DE2714665A1

DE2714665A1 - Praeparat zur behandlung von herpes zoster und anderen herpes-infektionen, sowie verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2714665A1
Application number: DE19772714665
Authority: DE
Inventors: Anton Prof Dr Dr Mayr
Original assignee: Stickl helmut A profdrmed
Current assignee: Stickl helmut A profdrmed
Priority date: 1977-04-01
Filing date: 1977-04-01
Publication date: 1978-10-05
Also published as: IL54370A0; DK152745B; ES468363A1; ATA227578A; PH20267A; AU521512B2; PT67829B; DK152745C; DK143778A; HU180260B; IL54370A; NO148874B; NZ186705A; JPS53124615A; AU3435978A; SE7803615L; US4191745A; AT359639B; CA1095407A; ZA781505B

Description

M. Westhues
8000 München 80

Präparat zur Behandlung von Herpes Zoster und anderen Herpes-Infektionen, sowie Verfahren zu seiner Herstellung

In den letzten Jahren haben sogenannte "Faktorenkrankheiten" zugenommen, bei denen es sich um bakterielle, Virus- und Pilz-bedingte Infektionskrankheiten von Warmblütern durch sogenannte "opportunistische Keime" handelt. Diese Erreger befinden sich entweder in latenter Form im Organismus oder sie leben in Symbiose mit unserem Körper ohne ihn zu schädigen. Kommt es jedoch zu einer Senkung der allgemeinen Resistenz durch irgendwelche Faktoren (z.B. energiereiche Strahlen, Antimetabolite, Systemerkrankungen des Immunapparates, Hormone, usw.), so gehen diese Infektionskrankheiten an und können zu schwer beeinflußbaren Krankheitsbildern führen.

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M089) 988272

988273 V/W 988274 983310

Mauerkirchentt 45 - 8000 München 80 Telegramme:

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Ein Beispiel hierfür ist der Herpes Zoster (Gürtelrose), der durch das Varizellen-Zoster-Virus hervorgerufen wird.

Der Herpes Zoster entsteht nach der Erkrankung an Windpocken durch eine zweite Auseinandersetzung des Organismus mit dem Varizellen-Zoster-Virus und ist seiner Natur nach eine vorwiegend neurokutane Erkrankung. Der Zoster tritt nur beim Menschen auf; es gibt weder eine natürliche tierische Erkrankung noch ein experimentelles Tiermodell.

Eine einheitliche Therapie des Zoster ist derzeit nicht bekannt. Zahlreiche Versuche, den Zoster zu behandeln führten zu unbefriedigenden Ergebnissen, so u.a. die Anwendung einer lokalen Behandlung (Puder und Salben), die Verwendung von Steroiden, von analgetisch und antirheumatisch wirkenden Wirkstoffen sowie der Interferonisierung.

Die passive Interferonisierung, d.h. die Applikation von isoliertem, exogenem Interferon, führte zu nur kurz dauernden Erfolgen und konnte den Zoster nicht entscheidend beeinflussen. Zu günstigeren Ergebnissen kam man durch die sog. Interferoninduktion, d.h. die Verabreichung von Substanzen, die körpereigene Zellen zur Abgabe von Interferon "induzieren". Doch auch diese erwiesen sich von beschränkter Wirksamkeit, weil sie - soweit es sich um sog. virale Interferon-Inducer handelte - über den Weg der Immunisierung

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selbst in ihrer Wirksamkeit limitierten. Synthetische Interferon-Induktoren erwiesen sich als schädlich weil sie in die genetische Substanz der Zellen eingriffen. Eine befriedigende, Wirksamkeit und Unschädlichkeit garantierende aktive Interferonisierung hat es daher bisher nicht gegeben.

Aus der Dr-OS 2 437 166 ist es bereits bekannt, zur Behandlung von Herpes Zoster und anderen Viruserkrankungen ein über 420 bis 800 Zellkulturpassagen attenuiertes Avipox-Virus einzusetzen. Das attenuierte Avipox-Virus zeigt über diese Passagenbreite identische und stabile Eigenschaften.

Das über 429 Passagen attenuierte und anschließend dreimal klonisierte Virus (432. Passage) wurde unter der Hinterlegungsbezeichnung "Mayr-Stick1-Avipox-Interferon-Inducer" bei der Landesimpfanstalt Nordrhein-Westfalen, Abteilung Viruszüchtung und -prüfung, 4 Düsseldorf, hinterlegt.

Der Nachteil dieses in der DT-OS 2 437 166 beschriebenen Hühnerpocken-Virus liegt in seiner noch vorhandenen Vermehrungsfähigkeit .

Es wurde nunmehr festgestellt, daß Pocken- und Parapockenviren (Familie: Poxviridae), im besonderen das Avipox-Virus und das Orf-Virus sowohl in originärer (virulenter) wie attenuierter (avirulenter) Form, durch ^Bestrahlung nicht nur ihre Vermehrungsfähigkeit verlieren, sondern gleich-

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zeitig in ihrer biologischen Wirksamkeit gegen Herpes-Infektionen gesteigert werden; dies ist deshalb überraschend, da durch eine Inaktivierungsbehandlung im allgemeinen ein Wirksamkeitsverlust eintritt.

Zu einer solchen Inaktivierung edgnet sich eine ^-Bestrahlung, durch die eine selektive Schädigung der Nukleinsäuren des Virus erfolgt, ohne daß die anderen Virusstrukturen, insbesondere die Oberflächenstrukturen des Virus, das Virus-Protein und die Hüllsubstanzen verändert und mitgeschädigt werden.

Es wurde weiterhin überraschend festgestellt, daß mit Hilfe der erfindungsgemäß behandelten Virus-Präparate eine medikamenteile Wirksamkeit nicht nur parenteral, sondern auch lokal eintritt.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Präparate werden Zellkulturen mit dem zu verwendenden Virus infiziert; am Höhepunkt der VirusVermehrung wird das Virus aus der Zellkultur nach bekannten Verfahren geerntet und gereinigt. Die gereinigte Virusernte wird auf Virusgehalt/ml untersucht und das zu inaktivierende Virusmaterial auf einen Titer, der

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mindestens etwa 10 " ID^/ml enthalten muß, vorzugsweise auf einen Titer der Virus-Gebrauchssuspension von mehr als 10 IDcq/ιπΙ eingestellt. Das Präparat verfügt jedoch be-

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reits über eine ausreichende Wirksamkeit, wenn mindestens ein Titer von etwa 5 x 10 IDc-q/ttiI als untere Grenze erreicht wird. Für eine optimale Wirksamkeit sind Titer bis

etwa 5 x 10 ID^/ml zu empfehlen.

Für die anschließende ^-Bestrahlung der wie oben erhaltenen Virusernten wird für jeden Virus-Stamm auf bekannte Weise eine Inaktivierungskinetik aufgestellt nach der die Strahlenbehandlung solange anzudauern hat bis sämtliches Virus des Ausgangsmaterials seine Vermehrungsfähigkeit verloren hat. Für die Inaktivierungskinetik sind besonders folgende Bezugsgrößen maßgebend:Art, Konzentration, Medium und Volumen des Virusmaterials, Gefäßmaterial und Energiequelle. Den inaktivierten Virusmaterialien werden vorzugsweise geeignete Stabilisatoren, z.B. 2$ige Magermilch oder Pepton zugesetzt. Anschließend werden die inaktivierten Materialien gefriergetrocknet, das getrocknete Produkt dient als Ausgangsmaterial für die Herstellung der jeweiligen Applikationsformen des erfindungsgemäßen Präparates.

Nachstehend wird beispielhaft die Herstellung eines erfindungsgemäßen Präparates beschrieben.

Ausgangsmaterial war das an der oben genannten Stelle unter der Bezeichnung "Mayr-Stickl-Avipox-Interferon-Inducer" hinterlegte, für Mensch und Tier unschädliche und in Hühner-

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embryofibroblastenkulturen (FHE) vermehrungsfähige Hühnerpocken-Virus. Das Virus geht auf den Hühnerpockenstamm HP-I zurück, der über zahlreiche Passagen in PHE bis zum Verlust der Virulenz attenuiert und nach der Ί29. Passage plaquegereinigt wurde. Die Virusernte der 3· Plaque-Passage (432. Passage) ist in FHE aus Valoeiern (leukosefrei) vermehrt und lyophilisiert worden. Sie stellt das Ausgangsmaterial für das anmeldungsgemäße Präparat (Saatvirus) dar. Für die Herstellung des anmeldungsgemäßen Präparates wird es in stationärem FHE (Medium : sterile Rinderammionflüssigkeit = RAF) vermehrt. Die Virusernten werden aufgeschlossen (Ultraschall), gereinigt (fraktionierte Zentrifugation) und nach Zugabe von 2,5 ί Molkeneiweiß lyophilisiert. Das Endpräparat

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weist einen Titer zwischen 10 bis 5 χ 10 *^ KID 50/ml auf. Der Nachweis des Virusgehalts erfolgt nach bekannten Verfahrensweisen auf FHE.

Das auf vorstehende Weise gewonnene Virus des Ausgangsmaterials (Virusernte) wird durch ^-Bestrahlung (Kobaltbombe; Dosisleistung ca. 20 krad/Min. 500 ml Industrieglasbehälter) mit 10 rad bezüglich seiner Vermehrungsfähigkeit inaktiviert, Der Nachweis der Inaktivierung erfolgt durch Eingabe ausreichender Stichproben-Volumina des behandelten Materials in Zellkulturen aus embryonalen Hühnerfibroblasten-Zellen. Wenn sich nach spätestens 9 Tagen keine virusbedingten cytophathogenen Effekte (CPE) auf dem Zellrasen entwickelt

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haben, wurde dies als Beweis für eine vollständige Inaktivie rung gewertet.

Die so erhaltenen Präparate können in verschiedenen Zubereitungsformen benutzt werden, z.B.

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1. Resuspendiert in sterilem aqua bidest. (1 ml = 10'*

KID 50/ml);

2. tablettiert oder verkapsuliert (1 Tablette bzw. Kapsel

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= 10 ' KID 50/ml; bei der tablettierten Form wird von der flüssigen Phase vor der Lyophilisation ausgegangen)

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3. als Spray (ImI inaqua bidest. und 10 2 Glycerin = 10 ' ^J

KID 50/ml).

Das erfindungsgemäße Präparat kann übliche Hilfsstoffe enthalten. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Präparate wird eine wirksame Bekämpfung von Herpes-Infektionen des Warmblüterorganismus im besonderen des Herpes-Zoster erreicht.

Nach Verabreichung der erfindungsgemäßen Präparate wird im Rahmen der unspezifischen Resistenz die Phagozytose gesteigert und es kommt zu einer Stimulierung humoraler Resistenzfaktoren, insbesondere von Komplement und von IgM-Antikörpern. Daneben wird entweder die Bildung von Interferon angeregt oder eine schon laufende Interferonproduktion

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erhöht, bzw. vorgebildetes Interferon freigesetzt. Parallel läuft eine Infiltration von Makrophagen in Milz, Leber und Lymphknoten und eine Zunahme von Monozyten in der Zirku lation. Generell nimmt die Makrophagen-Tätigkeit (Phagozytose, Antigenvermittlung) bis zu JJOOJS des Ausgangswertes zu.

Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Präparates läßt sich im SVS-Modell (standardisierte Infektion von Babymäusen mit dem Virus der Stomatitis Vesicularis) zeigen, das sich aus technischen Gründen und wegen seiner guten Reproduzierbarkeit für die Prüfung des erfindungsgemäßen Präparates anbietet.

Es wurden 276 Mäuse mit dem vesiculären Stomatitis-Virus infiziert, wobei innerhalb der nächsten Tage 22M (81Ϊ) der infizierten Tiere starben.

Eine Gruppe von 201 Tieren wurde mit dem unbehandelten Präparat, das aus vermehrungsfähigem Avipox-Virus bestand, vorbehandelt, wobei nur noch 85 Tiere, also noch ^2,J>% gemessen an der Mortalität der Kontrollen starben.

Eine Gruppe von 125 Tieren wurde mit dem erfindungsgemäßen Präparat vorbehandelt, wobei nur noch 18 Tiere starben, d. h. also nur noch eine Mortalität von ΙΊ,Μ %_t also weniger

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als 1/5 der Mortalität der infizierten und unbehandelten Kontrolltiere beobachtet wurde.

Was die Schnelligkeit des Todeseintritts anbetrifft, so sterben die infizierten und nicht behandelten Kontrolltiere durchschnittlich nach 5,3 Tagen, die mit dem Vergleichspräparat vorbehandelten Kontrolltiere nach 19,5 Tagen und die mit dem erfindungsgemäßen Präparat vorbehandelten Kontrolltiere nach 33,3 Tagen.

Die nachfolgende Tabelle läßt gleichfalls erkennen, daß der Wirkungsindex bei gleicher Virusantigen-Menge pro Dosis von 48 auf 82 anstieg.

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TABELLE

WIRKSAMKEITSPRÜFUNG DES ERFINDUNGSGEMÄßEN PRÄPARATES

IM VSV-MODELL

Versuchs gruppe	Zahl der Ver suchsansätze	Morta lität	Wirkungs index	Signi fikanz	mittlerer Todestag
unbehandel- tes Präparat gemäß DT-OS 2 437 166	8	85/201 42,3 %	Ü8	+ + +	19,5
erfindungs gemäßes Präparat	5	18/125 IU,HJ!	82	+ + + ·	33,3
Placebo (RAF)	11	22^/276 81,2 %			5,3

Bemerkungen: Signifikanzberechnung mit dem Chi-Quadrat-Test,

p<0,01

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Ein weiterer Unterschied zwischen dem Vergleichspräparat und dem erfindungsgemäßen Präparat ergibt sich in der Phagocytose-Untersuchung. Wird Mäusen intraperitoneal das vermehrungsfähige Vergleichspräparat injiziert, so kommt es zu einer erhöhten Phagocytose, die durch eine Kohlenpartikel-Clearance gemessen wird. Nach 48 Stunden vermag das bis zur Verdünnung 1:16 applizierte Präparat noch eine Phagocytosesteigerung zu erbringen. Bei dem erfindungsgemäßen Präparat ist der gleiche Effekt zum gleichen Zeitpunkt noch mit einer Verdünnung von 1:64 zu erzielen.

Beispiele für die Anwendung des erfindungsgemäßen Präparates:

1) 11 Jahre altes Mädchen mit einem seit 3 Tagen bestehenden Gesichtszoster. Jeweils 0,5 ml des wie oben hergestellten Präparates werden durch einen Zerstäuber intranasal eingebracht und inhaliert. Verabreichung am 1. Tag 3x» am 2. Tag 2x, am 3· Tag Ix. Bereits nach 48 Stunden Rückgang des Schmerzes und beginnende Verschorfung des Gesichtszosters (Abbildungen sind verfügbar). Abfall des Schorfes nach 12 Tagen (normalerweise nicht vor 32 Tagen!).

2) 51 Jahre alter Mann mit Ulcus duodeni und schlechtem Allgemeinzustand. Zoster in Höhe der 7. bis 10. Rippe von der Brustwarze bis zum Rücken hinreichend. Zahlreiche Bläschen, Neuaufschießen der Bläschen bis zum

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¹J. Tag nach Erstmanifestation der Bläschen. Starke Schmerzen mit Schmerzattacken, vor allem bei Nacht.

Verabreichung von insgesamt M8 der wie oben hergestellten Kau-Tabletten zu jeweils 6 Kau-Tabletten im Abstand von h bis 6 Stunden (unter Wahrung der Nachtpause von mindestens 8 Stunden). Behandlung über 3 Tage. Linderung der Schmerzen noch am Tag des Behände lungsbeginns, Schwund der Schmerzen am 3. Behandlungstag. Verschorfungsbeginn am 6. Tag der Behandlung, Abfall des Schorfes am 18. Tag ab Behandlung. Mit der erfolgreichen Behandlung des schweren Zosters Besserung des Ulcus duodeni. Begleitende katarrhalische Erscheinungen der Nebenhöhlen gingen ebenfalls zurück, die Nasenatmung wurde frei.

3) 23 Jahre altes Mädchen mit chronisch rezidivierender Cystitis (Coli-Bakterien, Soor in der Urinkultur). Mehrfache Therapieversuche konventioneller Art führten nicht zum Dauererfolg. Verabreichung von wie oben erhaltenen 36 Tabletten innerhalb von 3 Tagen. Besserung der Beschwerden (Polyurie und Brennen beim Wasserlassen) nach einer Woche und von da ab für längere Zeit beschwerdefrei.

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Claims

Patentansprüche:

1. Präparat zur Behandlung des Herpes Zoster und anderen Herpes-Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff Pocken- und/oder Parapockenvirus (Familie:Poxviridae) enthält, das durch -Bestrahlung eine selektive Schädigung der Nukleinsäuren erfahren hat, ohne daß die anderen Virusstrukturen, insbesondere die Oberflächenstrukturen des Virus, das Virus-Protein und die Hüllsubstanzen verändert und mitgeschädigt wurden.

2. Präparat nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet , daß es als Wirkstoff das unter der Hinterlegungsbezeichnung "Mayr-Stickl-Avipox-Interferon-Inducer" hinterlegte, über 420 bis 800 Zellkulturpassagen attenuierte, über diese Passagenbreite identische und stabile Avipox-Virus enthält, das durch eine geeignete ,!-Bestrahlung eine selektive Schädigung der Nukleinsäuren erfahren hat, ohne daß die anderen Virusstrukturen, insbesondere die Oberflächenstrukturen des Virus, das Virus-Protein und die Hüllsubstanzen verändert und mitgeschädigt wurden.

3. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch g e k enn zeichnet , daß das Virus durch ^-Be-

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Strahlung mit vorzugsweise einer Menge zwischen 6 χ 10 bis 10 rad inaktiviert wurde.

h. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzei chnet , daß das Virus einen Titer von etwa 5 x 10 ID₅₀/ml bis etwa 5 x 10 ID^/ml auf-

v/eist.

5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß es zusätzlich geeignete Stabilisatoren wie Eiweiß, Pepton usw. aufweist.

6. Verfahren zur Herstellung des Präparates nach einem der Ansprüche 1 bis 5> dadurch gekennzeichnet, daß man Zellkulturen mit Pocken- und Parapockenvirus (Familie: Poxviridae) infiziert, am Höhepunkt der Virusvermehrung das Virus erntet und reinigt, die gereinigte Virusernte auf einen Titer von etwa 5 x 10 bis

5 x 10 ID_r„/ml der Virus-Oebrauchssuspension einstellt, durch ^-Bestrahlung die Nukleinsäuren des Virus selektiv schädigt, ohne daß die anderen Virusstrukturen, insbesondere die Oberflächenstrukturen des Virus, das Virus-Protein und die Hüllsubstanzen verändert und geschädigt werden und anschließend gegebenenfalls mit Stabilisatoren und/oder anderen Hilfsstoffen zu einem intraperitoneal oder lokal verabreichbaren Präparat aufarbeitet.

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7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man das unter der Hinterlegungsbezeichnung "Mayr-Stickl-Avipox-Interferon-Inducer" hinterlegte, über ^20 bis 800 Zellkulturpassagen attenuierte, über diese Passagenbreite identische und stabile Avipox-Virus einery -Bestrahlung unterwirft.

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