Durch Restriktionsenzymanalyse von DNA aus 10 isolierten blauen Kolonien ergibt sich, daß diese Clone Plasmid-DNA mit einer EcoRI-Stelle enthalten. Sieben dieser Kolonien haben die EcoRI-Stelle, die sich zwischen dem Iac- und Tc -Promotor befindet, behalten. Die Nucleotidsequenz von der EcoRI-Stelle bis in den Iac-Regelbereich eines dieser Plasmide, pBH20, wird bestätigt gefunden. Dieses Plasmid v/ird dann zur Clonbildung des Somatostatingens verwendet,

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2ol, 051 - 35".

D. Aufbau von Plasmid pSOM 1

20 Mikrogramm Plasmid pBH2O werden mit Restriktionsendonuclease EcoRI und BamHI in einem Gesamtvolumen von 50 μΐ vollständig aufgeschlossen. Nach Zugabe von bakterieller alkalischer Phosphatase (0,1 Einheit von Worthington BAPF) wird die Inkubation 10 Minuten bei 65 ⁰C fortgesetzt. Die Reaktion wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion beendet, und die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol gefällt, zentrifugiert und in 50 μΐ 10 mm Tris-HCl pH 7,6, 1 mm EDTA gelöst. Die alkalische Phosphatasebehandlung verhindert mit guter Wirkung eine Selbstverknüpfung der EcoRI-BamHI-behandelten pBH20-DNA, aber kreisförmige Rekombinationsplasmide, die Somatostatin-DNA enthalten, können auch nach Verknüpfung noch ausgebildet werden. Da E. coli RRl durch linerare Plasmid-DNA nur mit sehr geringer Wirksamkeit transformiert wird, enthält der größte Teil der Transformanten Rekombinationsplasmide. 50 Mikroliter Somatostatin-DNA (4 μg/ml) werden mit 25 ml der BamHI-EcoRI alkalische Phosphatase-behandelter pBH2O DNA in einem Gesamtvolumen von 50 μΐ, enthaltend 20 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl₃, 10 mm Dithiothreitol, 0,5 mm ATP und 4 Einheiten T4 DNA-Ligase bei 22 ⁰C verknüpft. Nach 10, 20 und 30 Minuten werden dem Reaktionsgemisch weitere 40 ng Somtostatin-DNA zugesetzt (die allmähliche Zugabe von Somatostatin-DNA kann die Verknüpfung mit dem Plasmid anstelle einer Selbstverknüpfung begünstigen). Die Verknüpfungsreaktion wird noch 1 Stunde fortgesetzt, worauf die Mischung gegen 10 mm Tris-HCl pH 7,6 dialysiert wird. Bei einem Vergleichsversuch wird BamHI-, EcoRI-, alkalische Phosphadase-behandete pBH20-DNA unter vergleichbaren Bedingungen, aber in Abwesenheit von Somatostatin DNA verknüpft. Beide Präparate werden ohne weitere Behandlung zum Transformieren von E. coli RRl verwendet. Die Transformationsversuche werden in einem P3-physikalischen Behältergerät National Institutes of Health, USA, Recombinant DNA Research Guidelines, 1976) durchgeführt. Transformanten werden auf Platten aus Minimalmedium , das 20 μg/ml Ap und 40 μg/ml X-gal enthält, selektioniert. Es werden 10 Transformanten, von denen alle Tc-empfindlich sind, isoliert. Zur Bezugnahme werden sie als pS0M1, pS0M2,

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etc. ... pSOM 10 bezeichnet. Bei dem Vergleichsversuch werden keine Transformanten erhalten.. Vier der IO Transformanten enthalten Plasraide mit sowohl einer EcoRI- als auch einer BamHI-Stelle. Die Größe des kleinen EcoRI,BamKI-Fragments dieser Rekombinationsplasmide ist in allen 4 Fällen der Größe der in vitro hergestellten Somatostatin-DUÄ vergleichbar. Basen— sequenzanalyse nach Maxam und Gilbert Proc. Hat. Acad. Sei. USA 74, 560 (1977) ergibt, daß das Plasmid pSOMl das gewünschte Somato— statin-DNA-Fragment als Einfügung enthält.

Die DNA-Sequenanalyse des Clons mit Plasmid pSOMl läßt erwarten, daß damit ein Somatostatin enthaltendes Peptid erzeugt wird. Somatostatxnradxoimmumaktivxtät läßt sich jedoch in Extrakten von Zellkörnern oder überstehenden KuItürflüssigkeiten nicht nachweisen. Die Gegenwart von Somatostatin läßt sich auch nicht nachweisen, wenn die wachsende Kultur direkt zu 70-prozentiger Ameisensäure und Bromcyan gegeben wird. Es ist beobachtet worden, daß E. coli RRl-Extrakte exogenes Somatostatin sehr rasch abbauen. Das Fehlen von Somatostatinaktivität in Clonen, die Plasmid pSOMl enthalten, kann sehr wohl eine Folge eines intracellulären Abbaus durch endogene proteolytische Enzyme sein. Plasmid pSOM 1 wird daher zum Aufbau eines Plasmids verwendet, das den Code für ein Vorläuferprotein liefert, das Somatostatin enthält und groß genug ist, um einem proteolytischen Abbau zu wiederstehen.

E. Der Aufbau der Plasmide pSOM 11 und pSOM 11-3

Es wird ein Plasmid aufgebaut, worin das Somatostatingen am C-Terminus des ß-Galactosidasegens angeordnet werden kann, das die Translation in Phase hält. Das Vorhandensein einer EcoRI-Stelle nahe dem C-Terminus dieses Gens und die verfügbare Aminosäuresequenz dieses Proteins (B. Polisky et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 73, 3900 (1976), A.V. Fowler et al, ibid 74, 1507 (1976), A.I.Bukhari et al, Nature New Biology 243, 238 (1973) und K.E. Langley, J. Biol. Chem. 250, 2587 (1975)) ermöglichen die Einführung des EcoRI, BamHI-Somatostatingens in die EcoRI-Stelle unter Aufrechterhaltung des richtigen

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Leser ahimens » Sam Aufbau eines solchen Plasmids werden 50 μg pSQMI-DHA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Pstl in einem ,Gesamtvolumen won 1OO μΐ aufgeschlossen, Ein präparatives 5-prozentiges Polyacrylaimid<gel wird zur Abtrennung des großen Pst-EooRI-Fragments verwendet, das das Somatostatingen des kleinen Fragments mit den lac-Regelelementen aufweist. Die große Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA wird durch Aufteilen des Gels in kleine Stücke und Extraktion bei 65 ⁰C über Nacht eluiert. In vergleichbarer Weise werden 50 μg des Plasmids pBR322 DNA mit Pstl- und EcoRI-Restruktionsendonuclease aufgeschlossen, und die beiden erhaltenen DNA-Fragmente werden durch präparative Elektrophorse auf einem 5-prozentigen Polyaerylamidgel gereinigt. Das kleine Psti-EcoRI-Fragment von pBR322 (1 pg) wird mit dem großen Pstl-EcoRI-DNA-Fragment (5 μg} aus pS0M1 in einem Gesamtvolumen von 50 μΐ mit einer Einheit T4-DNA-Ligase in 12 Stunden bei 12 ⁰C verknüpft. Das Verknüpfungsgemisch wird zum Transformieren von E. coli RRI verwendet, und Transformanten werden auf X-gal-Medium auf Ampicillinreslstenz selektioniert. Erwartungsgemäß ergeben nahezu alle der Ap^r-Transformanten (95 %) weiße Kolonien (kein lac-Operator) auf X-gal-Indikatorplatten. Das erhaltene Plasmid, pS0M11, wird für den Aufbau des Plasmids pS0M11-3 verwendet. Eine Mischung aus 5 μg pSOMII-DNA und 5 μg T^plac -DNA wird mit 10 Einheiten EcoRI 30 Minuten bei 37 ⁰C aufgeschlossen. Der RestriktionsendonucleaseaufSchluß wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion beendet. Die DNA wird dann mit Ethanol gefällt und in 50 μΐ T4-DNA-Ligase-Puffer erneut suspendiert. Eine Einheit T4-DNA-Ligase wird zu der Mischung gegeben, worauf 12 Stunden bei 12 ⁰C inkubiert wird. Die Verknüpfungsmischung wird gegen 10 mm Tris-HCl pH 7,6 dialysiert und zum Transformieren von E. coli, Stamm RRl, verwendet. Transformanten werden auf X-gal-Platten, die Ampicillin enthalten, auf Ap^r selektioniert und auf wesentliche ß-Galactosidaseerzeugung ausgelesen. Etwa 2 % der Kolonien sind blau (pSOMH-1, 11-2 etc.). Restriktionsenzymanalyse von aus diesen Clonen erhaltener Plasmid-DNA ergibt, daß alle Plasmide ein neues EcoRI-Fragment von etwa 4,4 Megadalton

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aufweisen, das die lac-Operon-Regelstellen und den größten Teil des ß-Galactosidasegens aufweist. Da zwei Orientierungen des EcoRI-Fragments möglich sind, wird die asymmetrische Lage einer Hindlll-Restrictionsstelle dazu benutzt festzustellen, welche dieser Kolonien dieses EcoRI-Fragments mit fortschreitender lac-Transkription bis in das Somatostatingen aufweist.Hindlll-BamHI-DoppelaufSchlüsse zeigen, daß nur die Clone, die die Plasmide pSOMH-3, pSOMH-5, pSOM11-6 und pSOMH-7 aufweisen, das EcoRI-Fragment in dieser Orientierung enthalten.

4. Radioimmumprüfung auf Somatostatinaktivität

Die standartisierte Radioimmumprüfung (RIA) auf Somatostatin (A. Arimura et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 148, 784 (1975)) wird durch Verringerung des Prüfvolumens und durch Verwendung von Phosphatpuffer modifiziert. Tyr -Somatostatin wird unter Anwendung einer Chloramin-T-Arbeitsweise (ibid.) iodiert. Für die Prüfung auf Somatostatin wird die Probe, gewöhnlich in 70-prozentiger Ameisensäure, die 5 mg/ml Bromcyan enthält, in einem konischen Polypropylenrohr (0,7 ml, Sarstedt) über feuchtem KOH im Vakuum getrocknet. Nach Zugabe von 20 Mikroliter PBSA-Puffer (75 mm NaCl; 75 mm Natriumphosphat, pH 7,2;

1 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,2 mg/ml Natriumazid) werden

1 25
40 μΐ eines / jy-Somatostatin-"Cocktails" und 20 μΐ einer 1000-fachen Verdünnung von Kaninchenantisomatostatinimmunserum S39 (VaIe et al, Metabolism 25, 1491 (1976)) in PBSA zugegeben.

125

Der / jy-Somatostatin-Cocktail enthält je Milliliter PBSA-Puffer 25Ο ,ag normales Kaninchen-gamma-Globulin (Antibodies, Inc.), 1500 Einheiten Proteaseinhibitor ("Trasylol", Calbiochem.) und ca. 100 000 Zählungen / J/Tyr -Somatostatin. Nach wenigstens 16 Stunden bei Zimmertemperatur werden O,333 ml Ziegen-Antikaninchen-gamma-Globulin (Antibodies, Inc., P=O,03) in PBSA-Puffer zu den Proberöhrchen gegeben. Die Mischung wird

2 Stunden bei 37 ⁰C inkubiert, auf 5 ⁰C abgekühlt und dann bei 10 000 χ g 5 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit

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ORDINAL INSPECTED

-33- 2'όί, lh

wird entfernt, und das Korn wird in einem gamma-Zähler gezählt. Mit der verwendeten Menge an Antiserum werden 20 % der Zählungen ohne unmarkiertes konkurrierendes Somatostatin gefällt. Der Hintergrund mit unendlichem Somatostatin (200 ng) macht gewöhnlich 3 % aus. Die Hälfte der maximalen Konkurrenz wird mit 10 pg Somatostatin erhalten. Vorversuche mit Extrakten von E. coli Stamm RRl (Empfängerstamm) ergaben, daß weniger als 10 pg Somatostatin in Gegenwart von 16 μg oder mehr bromcyanbehandeltem bakteriellen Protein ohne weiteres erkennbar sind. Mehr als 2 μg Protein aus mit Ameisensäure behandelten bakteriellen Extrakten wirken sich durch Verstärkung des Hintergrunds etwas störend aus, aber diese Störung wird durch Bromcyanspaltung weitgehend kompensiert. Rekonstruktionsversuche zeigen, daß Somatostatin in mit Bromcyan behandelten Extrakten stabil ist.

A. Konkurrenz durch bakterielle Extrakte

Die Stämme E. coli RRl (pS0M11-5) und E. coli RRl (pS0M11-4)

werden in Luria-Brühe bei 37 °C bis 5 χ 10 Zellen/ml gezüchtet. Nach Zugabe von IPTG bis auf 1 mm wird die Züchtung noch 2 Stunden fortgesetzt. Aliquote Anteile von je 1 ml werden in einer Eppendorf-Zentrifuge einige Sekunden zentrifugiert, und die Körner werden in 500 μΐ 70-prozentiger Ameisensäure, die 5 mg/ml Bromcyan enthält, suspendiert. Nach etwa 24 Stunden bei Zimmertemperatur werden die aliquoten Anteile mit Wasser auf das 10-fache verdünnt, und die in Figur 6 angegebenen Volumina werden dreimal auf Somatostatin geprüft. In Figur 6 bedeutet "B/B " das Verhältnis von in Gegenwart

° 125

der Probe gebundenem /_ J/-Somastostatin zu dem in Abwesenheit von konkurrierendem Somatostatin gebundenem. Jeder Punkt entspricht dem Durchschnitt von drei Rohren. Der Proteingehalt der unverdünnten Proben wird mit 2,2 mg/ml für E. coli RRl (pS0M11-5) und mit 1,5 mg/ml für E. coli RRl (pSOM-4) bestimmt.

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öd/ ·- η

B. Das Auslesen, von pSOMI 1-Clonen auf Soma to statin

Wie oben in Verbindung mit Figur 6 beschrieben werden mit Bromcyan behandelte Extrakte von 11 Clonen (pS0M11-2, pSOMH-3, etc.) hergestellt. Dreimal 30 Mikroliter jedes Extrakts werden zur Radioimmunprufung entnommen, deren Ergebnisse in Figur 7 erscheinen. Der Bereich der Prüfpunkte ist angegeben. Die Werte für picogramm Somatostatin sind von einer Standardkurve abgelesen, die als Teil des gleichen Versuchs erhalten wurde.

Die oben angegebenen Ergebnisse der Radioimmunprüfung können folgendermaßen zusammengefaßt werden: Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Versuche mit pSOMI zeigen vier Clone CpSOMI1-3, 11-5, 11-6 und 11-7) ohne weiteres nachweisbare Somatostatinradioimmunaktivität (Figuren 6 und 7). Restriktionsfragmentanalyse ergibt, daß pS0M11-3, pS0M11-5, pS0M11-6 und pS0M11-7 die gewünschte Orientierung des lac-Operon aufweisen, wohingegen pS0M11-2 und 11-4 die entgegengesetzte Orientierung zeigen. Es besteht somit eine einwandfreie Beziehung zwischen der richtigen Orientierung des lac-Operon und der Erzeugung von Somatostatin-Radioimmunaktivität.

C. Wirkungen von IPTG-Induktion und CNBr-Spaltung auf positive und negative Clone

Die Ausgestaltung des Somatostatxnplasmxds läßt darauf schließen, daß die Synthese von Somatostatin unter der Kontrolle des lac-Operon steht. Das lac-Repressorgen ist nicht in dem Plasmid enthalten, und der Empfänger- oder Rezipientenstamm (E. coli RRl) enthält das Wildtyp-Chromosomen-lac-Repressorgen, das nur 10 bis 20 Repressormoleküle je Zelle (15) erzeugt. Die Anzahl der Plasmidkopien (und damit die Anzahl an lac-Operatoren) beläuft sich auf etwa 20 bis 30 pro Zelle, so daß eine vollständige Repression unmöglich ist. Wie aus der folgenden Tabelle III hervorgeht, wird die Aktivität von Somatostatin in E. coli RRl

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ORIGINAL

051

(pSOMIl—3) durch IFiG, einem Induktor des lac-Operons, erhöht. Wie erwartet ist der Grad der Induktion gering und liegt zwischen dem 2,4- bis 7-fachen. Im Versuch 7 {Tabelle III) wird ei-Aktivität, ein Maß der ersten 92 Aminosäuren von ß-Galactosidase gleichfalls um einen Faktor von 2 induziert. In mehreren Versuchen kann eine nachweisbare Somatostatinradioimmunaktivität vor der BromcyaiRspaltung des gesamten cellularen Proteins nicht festgestellt werden. Da das bei der Radioimmunprüfung verwendete Antiserum S 39 ein freies U-terminales Alanin erfordert, ist vor der Bromcyanspaltung eine Aktivität nicht zu erwarten.

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284051

Tabelle III

Somatostatinradioimmunaktivität Abkürzungen:

LB = Luriabrühe IPTG = Isopropylthxogalactosid CNBr = Bromcyan SS = Somatostatin

Protein wird nach der Methode von Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976) bestimmt.

IPTG CNBr Versuch Stamm Medium 1 mmolar 5 mg/ml pg SS^g Protein

+ < 0,1

+ 12

+ < 0,4

+ ' 15

+ 12

+ 61

+ 8

< 0,1

+ 71

+ 62

+ 250

+ 320

+ < 0,1

+ 24

+ 10

*Vogel-Bonner-Minimalmedium plus Glycerin

1	11-2	LB +
	11-3	LB +
	11-4	LB +
	11-5	LB +
2	11-3	LB +
	11-3	LB +
3	11-3	LB +
	11-3	LB
	11-3	LB +
4	11-3	LB +
	11-3	VB + Glycerin*+
5	11-3	LB + Glycerin +
6	11-3	LB +
	11-2	LB +
7	11-3	LB +
	11-3	LB

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op ί. .- λ C ι

D. Gelfiltration von mit Bromcyan behandelten Extrakten

Mit Ameisensäure und Bromcyan behandelte Extrakte der positiven Clone (pSOM 11-3, 11-5, 11-6 und 11-7) werden vereinigt, (Gesamtvolumen 250 μΐ), getrocknet und in 0,1 ml 50-prozentiger

3 Essigsäure wieder suspendiert. Nach Zugabe von / H/Leucin wird die Probe auf eine 0,7 χ 47 cm-Säule aus Sephadex G-50 in 50-prozentiger Essigsäure aufgebracht. Aliquote Anteile von jeweils 50 Mikroliter der Kolonnenfraktionen werden auf Somatostatin geprüft. Vereinigte negative Clonextrakte (11-2, 11-4 und 11-11) werden genauso behandelt. Die Ergebnisse sind der Figur 8 zu entnehmen. Auf der gleichen Säule wird bekanntes Somatostatin (Beckman Corp.) wie angegeben (SS) eluiert. In diesem System wird Somatostatin von ausgeschlossenen großen Peptiden und vollständig eingeschlossenen kleinen Molekülen gut getrennt. Nur Extrakte von für Somatostatin positiven Clonen zeigen Radioimmunaktivität in den Säulenfraktionen, und diese Aktivität wird in der gleichen Position wie chemisch synthetisiertes Somatostatin eluiert.

Zusammenfassung der Aktivitätsinformation

Die Daten für den Beweis der Synthese eines Polypeptids mit der Somatostatinaminosäuresequenz sind wie folgt zusammenzufassen:

(1) Somatostatinradioimmunaktivität liegt vor in E. coli-Zellen mit dem Plasmid pS0M11-3, das ein Somatostatingen mit erwiesener richtiger Sequenz enthält und die richtige Orientierung des lac-EcoRI-DNA-Fragments hat. Zellen mit dem verwandten Plasmid pS0M11-2, das das gleiche Somatostatingen enthält, aber eine entgegengesetzte Orientierung des lac-EcoRI-Fragments hat, erzeugen keine nachweisbare Somatostatinaktivität.

(2) Wie aufgrund des Gesaltungsschemas vorherzusehen, ist bis zur Bromcyanbehandlung des Zellextrakts eine nachweisbare Somtostatinradioirnmunaktivität nicht zu beobachten.

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(3) Die Somatostatinaktivxtat steht unter der Kontrolle des lac-Operons, was durch Induktion durch IFTG, einen Induktor des lac-Qperons, nachgewiesen wird.

(4) Die Samatostatinaktivität ergibt auf Sephadex G-5Q ein gemeinsames Chromatogramm mit bekanntem Samatostatin.

(5) Die DNA-Sequenz des geclonten Samafcastating/ens ist richtig. Wenn die Translation nicht in Phase ist_r wird ein Peptid gebildet _t das sich in. jeder Stellung von Somatostatin unterscheidet. Es wird eine Radioimmunaktivität festgestellt, die anzeigt, daß ein dem Somatostatin nahestehendes Peptid gebildet worden ist, und die Translation muß in Phase sein. Da Translation in Phase erfolgt, bestimmt der genetische Code, daß ein Peptid mit der genauen Sequenz von Somatostatin gebildet wird.

(6) Schließlich inhibieren die obigen Proben von E. coli RRl(pSOM11-3)-Extrakt die Freisetzung von Wachstumshormon aus Hypophysenzellen von Ratten, wohingegen parallel und mit identischer Proteinkonzentration hergestellte Proben von E. coli RRl(pSOM11-2) keine Wirkung auf Wachstumshormonfreisetzung ausüben.

Stabilität, Ausbeute und Reinigung von Somatostatin

Die Stämme mit dem EcoRI-lac-Operon-Pragment (pSOM11-2, pSOM11-3, etc.) trennen sich hinsichtlich des Plasmidphänotyps. Beispielsweise ist nach etwa 15 Generationen etwa die Hälfte der E. coli RRl(pSOM11-3)-Kultur für ß-Galactosidase verantwortlich, d. h. weist den lac-Operator auf, und etwa die Hälfte hiervon ist ainpicillinresistent. Für Somatostatin positive (pSOM.11-3) und negative (pSOM11-2) Stämme sind unbeständig, und deshalb rührt der Wachstumsnachteil vermutlich von der Überproduktion der großen aber unvollständigen und inaktiven Galactosidase her. Die Ausbeute

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an Somatostatin schwankt von 0,001 bis 0,03 % des gesamten cellularen Proteins !Tabelle I) , vermutlich infolge der Selektion von Kulturzellen mit Plasmiden mit einem fehlenden lac-Bereieh. Die hodhsten Ausbeuten an SDmatostatin werden mit Präparaten erzielt;, bei .deren Herstellung das Wachstem von. einer einzigen ampicillinresistenten richtunggebenden oder konstitutiven Kolonie ausgegangen ist. Selbst in diesen Fällen haben 3O % der Zellen bei der Gewinnung oder Ernte Verluste an lac-Bereichen. Lagerung in gefrorenem Eutand {üyophilisierung) und Wachstum bis zur Gewinnung aus einer einzigen derartigen Kolonie ist daher für das beschriebene System angezeigt. Ausbeuten können beispielsweise durch Verwendung von Bakterienstämmen erhöht werden, die Iac—Sepressor überproduzieren, so daß eine Expression von Vorläuferprotein vor Induktion und Ernte praktisch völlig unterdrückt wird. Wie bereits erörtert, kann aber auch ein Tryptophan- oder anderes Operatorpromotersystem angewandt werden, das gewöhnlich vollständig unterdrückt ist.

In dem rohen Extrakt, der beim Aufbrechen der Zellen in zum Beispiel einer Eaton-Presse erhalten wird, ist das ß-Galactosidase-Somatostatinvorläuferprotein unlöslich und findet sich in dem Korn der ersten Zentrifugierung mit geringer Geschwindigkeit. Die Aktivität kann in 70-prozentiger Ameisensäure, 6m Guanidiniumhydrochlorid oder 2-prozentigem Natriumdodecylsulfat gelöst werden. Vorzugsweise wird jedoch der Rohextrakt aus der Eaton-Presse mit 8m Harnstoff extrahiert und der Rückstand mit Bromcyan gespalten. Bei den anfänglichen Versuchen ist Somatostatinaktivität aus E. coli Stamm RRl (pSOM 11-3) durch Alkoholextraktion des gespaltenen Produkts und Chromatographie an Sephadex G-50 in 50-prozentiger Essigsäure etwa 100-fach angereichert worden. Wird das Produkt erneut an Sephadex G-50 chromatographiert und dann einer Hochdruckflüssigchromatographie unterworfen, kann praktisch reines Somatostatin erhalten werden.

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ORJQINAtr INSPECTED '

284.Ό51 -'Vf.

II. Humaninsulin

Die oben beschriebenen Arbeitsweisen werden als nächstes auf die Erzeugung von Humaninsulin angewandt. So werden die Gene für die Insulin B Kette (104 Basenpaare) und für die Insulin A Kette (77 Basenpaare) aus der Aminosäuresequenz der Humanpolypeptide jeweils mit einzelsträngigen Kohäsivtermini für die EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonuclease und jeweils für die getrennte Einführung in pBR322-Plasmide bestimmt, gestaltet. Die synthetischen Fragmente, Deca- bis Pentadecanucleotide, werden durch die Blockphosphotriestermethode unter Verwendung von Trinucleotiden als Baublöcke synthetisiert und schließlich mit einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gereinigt. Die synthetischen Gene für Humaninsulin A- und B-Ketten werden dann getrennt in Plasmid pBR322 zur Clonbildung gebracht. Die synthetischen Gene werden dann in Clonform an E. coli-ß-Galactosidasegen wie oben angelagert, wodurch eine wirksame Transkription und Translation und ein stabiles Vorläuferprotein erhalten wird. Insulinpeptide werden vom ß-Galactosidasevorläufer gespalten, durch Radioimmunprüfung nachgewiesen und gereinigt. Insulinradioimmunprüfungsaktivität wird dann durch Vermischen der E. coli-Produkte erzeugt.

1. Ausgestaltung und Synthese von Humaninsulinqenen

Die für Humaninsulin aufgebauten Gene sind in Figur 9 dargestellt. Die Gene für Humaninsulin, B-Kette und Α-Kette, werden aus der Aminosäuresequenz von Humanpolypeptiden gestaltet. Die 5'-Enden jedes Gens haben einsträngige kohäsxve Termini für die EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonuclease für die richtige Einfügung jedes Gens in das Plasmid pBR322. In die Mitte des B-Ketten-Gens für die Aminosäuresequenz Glu-Ala wird eine Hindlll-Endonuclease-Erkennungsstelle eingebaut, um Verbreitung und Nachweis jeder Hälfte des Gens gesondert vor dem Aufbau des gesamten B-Kettengens zu ermöglichen. Die B-Ketten- und A-Ketten-Gene werden so gestaltet, daß sie von 29 verschiedenen

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Oligodesoxyribonucleotiden, vom Decameren bis zu den Pentadecameren, aufgebaut werden. Jeder Pfeil bezeichnet das Fragment, das durch die verbesserte Phosphotriestermethode synthetisiert wird, H1 bis H8 und B1 bis B12 für das B-Kettengen und Al bis A11 für das A-Kettengen.

2. Chemische Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden

Die für die Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden angewandten Materialien und Methoden sind im Wesentlichen die in Itakura, K. et al (1975) J. Biol. Chem. 250, 4592 und Itakura, K. et al (1975) J. Amer. Chem. Soc. 97, 7327 beschriebenen, mit Ausnahme der folgenden Modifikationen:

a) Die vollständig geschützten Mononucleotide 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-p-chlorphenyl-ß-cyanethyl-phosphate werden aus den Nucleosidderivaten unter Verwendung des monofunktionellen Phosphorylierungsmittels p-Chlorphenyl-ß-cyanethyl-phosphorochloridat (1,5 Moläquivalente) in Acetonitril in Gegenwart von 1-Methylimidazol, Van Boom, J. H. et al (1975) Tetrahedron 31, 2953, synthetisiert. Die Produkte werden in großem Maßstab (100 bis 300 g) durch präparative Flüssigchromatographie (Prep 500 LC, Waters Associates) isoliert.

b) Unter Anwendung der Lösungsmittelextraktionsmethode /Hirose, T. et al (1978) Tetrahedron Letters, 2449/ werden 32 bifunktionelle Trimere (vergleiche Tabelle IV) in einem Maßstab von 5 bis 10 mm und 13 Trimere, 3 Tetramere und 4 Dimere als 3'-Terminusblöcke in einem Maßstab von 1 mMol synthetisiert. Die Homogenität der vollständig geschützten Trimeren wird durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel in zwei Methanol/Chloroform-Lösungsmittelsystemen: Lösungsmittel a 5 % Vol./Vol. und Lösungsmittel b 10 % Vol./Vol.

(vgl. Tabelle IV) kontrolliert. Ausgehend von diesen verschiedenen Verbindungen werden 29 Oligodesoxyribonucleotide mit definierter Sequenz synthetisiert, 18 für das B-Ketten- und 11 für das A-Ketten-Gen.

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Als Grundeinheiten für den Aufbau von Polynucleotiden werden zwei Arten von Trimerblöcken_r d, fr. die bifunktioneilen Tri— merblöcke von Tabelle IV und entsprechende an der S'-Hydroxygruppe durch eine Anisoylgruppe geschützte 3'-Terminus-Trimere verwendet. Das bifunktionelle Trimere wird mit einer Mischung aus Pyridin, Triethylamin und Wasser C3 s 1 ι 1_r Vol./FoI.) zu der entsprechenden 3'-Phosphadiesterkomponente und mit 2 % Benzolsulfonsäure zu der entsprechenden 5^l—Hydroxykomponente hydrolysiert. Der bereits erwähnte 3'-Terminus-Block wird mit 2-prozentiger Benzolsulfonsäuxe behandelt, wodurch die entsprechende 5'-Hydroxylverbindung gebildet wird. Die Kupplungsreaktion eines Überschusses des 3'-Phosphodxestertrxmeren (1,5 Mo!äquivalente) mit der 5'-Hydroxy!komponente (1 Moläquivalent) in Gegenwart von 2,4,6-Trxisopropylbenzolsulfonyltetrazolid (TPSTe, 3 bis 4 Äquivalente) ist nach drei Stunden nahezu vollständig abgelaufen. Zur Entfernung des Überschusses des 3^r-Phosphodiesterblocks wird das Reaktionsgemisch durch eine kurze Kiesigelsäule auf einem Sinterglasfilter geleitet. Die Säule wird zuerst mit CHCl^ zum Eluieren einiger Nebenprodukte und des Kupplungsreagens und dann mit CHCl^rMeOH (95:5 Vol./Vol.), worin nahezu das gesamte, vollständig geschützte Oligomere eluiert wird, gewaschen. Unter diesen Bedingungen bleibt der eingesetzte 3'-Phosphodiesterblock-Reaktionsteilnehmer in der Säule. In entsprechender Weise werden Blockkupplungen wiederholt, bis die gewünschte Länge aufgebaut ist.

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-43--

Tabelle Synthese -yon Trimerbaublöcken

	Verbin	Ausbeute **	a.	Rf . Reinheit***	<%)	zugegen in
JSTr.	dung*	ί%)	0,15	b,	93	(siehe Fig. 9)
1.	AAG	47	0,25	0,40	95	B5,B6
2.	AAT	49	0,28	0^.52	93	ΗΙ,ΑΙ,Αδ
	AAC	52".	0.27	0.55	91	H5,B6,A2,A8
4I	ACT	43	0,33	0,53	96	B4,B5,A6
5.	ACC	56	0,18	0.60	90	B7
6.	ACG	39	-OyIO	0,45	89	Eo,B7
7.	AGG	45	0,14	0,26	96	X3C XJ"7 T3 Q flu .Q / »Ij_7
8.	AGT	33-	0,19	0,40	92	B9,A2,A11
9.	AGC	50	0,24	0.48	91	H8,B1,A5,A1O
10.	AGA	48	0,26	GI50	95	Α9Λ
11.	TTC	44	0 11	G, 52	94	B4,B7,A3
12I	TTC	49	0,24	0 31	96	H3,H5,A2,A3,A5
13.	TCT	58	0,28	0,49	92	A4
14.	TCA	45	0,12	0 53	91	H1,H2,H4,A1
15.	TCG	39	0,10	0,34	87	A2
16.	TGG	32	0,18	0,28	93	H3,A1,A1O
17.	TGC-	51	0,12	0,47	94	H6,B2,A4,A7,A3
18.	TGA	46	0,22	0,37	90	H7
19.	TAG	61	0,17	0,50	95	B4,A11
20.	TAA	55	0,30	0,44	97	B5,A10
21.	CCT	53	0,25	0,55	92	H3,H4,B10
22.	CAC	47	0,25	0,51	93	A3
23.	CAA	58	0,28	0,51	92	H2,H6,HS,A7
24.	CTT	41	• 0,27	0,54	93	82^9,^4
25.	CGA	40	0,25	0,52	89	A7
26.	CGT	75	0,09	0.50	90	Ε2,Η4,Β3,31
27.	GGT	35	0,18	0^26	93	B3
28.	GTT	46	0,25	0,45	95	B2
29.	GTA	38	0,15	0,50	88	•B6,B3,A6
30.	GAA	39	0,22	0,39	89	H7/B3,33/A5
31.	GAT	52	0,14	0,49	93	BIO,A9
32.	GCA	42	0,39	A3

* vollständig geschützte Tridesoxynucleotide; 5-0 9-Dimethoxytrityl-3'-p-chlorphenyl-ß-cyanethylphosphpat

** Gesamtausbeute, bezogen auf die 5'-Hydroxylmonomeren *** Aufgrund der HPLC-Analyse

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Während der Oligonucleotxdsynthese wird ausgiebig von der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) Gebrauch gemacht, und zwar für die Analyse von a) jedem Trimer- und Tetramerblock, b) den als Zwischenprodukte auftretenden Fragmenten (Hexamere, Nonamere und Decamere), c) der letzten Kupplungsreaktion und d) zur Reinigung der Endprodukte. Für die HPLC wird ein Spectra-Physics 35OOB Flüssgchromatograph verwendet. Nach Entfernung aller Schutzgruppen mit konzentriertem NH₄OH bei 50 ⁰C (6 Stunden) und 80-prozentiger Essigsäure bei Zimmertemperatur (15 Minuten) werden die Verbindungen an einer Permaphase AAX (DuPont) /Van Boom, J. et al (1977) J. Chromatography 131, 169/ Säule (1 m . 2 mm) unter Anwendung eines linearen Gradienten des Lösungsmittels B (0,05m KH„PO. - 1,0m KCl, pH 4,5) in Lösungsmittel A (0,01m KH₂PO₄, pH 4,5) analysiert. Der Gradient verläuft folgendermaßen: Es wird mit Puffer A begonnen, und dann werden 3 % Puffer B in der Minute angewandt. Die Elution wird bei 60 ⁰C mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/Minute durchgeführt. Auch die Reinigung der 29 End-Oligonucleotide wird an Permaphase AAX unter den gleichen oben angegebenen Bedingungen durchgeführt. Die Materialien mit dem gewünschten Peak werden vereinigt, durch Dialyse entsalzt und lyophilisiert. Nach Markieren der 5'-Termini 32

mit (gamma- P)ATP unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase wird die Homogenität jedes Oligonucleotids durch Elektrophorese auf einem 20-prozentigen Polyacrylamidgel kontrolliert.

3. Anordnung und Clonbildung von B-Kettengen und A-Ketten-Gen

Das Gen für die B-Kette von Insulin weist eine EcoRI-Restriktionsstelle am linken Ende, eine Hindlll-Stelle in der Mitte und eine BamHI-Stelle am rechten Ende auf. Dadurch ist es möglich, beide Hälften, die linke EcoRI-Hindlll-Hälfte (BH) und die rechte Hindlll-BamHI-Hälfte (BB), in dem gut geeigneten Clonbildungsträger pBR322 getrennt zu clonen und nach Feststellung ihrer Sequenzen zu dem vollständigen B-Gen zu verbinden (Figur 10). Die BB-Hälfte wird durch Verknüpfen aus 10 Oligodesoxyribonucleotiden, in Figur 9 mit B1 bis B1O bezeichnet,

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- &sr- 2^' "-51

-Sa-

zusammengestellt, die durch chemische Phosphotriestersynthese gebildet wurden. B1 und B10 sind nicht phosphoryliert, wodurch eine unerwünschte Polymerisation dieser Fragmente über ihre Cohäsivenden (Hindlll und BamHI) vermieden wird. Nach Reinigung durch präparative Acrylamidgelelektrophorese und Elution der größten DNA-Bande wird das BB-Fragment in das mit Hindlll und BamHI gespaltene Plasmid pBR322 eingefügt. Etwa 50 % der von der DNA stammenden ampicillinresistenten Kolonien sind tetracyclinempfindlich, was zeigt, daß ein Nichtplasmid-Hindlll-BamHI-Fragment eingeführt worden ist. Die kleinen HindllI-BamHI-Fragmente aus vier dieser Kolonien (pBB101 bis pBB104) erweisen sich bei der Sequenzprüfung als richtig gestaltet.

Das BH-Fragment wird in entsprechender Weise hergestellt und in mit EcoRI- und Hindlll-Restriktionsendonuclease gespaltenes pBR322 eingefügt. Plasmide aus drei ampicillinresistenten, tetracyclinempfindlichen Transformanten (pBH1 bis pBH3) werden analysiert. Dabei wird festgestellt, daß die kleinen EcoRI-HindllI-Fragmente die erwartete Nucleotidsequenz aufweisen.

Das A-Kettengen wird aus drei Teilen zusammengestellt. Die vier linken, vier mittleren und vier rechten Oligonucleotide (vergleiche Figur 9) werden gesondert verknüpft, dann vermischt und verknüpft (die Oligonucleotide A1 und A12 sind unphosphoryliert). Das zusammengestellte A-Kettengen wird phosphoryliert, durch Gelelektrophorese gereinigt und in pBR322 an den EcoRI-BamHI-Stellen geclont. Die EcoRI-BamHI-Fragmente von zwei ampicillinresistenten, tetracyclinempfindlichen Clonen (pAiO, pA11) enthalten die angestrebte A-Gensequenz.

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284-351

4. Aufbau von Plasmiden zur Expression von A- und B-Insulingenen

Figur 10 zeigt den Aufbau des lac-Insulin B Plasmoids fpIB1) . Die Plasmide pBHl und PBB101 werden mit EcoRI- und Hindlll-Endonuclease aufgeschlosen. Das kleine BH-Fragment von pBHT und das große Fragment von pBBlOI (enthaltend das BB-Fragmen.t und den größten Teil von pBR322) werden durch Gelelektrophorese gereinigt, vermischt und xn Gegenwart von mit EcoRI gespaltenen /L plac verknüpft. Das Megadalton-EcoRI-Fragment von Λ. plac enthält den lac-Regelbereich und den größten Teil des ß-Galactosidase-Strukturgens. Die Konfiguration der Restriktionsstellen gewährleistet die richtige Verbindung von BH an BB- Das lac-EcoRI-Fragment kann sich in zwei Orientierungen einfügen; deshalb hat nur eine Hälfte der nach Transformation erhaltenen Clone die angestrebte Orientierung. Die Orientierung von 10 ampicillinresistenten ß-Galactosidase bildenden Clonen wird durch Restriktionsanalyse kontrolliert. Fünf dieser Kolonien enthalten die gesamte B-Gensequenz und den richtigen Leserahmen aus dem ß-Galactosidasegen in das B-Kettengen. Eine Kolonie, pIB1, wird für anschließende Versuche ausgewählt.

Bei einem vergleichbaren Versuch wird das 4,4-Megadaltonlac-Fragment /\_plac an der EcoRI-Stelle in das pA11-Plasmid eingeführt, wodurch pIA1 erhalten wird. Letzteres erweist sich als mit pIB1 identisch mit der Ausnahme, daß das B-Gen-Fragment durch das A-Gen-Fragment ersetzt ist. Die DNA-Sequenzanalyse zeigt, daß die korrekten A- und B-Kettengensequenzen in pIAi bzw. pIBi erhalten geblieben sind.

5. Expression

Die Stämme mit den in richtiger Weise an ß-Galactosidase gebundenen Isulingenen erzeugen beide große Mengen eines Proteins mit der Größe von ß-Galactosidase. Etwa 20 % des

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ÖFHGINAt

2S4-::051

gesamten Zellproteins bestehen aus diesem ß-Galactosidase-Insulin A- oder B-Ketten-Hybrid. Die Hybridproteine sind unlöslich und finden sich in dem ersten bei geringer Geschwindigkeit erhaltenen .Korn, worin sie etwa 50 % des Proteins ausmachen.

Zum Nachweis der Expression der Insulin-Ä- und -B-Ketten wird eine Eadioiinmunpxüfung {ΈΣΚ) angewandt, die auf der Bildung von vollständigem Insulin aus den gesonderten Ketten beruht. Die InsulinbildiHigsmaßnahmen von Katsoyannis et al (1967) Biochemistry 6, 2642-2655, ergeben, angepaßt an ein Prüfvolumen von 27 Mikroliter, eine sehr gut geeignete Prüfung. Nach Vermischen und Bildung von S-sulfonierten Derivaten der Insulinketten wird ohne weiteres nachweisbare Insulinaktivität erhalten. Die getrennten S—sulfonierten Ketten von Insulin reagieren nach Reduktion und Oxidation nicht merklich mit dem verwendeten Antiinsulin-Antikörper.

Für die Insulinbildungsprüfung wird das ß-Galactosidase-A- oder B-Ketten-Hybridprotein teilweise gereinigt, mit Bromcyan gespalten und in S-sulfonierte Derivate übergeführt.

Der Nachweis dafür, daß die richtige Expression von chemisch synthetisierten Genen für Humaninsulin erzielt worden ist, kann folgendermaßen zusammengefaßt werden:

a) Radioimmunaktivität ist für beide Ketten nachgewiesen worden.

b) Die nach Clonbildung und Plasmidaufbau erhaltenen DNA-Sequensen sind direkt als der Gesaltung entsprechend nachgewiesen worden. Da Radioimmunaktivität erhalten wird, muß die Translation in Phase sein. Der genetische Code bestimmt daher, daß Peptide mit der Sequenz von Humaninsulin erzeugt werden.

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c) Nach der Bromcyanspaltung verhalten sich die E. coli-Produkte in drei verschiedenen chromatographxschen Systemen, bei denen die Trennung auf verschiedenen Prinzipien beruht (Gelfiltration, Ionenaustausch und Umkehrphasen-HPLC) als Insulinketten.

d) Die von E. coli erzeugte Α-Kette ist durch HPLC in einem kleinen Maßstab gereinigt worden und hat die richtige Aminosäurezusammensetzt .

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Claims (21)

.153/244 - 2 8 4 η ο Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Strukturgens, das den Code für die mikrobielle Expression eines Polypeptids liefert, durch Herstellung und Zusammenstellung einer Reihe von Oligodesoxyribonucleotidf ragmenten , wobei-

(a) eine erste Reihe von Oligodesoxyribonucleotidfragmenten, die nach Verbinden in der richtigen Reihenfolge eine DNA mit einem Codierstrang für die Aminosäuresequenz des Polypeptids ergibt, und

(b) eine zweite Reihe von Oligodesoxyribonucleotidfragmenten, die nach Verbinden in der richtigen Reihenfolge einen DNA-Strang ergeben, der zu dem Codierstrang komplementär ist, hergestellt,

(c) Wasserstoffbindung zwischen zueinander komplementären
Stellen der Fragmente der ersten und der zweiten Reihe unter Bildung einer doppelsträngigen Struktur ausgebildet wird und

(d) die jeweiligen Stränge durch Verknüpfung vervollständigt werden, dadurch gekennzeichnet, daß

(1) das gebildete Gen den Code für die Expression
eines Säugerpolypeptids liefert,

(2) die Codone in dem Codierstrang wenigstens zum überwiegenden Teil solche für die Expression von mikrobiellen Genomen bevorzugte sind und

(3) den in Stufe (c) verbundenen Fragmenten untereinander Komplementarität mangelt mit Ausnahme von in dem Strukturgen aneinanderangrenzenden Fragmenten.

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.""■ Γ

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , daß Fragmente verwendet werden, bei deren Verwendung dem Codierstrang des Strukturgens das Codon ATG unmittelbar vorausgeht und ein oder mehrere Beendigungscodone unmittelbar folgen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die verwendeten Fragmente das gebildete Gen mit Cohäsivtermini mit einem der beiden Stränge einer Restriktionsendonucleasen-Erkennungsstelle versehen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß das gebildete Gen den Code für ein Hormon oder ein Zwischenprodukt dafür als Polypeptid liefert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Polypeptid Somatostatin ist und die Codone für die Aminosäuren von Somatostatin folgendermaßen ausgewählt werden:

Aminosäure: Codon Aminosäure: Codon aus der Gruppe: gly: GGT ala: GCT und GCG cys TGT asn: AAT und AAC lys AAG phe: TTC und TTT trp TGG thr: ACT und ACG ser: TCC und TCG.

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6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß das gebildete Gen den Code für Humanvorproinsulin, Humanproinsulin, die Α-Kette von Humaninsulin, die B-Kette von Humaninsulin, Human- oder Rinderwachstumshormon, luteinisierendes Hormon, ACTH oder Pancreaspolypeptid liefert.

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß die entgegengesetzten Termini des gebildeten Gens einen der zwei Stränge verschiedener Restriktionsendonucleasen-Erkennungsstellen aufweisen.

8. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet , daß die verwendeten Fragmente jeweils etwa 11 bis 16 Nucleotide aufweisen.

9. Doppelsträngiges Polydesoxyribonucleotid mit Cohäsivtermini mit jeweils einem Strang einer doppelsträngigen Restriktionsendonucleasen-Erstellungsstelle und zwischen den Termini einem Strukturgen, das den Code für die Expression eines Säugerpolypeptids liefert, wobei die Codone in dem Codierstrang des Gens wenigstens überwiegend für die Expression von mikrobiellen Genomen bevorzugte Codone sind.

10. Polydesoxyribonucleotid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgen den Code für ein Hormon oder ein Zwischenprodukt dafür liefert.

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11. Polydesoxyrxbonucleotid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgen den Code für Humanvorproinsulin, Humanproinsulin, die Α-Kette von Humaninsulin, die B-Kette von Humaninsulin, Humanoder Rinderwachstumshormon, luteinisierendes Hormon, ACTH oder Pancreaspolypeptid liefert.

12. Polydesoxyrxbonucleotid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgen den Code für Somatostatin liefert.

13. Polydesoxyrxbonucleotid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die entgegengesetzten Termini einen der beiden Stränge verschiedener restriktionsendonucleasen-Erkennungsstellen aufweisen.

14. Polydesoxyrxbonucleotid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Codone für die Aminosäuren für Somatostatin folgende sind:

Amxnsoäuren: Codon Amino säuren: Codon aus der Gruppe: gly: GGT ala: GCT und GCG cys TGT asn: AAT und AAC lys AAG phe: TTC und TTT trp TGG thr: ACT und ACG ser: TCC und TCG

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15. Polydesoxyribonucleotid nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch die Basenpaarsequenz:

GCT GGT TGT- AAG AAC TTC TTT TGG AAG ACT TTC ACT TCG TGT CGÄ CCA. ÄCÄ -TTC TTG AAG AAA ACC TTC TGA AAG TGA AGC ACA

16. Polydesoxyribonucleotid nach Anspruch 14 mit der Nucleotidsequenz:

5· 'ΛΑ -TTC ATG GCT GGT TGT AAG AAC TTC TTT G TAC CGA CCA ACA TTC TTG ÄÄG ÄÄX

TGG AAG ACT TTC .ACT TCG TGT TGA TAP

ACC -TTC TGA ÄÄG TGA AGC ÄÜÄ Äül Αϊϋ CTAG 5

17. Mikrobieller Recombinationsclonbildungsträger mit einer ersten Restriktionsendonucleasen-Erkennungstelle, einem Strukturgen, das den Code für die Expression eines Polypeptids liefert, und einer zweiten Restriktionsendonucleasen-Erkennungsstelle, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen den Code für die Expression eines Säugerpolypeptids oder eines Zwischenprodukts dafür liefert, wobei die Codone dieses Strukturgens wenigstens zum überwiegenden Teil für die Expression von mikrobiellen Genomen bevorzugte Codone sind.

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18. Bakterielles Plasmid nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , daß das Polypeptid ein Hormon ist.

19. Plasmid nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , daß das Hormon Somatostatin ist.

20. Plasmid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß die Codone für Somatostatin folgendermaßen ausgewählt sind:

Aminosäure: Codon Aminosäure: Codon aus der Gruppe: gly: GGT ala: GCT und GCG cys TGT asn: AAT und AAC lys AAG phe: TTC und TTT trp TGG thr: ACT und ACG ser: TCC und TCG

21. Plasmid nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch die Basenpaarsequenz:

GCT GGT TGT AAG AAC TTC TTT TGG AAG ACT "TTC ACT TCG TGT CGA CCA ACA TTC TTG AAG AAA ACC -TTC TGA AAG T.GA AGC ACA

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