DE2846725B2

DE2846725B2 - Offene, röhrenförmige Chromatographiesäule

Info

Publication number: DE2846725B2
Application number: DE2846725A
Authority: DE
Inventors: Kiyokatsu Ohgaki Gifu Hibi; Daido Nagoya Ishii; Koichi Tsushima Mochizuki; Tomohiko Kariya Nakanishi; Toyohide Tokoname Takeuchi; Takao Aichi Tsuda
Original assignee: Japan Spectroscopic Co Ltd
Current assignee: Jasco Corp
Priority date: 1977-12-24
Filing date: 1978-10-26
Publication date: 1981-01-08
Also published as: JPS5489691A; DE2846725A1; US4207188A; DE2846725C3

Description

worin Ri und R₂ jeweils einer, organischen Rest mit 1 bis 24 C-Atomen, vorzugsweise mit 6 bis 20 C-Atomen, X eine Gruppe oder ein Atom, das mit einer Silanolgruppe reagieren kann, m und π jeweils ganze Zahlen im Bereich 0 bis 3 und die Summe von so /n plus η eh;; Zahl im Bereich von 1 bis 3 bedeuten.

5. Säule nach Anspruch A dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung Octadecycltrichlorsilan ist

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Die vorliegende Erfindung betrifft eine offene, röhrenförmige Chromatographiesäule, bestehend aus einer Glaskapillare, in der als stationäre Phase eine Polymerschicht aus einem chemisch an ihre Oberfläche gebundenen Silanderivat aufgebracht ist

In den letzten Jahren hat die Flüssigkeitschromatographie, angeregt durch die Entwicklung von Hochdruckpumpen sowie durch die Steigerung der Trennfähigkeit von SäulenfÜllmaterialien, erhebliche Fortschritte gemacht Als Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie, bei der zur raschen Trennung eine mobile Phase mit hoher Geschwindigkeit durch die Säule durchfließt, ist die Flüssigkeitschromatographie so ein sehr wirksames Instrument zur Trennung und Analyse auf dem Gebiet der Chemie, Biologie, medizinischen Wissenschaften oder dergleichen.

Säulen zur Verwendung bei der Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie müssen zur Erhö- 5i hüng der Trenngeschwindigkeit, zu einer guten Eignung für die Mikroanalyse, einer hochgradigen Trennfähigkeit, einer Wirtschaftlichkeit der SäulenfÜllmaterialien oder -medien und dergleichen in ihrem Innendurchmesser so klein wie möglich sein. In der Praxis werden Säulen mit einem Durchmesser von um die 2,5 mm weithin verwendet. Eine weitere Verringerung des Innendurchmessers auf 1,0 bis 0,5 mm wird üblicherweise als sehr schwierig oder unmöglich betrachtet, da kleine Vertiefungen oder die Rauhigkeit der inneren Wandoberfläche der Säule die Trennfähigkeit direkt beeinflussen können.

In der US-PS 40 59 523 ist --ine Säule mit einem

Innendurchmesser von weniger als 1 mm und die hierfür relevante Technologie beschrieben· Diese Säule kann in der Hochgeschwindjgkeits-FIüssigkeitschromatographie bei einer Fließgeschwindigkeit von ca. 10 μΐ/min verwendet werden. Selbst eine solche Säule aus einem Glasrohr mit so geringem Durchmesser entbindet jedoch nicht von der Notwendigkeit, ein Säulenfüllmaterial zu verwenden. Das Einfüllen von Säulenmaterial in die Säule mit einem so geringen Durchmesser ist jedoch nicht einfach zu bewerkstelligea

In der Gaschromatographie ist jedoch andererseits eine sogenannte Golay-Säule bekannt, eine Art offene, röhrenförmige Kapillarsäule, in der kein Säulenfüllmaterial verwendet wird, sondern statt dessen eine flüssige Phase (stationäre Phase) als Film an der Kapillarinnenwand haftet Diese Golay-Säule ermöglicht den Verzicht auf den umständlichen Einfüllvorgang des Säulenfüllmaterials.

In der Gaschromatographie sind außerdem Kapillaren mit chemisch modifizierten Innenoberflächen bekannt So ist die Siianierung von Giaskapiiiaren mit kleinem Durchmesser, nämlich 0,25 mm, mit monofunktionellen substituierten Halogensilanen aus »Chromatographia« 10, Januar 1977, Seiten 22 bis 24, bekannt Daß Polymere aus substituierten Siloxanen sich chemisch an die innere Oberfläche von Glaskapillaren von 0,16 bis 03 mm innerem Durchmesser binden lassen, ist aus »Chromatographia« 10, August 1977, Seiten 466 bis 472, bekannt

In der DE-OS 19 04 518 wird ein Verfahren zur Behandlung der inneren Oberfläche von langen Glaskapillaren mit einem inneren Durchmesser von weniger als 0,1 mm durch Ätzung beschrieben.

Es wurde daher versucht, offene, röhrenförmige Kapillarsäulen auch in der Flüssigkeitschromatographie zu verwenden. Bisher ist jedoch kein erfolgreicher Versuch beschrieben. Dies kann an einem fundamentalen Unterschied zwischen der mobilen Phase der Gaschromatographie und dsr FlüVagkeitschromatographie liegen. Die Anwendung der Gaschromatographietechnik auf die Flüssigkeitschromatographie ist nicht möglich, ohne Veränderungen an der Konstruktion der Kapillarsäule aufgrund der unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten, was sich bisher nicht lösen ließ.

Als wesentlichstes Problem bei der Auffindung einer idealen Säule für die Flüssigkeitschromatographie stellt sich die Bestimmung der Konstruktionsbedingungen für eine relative Verringerung der Diffusion der Probe in der flüssigen mobilen Phase dar.

In einer Reihe von Experimenten wurde gefunden, daß der Innendurchmesser der Säule aus Glasrohr 0,10 mm oder weniger betragen und ihre Länge dann so bestimmt werden sollte, daß das innere Nettofassungsvermögen 04 μΐ oder mehr, vorzugsweise" 1,0 μΙ oder mehr, beträgt Bei einer Säule, die diesen Bedingungen genügt, hat sich herausgestellt daß sie eine sehr gute Trennfähigkeit bei einer hohen Zahl theoretischer Böden aufweist Ein weiteres Problem vor der praktischen Anwendung einer solchen Säule in der Flüssigkeitschromatographie liegt in der Aufschichtung einer stationären Phase auf die innere Oberfläche der Säule aus Glasrohr, was eine notwendige Bedingung hierfür ist. Man muß hinreichende Maßnahmen treffen, zu verhindern, daß die stationäre Phase sich in der mobilen Phase auflöst, da die stationäre Phase sonst abblättert oder mechanisch abschuppt, wenn sie in der mobilen Phase löslich ist, auch wenn dies allmählich geschieht, da die mobile Phase sehr schnell läuft, wenn

eine Hochgeschwindigkeitstrennung durchgeführt wird. Beim Versuch, das mechanische Abschuppen der mobilen Phase in einer solchen dünnen Schicht mit geringem Innendurchmesser zu verringern, wurde nun gefunden, daß wie in der Gaschromatographie eine Schicht aus Silan oder irgendeinem Derivat davon eine sehr brauchbare stationäre Phase darstellt

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung einer offenen, röhrenförmigen Chromatographiesäuie, die für die Hochgeschwindigkeitsmikroflüssigkeitschromato- ι ο graphie geeignet ist

Diese Aufgabe wird bei einer Säule der eingangs genannten Art durch die Erfindung gemäß dem Kennzeichenteil des Patentanspruchs 1 gelöst

Durch die Erfindung wird erstmals auf dem Gebiet der Flüssigkeitschromatographie eine offene Kapillarsäule eingeführt. Eine derartige Säule mit guter Eignung für die Mikroanalyse, Hochgeschwindigkeitstrennung und Trennung bei hoher theoretischer Bodenzahl läßt sich leicht herstellen. Da die, erfindungsgemäße offene Säuie im unterschied zu den bereits bekannten Säulen keinen Träger für die stationäre Phase (Füllmaterial) verwendet, werden Einfüllschwierigkeiten oder andere mit dem Füllmaterial in Verbindung stehende Probleme vollständig vermieden. Die Eigenschaften der chemi- 2s sehen Bindung des Silans oder des Derivates an die innere Oberfläche des Glasrohres bringt viele Vorteile mit sich, so wird etwa das Abschuppen oder Abblättern der Schicht der stationären Phase selbst bei Hochgeschwindigkeitstrennungen vermieden, das Vorsättigen der mobilen Phase mit der stationären Phase entfällt, eine Vorsäule entfällt, es besteht freie Wahl der Zusammensetzung der mobilen Phase, die Verschlechterung der Wirksamkeit der Säule sowie Schwankungen der Retentionszeit werden vermieden und die Reproduzierbarkeit des Chromatogramms wird verbessert Weitere Vorteile der Erfindung bestehen darin, daß erstens die Abmessungen des Chromatographen aufgrund der Miniaturisierung der Säule durch Verkleinerung des Innendurchmessers verringert werden, und zweitens die Empfindlichkeit und die sich ergebende Fähigkeit zur Supermikroanalyse verbessert wird, da die Verdünnung der Probe durch die mobile Phase verringert wird, was auf die Verringerung der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase auf nur ungefähr einige μι/min und eine Verringerung der Probenmenge auf einige 10 nl zurückgeht

Die Erfindung wird durch die beiliegenden Zeichnungen und die am Schluß folgenden Beispiele erläutert, und zwar zeigt

F i g. 1 einen senkrechten Querschnitt, im Ausschnitt, einer Säuie einer ersten Ausführungsform,

Fig.2 eine schematische Darstellung eines Flüssigkeits-Chromatographen, in welchem eine Säule eingebaut ist,

F i g. 3 ein mit der Ausführungsform gemäß Beispiel 1 erhaltenes Chromatogramm und

F i g. 4 ein mit der Ausführungsform gemäß Beispiel 2 erhaltenes Chromatogramm.

Eine offene, röhrenförmige Säule bestehend aus einer fto Glaskapillare mit extrem geringem Innendurchmesser erhält man leicht mit einer üblichen Vorrichtung zum Ausziehen oder Extrudieren von Glasrohr für die Gaschromatographie. Der Innendurchmesser dieser Säule darf nicht größer als 0,10 mm sein, in der Praxis M werden Säulen mit einem Innendurchmesser von 0,05 bis 0,08 mm hergestellt. Die Länge der Säulen muß so bemessen werden, daß das innere Nettofassungsverrriögen der Säule nicht weniger als 0,5 μ|, vorzugsweise nicht weniger als 1,0 μΐ, beträgt Säulen außerhalb der obengenannten Bedingungen sind für die Hochgeschwindigkeitsmikroflüssigkeitschromatographie von wenig Nutzen, da sie eine geringe Säulentrennwirksamkeit zeigen, nicht für die Hochgeschwindigkeitstrennung anzupassen sind, und femer die Probeninjektion sowie die Detektion der aufgetrennten Komponenten Probleme bereiten.

Solche Glassäulen müssen, bevor auf ihre innere Oberfläche eine chemisch gebundene Schicht aus Silan oder einem Derivat davon aufgebracht wird, sauber gewaschen oder gespült werden. Die Reinigung kann ein geringes Höhenäquivalent für einen theoretischen Boden günstig beeinflussen, sie wird ferner wirksamer sein, wenn die Säurereinigung, wie etwa mit Salzsäure, und/oder eine Alkalireinigung, wie etwa mit Natriumhydroxid, zusätzlich zur üblichen Spülung mit Wasser und/oder Methanol durchgeführt wird.

An die innere Oberfläche einer 'olchen Säule wird chemisch mindestens ein Siian oder ein Derivat davon (im folgenden Silanierungsmittel genannt), das eine stationäre Phase werden kann, mit dem Grundmaterial des Glasrohres unter Bildung einer Polymerschicht aus dem Silanierungsmittel chemisch kombiniert oder gebunden. Eine solche chemische Bindung oder Kombination, eine Wechselwirkung zwischen der inneren Oberfläche des Glasrohres und dem Silanierungsmittel, beruht wahrscheinlich auf der chemischen Reaktion des Silaniemngsmittels mit den Silanolgruppen (> SiOH), die im Grundmaterial der inneren Oberfläche des Glasrohrs vorkommen. Wenn tri-substituiertes Chlorsilan (R' R" R'" SiCl) als Silanierungsmittel verwendet wird, soll eine chemische Reaktion der folgenden Art stattfinden.:

R'

-SiOH + ClSi-R"

R'"

R'

—Si —O—Si —R" + HCl

R'

Diese Reaktion kann angenommen werden, wenn das Silanierungsmittel monoaktiv oder monofunktional ist, und folglich wird eine Monoschicht der stationären Phase gebildet Ist das Silanierungsmittel polyfunktional und weist zwei oder drei reaktive Gruppen (wobei die Summe m + η entweder 2 oder 1 beträft) auf, dann wird die chemische Reaktion wesentlich komplizierter sein; es wird eine stationäre Phase mit einer Siloxan-(Si—O)-Bindung mit zweidimensionaler oder dreidimensionaler Struktur auf der inneren Oberfläche des Glasrohres gebildet werden. In dieser Erfindung sollen vorzugsweise solche stationäre Phasen von mehrdimensionaler Struktur gebildet werden.

Als Silanierungsmittel, die eine stationäre Phase bilden können, können substituiertes Halogensilan, substituiertes Oxys'^n, substituiertes Siloxan, substituiertes Silazan, substituiertes Silanol und dergleichen genannt werden. Es muß entsprechend der gewünschten Verwendung der Säule der zur Trennung verwendeten

Probe, der Art der afs mobile Phase verwendeten Flüssigkeit gleich ausgewählt werden. Vorzugsweise werden organische Verbindungen eingesetzt, die mit der folgenden allgemeinen Formel geschrieben werden können:

worin Ri und Rj jeweils einen organischen Rest, der als stationäre Phase dient, bedeuten, z. B. eine Alkylgruppe mit I bis 24 C-Atomen, eine Alkenylgruppe mit 2 bis 24 C-Atomen, eine Arylgruppe, insbesondere eine einkernige Arylgruppe, eine Aralkylgruppe mit 7 bis 24 C-Atomen, eine Alkarylgruppe mit 7 bis 24 C-Atomen und/oder Derivate der obenerwähnten Gruppen, die man durch Substitution mit Halogen oder einer polaren Gruppe (Cyano, Amino und dergleichen) erhält, ferner können Ri und R2 auch zusammen einen Ring bilden und gleiche oder verschiedene Gruppen bedeuten. Obwohl Hip nroanisrhen Reste allgemein 1 bis 24 C-Atome aufweisen können (soweit dies chemisch möglich ist, z. B. weist Alkenyl mindestens 2 C-Atome auf), ist eine Kohlenstoffzahl von 6 bis 20 bevorzugt. Ferner kann X irgendeine Gruppe oder ein Atom bedeuten, die mit der Hydroxylgruppe der Silanolgruppe auf der inneren Oberfläche der Glassäule reagieren kann, beispielsweise Halogene, wie Chlor, Brom und dergleichen, eine Alkoxygruppe, Carboxylgruppe, Phenoxygruppe, SiI-oxygruppe, oder halogenierte Derivate dieser Gruppen, oder andere. Im allgemeinen wird jede Art von Halogen bevorzugt, m bzw. η stehen für eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis einschließlich 3; die Summe von m und η soll im Bereich von I bis einschließlich 3 liegen, vorzugsweise beträgt sie 1 oder 2. Typische Beispiele von Verbindungen, die dieser allgemeinen Formel entsprechen sind

Methyltrichlorsilan, Dimethyldichlorsilan, Cyanoäthyltrichlorsilan, Trihexylbromsilan, Octadecyltrichlorsilan, Methyloctadecyltrichlorsilan, Phenyltrichlorsilan, Diphenyldichlorsilan, Methyltriäthoxysilan,

p-Tolyltrimethoxysilan,

N-(2-aminoäthyl)-y-aminopropyltrimeth-

oxysilan und dergleichen.

Ein jedes dieser Sicherungsmittel kann nach üblichen Verfahren auf die innere Oberfläche der Glassäule aufgebracht oder dort zum Festhaften gebracht werden, beispielsweise indem man eine Lösung eines Silanierungsmittels im Zustand der idealisierten Kolbenströmung, einer sogenannten dynamischen Methode, durchfließen oder passieren läßt, das Lösungsmittel der Lösung eines Silanierungsmittels, das bereits in die Glassäule eingefüllt ist zum Verdampfen bringt, oder das Sicherungsmittel auf der inneren Oberfläche der Glassäule zum Haften bringt, indem man einen Dampf des Silanierungsmittels oder seiner Lösung durchströmen läßt Das an der inneren Oberfläche der Glassäule auf solche Weise befestigte oder aufgeschichtete Silanierungsmiitel kann durch Erhitzen durch die chemische Reaktion zwischen den auf der inneren Oberfläche der Glassäule bestehenden Silanolgruppen • und ö?r* darauf aufgebrachte Silaniefig^miMei in eine chemisch stabile Schicht umgewandelt werden. Die Schicht wird ein chemisch gebundenes stabiles Silan oder ein Derivat davon. Die Silanolgruppen der inneren Oberfläche der Glas<äule sollen zum größten Teil mit dem Sicherungsmittel reagieren. Der nicht-abreagierte Anteil von Sicherungsmittel wird, falls überhaupt noch vorhanden, vorzugsweise weiter polymerisiert. Die Polymerisation des restlichen, nicht-abreagierten Silanierungsmittels macht dieses zu einer weiteren stationären Phase, die die Trennungsfunktion weiter fördert. Die Polymerisation wird praktisch durchgeführt, indem man in Gegenwart von Wasser erhitzt, d. h, indem man das nicht-abreagierte Silanierungsmittel in der Glassäulc unter Durchlesen von Dampf (Wasserdampf) erhit/t.

Es ist natürlich denkbar, vor dem Aufbringen der Polymerschicht aus einem solchen Silanierungsmittel auf die innere Oberfläche der Glassäule eine aufrauhende Behandlung derselben unter Bildung von Unebenheiten vorzunehmen. Obwohl dies bezüglich der Erhöhung

r. des Trennvermögens und einer Verbesserung der theoretischen Bodenzahl, folglich einer Erhöhung der Probemenge, wünschenswert wäre, ist sie kein geeignetes Vprfahren, sondern sollte vielmehr, wenn eine äußer» dünne oder feine Säule verwendet wird,

jo vermieden werden, da sie den Strömungswiderstand der Säule bzw. deren Rückdruck erhöht.

Eine offene, röhrenförmige Chromatographiesäule 1, bestehend aus einer Glaskapillare, ist in F i g. 1 mit einer fast flachen Polymerschicht 3 aus Silan oder einem

r» Derivat davon dargestellt, das chemisch mit dem Hauptbestandteil der inneren Oberfläche 2 der Säule 1 kombiniert oder gebunden ist. Diese fast flache, chemisch gebundene Polymerschicht zeigt die bereits obenerwähnten ausgezeichneten Wirkungen. Eine solehe Säule ist für den praktischen Gebrauch, wie in F i g. 2 gezeigt ist, an einem Ende mit einem Pumpsystem 4, das die mobile Phase liefert, und am anderen Ende mit einem Detektorsystem 5, das zur Analyse der getrennten Probe dient verbunden. Eine Probe wird in vorher bestimmter Menge mit einem Probeninjektionsmechanismus (nicht gezeigt) in das Chromatographiesystem, d. h. in die Säule 1, eingeführt Zur Einführung der Probe und Beschickung mit der mobilen Phase werden vorzugsweise das Verfahren zur

so Probeneinführung und eine Vorrichtung hierfür verwendet wie sie in der US-PS 41 02 782 beschrieben sind.

Beispiel 1 Durch eine offene, röhrenförmige Glassäule mit

einem Innendurchmesser von 0,060 mm und einer Länge von 336 cm ließ man zur Reinigung nacheinander 200 μΐ

Methanol, 100 μΐ 6N HCL 200 μΐ Wasser, 100 μΐ IN NaOH, 200 μΐ Wasser, 200 μΐ Methanol und 200 μΐ Toluol durchfließen, gefolgt von Erhitzen auf 200⁰C

unter Stickstoffstrom und 1 stündigem Trocknen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

1. Offene, röhrenförmige Chromatographiesaule, bestehend aus einer Glaskapillare, in der als stationäre Phase eine Polymerschicht aus einem chemisch an ihre Oberfläche gebundenen Silanderivat aufgebracht ist, dadurch gekennzeichnet, daß zur Hochgeschwindigkeits-Mikroflüssigkeitschromatographie die Kapillare (1) einen Innendurchmesser von höchstens 0,1 mm und ein Fassungsvermögen von mindestens 0,5 μ] aufweist

2. Säule nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihr Fassungsvermögen mindestens 1,0 μ! beträgt

3. Säule nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß ihr Innendurchmesser im Bereich von 0,05 mm bis 0,08 mm liegt

4. Säule nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, άφ ,die Polymerschicht durch chemische Reaktion zwischen den Siianoigruppen des Giasrohrs und einer Verbindung mit folgender Formel entsteht