DE2713369A1

DE2713369A1 - Nicht loeslicher antikoerper, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung im analysenbesteck fuer den enzymimmunassay oder radioimmunassay

Info

Publication number: DE2713369A1
Application number: DE19772713369
Authority: DE
Inventors: Shigeru Kurooka; Noriyuki Sunahara
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1976-03-25
Filing date: 1977-03-25
Publication date: 1977-10-06
Also published as: GB1536396A; FR2345461B1; DE2713369C2; US4166767A; FR2345461A1

Description

u.Z.: M 152 Case: 55 269

DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., LTD. Osaka, Japan

w Nicht löslicher Antikörper, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung im Analysenbesteck für den Enzymimmunassay oder Radioimmunassay·"

Im Enzymimmunassay (EIA) oder Radioimmunassay (RIA) wird ein mit einem Enzym oder radioaktiven Isotop markiertes Antigen, ein unmarkiertes Antigen, d.h. die zu bestimmende Substanz, und ein Antikörper der kompetitiven Antigen-Antikörper-Reaktion in einer Pufferlösung unterworfen. Sodann werden das an den Antikörper gebundene markierte Antigen und das freie markierte Antigen, d.h. das markierte Antigen, an das kein Antikörper gebunden ist, voneinander getrennt. Hierauf wird die Menge des nicht markierten Antigens, d.h. die zu bestimmende Substanz, bestimmt. Die Bestimmung des nicht markierten Anti gens kann durch Messung der Enzymaktivität oder der Radioakti vität des an den Antikörper gebundenen markierten Antigens oder des freien markierten Antigens erfolgen. Die Methode

\im einzelnen schon

ist\ΐή verschiedenen Druckschriften beschrieben, beispiels-L- 709840/0965

weise in den US-PSen 3 654 090, 3 839 153 und 3 850 752 sowie in Clinical Chemistry, Bd. 19 (1973), S. 146 bis 186.

Die Genauigkeit des EIA oder RIA hängt im wesentlichen von der Trennung des an den Antikörper (B) gebundenen markierten Antigens vom freien markierten Antigen (F) nach der Antigen-Antikörper-Reaktion ab. Nachstehend wird diese als F/B-Trennungsmethode bezeichnet. Bisher sind folgende Ρ/Β-Trennungsmethoden bekanntgeworden; 10

1. Sekundäre Agglomeration des Antigen-Antikörper-Komplexes;

2. Der Antigen-Antikörper-Komplex wird durch Zugabe eines zweiten Antikörpers vollständig ausgefällt, der gegen den ersten Antikörper gerichtet ist (Doppelantikörper-Technik);

3. Bindung des Antikörpers aa eine unlösliche Substanz.

Die Methode (1) ist anwendbar, wenn das Antigen eine hochmolekulare Verbindung darstellt. Dementsprechend ist dieses Verfahren nur für Spezialfälle anwendbar. Ferner hat es den Nachteil, daß die sekundäre Agglomeration verhältnismäßig langsam verläuft. Die Doppelantikörper-Methode (2) ist ebenfalls zeitraubend, weil die Antigen-Antikörper-Reaktion zweimal durchgeführt werden muß. Außerdem hat sie den Nachteil, daß bei der Zugabe des zweiten Antikörpers gelegentlich un erwünschte Nebenreaktionen auftreten.

Die Verwendung eines an eine unlösliche Substanz gebundenen Antikörpers ist die beste Methode. Die vorliegende L Erfindung bezieht sich auf diese Methode und liefert einen _j

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verbesserten unlöslich gemachten, d.h. nicht löslichen Antikörper.

Ein nicht löslicher Antikörper für den EIA oder RIA soll folgende Bedungungen erfüllen:

(a) Der nicht lösliche Antikörper soll die Antigen-Antikörper-Reaktion nicht hemmen;

(b) Der nicht lösliche Antikörper soll ein geeignetes spezifisches Gewicht besitzen, so daß er eine gleich mäßige und stabile Suspension bildet und die Reaktions fähigkeit des Antikörpers soll so groß wie möglich sein ι

(c) der bei der Reaktion des nicht löslichen Antikörpers mit dem Antigen erzeugte Antigen-Antikörper-Komplex soll sich durch Zentrifugieren bei niedriger g-Zahl oder

!5 durch Filtration leicht abtrennen lassen;

(d) der nicht lösliche Antikörper soll an den Wandungen von Laborgeräten, wie Pipetten, nicht haften.

Es gibt bereits eine Reihe von Antikörpern, die durch Bindung an eine feste Phase unlöslich gemacht wurden. Als feste Phase wurden Dextran- oder Cellulosederivate verwendet; vgl. US-PSen 3 839 153 und 3 645 852. Diese bekannten nicht löslichen Antikörper befriedigen jedoch noch nicht in jeder

Hinsicht. 25

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen nicht löslichen Antikörper zu schaffen, der die vorstehend beschriebenen Bedingungen (a) bis(d) im EIA oder RIA erfüllt. L 709840/0965

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß bei der chemischen Verankerung oder Bindung eines Antikörpers an die Zellwand von kugelförmigen oder stäbchenförmigen Bakterien oder Hefen ein nicht löslicher Antikörper entsteht, der* sich vorzüglich in einem Enzymimmunassay oder Radioimmunassay einsetzen läßt.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Zur Herstellung von nicht löslichen Antikörpern können erfindungsgemäß die Zellwände aller kugelförmigen oder stäbchenförmigen Bakterien oder Hefen eingesetzt werden, unabhängig von der Art der Stoffwechselprodukte oder der Pathogenität der Mikroorganismen. Beispielsweise können die Zellwände von Lactobacillus plantarum ATCC 8014 ebenso verwendet werden wie die Zellwände anderer Stämme der gleichen Art. Ferner können die Zellwände von Micrococcus roseus ATCC 9815 und von Micrococcus lysodeiticus ATCC 4698 verwendet werden, die der gleichen Gattung aber einer anderen Art angehören. Ferner können die Zellwände von Saccharomyces cerevisiae, d.h. Bäckerhefe, und von Lactobacillus plantarum ATCC 8014 verwendet werden, die verschiedenen Klassen angehören.

Zur Herstellung der Zellwände können Bakterien der Ordnung Eubacteriales verwendet werden, beispielsweise Microorganismen der Gattung Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus,

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Lactobacillus, Bacillus, Escherichia und Achromobacter. Besonders geeignete Bakterienarten sind Streptococcus faecalis, Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Micrococcus lysodeiticus, Micrococcus roseus, Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, Bacillus megatherium, Escherichia coli und Achromobacter aquamarinus.

Beispiele für Hefen, die zur Herstellung der Zellwände verwendet werden können, sind Keime der Gattung Sacchaomyces, wie Saccharomyces cerevisiae, der Gattung Pichia, wie Pichia polymorpha und der Gattung Schizosaccharomyces, wie Schizosaccharomyces porabe. Besonders bevorzugt ist auf Grund seiner leichten Zugänglichkeit Saccharomyces cerevisiae.

Die Zellwände der Bakterien oder Hefen können mit verschiedenen Methoden gewonnen werden, beispielsweise mit physikalischen Methoden, wie Behandlung in einem Homogenisator oder mit Ultraschall, durch enzyraatischen Aufschluß, beispielsweise mit Trypsin, durch chemische Behandlung, beispielsweise Kochen in verdünnter alkalischer Lösung, oder einer Kombination dieser Verfahren.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Antikörper kann in an sich bekannter Welse durch Immunisierung von Tieren, wie Kaninchen, Pferden, Ziegen, Meerschweinchen oder Rindern, mit dem entsprechenden Antigen und einem Adjuvans hergestellt werden. Ferner können Antikörper gegen Haptene

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AO

durch Absorption oder Bindung des Haptens an einen hochmolekularen Träger, wie Albumin, und anschließende Immunisierung der Tiere mit dem Haptenkonjugat unter Zusatz von AdJuvans hergestellt werden.
5

Beispiele für verwendbare Antigene zur Herstellung der Antikörper sind Hormone wie Angiotensin I, Insulin, Trijodthyronin (T,), Tetrajodthyronin (T^) oder humanes Chorion-Gonadotropin (HCG), Bakterien, Enzyme, Viren, virusspezifisehe Antigene, wie Virushepatitis B, Tumor-assoziierte Antigene, wie Alphafetoprotein (AFP) und Carcino-embryonales Antigen (CEA), Immunoglobuline, wie IgG und IgE, humanes Serum-Albumin (HSA) und Rinderserum-Albumin (BSA), oder Heptene, wie Diphenylhydantoin (DPH), Haioperidol, d.h. 1-(3-p-Fluorbenzoylpropyl)-4-p-chlorphenyl-4-hydroxypiperidin, Testosteron und Phenobarbital. Als Haptene können auch einige Verbindungen verwendet werden, deren chemische Struktur teilweise mit der zu bestimmenden Substanz, d.h. dem nicht markierten

der Menge •Antigen, Übereinstimmt. Beispielsweise kann zur Bestimmung/ von Haloperidol als Hapten auch eine Verbindung verwendet werden, die sich in der 3-fp-Fluorbenzoyl)-propionylgruppe von Haloperidol unterscheidet. Der gegen diese Verbindung spezifische Antikörper reagiert mit Haloperidol unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes.

Die chemische Verankerung des Antikörpers an die Zellwand der Bakterien oder Hefen kann unter Benützung eines Bindemittels durchgeführt werden. Beispiele für verwendbare Bindemit-

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-.*- 271*369

tel sind in Methods of Enzymology, Bd. 11, S. 617 bis 641, Academic Press, New York, 1967, beschrieben. Spezielle Bindemittel sind z.B. Glutardialdehyd, Epichlorhydrin, Toluylen-2,4-diisocyanat und Carbodiimide Besonders geeignet ist Glutardialdehyd.

Die Bindung des Antikörpers an die Zellwand der Bakterien oder Hefen kann auch dadurch bewirkt werden, daß man die ZeIl wand mit einem Oxidationsmittel, wie Natriumperjodat, behan delt, sodann den Antikörper mit der oxidierten Zellwand reagieren läßt und hierauf das erhaltene Produkt reduziert. Bei diesem Oxidationsverfahren können die in der Zellwand vorhandenen Aminogruppen zunächst mit einem Schutzgruppen reagens, wie 2,4-Dinitrofluorbenzol, geschützt werden, um eine Polymerisation der Zellwand bei der Oxidation zu vermeiden.

Die Bindung des Antikörpers an die oxidierte Zellwand verläuft vermutlich folgendermaßen:

Die Zuckerbestandteile der Zellwand werden unter Bildung von Aldehydgruppen oxidiert, und diese reagieren mit den im Antikörpermolekül vorhandenen Aminogruppen unter Bildung einer Schiff-Base. Die dabei entstehenden Azomethinbindungen werden durch Reduktion stabilisiert. Bei diesem Verfahren kann der la Reaktionsgemisch verbleibende nicht-umgesetzte Antikörper durch Zusatz von frischen oxidierten Zellwänden zum

Gemisch wiedergewonnen werden.

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4%

Der erfindungsgemäß hergestellte nicht lösliche Antikörper zeigt im ultraroten Spektralbereich charakteristische

—1 — 1

Absorptionsbanden bei etwa 1540 cm" und 1640 cm"* (A), die

der Gruppe -NHCO- zuzuordnen sind, sowie eine Absorption bei ^ etwa 1040 cm" (B), die der Gruppe -C-OH zuzuordnen ist, die im Zucker vorliegt. Die Ultrarotabsorptionsspektren sind in Figur 1 bis 4 wiedergegeben.

Das Verhältnis von ΑϊB der Ultrarotabsorptionen (Durchlässigkeiten) des nicht löslichen Antikörpers ist immer größer als das der Zellwand vor ihrer Bindung mit dem Antikörper, d.h. der oxidierten Zellwand oder der mit Glutardialdehyd behandelten Zellwand. Das Verhältnis A j B wird auf der Basis der Grundlinie berechnet, wobei die Absorption bei

-1 -1

etwa 1900 cm und bei etwa 850 bis 900 cm vereinigt wird.

Zur Durchführung des EIA oder RIA unter Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten nicht löslichen Antikörpers wird ein mit einem Enzym, wie ß-D-Galactosidase, Pankreaslipase, Peroxidase oder Glucoseoxidase,oder mit einem radio-

12*5 "*> 14
aktiven Isotop, wie I, H oder C,markiertes Antigen, ein nicht-markiertes Antigen (die zu bestimmende Substanz) und der nicht lösliche Antikörper einer kompetitiven Immunreaktion in einer Pufferlösung unterworfen. Sodann wird der entstehende Antigen-Antikörper-Komplex durch Zentrifuge tion abgetrennt. Hierauf wird die Enzymaktivität oder die Radioaktivität des markierten Antigens in dem Präzipitat in der überstehenden Flüssigkeit in üblicher Weise bestimmt.

L _j

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Zur Durchführung des EIA oder RIA sind im wesentlichen folgende Reagentien erforderlich:

(a) Der erfindungsgemäß hergestellte nicht lösliche Antikörper und
(b) ein markiertes Antigen für diesen Antikörper.

Außer den vorgenannten Reagentien können eine Standardsubstanz zur Herstellung einer Eichkurve sowie im Falle des EIA ein chromogenes Substrat für das Enzym und/oder ein die Enzymreaktion abbrechendes Reagens verwendet werden.

Diese Reagentien können vorzugsweise in Form eines Analysenbesteckes (Kit) vorliegen.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Methoden und Beispiele erläutert.

In den Beispielen werden folgende Bakterien und Hefen zur Gewinnung des Zellwandmaterials verwendet:

Streptococcus faecalis IFO 14580 (St. faecalis), Staphylococcus aureus Terajima (Sta. aureus), Micrococcus roseus ATCC 9815 (M. roseus), Micrococcus lysodeiticus ATCC 4698 (M. lysodeiticus), Lactobacillus plantarum ATCC 8014 (L. plantarum), Bacillus subtilis IFO 3335

(B. subtilis), Escherichia coli K-12 (E. coli), Achromobacter aquamarinus ATCC 14400 (A. aquamarinus), Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), Pichia polymorpha IFO 0195 (P. polymorpha) und Schizosaccharomyces pombe IFO 0346

L (S. pombe). j

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Methode A ^H-

Herstellung von Bakterlenzellwandmaterial

Zellen von L. plantarum werden mit Wasser und 0,9prozentiger Kochsalzlösung gründlich gewaschen und sodann gefriergetrocknet. 15 g gefriergetrocknete Zellen und 30 g Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,17 bis 0,18 mm werden in 30 ml O₁9prozentiger Kochsalzlösung suspendiert und unter Kühlung mit Trockeneis durch viermalige Jeweils 30 Sekunden dauernde Behandlung mit einem Homogenisator mit 60 Hz aufgeschlossen.

Sodann werden die Glasperlen 30 Minuten bei 300 g abzentrifugiert. Hierauf werden die Zelltrümmer 30 Minuten bei 10 000 g abzentrifugiert, gründlich mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten Zelltrümmer werden in 0,05 molarem Phosphatpuffer (1 g/50 ml) resuspendiert und 2 Stunden bei 40⁰C in Gegenwart von 0,001 % Trypsin aufgeschlossen und sodann 30 Minuten bei 9000 g zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wird erneut mit Trypsin behandelt, gründlich mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Es werden insgesamt 750 mg Zellwandmaterial erhalten. Die Ausbeute beträgt 10 # d. Th., bezogen auf getrocknete Zellen.

In gleicher Weise wird gefriergetrocknetes Zellwandmaterial von A. aquamarinus, Sta. aureus, St. faecalis, M. roseus,

B. subtilis und E. coli hergestellt. 25

Methode B

Herstellung von Zellwandwaterial aus Hefen der Art

250 g Presshefe/s, cerevisiae werden in 500 ml Wasser sus-

L _l

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AS

penOiex-t und ml-t-tels Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,25 bis 0,5 mm in einer Mühle (Dinomil) bei einer Tourenzahl von 3000 U/min aufgeschlossen. Die aufgeschlossenen Zellen werden abwechselnd mit 1 molarer Kochsalzlösung und Vasser gründlich gewaschen und sodann gefriergetrocknet. Auf diese Weise werden etwa 13 g Zellwandmaterial erhalten.

In gleicher Weise wird Zellwandmaterial von P. polymorpha und S. pombe hergestellt.

Methode C

Herstellung eines enzvmmarklerten Antigens A) Glutardialdehyd-Methode Eine Lösung von 100 ug 3,3-Diphenylpropylamin und 1 mg gerei-

nigter Schweinepankreaslipase in 0,25 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers wird unter Rühren mit 0,25 ml Iprozentiger Glutardialdehydlösung versetzt und 2 Stunden gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch auf eine mit Sephadex G 200 gefüllte Säule mit den Abmessungen 1 χ 54 cm aufgesetzt und mit 0,05 molarem Tris-HCl - 0,1 molarem KCl-Puffer (pH-Wert 8,0) eluiert. Es werden Fraktionen von 1,5 ml aufgefangen.

Es wird ein ^»S-DiphenylpropylajainZ-Zschweinepankreaslipase/-Komplex (enzymmarkiertes Antigen) (7 ml) erhalten, der in der Nähe der Leerfraktionen eluiert wird. Das enzymmarkierte Antigen wird bei 5⁰C in Gegenwart von 0,1 % BSA aufbewahrt.

In gleicher Weise wird ein enzymmarkiertes Antigen, nämlich ein ZSchweineleberesteraseZ-^HSA/ oder -/humanes Serum IgG?-

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Γ Π

- V-

Komplex aus gereinigter Schweineleberesterase (2 mg) und HSA (2,5 mg) oder der Esterase (5 mg) und humanem Serum IgG (3 mg) hergestellt.

B) Maleinimid-Methode

B-1 ^ß-D-GalactosidaseZ-ZTy' oder -ZT^-Konjugat 50^il einer. 0,1 η Natronlauge mit 0,5^Ol T^ oder T^ werden mit 1 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 vermischt. Sodann wird die Lösung tropfenweise und unter Rühren mit einer Lösung von 0,5^uMoI 6-Maleinimid-n-capronsäure-N-succinimidester in 25^1 Tetrahydrofuran versetzt.

Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen

und

sodann mit 40 ul eines 0,2 molaren Citrat-Phosphat-Puffers

vom pH-Wert 4,3 versetzt. Das entstandene Präzipitat wird durch
lOminütiges Zentrifugieren bei 2000 g abgetrennt und mit 1ml eines 0,05 molaren Citrat-Phosphat-Puffers durch Zentrifugieren gewaschen. Sodann wird das erhaltene Prä^zipitat mit 1 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 sowie unter Rühren mit 100^ug (0,19 nMol) ß-D-Galactosidase versetzt. Nach lOminütigem Rühren werden 5 ml eines 0,1 molaren Glykokoll-NaOH-Puffer vom pH-Wert 10,3 zugegeben. Das Gemisch wird zur Abtrennung des freien 6-Maleinimid-n-capronsäure-N-succinimidesters oder des freien Τ, oder T^ durch eine Diaflo-Membran PM 30 filtriert. Der erhaltene Rückstand wird zweimal mit jeweils 3 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gewaschen und hierauf in 1,5 ml eines 1 % BSA - 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gelöst.

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B-2 /3»3-Diphenylpropylamin7-/ß-D-galactosidase_/ Eine Lösung von 1 mg ß-D-Galactosidase in 2 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 8,0 wird tropfenweise und unter Rühren mit einer Lösung von 500 ^ig N-(3,3-Diphenylpropyl)-aminocarbonylmethylmaleinimid in 25 Ul Tetrahydrofuran versetzt. Das Gemisch wird eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt, sodann durch eine Diaflo-Membran PM 30 filtriert und dreimal mit Jeweils k ml eines 0,02 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gewaschen. Der Rückstand wird in 20 ml eines 0,2 % BSA - 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gelöst.

B-3 /HCGy-Zß-D-Galactosidasey

Eine Lösung von 100 jug ß-D-Galactosidase in 1 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 8,0 wird mit 600 Einheiten mit m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester acyliertem HCG versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, sodann durch eine Diaflo-Membran filtriert und wie in B-2 beschrieben gewaschen. Sodann wird

der Rückstand in 1 ml eines 1 % BSA-O,05 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gelöst.

B-4 /Rinderinsulin7-/ß-D-Galactosidase7 Die Verbindung wird nach dem in J. Biochem., Bd. 79 (1976),

S. 235 beschriebenen Verfahren hergestellt.

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-V-

C) Diazokupplungsmethode

/ß-D-GalactosidaseZ-^-diazophenobarbital/ Eine Lösung von 1,5 mg m-Aminophenylbarbital, 170 ug Kaliumbromid und 2 jul 36prozentige Salzsäure in 0,23 ml Wasser wird unter Eiskühlung mit einer Lösung von 570 ug Natriumnitrit in 80 yl Wasser versetzt und 1 Stunde stehengelassen. 80 ul des Reaktionsgemisches werden mit 4 ml einer 0,01 molaren Natriumboratlösung versetzt und in eine Lösung von 500 ^ug ß-D-Galactosidase in 2 ml eines 0,02 molaren Kaliumphosphatpuffers vom pH 7,0 eingetragen. Das Gemisch wird 1 Stunde unter Eiskühlung gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch durch eine Diaflo-Membrane PM 30 filtriert. Der erhaltene Rückstand wird dreimal mit jeweils 10 ml eines 0,9 % NaCl- 0,02 M Xris-HCl-Puffers vom pH-Wert 7,0 gewaschen. Hierauf wird der Rückstand in 20 ml eines 0,2 % BSA - 0,9 % NaCl - 0,1 36 NaN₃ - 0,02 M Tris-HCl-Puffers vom pH-Wert 7 gelöst (400 Assays).

Beispiel 1

Herstellung von nicht löslichem Antikörper 125 mg gemäß Methode A hergestelltes Zellwandmaterial von L. plantarum werden in 2,5 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit 2,5 ml einer anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper-Lösung /IgG-Fraktion; Protein 10 mg/ 0,05 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) 1 ml/, 2,5 ml Wasser und 2,5 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gemischt. Sodann wird das Gemisch tropfenweise und unter Rühren mit 2,5 ml einer 2,5prozentigen wäßrigen Glutardi-

L aldehydlösung versetzt. Nach 1 stundigem Rühren wird das Ge-_,

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misch 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wird dreimal mit jeweils 5 ml eines 0,9 % NaCl-0,02 M T-ris-HCl-Puffers vom pH-Wert 7,0 gewaschen. Man erhält /L. plantarum ZellwandZ-ZAnti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper^ Ein Teil des erhaltenen nicht löslichen

Antikörpers wird gefriergetrocknet und das IR-Absorptionsspektrum aufgenommen. Das Spektrum ist in Figur 1 wiedergegeben. Der nicht lösliche Antikörper wird in einem 0,1 % BSA - 0,9 % NaCl - 0,02 MTris -HCl-Puffer vom pH-Wert 7,0 zu einer Iprozentigen Zellwand - 0,1 % BSA-Lösung resuspendiert, die 30 Sekunden bei 20 KHz (kc/s) mit Ultraschall behandelt und sodann für den EIA oder RIA verwendet wird.

In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben wird Zellwandmaterial von L« plantarum, jedoch ohne Antikörper, mit Glutardialdehyd behandelt. Das IR-Absorptionsspektrums des Zellwandmaterials ist in Figur 2 wiedergegeben.

Aus Figur 1 und Figur 2 ist ersichtlich, daß das A/B-Verhältnis von L. plantarum Zellwandmaterial, das mit Glutardialdehyd behandelt wurde, den Wert 1,24 hat, während der Wert für /L. plantarum Zellwan(ä7-/Änti-Dlphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper/ 1,64 beträgt. Dies beweist die Bildung eines ZeIlwand-Antikörper-Komplexes.

Beim Vermischen von unbehandeltem L« plantarum Zellwandmaterial mit dem Antikörper und anschließendem Waschen wird we-

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der eine Zunahme des A/B-Verhältnisses noch eine Zunahme der Antikörperkapazität beobachtet.

In gleicher Weise werden folgende nicht lösliche Antikörper hergestellt:

/L. plantarum-Zellwand/ - /Anti-HCG-Kaninchenantikörper/;

/L. plantarum-Zellwand/ - /Änti-humanes IgG-Kaninchenantikörper/;

/L. plantarum-Zellwand/ - /Änti-HSA-Kaninchenantikörper

(ohne BSA17;

/L. plantarum-Zellwand/ - /Änti-Tx-BSA-Kaninchenantikörper/; /L. plantarum -Zellwand/ - /Jtoti-Rinder-Thyreoglobulin-Meer-

schweinchenantikörper/;

/S. cerevisiae-Zellwand/- /Änti-Rinderinsulin-Meerschweinchenantikörper/;

/B. subtilis-Zellwand_7 - ^nti-HCG-Kaninchenantikörper/;

/jt. coli-Zellwand7 - Z^nti-humanes IgG-Kaninchenanti-

körper/;

/fo. roseus-Zellwand7 - /Anti-HSA-Kaninchenantikörper (ohne BSAl/

/St. faecalis-Zellwand/ - /Änti-Ta-BSA-Kaninchenantikörper/ und

fk. aquamarinus-Zellwand/-/Änti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchen-

antikörper/.

Beispiel 2 Herstellung von nicht löslichem Antikörper

20 mg gemäß Versuch B hergestelltes Zellwandmaterial von

S. cerevisiae werden in ein Gemisch von 2 ml einer 0,3 mola-

_L ren NaHCO^-Lösung und 0,2 ml einer Iprozentigen Lösung von _j

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2,4-Dinitrofluorbenzol in Äthanol eingetragen und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zusatz von 2 ml einer 0,1 molaren Natriumperjodatlösung wird das Gemisch 48 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß stehengelassen. Sodann wird das oxidierte Zellwandmaterial mit Wasser gewaschen. Das IR-Absorptionsspektrum des oxidierten Zellwandmaterials ist in Figur 3 wiedergegeben.

Das oxidierte Zellwandmaterial wird mit 0,1 ml eines 1 molaren NagCOyPuffers vom pH-Wert 9,0 und 0,2 ml Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper /IgG-Fraktion; Protein 10 mg/ 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7_f0) 1 ml/ sowie mit Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 ml versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4°C gerührt und sodann 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wird abwechselnd mit einem 0,02 M Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7»0 und 0,9prozentiger wäßriger Kochsalzlösung gründlich gewaschen. Sodann wird das Präzipitat in 1ml einer Iprozentigen wäßrigen NaBH^- Lösung resuspendiert, 15 Minuten stehengelassen und mit Wasser gewaschen. Es wird der nicht lösliche Antikörper /S. cerevisiae-Zellwand7 - /Änti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper/ erhalten. Das IR-Absorptionsspektrum dieses Produkts ist in Figur 4 wiedergegeben.

Der nicht lösliche Antikörper wird in einem 0,9 % NaCl 0,1 % BSA - 0,02 M Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,0 zu einer 1 % Zellwand - 0,1 % Albumin-Lösung suspendiert, die für den EIA oder RIA benutzt wird.

L _j

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In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben, werden folgende nicht lösliche Antikörper hergestellt:

/ß. cerevisiae-Zellwand/ - /Änti-Rinderinsulin-Meerschweinchenantikörper/;

/s. cerevisiae-Zellwand/ - /Anti-Testosteron-3-oxim-BSA-

Kaninch enantikörper7;

/S. cerevisiae-Zellwand/ - /Änti-3-(p-Fluorbenzoyl)-propio-

nyl-BSA-Meerschweinchenantikörper/; /L. plantarum-Zellwand/ - /Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kanin-

chenantikörper/;

/B. subtilis-Zellwand_/ - /Änti-Diphenylacetyl-BSA-Kanin-

chenantikörp er/;

/Sta. aureus-Zellwand_7 - /Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kanin-

chenantikörper/ und 15

/E. coli-Zellwandv - /Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kanin-

chenantikörper/.

Beispiel 3

Herstellung eines nicht löslichen Anti-Phenobarbltal-Antikörpers

Anti-Phenobarbital-Kaninchenserum wird nach der von

H. Satoh u. Mitarb., J. Biochem., Bd. 73 (1973), S. 1115, beschriebenen Methode hergestellt, jedoch wird als Hapten

BSA-m-Diazophenobarbita1 verwendet.
25

Aus dem Antiserum wird durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung (0 bis 48 SO und Dialyse gegen einen 0,05 molaren Phosphatpuffer der Anti-Phenobarbital-Kaninchenantikörper herge-

L stellt. _l

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23 mg Anti-Phenobarbital-Kaninchenantikörper und 25 mg gemäß Versuch B hergestelltes Zellwandmaterial von S. cerevisiae werden in 3 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers vom pH-Wert 4,9 suspendiert und tropfenweise und unter Rühren mit 70 jxL einer 25prozentigen Glutardialdehydlösung versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Reaktionsgemisch 20 Minuten bei 3500 g zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat zweimal mit jeweils 10 ml eines 0,9 % NaCl - 0,02 M Tris- HCl-Puffers vom pH-Wert 7,0 durch Zentrifugieren gründlich gewaschen. Der erhaltene /ß. cerevisiae-Zellwandy-ZÄnti-Phenobarbital-Kaninchenantikörper/ wird in 5,2 ml eines 0,2 % BSA - 0,9 % NaCl - 0,1 # NaN₃ - 0,02 M Tris-HCl-Puffers vom pH-Wert 7,0 resuspendiert, 30 Sekunden bei 19 kHz (kc/s) mit Ultraschall behandelt und für den EIA von Serum Phenobarbital verwendet.

Beispiel 4

Allgemeine Methode des EIA oder RIA unter Verwendung »^icht lgsiicher Antikörper A) Reagentien

a) 0,9 % NaCl - 0,02 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0).

b) Standard-Antigen

Das Standard-Antigen wird durch Verdünnen des Antigens in 2er Potenzen mit dem Puffer a) hergestellt.

c) Enzym- oder isotopen-markiertes Antigen:

Eine bestimmte Menge. Die bestimmte Menge des enzymmarkier-

i_ ten Antigens wird durch die Änderung der optischen Dichte _j

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(OD) während einer bestimmten Zeit bei der Messung nach der nachstehend in C beschriebenen Methode wiedergegeben, wobei die Enzymaktivität des markierten Antigens, die den nicht löslichen Antikörper binden kann, bestimmt wird.

d) unlöslich gemachter Antikörper; eine bestimmte Menge Die bestimmte Menge an Antikörper bedeutet diejenige Menge des an Zellwandmaterial gebundenen Antikörpers, von der 50 bis 70 % an eine bestimmte Menge des markierten Antigens gebunden werden kann. Für einen Test werden vorzugsweise 500 ug Zellwandmaterial verwendet.

B) Durchführung der Tests

In Zentrifugenröhrchen aus Glas (1,3 x 10 cm) X₁

für die Standard- An ti gen-Eichkurve und Y₁ Y für die Proben werden 1 ml der Pufferlösung a) gegeben. Bestimmte Mengen (hergestellt durch eine Verdünnungsreihe in 2^er Potenzen) des Standard-Antigens b) werden in die Röhrchen X₁ - X_n und die Proben (50^uI) werden in die anderen Röhrchen Y₁ - Y_ffi gegeben. Sodann wird die bestimmte Menge des markierten Antigens c) und des nicht löslichen Antikörpers d) (jeweils ) in sämtliche Röhrchen gegeben. Die Röhrchen werden

eine bestimmte Zeit bei 5⁰C aufbewahrt und sodann 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Die Enzymaktivität oder Radioaktivitat des markierten Antigens im überstand oder Präzipitat wird bestimmt. Aus den Werten wird eine Standard-Eichkurve angefertigt, aus der die Menge an Antigen in den Proben Y₁ Y_m berechnet wird.

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C) Bestimmung der Enzymaktivität oder Radioaktivität Die Aktivität von Schweinepankreaslipase oder Schweineleberesterasewird colorimetrisch mit 3-Butyroyloxy-1,2-bis-(butyroylthio)-propan als Substrat bestimmt; vgl.

US-PS 3 986 930. Die Aktivität von ß-D-Galactosidase wird fluorometrisch mit 4-Methylumbelliferyl-ß-D-galactopyranosid als Substrat (vgl. J. Biochera., Bd. 78 (1975), S. 235) oder colorimetrisch mit ο -Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid als Substrat (vgl. Biochem. Biophys. Acta, Bd. 403 (1975), S. 131) bestimmt.

125
Die Radioaktivität von I wird mit einem automatischen

Szintillationszähler AL 201 (Dainabat-Shimazu Co.) gemessen. Die ,

Radioaktivität von "Ή wird mit einem Tri-Carb-Flüssigkeits-Szintillations-Spektrophotometer Typ 3380 (Packard Instrument Co.) gemessen.

Beispiel 5 Bestimmung von DPH

Gemäß Beispiel 4 wird der EIA und RIA unter folgenden Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten wird die Eichkurve angefertigt, die in Figur 5 wiedergegeben ist.

Nicht löslicher Antikörperj

/S. cerevisiae-Zellwand7 - /Änti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper/, hergestellt gemäß Beispiel 2.

Markiertes Antigen:

/3 1 S-DiphenylpropylaminZ-Zschweinepankreaslipase/, herge-

L stellt gemäß Versuch C, (A) OD^/^O min »0,6.

709840/0985

/3,3-Diphenylpropylamin/ - /ß-D-Galactosidase/, hergestellt gemäß Versuch C, (B-2) ...OD^q/20 min - 1,8.

³H- DPH 100 pg (10 000 cpm)

unmarkiertes Antigen:

Standard DPH 0 bis 100 ng

Zeit der Antigen-Antikörper-Reaktion .... 30 Minuten 10

Aus Figur 5 ist ersichtlich, daß sowohl der eIA als auch der

vfür

RIAxdie Bestimmung von DPH (0,4 bis 100 ng) innerhalb von 90 Minuten beendet werden kann. Nach der Doppelantikörper-Methode

erfordert die Bestimmung etwa 2 Tage. 15

Beispiel 6 Bestimmung von DPH

Gemäß Beispiel 5 wurde DPH in Seren (jeweils 10 ^lL) von normalen Personen und von Patienten bestimmt, denen DPH oral gegeben wurde.

Das DPH in den gleichen Proben wurde durch Gaschromatographie (G. C.) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.
25

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1-*

Tabelle I

*): Als markiertes Antigen wird /ß-D-Galactosidase/ verwendet

Probe	* EIA (μ9/ΐη1)	RIA (μς/ΐηΐ)	G.C. (_ug/ml)
Serum von normalen Personen ~ .' ' (10 Personen)	0	0	0
Serum von a Patient	3.3 2.8	3.4 2.3	3.1 2.7
C	1.2	1.3	1.0
D	1.5	1.8	116
E	1.5	1.5	1.6
F	2.6	2.8	2.5
G	1.7	1.8	1.6
H	1.2	1.6	1.4
I	2.4	2.6	2.4
J	0.3	0.1	0

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß die nach den drei Methoden erhaltenen quantitativen Werte gut miteinander Übereinstimmen.

Beispiel von DPH

Der RIA wird gemäß Beispiel 5 durchgeführt, jedoch werden .folgende, gemäß Beispiel 2 hergestellte nicht lösliche Antikörper verwendet: /L. plantarum-Zellwand/ - /Anti-Diphenylacetyl-BSA-Käninchenantikörper/, /ß. subtiUs-Zellwand7 - ^nti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper/,

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■* "a?

/Sta. aureus-Zellwand/ -/Anti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper7 und /Ε. coli-Zellwand/ - ZÄnti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper/.

Es konnte die gleiche Eichkurve für DPH wie in Figur 5 errechnet werden

Beispiel 8 Bestimmung von HCG

Der EIA wird gemäß Beispiel 4 unter den nachstehend angegebenen Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten wird die in Figur 6 wiedergegebene Eichkurve für HCG angefertigt.

Nicht löslicher Antikörperi

/h. plantarura-Zellwand/ - /Änti-KCG-K&nlncheii&ntiktirperJ', hergestellt gemäß Beispiel 1.

Markiertes Antigen:

/HCCrZ-Zß-D-Galactosidase/, hergestellt gemäß Versuch C, (B-3) Od2oS/90 min = 0,6.

Unmarkiertes Antigen: Standard HCG 0 bis 10 IU

Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion .... 30 Minuten.

Aus Figur 6 ist ersichtlich, daß die Bestimmung von HCG (0,25 bis 2,5 IU) innerhalb 90 Minuten beendet werden kann,

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während die Doppelantikörper-Methode etwa 2 Tage erfordert.

Beispiel 9 Bestimmung von HSA

Gemäß Beispiel A wird der EIA unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Ergebnissen wird die in Figur 7 wiedergegebene Eichkurve für HSA angefertigt.

Nicht löslicher Antikörper:

/L. plantarum-Zellwand7 - /Änti-HSA-Kaninchenantikörper/, hergestellt gemäß Beispiel 1.

Markiertes Antigen:

^HSAZ-Zschweineleberesterase/, hergestellt gemäß Versuch C,

(A) OD/_Ai?/15 min = 0,9.

Unmarkiertes Antigen:
Standard HSA 0 bis 10 )ig.

Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion .... 30 Minuten.

Aus Figur 7 ist ersichtlich, daß die Bestimmung von HSA (0,6 bis 10^Ug) innerhalb 90 Minuten beendet werden kann.

Beispiel 10

Bestimmung von T,

Gemäß Beispiel 4 wird der EIA unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten

7 098 40/096 5

wird die in Figur 8 wiedergegebene Eichkurve für T* angefertigt.

Nicht löslicher Antikörper:

/h. plantarum-Zellwandy-ZÄnti-Ts-BSA-Kaninchenantikörper/, hergestellt gemäß Beispiel 1.

Markiertes Antigen:

/!,/-/ß-D-Galactosidase/, hergestellt gemäß Versuch C

(B-1) 0D^4q/20 Minuten =1,4

/ 3500 cpm.

Unmarkiertes Antigen:

Standard Tj 0 bis 50 ng

Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion .... 30 Minuten.

Aus Figur 8 ist ersichtlich, daß sowohl im EIA als auch im RIA die Bestimmung von T, (0,1 bis 50 ng) innerhalb 90 Minuten beendet werden kann. Nach der Doppelantikörper-Methode erfordert die Bestimmung etwa 2 Tage.

Beispiel 11 Bestimmung von Insulin

Gemäß Beispiel 4 wird der RIA unter den nachstehend aufge führten Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten wird die in Figur 9 wiedergegebene Eichkurve für Rinderinsulin angefertigt.

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Nicht löslicher Antikörper:

/S. cerevisiae-ZellwandZ-ZÄnti-Rinderinsulin-Meerschweinchenantikörper/ hergestellt gemäß Beispiel 1.

Markiertes Antigen:

[_ ²-^>l7-/Schweineinsulin7 etwa 10 000 cpm

unmarkiertes Antigen:
Standard-Schweineinsulin 0 bis 32 uIU

Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion 15 Stunden.

Aus Figur 9 ist ersichtlich, daß die Bestimmung von Schweineinsulin (0,5 bis 32 UlU) innerhalb 24 Stunden beendet werden kann. Nach der Doppelantikörper-Methode erfordert die Antigen-Antikörper-Reaktion 48 Stunden (die erste Reaktion 24 Stunden und die zweite Reaktion 24 Stunden).

Beispiel 12 Best^wifung von Insulin

Beispiel 11 wird wiederholt, jedoch wird /s. cerevisiae-Zellwandy-ZÄnti-Rinderinsulin-Meerschweinchenantikörper/, hergestellt gemäß Beispiel 2, verwendet. Es wird das gleiche Ergebnis wie in Beispiel 11 erhalten.

Beispiel 13

von Insulin

Gemäß Beispiel 4 wird der EIA unter den nachstehend angegebenen Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten _L wird die in Figur 10 wiedergegebene Eichkurve für Insulin

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angefertigt.

Nicht löslicher Antikörper:

/S. cerevisiae-ZellwandZ-ZÄnti-Rinderinsulin-Meerschweinchen-Antikörper7, hergestellt gemäß Beispiel 2.

Markiertes Antigen:

/RinderinsulinZ-Zß-D-Galactosidase/, hergestellt gemäß Versuch C, (B-A) ^OD2Sn/3O Minuten = 0,016.

Anm.: Dieses markierte Antigen wird colorimetrisch bestimmt, und die Bestimmung der Enzymaktivität im EIA wird fluorophotometrisch durchgeführt.

Unmarkiertes Antigen:

Standard-Rinderinsulin 0 bis 160^uIU.

Die Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion 15 Stunden.

Beispiel 14 Bestimmung von Testosteron

Gemäß Beispiel 4 wird der RIA unter den nachstehend aufge führten Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten wird die in Figur 11 wiedergegebene Eichkurve für Testo steron angefertigt.

Nicht löslicher Antikörper:

/S. cerevisiae-Zellwand/ - ZÄnti-Testosteron-3-oxim-BSA-_L Kaninchenantikörper/, hergestellt gemäß Beispiel 2.

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Markiertes Antigen: ^

/^!/-/Testosteron/ 8,8 pg (1700 cpm)

Unmarkiertes Antigen:

Standard-Testosteron 0 bis 1,3 ng.

Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion: 3 Stunden.

Beispiel 15 Bestimmung von Haloperidol

Gemäß Beispiel A wird der RIA unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten ' wird die in Figur 12 wiedergegebene Eichkurve für Haloperidol angefertigt.

Nicht löslicher Antikörper:

/S: cerevisiae-ZellwandZ-ZÄnti^- (p-Fluorbenzoyl )-propionyl-BSA-Meerschweinchenantikörper/, hergestellt gemäß Beispiel

Markiertes Antigen:
/^-/Haloperidol/ 356 pg (7300 cpm).

Unmarkiertes Antigen:

Standard-Haloperidol 0 bis 10 ng

Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion 30 Minuten.

Beispiel 16 Bestimmung von humanem IgG

Gemäß Beispiel 4 wird der EIA unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten

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wird die in Figur 13 wiedergegebene Eichkurve für humanes IgG angefertigt, aus der die Menge IgG in humanem Serum berechnet wird. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle II zusammengefaßt.

Nicht löslicher Antikörper:

/L. plantarum-Zellwand7 -/Änti-humanes IgG-Kaninchenantikörper/, hergestellt gemäß Beispiel 1.

Markiertes Antigen:

^humanes IgGy-y/Schweineleberesterase/, hergestellt gemäß

Versuch C, (A) 0D^^cm/40 Minuten = 0,4.

O bis

50 με

Unmarkiertes Antigen: Standard-humanes IgG

humanes Serum 400-fach verdünnt

mit 0,9prozentiger Kochsalzlösung 20

Zeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion .... 30 Minuten. Tabelle II

humanes Serum	elektrophoretische Analyse, wg/ml ' .j	EIA, /ig/ml
A B C D	12.8 22.4 23.6 12.0	12.5 27.5 22.8 11.7

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Beispiel 17 Bestimmung von Serum-T^

50 ul Standard-T^-Serum mit O bis 20 ng T^ werden mit 0,2 ml eines Gemisches von 20prozentiger Trichloressigsäure und 0,5 η Natronlauge (1 : 3) versetzt. Das Gemisch wird 10 Hinuten bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann mit 0,1 ml eines 1 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 neutralisiert. Die erhaltene Lösung wird mit 0,2 ml eines 0,4 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 versetzt, der 0,1 % BSA, /T^A/ß-D-Galactosidase/ (enzymmarkiertes Antigen) (0,1 ml), hergestellt gemäß Versuch C, (B-1), und 0,1 ml /L. plantarum-ZellwandZ-ZAnti-Rinderthyreoglobulin-Meerschweinchenantikörper/, hergestellt gemäß Beispiel 1, enthält. Nach 90minütiger Inkubation des Gemisches bei 37° C

wird das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. Das Präzipitat wird mit 2 ml 0,9proζentiger Kochsalzlösung grundlich gewaschen. Hierauf wird das Präzipitat mit 0,8 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0

versetzt, der 1 uMol HgCl₂ und 0,2 ml einer 0,7 % 2-Hercapto-20

äthanol- 0,4 % o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid-Lösung enthält. Das Gemisch wird 60 Hinuten bei 45° C inkubiert. Sodann wird die Reaktion durch Zusatz von 2,5 ml eines 0,2 H K₂HPO^-NaOH-Puffers vom pH-Wert 11,0 abgebrochen. Hierauf

wird das Reaktionsgemisch 10 Hinuten bei 1500 g zentrifugiert 25

und sodann die optische Dichte (OD) des Überstandes bei 410 nm gemessen. Die auf diese Weise für den Serum-T^-Test nach der EIA-Hethode erhaltene Eichkurve ist in Figur 14

wiedergegeben. L

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Beispiel 18 Bestimmung von humanem Serum-T^

Die Ty₊-Wer te von humanen Serum-Proben, bestimmt nach dem EIA gemäß Beispiel 17 werden mit denen verglichen, die mit einem T^-RIA-Kit erhalten werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

"humane Serumproben	Ty₁-RIA-KIt, * ,ug/dl	EIA, ^g/dl
A B C D E	2.6 6.8 9.7 12.3 19.0	3.2 8.4 10.3 16.0 23.0

Beispiel 19

Realen ti en und Methodik zur Bestimmung von Serum Phenobarbital Reagent!en

(A) Pufferlösung 0,2 M Tris-HCl - 0,9 % NaCl (pH 7,0). (b) Standard-Phenobarbitallösung: Lösung von 1 ug Phenobarbital in 1 ml (A).

(C) Enzymmarkiertes Antigen: Eine 0,02 M Tris-HCl - 0,9 36 NaCl - 0,2 % BSA - 0,1 % NaN₃-Lösung (pH 7,0), die /Phenobarbita^-Zß-D-Galactosidase/, hergestellt ge mäß Methode 3 (C),enthält(25 ^g/ml ß-D-Galactosidase).

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(D) Anti-Phenobarbital- nicht löslicher Antikörper: Eine 0,02 MTris-HCl- 0,9 X NaCl - 0,2 % BSA 0,1 S^ NaN^-Lösung (pH 7,0^dXe gemäß Beispiel 3 hergestellten Anti-Phenobarbital- nicht löslichen Antikörper (10 ^ug/ml Zellwand) enthält.

(E) Substratlösung: Eine 0,16 % o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid-0,2 ;jMol MgCl₂ - 0,3 % ß-Mercaptoäthanol 0,06 M Kaliumphosphat-Lösung (pH 7,0). (P) Reagens zum Abbruch der Enzymreaktion: 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 10,3).

' Methodik .
In Zentrifugenröhrchen aus Glas (2 χ 10 cm) X₁...^ für die

Standard-Phenobarbital-Eichkurche und Y₁ Y_m für die Pro-

ben werden jeweils 1 ml der Pufferlösung (A) gegeben.

Eine bestimmte Menge (0 bis 500 ng) der Standard-Phenobarbitallösung (B), die mit der Pufferlösung (A) in 2^er Potenzen

. verdünnt wurde, wird in die Röhrchen X₁ - X_n gegeben, und eine entsprechende Menge der Probe (beispielsweise im Fall von humanem Serum 50 ^uI nach 50-fächer Verdünnung der Probe mit der Pufferlösung (A)), wird in die Röhrchen Y₁ Y_n gegeben. In sämtliche Röhrchen werden 50 ul des enzymmarkierten Antigens (C) und 50 γΐ des Anti-Phenobarbital-nicht löslichen Antikörpers (O) gegeben. Sofern die Probe von einem Patienten stammt, werden 100 ul humanes Normalserum ohne Phenobarbital zugegeben, das 10-fach verdünnt wurde. Nach gründlichem Mischen

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- 3fr-

wird das Gemisch 30 Minuten bei 5⁰C inkubiert, sodann 10 Minuten bei 1^00 g zentrifugiert und der Überstand abgetrennt· Das Präzipitat wird zweimal mit Jeweils 1 ml der Pufferlösung

(A) durch Zentrifugieren gewaschen. 5

Das erhaltene Präzipitat wird mit 0,5 ml der Substxatlösung (E) versetzt und das Gemisch 15 oder 30 Minuten bei 37 C inku-

(F)

biert. Sodann werden 2 ml des Reagens/zum Abbruch der Enzymreaktion zugegeben, und das Gemisch wird zentrifugiert. Die Absorption des überstandes wird bei 412 nm gemessen. Aus den erhaltenen Werten wird eine Standard-Eichkurve ange-' fertigt und sodann die Menge an Phenobarbital in der Probe berechnet.

Beispiel 20

\anti-Einfluß anderer VeOileptischer Arzneistoffe auf den EIA zur

Bestimmung von Phenobarbital In Gegenwart unterschiedlicher Mengen Phenobarbital (PB), DPH, p-Hydroxydiphenylhydantoin (HO-DPH), Trimetadion (ΊΜ), Carbamazepin (CM) und Primidon (PM) wird die Antigen-

Antikörper-Reaktion gemäß Beispiel 19 durchgeführt. Es wird die Enzymaktivität des enzymmarkierten Antigens, gebunden an den nicht löslichen Antikörper, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur 15 wiedergegeben. Aus Figur 15 ist er- sichtlich, daß die Standardkurve für den Phenobarbital-Test durch Mengen von 0,4 bis 10 ^ig der vorgenannten Antiepileptika und ihrer Metaboliten nicht beeinträchtigt wird.

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-""39

Beispiel 21 des EIA

Die Phenobarbitalwerte in drei humanen Serumproben werden 10 malmit dem EIA nach den in Beispiel 19 beschriebenen Bedingungen bestimmt, und es wird die Variationskonstante (CV) berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt. Außerdem werden die Phenobarbitalmengen in drei anderen humanen Serumproben einmal täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagei nach dem EIA gemäß Beispiel 19 bestimmt, und es wird die Variation innerhalb eines Tages oder zwischen den Tagen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt. Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß die Variationskonstante (CV) im EIA innerhalb 10 % liegt.

Tabelle IV

' Probe	G.C. (μ9/πι1)	EIA	CV (%)
a b C	10.4 22.4 32.0	X + SD* (^g/ml)	4.3 4.2 5.4
9.2 + 0.4 21.0 + 0.9 36.8 + 2.0

*) χ bedeutet Hittelwert, SD bedeutet Standard abweichung

Tabelle V

Probe	G.C.	EIA	X + SD (_ug/ml)	CV (%)
d e f	5.5 15.1 27.2	12 3 4 5Tage- (ng/ml)	5.3 + 0.2 16.2 + 1.2 27.0 + 1.5	3.7 7.0 5.0
5.1 5.5 5.3 5.6 5.0 15.4 16.3 15.0 16.0 18.5 27.0 26.0 28.5 29.0 25.1

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Beispiel 22

Bestimmung von Phenobarbital in humanem Serum

In 77 humanen Serumproben von Patienten, die oral drei antiepileptische Arzneistoffe eingenommen hatten, nämlich

Phenobarbital (PB), DPH und Primidon (PM), wird Phenobarbital sowohl nach dem EIA als auch durch GasChromatographie bestimmt. Die nach den beiden Methoden erhaltenen Phenobarbitalwerte stimmen gut überein, wie aus Figur 16 hervorgeht.

Beispiel 23

Herstellung eines EIA-Bestecks zur Bestimmung von Phenobar-' bital

(A) Pufferlösung

In 100 Glasschlifflaschen mit einem Volumen von 30 ml werden jeweils 25 ml eines 0,2 M Tris-HCl - 9 % NaCl -Puffers,

(pH 7,0) abgefüllt. Beim Gebrauch wird der Inhalt der Glasflaschen mit Wasser auf ein Volumen von 250 ml aufgefüllt. Diese Lösung wird als Pufferlösung (A) wie in Beispiel 19 verwendet.
20

(B) Standard-Phenobarbital-Äthanollösung

100 Glasschlifflaschen mit einem Fassungsvermögen von 6 ml werden jeweils mit 5 ml einer Lösung von 500 ^ug Phenobarbital in Äthanol gefüllt. Zur Verwendung wird die Lösung in 2^er Potenzen mit der Pufferlösung (A) verdünnt.

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(C) Enzymmarkiertes Antigen

100 Glasschlifflaschen mit einem Fassungsvermögen von 6 ml werden jeweils mit 5,2 ml des in Beispiel 19 beschriebenen enzymmarkierten Antigens (C) gefüllt.

(D) Anti-Phenobarbital- nicht löslicher Antikörper

100 Glasschlifflaschen mit einem Fassungsvermögen von 6 ml werden jeweils mit 5,2 ml des in Beispiel 19 beschriebenen Anti-Phenobarbital- nicht löslichen Antikörpers (d) gefüllt.

(E) Substratlösung

100 Glasflaschen mit einem Fassungsvermögen von 2 ml werden mit jeweils 88 mg o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosidpulver gefüllt. Die Flaschen werden verschlossen. Zum Gebrauch wird der Inhalt der Flaschen in 52 ml eines 0,2 mMol MgCl₂ 0,3 % ß-Mercaptoäthanol - 0,06 M Kaliumphosphatpuffers (pH 7,0) zur Substratlösung (E)_f wie in Beispiel 19 beschrieben, gelöst.

(F) Reagens zum Abbruch der Enzymreaktion

100 Glasschlifflaschen mit einem Fassungsvermögen von jeweils 25 ml werden mit jeweils 22 ml eines 1 M Kaliumphosphatpuffers (pH 10,3) gefüllt. Zum Gebrauch wird der Inhalt mit Wasser auf 220 ml verdünnt. Diese Lösung wird als Reagens (F) zum Abbruch der Enzymreaktion_fwie in Beispiel 19 beschri eben, verwendet.

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Es werden 100 Analysenbestecke hergestellt, die jeweils eine Flasche der Reagentien (A) bis (F) enthalten. Diese werden für 100 Phenobarbital-Tests gemäß Beispiel 19 verwendet.

Beispiel 24

Herstellung eines EIA-Bestecks zur Bestimmung von DPH

(1) Nicht löslicher Antikörper

Gemäß Beispiel 1 wird ein /L. plantarum-Zellwand7 - ZÄnti-Diphenylacetyl-BSA-Kaninchenantikörper/ - 0,1 % BSA 0,9 % NaCl - 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0; 11 ml) hergestellt. Jeweils 2,5 ml der erhaltenen nicht löslichen Antikörpersuspension werden unter Stickstoff in vier braune Glasschliff laschen mit einem Fassungsvermögen von 10 ml abgefüllt, gefriergetrocknet und verschlossen. Auch nach 2monatiger Lagerung bei 50⁰C wird keine Abnahme im Antikörper-

titer beobachtet. Beim Verdünnen des Inhalts einer Flasche mit 5,0 ml Wasser entsprechen 50 ^iI der Lösung einem nicht löslichen Antikörper mit etwa 500 ug Zellwandmaterial.

(2) Enzymmarkiertes Antigen

Gemäß Versuch (C), (B-2) werden 9 ml einer 0,2 % BSA -

0,1 % NaN, - 0,05 M Phosphatpufferlösung mit /3,3-Diphenyl propylamin/-/ß-D-Galactosidase/ einer OD^^/20 Minuten = 810 hergestellt. Jeweils 2,0 ml der Lösung werden in vier

braune Glasschlifflaschen mit einem Fassungsvermögen von

10 ml abgefüllt. 20^uI dieser Lösung entsprechen einem enzymmarkierten Antigen mit 0D^|/20 Minuten = 1,8.

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Ein EIA-Besteck zur Bestimmung von DPH besteht aus jeweils einer Flasche, von (1) und (2), das für etwa 100 DPA-Tests gemäß Beispiel 5 verwendet wird.

709840/0965

Lee rhi»

Claims

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellwand von Bakterien der Ordnung Eubacteriales verwendet.

h. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Gattung Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus, Lactobacillus, Bacillus, Escherichia oder Achromobacter verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Art Streptococcus faecalis, Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Micrococcus lysodeiticus, Micrococcus roseus, Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, Bacillus megatherium, Escherichia coli oder Achromobacter aquamarinus verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellwand von Bakterien der Art Lactobacillus

plantarum verwendet.
20

7· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellwand von Hefen der Gattung Saccharomyces, Pichia oder Schizosaccharomyces verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellwand von Hefen .der Art Saccharomyces cerevisiae, Pichia polymorpha oder Schizosaccharomyces pombe verwendet.

^L 709840/0965 -J

9· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellwand von Hefen der Art Saccharomyces cerevisiae verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Antikörper gegen ein Hormon, Enzym, ein virusspezifisches Antigen, Tumorantigen, Immunglobulin, Humanserum-Albumin, Rinderserum-Albumin oder ein Hapten verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hormon Insulin, Trijodthyronin, Tetrajodthyronin oder humanes Chorion-Gonadotropin verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hapten mit der gleichen Partiaistruktur wie die der zu bestimmenden Substanz verwendet.

13- Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hapten Diphenylhydantoin, Phenobarbital, Testosteron oder Haioperidol verwendet .

14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Antikörper mittels eines Bindemittels an die ZeIlwand verankert.

15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bindemittel Glutardialdehyd verwendet.

^L 709840/0965 ->

' 16. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellwand mit einem Oxidationsmittel behandelt und das erhaltene Produkt mit dem Antikörper zur Reaktion bringt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß ma'n als Oxidationsmittel Natriumperjodat verwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reaktionsprodukt des Antikörpers mit der oxidierten Zellwand reduziert.

19· Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1 im Enzymimmunassay oder Radioimmunassay.

20. Analysenbesteck (Kit) für den Enzymimmunassay oder Radioimmunassay, bestehend aus

A) einem nicht löslichen Antikörper nach Anspruch 1 und

B) einem markierten Antigen.
20

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