DE2712007C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das stabilisierte Glucoseisomerase-Enzymkonzentrat des Anspruchs 1 und die Herstellung eines solchen gemäß Anspruch 10. Die Unteransprüche 2 bis 9 und 11 bis 18 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Die als Isomerisierung bekannte Umwandlung von Dextrose in Lävulose liefert ein Produkt, das in der Praxis einen vollwertigen Ersatz für handelsüblichen Invertzucker darstellt. Bei der Isomerisierung geht man von Dextrose aus, einem Monosaccharid, das nur etwa 70% der Süßkraft von Saccharose besitzt, und wandelt bis zu etwa 50% davon in einen Zucker um, der etwa 140% der Süßkraft von Saccharose oder Invertzucker besitzt. Dieses besondere Süßungsvermögen ist es, das die Stärkeindustrie an lävulosehaltigem Maissirup (der heute üblicherweise als fructosereicher Maissirup [HFSC] bezeichnet wird) und dem Verfahren zur Herstellung derartiger Sirupe so stark interessiert.

Die Erforschung des enzymatischen Isomerisierungsverfahrens begann 1955. Diese Arbeiten haben ihren Niederschlag im US-Patent 29 50 228 und einer Veröffentlichung von Marshall und Kooi in Science, 125, 648 (1957), gefunden. Seit dieser Zeit sind die Veröffentlichungen über Arbeiten von Forschern, die durch die grundlegenden Arbeiten von Marshall und Kooi angeregt wurden, in Fachliteratur und Patenten buchstäblich explosionsartig angeschwollen.

Eine der wichtigeren Veröffentlichungen auf diesem Gebiet stellt der Vorabdruck des Manuskriptes eines Berichtes von Dr. Sato und Dr. Tsumura vom Japanese Food Research Institute auf der Jahrestagung der Agricultural Chemical Society of Japan in Sapporo am 20. Juli 1964 dar. In diesem 1964 erschienenen Vorabdruck und dem am 7. Oktober 1966 veröffentlichten japanischen Patent 17 640 offenbarten Dr. Sato und Dr. Tsumura, daß mehrere Stämme von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, wenn sie auf Xylose kultiviert werden, das Enzym Glucoseisomerase erzeugen sowie, daß dieses Enzym die Isomerisierung von Glucose zu Fructose bewirkt. Im Zuge nachfolgender Entwicklungsarbeiten stellte eine andere Gruppe von Wissenschaftlern unter der Leitung von Dr. Takasaki vom Japanese Fermentation Research Institute, einem Organ des Ministry of International Trade and Industry (MITI), fest, daß bestimmte Stämme von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, die Xylan, ein Polymer der Xylose, assimilieren, auf Xylan kultiviert werden können und dabei Glucoseisomerase erzeugen (jap. Patentschrift 27 525 und US-Patentschrift 36 16 221).

Die Hersteller von hochfructosehaltigem Maissirup haben festgestellt, daß die enzymatische Isomerisierung von Glucose vorzugsweise kontinuierlich durchgeführt werden sollte, um ein kommerziell annehmbares fructosereiches Maissirupprodukt wirtschaftlich herzustellen. In der Regel wird bei derartigen Verfahren ein Glucosesirup mit einer großen Menge eines auf einer inerten Trägersubstanz aufgebrachten Glucoseisomerase-Enzympräparats in Berührung gebracht, d. h. einem immobilisierten Glucoseisomerase-Enzympräparat. Ein wesentlicher Punkt eines derartigen Verfahrens ist es, daß man ein immobilisiertes Glucoseisomerase- Enzympräparat verwendet, das pro Volumeneinheit eine hohe Isomeraseaktivitätskonzentration aufweist, so daß es sich für den Einsatz in einem kontinuierlichen enzymatischen Isomerisierungsverfahren eignet.

Glucoseisomerase wird in der Regel intrazellular erzeugt, d. h., daß der größte Teil des Glucoseisomerase-Enzyms innerhalb der und/oder an den Zellwänden der Mikroorganismen sitzt, von denen es erzeugt wird. Bei einigen kontinuierlichen Isomerisierungsverfahren verwendet man die ganzen, die Glucoseisomerase enthaltenden Zellen. Bei derartigen Verfahren ist es in der Regel erforderlich, die Zellen einer speziellen Behandlung zu unterwerfen, durch die verhindert wird, daß die Glucoseisomerase aus den Zellen extrahiert wird, so daß bei dieser Behandlung somit im Endeffekt das Enzym in den Zellen selbst immobilisiert wird, und/oder spezielle Vorrichtungen zu verwenden, um die hydraulischen Probleme lösen zu können, die damit verbunden sind, die glucosehaltige Lösung durch das Bett aus das Glucoseisomerase- Enzym enthaltenden Zellen zu treiben. Verfahren, bei denen ganze Glucoseisomerase enthaltende Zellen verwendet werden, sind beispielsweise in den US-Patentschriften 36 94 314, 37 53 858, 37 79 869, 38 17 832 und 38 21 086 sowie den deutschen Offenlegungsschriften 23 17 680 und 23 45 186 beschrieben. Diese Verfahren, bei denen ganze, Glucoseisomerase enthaltende Zellen verwendet werden, sind mit einer Reihe von Nachteilen behaftet. Nachteilig sind dabei u. a. das Auftreten hydraulischer Probleme, die Bildung von Verunreinigungen aufgrund der Anwesenheit anderer Enzyme als Isomerase, von Nucleinsäuren und anderen Stoffen in den Zellwänden sowie längerer notwendiger Kontaktzeiten zwischen der Glucoselösung und dem Zell-Enzympräparat, wobei letztere unter alkalischen Bedingungen zur Bildung unerwünschter, durch alkalikatalysierte Reaktion aus Fructose entstehender Produkte, wie Psicose und Hydroxymethylfurfural (HMF) führen. Die vorstehenden Probleme führen zu höheren Herstellungskosten aufgrund der zur Entfernung der erzeugten Verunreinigungen erforderlichen Reinigung und/oder zur Erzeugung eines minderwertigen Produktes.

Um die bei der Verwendung ganzer, intrazellulare Glucoseisomerase enthaltender Zellen auftretenden Probleme zu lösen, wurden nach dem Stand der Technik bereits Verfahren vorgeschlagen, bei denen die Glucoseisomerase aus den Zellen abgetrennt wird, um sie in eine lösliche Form zu bringen, worauf man sie an einem nicht-wasserlöslichen inerten Träger immobilisiert. Das immobilisierte Enzym eignet sich dann zur Verwendung bei der kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in einen hochfructosehaltigen Maissirup. Beispiele derartiger Verfahren sind in den US-Patentschriften 37 08 397, 37 88 945, 38 50 751 und 38 68 304, der belgischen Patentschrift 8 19 859 und der US- Patentanmeldung 5 05 823 bzw. der belgischen Patentschrift 8 10 480 beschrieben.

Diese Verfahren, bei denen zellfreie immobilisierte Glucoseisomerase verwendet wird, lösen zwar einige der mit der Verwendung ganzer Zellen verbundenen Probleme, erfordern jedoch die Solubilisierung der Glucoseisomerase, d. h., die Abtrennung der Glucoseisomerase von bzw. aus den ganzen Zellen. Verfahren zur Solubilisierung der Glucoseisomerase sind zwar bekannt, jedoch ist es wünschenswert, zellfreie und lösliche Glucoseisomerase in hochreiner Form zu erhalten, die eine hohe Isomeraseaktivität pro Volumeneinheit aufweist. Die Verwendung eines hochgereinigten und -konzentrierten Enzyms erhöht nämlich die Effizienz, mit der das Enzym auf den unlöslichen Träger aufgebracht werden kann.

Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von Glucoseisomerase aus Mikroorganismenzellen in konzentrierter und gereinigter Form machten bislang die Anwendung teurer und komplizierter Arbeitsgänge erforderlich, die nur für Versuchsarbeiten im kleinen Labormaßstab geeignet waren.

Ein derartiges Laborverfahren zum Extrahieren und Reinigen solubilisierter Glucoseisomerase ist von Danno und Mitarbeitern in Agr. Biol. Chem., Band 31, Seiten 284 bis 292 (1967), beschrieben worden. Danno und Mitarbeiter beschrieben ein Verfahren zum Reinigen von aus Bacillus coagulans, Stamm HN-68 stammender Glucoseisomerase, bei dem man mit Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) behandelte Zellen der Einwirkung von Lysozym aussetzt, um einen zellfreien Extrakt herzustellen, aus dem man dann durch Behandeln mit Mangansulfat unerwünschte Stoffe ausfällt. Die überstehende Flüssigkeit wird dann mehrmals mit Ammoniumsulfat behandelt, um eine proteinhaltige Glucoseisomerasefraktion auszufällen, die durch Dialyse und Chromatographie an DEAE-Sephadex A-50 weiter gereinigt wird. Auf diese Weise wird angeblich eine Konzentrationssteigerung auf das 60fache erreicht.

Eine andere Labormethode zum Reinigen von Glucoseisomerase wurde von Takasaki und Mitarbeitern beschrieben (Agri. Biol. Chem., Band 33, Seiten 1527 bis 1534 [1969], und "Fermentation Advances", Seiten 561 bis 589 [1969]), Academic Press, Inc., New York, New York). Takasaki und Mitarbeiter offenbarten, daß intrazellulare Glucoseisomerase von Streptomyces albus aus den Zellen durch Behandlung mit einem kationischen Netzmittel, Cetylpyridiniumchlorid, freigesetzt und dann fraktioniert werden kann, indem man den zellfreien Extrakt mit Aceton behandelt, dialysiert, anschließend nacheinander in einer mit DEAE-Cellulose gefüllten und einer mit DEAE-Sephadex gefüllten chromatographischen Säule chromatographiert und schließlich einer weiteren Dialyse unterwirft. Der gereinigte zellfreie Extrakt wurde dann weiter durch Diaylse in einer pro Liter 0,005 Mol Magnesiumsulfat und 0,0002 Mol CoCl₂ enthaltenden Lösung gereinigt. Zu der dabei erhaltenen Lösung wurde allmählich Aceton bis zu einer Konzentration von 40, 45 und schließlich 50% zugegeben, um das Glucoseisomerase-Enzym zu kristallisieren. Dieses Verfahren ist zu kompliziert und zeitraubend, um beim Arbeiten in großem Maßstab angewendet werden zu können.

Aus der US-Patentschrift 37 08 397 ist ein weiteres derartiges Verfahren bekannt, bei dem Glucoseisomerase aus mit EDTA behandelten Zellen von auf Weizenkleie kultivierten Mikroorganismen der Spezies Streptomyces phaeochromogenes durch Behandeln mit einer Lysozym, Toluol, Magnesiumchlorid, einen Puffer und Wasser enthaltenden Lösung abgetrennt werden. Die lysierte Aufschlämmung wird dann mit Magnesiumchlorid behandelt, worauf man das Enzym schließlich durch allmähliche Zugabe von kaltem Aceton ausfällt. Die so erhaltene Enzymfällung wird in Wasser gelöst und an DEAE-Cellulose immobilisiert, wodurch man einen zur Umwandlung von Glucose in einen fructosereichen Maissirup verwendbaren Biokatalysator erhält. Bei einem weiteren, aus der US-Patentschrift 37 88 945 bekannten Verfahren wird von auf Xylose und Xylanhydrolysat kultivierten Mikroorganismen vom Stamm Streptomyces sp, ATCC 21 175, stammende intrazelluläre Glucoseisomerase mit einem kationischen Netzmittel (Arquad 18-50) und dann mit DEAE-Cellulose behandelt, um Nicht-Isomerasematerial abzutrennen. Das Glucoseisomerase enthaltende Filtrat wird dann an DEAE-Cellulose oder einem synthetischen Anionaustauscherharz immobilisiert, wodurch man einen Biokatalysator für die kontinuierliche Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltigen Maissirup erhält.

Auch in den US-Patentschriften 38 47 740 und 38 47 741 ist ein derartiges Verfahren beschrieben, bei dem intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Zellen mit einer kleinen Menge eines Netzmittels, Tween 80, in einer gepufferten Glycinlösung behandelt werden. Nach innigem Durchmischen werden die Zelltrümmer entfernt, wobei man ein 17,5 Isomeraseaktivitätseinheiten pro ml enthaltendes Filtrat erhält.

Aus der US-Patentschrift 38 47 740 ist ein Verfahren zum Immobilisieren gereinigter Glucoseisomerase-Präparate an einem basischen Magnesiumcarbonat-Träger und aus den US-Patentschriften 38 50 751 und 38 68 304 ein Verfahren zum Immobilisieren von Glucoseisomerase-Präparaten an Aluminiumoxyd-Trägern mit geregelter Porosität bekannt. Die Verwendung auf diese Weise erhaltener immobilisierter Enzympräparate ergibt zwar überlegene Verfahren zur Erzeugung hochfructosehaltiger Maissriupe, erfordert jedoch hochgereinigte und -konzentrierte Glucoseisomerase, um sie effizient und wirtschaftlich industriell nutzen zu können.

Trotz der vorstehend beschriebenen Verfahren besteht somit immer noch ein Bedarf an einem wirtschaftlichen Verfahren, nach dem in großem Maßstab im wesentlichen lösliche und gereinigte Glucoseisomerase-Präparate hergestellt werden können, die eine hohe Aktivität pro Volumeneinheit und eine hohe Stabilität besitzen und sich zur Herstellung von bei kontinuierlichen Verfahren zum Herstellen hochfructosehaltiger Maissirupe verwendbaren Biokatalysatoren durch Binden bzw. Immobilisieren des Glucoseisomerase-Präparats an einen wasserunlöslichen Träger eignen, aber auch an sich wertvoll und nützlich sowie in anderen Immobilisierungsverfahren brauchbar sind.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, derartige Glucoseisomerase- Enzymkonzentrate zur Verfügung zu stellen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch das stabilisierte Glucoseisomerase- Enzymkonzentrat des Patentanspruchs 1 gelöst.

Die Glucoseisomerase-Enzymkonzentrate der Erfindung sind so stabil, daß sie bei Lagerung unter den angegebenen Bedingungen durchschnittlich etwa 95% ihrer anfänglichen Aktivität behalten und vorzugsweise sogar so stabil, daß sie bis zu 80±10% ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität behalten, wenn sie bis zu 12 Monate lang bei 18°C gelagert werden.

Das erfindungsgemäße Enzymkonzentrat enthält vorzugsweise zusätzlich 5 bis 25 Gew.-% Methanol, Ethanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol. Es besitzt ferner vorzugsweise eine Isomeraseaktivität von mindestens 5000 und insbesondere mindestens 8000 IGIU/g Trockensubstanz.

Vorzugsweise beträgt der Proteingehalt des Enzymkonzentrats 60 bis 75 Gew.-%, bezogen auf die Trockensubstanz, und das Mg⁺⁺-Protein-Verhältnis liegt vorzugsweise zwischen 0,03 und 0,5, wobei das Konzentrat vorzugsweise einen Mg⁺⁺-Gehalt von 5 bis 25 mg/ml Enzymkonzentrat aufweist.

Ferner beträgt der Wassergehalt des erfindungsgemäßen Enzymkonzentrats vorzugsweise 50 bis 80 und der Trockensubstanzgehalt 5 bis 30 Gew.-%.

Ferner stammt vorzugsweise die in dem Enzymkonzentrat enthaltene Glucoseisomerase von den Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 713, ATCC 21 714 und/oder ATCC 21 715.

Ein ganz besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Glucoseisomerase- Enzymkonzentrat enthält 20 bis 30 Gew.-% Propan-2-ol und 55 bis 70 Gew.-% Wasser, während sein Mg⁺⁺-Gehalt aus Magnesiumacetat, -chlorid und/oder -sulfat stammt.

Das erfindungsgemäße Enzymkonzentrat kann nach dem Verfahren des Patentanspruchs 10 hergestellt werden.

Der in der Stufe a) dieses Verfahrens erhaltene Glucoseisomerase- Magnesium-Niederschlag kann nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Zentrifugieren, abgetrennt werden.

Das Enzymkonzentrat kann dazu verwendet werden, auf wasserunlösliche Träger, beispielsweise DEAE-Cellulose, synthetische Anionenaustauscherharze, poröse, wasserunlösliche Materialien, wie basisches Magnesiumcarbonat und poröse Aluminiumoxydmaterialien, aufgebracht zu werden zur Herstellung von Biokatalysatoren, die zur kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in Fructose geeignet sind. Das abgetrennte Enzymkonzentrat, das in Form eines dicken Breies bzw. einer dicken Aufschlämmung vorliegt, wird vorzugsweise mit einer kleinen Menge Wasser verdünnt, um es leichter auf wasserunlöslichen Trägern unter Bildung außerordentlich stabiler, immobilisierter Glucoseisomerase-Biokatalysatoren mit hoher Isomeraseaktivität pro Trägervolumeneinheit sorbierbar zu machen. Das Konzentrations-, Reinigungs- und Stabilisierungsverfahren ergibt eine Steigerung der Enzymkonzentration auf mehr als das 70fache und insbesondere mehr als das 100fache der in der ursprünglichen Kulturbrühe vorliegenden Konzentration. Das Enzymkonzentrat ist außerdem 10- bis 15mal reiner als das ursprüngliche Enzym.

Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen Enzymkonzentrats sind Gegenstand der Patentansprüche 11 bis 18.

Wegen der Vielfalt und oftmals fehlenden Eindeutigkeit der im gegebenen Zusammenhang allgemein gebräuchlichen Fachausdrücke werden nachfolgend einige Definitionen gegeben, die das Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche erleichtern und exakte und eindeutige Angaben ermöglichen sollen.

"DE" ist eine gebräuchliche Abkürzung für die Bezeichnung "Dextroseäquivalent", die den Gehalt einer Substanz an reduzierenden Zuckern, berechnet als Dextrose und angegeben in Prozent des gesamten Feststoffgehaltes, bedeutet.

Der Ausdruck "Stärkehydrolysat" wird als allgemeiner Begriff zur Bezeichnung eines Sirup- oder Trockenproduktes benutzt, das durch Hydrolyse von Stärke hergestellt ist. Ein derartiges Produkt kann durch saure und/oder enzymatische Hydrolyse hergestellt werden. Für die Isomerisierung bevorzugt verwendbare Stärkehydrolyse erhält man durch Verflüssigung bzw. Verdünnung von Stärke mit Säure oder Enzym bis zu einem DE von 10 oder weniger und anschließende enzymatische Verzuckerung bis zu einem DE von über 90 und vorzugsweise über 95. Die Bezeichnung "Dextrose" ist im wirtschaftlichen Sprachgebrauch üblicherweise dem raffinierten, kristallinen Zucker (einem Monosaccharid) vorbehalten, der aus einem hochgradig konvertierten Stärkehydrolysat gewonnen wird. Die Bezeichnung "Glucose" wird in der Beschreibung und den Ansprüchen sowohl in ihrer im wirtschaftlichen Sprachgebrauch üblichen Bedeutung als auch zur Bezeichnung des Monosaccharids Dextrose in beliebiger Form, gleich, ob in Lösung oder trocken, als Bestandteil eines Stärkehydrolysatsirups oder von Stärkehydrolysatfeststoffen oder aber in raffinierter kristalliner Form gebraucht.

Die Ausdrücke "Fructose" und "Lävulose" werden vom Fachmann in der Regel gegeneinander austauschbar zur Bezeichnung des linksdrehenden Isomeren der Glucose gebraucht, das süßer als Dextrose ist. Dieses Isomere kommt in der Natur im Honig und in Invertzucker zusammen mit Glucose vor und wird wegen seiner hohen Süßkraft geschätzt. Nachfolgend wird dieses Monosaccharid als "Fructose" bezeichnet.

"Glucoseisomerase" ist ein Enzym oder Enzympräparat, das Xylose zu Xylulose und Glucose zur Fructose isomerisieren kann. Die vorherrschende Aktivität dieses Enzyms ist die Umwandlung von Xylose in Xylulose, so daß die Bezeichnung "Xyloseisomerase" die wissenschaftlich exakteste Benennung darstellt (EC 5.3.1.5.). Dieses Enzym ist fachsprachlich auch schon als "Dextroseisomerase", "Xylose-(Dextrose-)Isomerase" und "Glucoseisomerase" bezeichnet worden. Die gebräuchlichste Bezeichnung ist "Glucoseisomerase", so daß nachstehend dieser Ausdruck der Einfachheit und leichteren Verständlichkeit wegen benutzt wird.

In der Beschreibung und den Ansprüchen beziehen sich Angaben in Teilen und Prozenten stets auf das Gewicht des jeweiligen Produktes, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist.

Die Angabe "IGIU" ist eine Abkürzung der Bezeichnung International Glucose Isomerase Unit (Internatinonale Glucoseisomeraseeinheit). Eine IGIU ist diejenige Glucoseisomerasemenge, die in einer 0,8molaren Glucoselösung bei pH 7,5 und 60°C sowie unter Anwendung der nachstehend beschriebenen Testmethode ein Mikromol Fructose pro Minute erzeugt.

Bei der zur Bestimmung der Isomeraseaktivität benutzten Testmethode wird die in einer Glucoselösung unter standardisierten Bedingungen erzeugte Ketose spektrophotometrisch bestimmt.

Zur Durchführung der Isomeraseaktivitätsbestimmung wird zunächst jeweils eine Probestammlösung nach folgender Rezeptur angesetzt:

Probe-Stammlösung

Das Enzympräparat, dessen Aktivität bestimmt werden soll, wird zunächst so weit verdünnt, daß es 1 bis 6 IGIU/ml enthält.

Dann führt man eine enzymatische Isomerisierung durch, indem man 3 ml der Probe-Stammlösung mit 1 ml des verdünnten Enzympräparats versetzt und das Gemisch 30 Minuten bei 60°C bebrütet. Am Ende der Inkubationsperiode wird eine 1 ml-Probe gezogen und in 9 ml 0,5normaler Perchlorsäure "abgeschreckt". Die abgeschreckte Probe wird dann auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Zu Vergleichszwecken wird jeweils auf analoge Weise ein Blindversuch durchgeführt, wobei statt 1 ml der zu untersuchenden Enzympräparatlösung 1 ml Wasser am Beginn der Bebrütungszeit zugegeben wird. Der Ketosegehalt wird dann nach der Cystein-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Wie vorstehend bereits erwähnt, wird die nach dieser Methode bestimmte Aktivität in IGIU angegeben, wobei eine IGIU als diejenige Enzymaktivität definiert ist, die erforderlich ist, um unter den vorstehend beschriebenen Isomerisierungsbedingungen ein Mikromol Fructose pro Minute zu erzeugen.

"Lysozym" (EC 3.2.1.17) ist ein Enzym, das β-1,4-Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure (oder 2-Acetamido-2-dexoxy-D- glucose) und 2-Acetamido-2-desoxy-D-glucoseresten in Mucopolysacchariden, Mucopolypeptiden oder in Chitin hydrolysiert. Lysozym wird in der Regel aus Eiweiß erzeugt. Es katalysiert die Hydrolyse (Lyse) der Zellwände vieler Mikroorganismen.

Aufgrund des erwähnten Verfahrens, nachdem die erfindungsgemäßen Enzymkonzentrate hergestellt werden können, sind sie im wesentlichen frei von Nucleinsäuren, wie Ribonucleinsäure (RNA) und Desoxyribonucleinsäure (DNA).

Die stabilisierten Enzymkonzentrate weisen, wenn sie in flüsiger Form vorliegen, in der Regel eine Magnesiummolarität in einem Bereich von etwa 0,1 bis 2 und vorzugsweise 0,2 bis 1,0 Magnesium pro Liter auf, wobei ihr Wassergehalt insbesondere 55 bis 70% und ihr Trockensubstanzgehalt 20 bis 30 Gew.-% beträgt. Ferner enthalten sie kein zugesetztes Kobalt.

Bei der Durchführung des obenerwähnten Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Enzymkonzentrate sollten die Temperatur- und pH-Bedingungen so gewählt werden, daß das Enzym nicht inaktiviert wird. In der Regel sollte der pH-Wert während aller Verfahrensstufen in einem Bereich von etwa 6 bis 9 und insbesondere zwischen 7 und 7,5 liegen. Die Temperatur kann zweckmäßigerweise in einem Bereich von etwa 5 bis 55, vorzugsweise 15 bis etwa 35 und insbesondere 25 bis 30°C liegen.

Als im wesentlichen wasserlösliches Magnesiumsalz wird beim Verfahren der Erfindung vorzugsweise ein Salz verwendet, das bei Raumtemperatur in Wasser in einer Konzentration von etwa 0,02 bis 2 Mol/Liter im wesentlichen löslich ist. Typische geeignete Magnesiumsalze sind beispielsweise Magnesiumchlorid, -bromid, -nitrat, -sulfatheptahydrat, -acetat und -lactat. Vorzugsweise verwendet man Magnesiumchlorid und insbesondere Magnesiumsulfat (wenn in dieser Beschreibung Magnesiumsulfat erwähnt wird, so ist damit stets die Heptahydratform gemeint).

Die beim Verfahren der Erfindung verwendete Menge an im wesentlichen wasserlöslichen Magnesiumsalz sollte zumindest so hoch gewählt werden, daß die die wäßrige Aufschlämmung des wasserlöslichen organischen Lösungsmittels und der zellfreien Glucoseisomerase enthaltende Flüssigkeit bezüglich ihres Magnesiumionengehaltes mindestens etwa 0,02 molar ist. Die obere Grenze der Magnesiumsalzkonzentration schwankt in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Salz. Man sollte nicht soviel Magnesiumsalz zusetzen, daß ein totaler "Aussalzeffekt" oder eine Salz-Wasser-Phasentrennung auftritt. Allgemein gesagt, liegt die Höchstmenge an Magnesiumsalz in der Lösung bei etwa 0,3 Mol/ Liter. Vorzugsweise sollte die Magnesiumsalzkonzentration in der Lösung in einem Bereich von etwa 0,02 bis etwa 0,2 Mol Magnesiumionen/ Liter liegen. Die besten Ergebnisse erzielt man, wie gefunden wurde, wenn man das Magnesiumsalz in einer Menge zusetzt, die eine Magnesiumionenkonzentration in der Lösung von etwa 0,05 Mol/Liter ergibt.

Die intrazellulare Glucoseisomerase, aus der die stabilisierten Enzymkonzentrate der Erfindung hergestellt werden, kann aus jedem geeigneten Mikroorganismus gewonnen werden, der Glucoseisomerase zu erzeugen vermag.

Das intrazellulare, Glucoseisomerase enthaltende Enzym wird vorzugsweise hergestellt, indem man einen Glucoseisomerase erzeugenden Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium, das eine geeignete Kohlenstoffquelle und andere entsprechende Nährstoffe enthält, kultiviert und das Enzym sich dabei bilden läßt.

Beispielsweise stellt man zunächst eine Impfkultur eines Glucoseisomerase erzeugenden Stammes, z. B. auf einer Agar-Platte, her und beimpft damit ein geeignetes Kulturmedium. Dann läßt man den Mikroorganismus wachsen und intrazellular Glucoseisomerase (nachstehend kurz "intrazellulare Glucoseisomerase") erzeugen. Die Inkubationsdauer kann, je nachdem, welcher spezielle Mikroorganismus auf welchem Kulturmedium jeweils gerade verwendet wird, innerhalb eines breiten Bereiches schwanken und liegt vorzugsweise zwischen 4 und 48 Stunden. Dann wird eine Teilmenge der auf diese Weise erhaltenen Impfkultur dazu verwendet, ein geeignetes Kulturmedium in einer oder mehreren Entwicklungsstufen zu beimpfen, worauf das Inoculum aus der letzten Entwicklungsstufe zum Beimpfen eines geeigneten Kulturmediums in einem (Produktions-)Fermenter verwendet wird.

Die die Mikroorganismen mit der intrazellularen Glucoseisomerase enthaltende Kulturbrühe kann nach jeder beliebigen geeigneten Methode konzentriert werden, z. B. durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren. Die Zellpaste aus intrazellulare Glucoseisomerase enthaltenden Zellen liegt dann in zur weiteren Aufarbeitung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren geeigneter Form vor.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung. Es sei darauf hingewiesen, daß sich Angaben in Teilen jeweils auf das Gewicht beziehen, wenn nichts anderes angegeben ist. Die in den Beispielen angegebenen Glucoseisomeraseaktivitäten wurden nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt und sind jeweils in IGIU angegeben.

Beispiel 1 a) Herstellung intrazellularer Glucoseisomerase

Die zur Herstellung des stabilisierten Enzymkonzentrats verwendeten, intrazellulare Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismen wurden in vier mit 1 Liter fassenden Schüttelkolben beginnenden und bis zu 3785,4 Liter fassenden Impfkultur-Tanks führenden Impfkultur-Entwicklungsstufen sowie einer abschließenden Produktionsstufe in 75 708 Liter fassenden Fermentern hergestellt. Jede der aufeinanderfolgenden Entwicklungsstufen und die Fermenter der Produktionsstufe wurden jeweils mit einer 5 Vol.-% des Fassungsvermögens des beimpften Fermentationsgefäßes entsprechenden Impfkulturmenge angeimpft. Die Zusammensetzung der Kulturmedien für die Impfkultur-Entwicklung und die Produktionsstufe sind aus der nachfolgenden Tabelle I zu ersehen. Die Kulturmedien für alle Stufen wurden jeweils 30 Minuten bei 120°C sterilisiert. Die Fermentations- bzw. Bebrütungszeiten bei der Impfkultur-Entwicklung betrugen 48 Std. für die erste Stufe, 24 Std. für die zweite Stufe, 22 Std. für die dritte Stufe und 15 bis 17 Std. für die vierte Stufe. In der ersten Stufe wurde das Kulturmedium mit Zellen von Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 715 (ein Einzelkolonieisolat aus dem Stamm ATCC 21 713, vgl. die US-Patentschrift 38 13 318) versetzt bzw. angeimpft. Die vier Impfkultur-Entwicklungsstufen wurden jeweils bei einer Temperatur von 28°C und einem pH-Wert von 7,0 durchgeführt, der vor dem Sterilisieren mit 10normaler Natronlauge eingestellt wurde.

Tabelle I

Inoculum-Entwicklung/Medium-Zusammensetzung

In der zweiten, dritten und vierten Impfkultur-Entwicklungsstufe wurde der Inhalt der Kolben bzw. Tanks während der Fermentation jeweils belüftet und gerührt.

Die abschließende Produktionsfermentation wurde in ca. 75 m³ fassenden Fermentern durchgeführt. Die Kulturmediumingredienzien (außer der Xylose und der Dextrose) wurden in 52 996 Litern Kondensat angesetzt. Dann wurde das Kulturmedium auf etwa 60°C erhitzt und sein pH-Wert mit Natriumcarbonatlösung mit einer Dichte von 16° Baum´ auf 5,6 bis 5,8 eingestellt. Vor der Einstellung wurde die Kulturbrühe erhitzt, um das bei der Natriumcarbonatzugabe entwickelte Kohlendioxyd abzutreiben. Nach der Einstellung des pH-Wertes wurde dem Kulturmedium das Antischaummittel zugesetzt und der Fermenterinhalt dann 30 Minuten bei 120°C sterilisiert, worauf es wieder auf 60°C abgekühlt wurde. Die Zucker, Xylose und Dextrose, wurden in dem ca. 3800 Liter fassenden Impfkulturtank in 1514 Litern Kondensat angesetzt. Die Zuckerlösung wurde 30 Minuten bei 120°C sterilisiert und nach dem Herunterkühlen mittels eines Inoculumschlauches in den Produktionsfermenter überführt. Nach der Zugabe der Zucker wurde die Temperatur des Fermenters beim Betriebswert von 32°C stabilisiert, worauf der Fermenter mit der Impfkultur angeimpft wurde. Ab der 20. Stunde nach dem Animpfen wurden alle zwei Stunden Proben aus der Fermenterkulturbrühe gezogen und auf ihre Isomeraseaktivität, das Zellengewicht, den Gehalt an reduzierenden Zuckern und den Gesamtkohlenhydratgehalt analysiert. Die Fermentation wurde als vollendet angesehen, wenn die Erzeugung von Isomeraseenzym das Maximum überschritten hatte. Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch automatische oder manuelle Zufuhr von vorsterilisiertem Ammoniakgas durch die Fermenterlufteinblasleitungen so eingestellt, daß er nicht unter 5,4 bis 5,6 fiel. Die Mediumzusammensetzung und die Betriebsparameter bzw. -bedingungen für die Fermentation im ca. 75-m³-Produktionsfermenter, die bereits in den US-Patentschriften 37 70 589 und 38 13 318 beschrieben worden sind, sind in der nachfolgenden Tabelle II wiedergegeben.

Tabelle II

Mediumansatzrezeptur für 75 m³ fassende Fermenter

Mediumansatzvolumen - 64 352 Liter

Weder während der Impfkultur-Entwicklungsstufen noch während der Produktions-Fermentation wurde Kobalt zugesetzt.

Die aus der Kulturbrühe gewonnene intrazellulare Glucoseisomerase besaß eine Aktivität von 19,5 IGIU/ml. Zur Herstellung des stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrats wurde eine Teilmenge von 8857,9 Litern der Kulturbrühe verwendet. Ein anderer Teil der Kulturbrühe wurde in Form ganzer Zellen unter Verwendung von Mg(OH)₂, Filterhilfe und Propan-2-ol gewonnen. Die auf diese Weise gewonnenen ganzen Zellen wurden dann zur enzymatischen Umwandlung von Glucose in Fructose in einem Chargenkonverter verwendet.

b) Herstellung von stabilisiertem Glucoseisomerase-Enzymkonzentrat

8857,9 Liter wie vorstehend beschrieben im Produktionsfermenter hergestellter intrazellularer Glucoseisomerase-Kulturbürhe mit einer spezifischen Aktivität von 19,5 IGIU/ml, entsprechend einer Gesamtisomeraseaktivität von 173×10⁶ IGIU, wurden in einer Feststoffe ausstoßenden Zentrifuge verarbeitet. Die Zentrifuge wurde mit einer Zufuhrgeschwindigkeit von 18,93 Litern/Minute und einem 2-Minuten-Schußzyklus gespeist. Unmittelbar vor und nach dem Schüsselschuß wurde jeweils eine Sekunde Wasch- und Spülwasser zugeführt. Die Zellpaste aus dem Schußauslaß der Zentrifuge, insgesamt 917,6 kg mit einer Isomeraseaktivität von 187 IGIU/g, wurde mit 75,7 Litern Wasser in einen ca. 850 Liter fassenden Tank mit rundem Boden gegeben. Wenn 294,8 bis 317,5 kg Zellpaste gesammelt waren, wurde diese jeweils mit 8 g eines Lysozym-Enzympräparats (ein aus Eiweiß stammendes, zweimal kristallines, gefriergetrocknetes Pulver mit einer Aktivität von 23 300 Einheiten/mg) behandelt bzw. versetzt, um den Abbau der Zellwände und damit die Freisetzung der intrazellularen Glucoseisomerase in löslicher Form in Gang zu setzen. Der Zellpaste wurde eine 85-vol.-%ige, wäßrige Propan-2-ol-Lösung in einer Menge von 21,2 Litern Lösung auf 45,36 kg Zellpaste zugesetzt. Dann wurde das Gemisch mit weiteren 41,64 Litern der wäßrigen Propan-2-ol-Lösung versetzt, um den Alkoholgehalt der Flüssigkeit auf 30 Vol.-% zu bringen. Das so erhaltene Zellpaste- Propan-2-ol-Wasser-Gemisch wurde dann in einen ca. 3800 Liter fassenden Abbautank gepumpt, worauf man den Zellwandabbau 24 Std. ablaufen ließ. Die Temperatur der Flüssigkeit im Zellabbautank wurde bei etwa 26°C gehalten. Nach 24 Std. wurde dem Gemisch so viel 85-vol.-%ige Propan-2-ol-Lösung zugesetzt, daß sein Propan-2-ol-Gehalt auf 52 Vol.-% gebracht wurde, d. h. auf eine Propan-2-ol-Konzentration, bei der die Nucleinsäuren, wie Ribonucleinsäure und Desoxyribonucleinsäure, im wesentlichen unlöslich sind, während das Enzymproteinmaterial löslich ist. Auf einem Vakuumrotationsfilter wurden zur Vorbeschichtung 90,7 kg Filterhilfe angeschwemmt.

Nach der Vorbeschichtung wurde dem in der angeschwemmten Filterhilfeschicht enthaltenen Wasser so viel Propan-2-ol zugesetzt, daß der Alkoholgehalt auf etwa 52 Vol.-% gebracht wurde, um die Nucleinsäuren in unlöslicher Form zu halten bzw., anders gesagt, um eine Lösung der Nucleinsäuren zu verhindern. Bei diesem Rotationsfilter wurde kein Waschwasser verwendet, sondern nach beendeter Filtration des Zellpastenbreies das Vorbeschichtungsanschwemm-Wasser/Alkohol-Gemisch durch den Filter geschickt. Der im Vorbeschichtungsfilterbett verbleibende Zellpastenbrei wurde zu einem Nutschenfilter gepumpt, um den Enzymverlust so gering wie möglich zu halten. Beim Filtrieren auf den Nutschenfilter wurde die erwähnte Filterhilfe zugesetzt.

Die Filtrate aus dem Anschwemm-Rotationsfilter und dem Nutschenfilter wurden jeweils in einen als Lager- bzw. Vorratstank für die Beschickung eines Beschickungstanks dienenden, ca. 3800 Liter fassenden Tank gepumpt, in dem 56,8 Liter 1,0molare Magnesiumsulfat- (MgSO₄ · 7H₂O)-Lösung und 49,2 Liter 85-vol.-%iger Propan- 2-ol zugesetzt wurden. Das so erhaltene Gemisch wurde mit einer Geschwindigkeit von 62,8 Litern/Minute in einem 5-Minuten- Schußzyklus einer Zentrifuge zugeführt. Nach dem Zentrifugieren wurde die Schüssel durch fünf aufeinanderfolgende, jeweils eine Sekunde dauernde Spülwasserzufuhren und Schüsse gespült. Der in der Schüssel und der Schußkammer verbleibende, das stabilisierte Enzymkonzentrat enthaltende Rückstand wurde ausgekratzt, worauf die Schüssel und die Kammer mit etwas leichter Ablaufphase aus der Zentrifuge gewaschen wurden. Sowohl der Rückstand als auch das Waschwaser gingen in das stabilisierte Enzymkonzentratprodukt. Das Produkt wurde mit einem Labormischer gerührt und in ca. 3,8 Liter fassende Plastikbehälter zur Auswertung und zum weiteren Gebrauch zur enzymatischen Umwandlung von Glucose in Fructose abgefüllt. Die Gesamtausbeute an stabilisiertem Glucoseisomerase-Enzymkonzentrat (Ansatz 1) betrug 41,64 Liter konzentrierte Flüssigkeit, die eine Aktivität von insgesamt 109×10⁶ IGIU, entsprechend einer Isomeraseaktivität von etwa 11 261 IGIU/g Trockensubstanz enthielt. Dies entsprach einer Aktivitätsausbeute von 63% der in der als Ausgangsmaterial verwendeten, ganze Zellen enthaltenden Kulturbrühe enthaltenen Gesamtaktivität. Eine vollständigere Übersicht über die Analysenkennwerte des stabilisierten Enzymkonzentrats ist der nachstehenden Tabelle III zu entnehmen.

Tabelle III

Analysenkennwerte des stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrats

Beispiel 2

Analog Beispiel 1a) wurden unter Verwendung von 7,5 Liter, 40 Liter und 400 Liter fassenden Fermentern für die Impfkulturentwicklung und eines 4000 Liter fassenden Fermenters für die abschließende Produktionsstufe mehrere Chargen bzw. Ansätze intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 715 hergestellt. Nach der Fermentation wurde die Temperatur der ganze Zellen intrazellularer Glucoseisomerase enthaltenden Chargen bzw. Ansätze jeweils von 32 auf 22°C herabgesetzt, um das weitere Mikrobenwachstum und eventuelle Zellautolyse zu verzögern. Die Ansätze wurden dann zentrifugiert, um die Zellen zu einer Zellpaste zu konzentrieren. Die schwere Zellpastenphase wurde in ca. 38 Liter fassenden Eimern aufgefangen, gewogen und dann zum Zellabbau in einen ca. 3800 Liter fassenden Abbautank gepumpt. Dort wurde die Zellpaste unter Rühren mit dem auch in Beispiel 1 verwendeten Lysozym-Enzympräparat versetzt, um die Zellwände abzubauen und die intrazellulare Glucoseisomerase in löslicher Form freizusetzen. Das Lysozym wurde den Ansätzen jeweils in einer 6,8 Einheiten/mg Zelltrockensubstanz entsprechenden Menge zugesetzt. Das in der Zellpaste enthaltene Gesamtzelltrockensubstanzgewicht wurde aus dem Zelltrockensubstanzgehalt der Fermenterkulturbrühe und dem Fermenterkulturbrühenvolumen berechnet. Dieser Berechnung lag somit die Annahme zugrunde, daß die Zelltrockensubstanzausbeute bei der ersten Konzentrationsstufe 100% betragen hatte. Das Lysozym wurde der Zellpaste nach dem Zentrifugieren der Gesamt-Kulturbrühe und vor der Zugabe von Alkohol zugesetzt. Nach der Zugabe des Lysozyms wurde eine azeotrope, wäßrige Propan-2-ol-Lösung in einer eine Propan-2-ol-Konzentration von 42±1 Gew.-% ergebenden Menge zugesetzt. Die anfängliche Zugabe von Propan-2-ol wurde auf der Basis des Zellpastengewichtes minus 8% für Unlösliches (T.S.) und der Qualität des zugesetzten Alkohols errechnet. Nach der Einstellung der Alkoholkonzentration wurde der pH-Wert des Lysats, d. h., der Zellpasten/Alkohol-Aufschlämmung mit wasserfreiem Mononatriumphosphat (zur Verringerung des pH) auf 7,0 eingestellt. Das Mononatriumphosphat wurde in 250-g-Anteilen nach Bedarf zugesetzt. Um örtliche "Hitzenester" zu vermeiden, wurde das Reagens vor der Zugabe in Wasser gelöst. Die Lysate wurden dann unter turbulentem Rühren bei einer Temperatur von 28 bis 30°C gehalten, bis das Enzym 100%ig solubilisiert war. Der Solubilisierungsgrad wurde durch eine Vergleichsenzymanalyse einer ganzen Lysatprobe und eines Teils der gleichen Probe, aus dem die Zellfeststoffe durch Zentrifugieren abgetrennt worden waren, bestimmt.

Am Ende der Abbauperiode wurde die Alkoholkonzentration im Lysat nachgeprüft und auf den Sollwert von 42±1% eingestellt. Dann wurden die Zelltrümmer aus dem Lysat unter Verwendung eines Anschwemmfilters abgetrennt, der mit einer in 44- bis 46%igen wäßrigen Propan-2-ol-Lösung aufgeschlämmten Diatomeenerde-Filterhilfe beschichtet bzw. angeschwemmt worden war. Beim Anschwemmen wurde also mit einem etwas über 42±1% liegenden Alkoholgehalt gearbeitet, um den infolge von Entspannungsverdampfung im Inneren des Vakuum-Anschwemmfilters auftretenden Alkoholverlusten Rechnung zu tragen. Das abgebaute Lysat wurde wie es war, d. h., mit einem pH-Wert von 7,0±0,3 und bei einer Temperatur von 28 bis 30°C, filtriert. Die vom Anschwemmfilter abgezogenen Filtrate wurden einem ca. 3800 Liter fassenden Tank zugeführt, der als Vorratstank für die Ausfällungsstufe verwendet wurde.

Bei vier Ansätzen wurde die Ausfällung chargenweise unter Verwendung eines Vorratstanks als Ausfällgefäß durchgeführt. Die geklärten Filtrate wurden jeweils in Chargen von etwa 643,5 Litern im Tank vorgelegt. Dann wurden pro Liter geklärtem Lysat jeweils 0,05 Liter 1,0molare Magnesiumsulfatlösung und so viel azeotrope Propan-2-ol-Lösung zugesetzt, daß der Gesamtgehalt an Propan-2-ol bei etwa 42 Gew.-% gehalten wurde. Während der Zugabe wurde die Lösung jeweils gerührt und mittels einer Einspeispumpe umgepumpt, um die Durchmischung zu erleichtern. Der Enzymniederschlag wurde 10 bis 15 Minuten ruhengelassen, damit er sich zu größeren Flocken agglomerieren konnte, und dann mittels einer Zentrifuge abgetrennt. Die Lösung wurde der Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von 6 bis 10 g/Minute zugeführt und die Schale während jeder Charge zweimal geschossen (entleert).

Bei einem Ansatz (Ansatz 10) wurde die Fällung kontinuierlich durchgeführt, wobei der Vorratstank als kontinuierlich arbeitender Rührkesselreaktor benutzt wurde. Das geklärte Lysat und die Magnesiumsulfatlösung wurden dabei in den Vorratstank kontinuierlich durch ein Misch-T-Rohr eindosiert. Der Propan-2-ol-Gehalt des geklärten Lysats wurde auf 44 bis 45 Gew.-% eingestellt, um die Verdünnung durch die Magnesiumsulfatlösung auszugleichen und so einen Alkoholgehalt von 42±1% während der Fällung einzuhalten. Der Zufluß von geklärtem Lysat wurde mittels eines Durchflußreglers geregelt. Die 1,0molare Magnesiumsulfatlösung wurde mittels einer kleinen Membranpumpe in einer Menge von 0,05 Litern/Liter geklärtem Lysat zudosiert. Zunächst wurden beide Lösungen so lange ohne Entnahme in den Vorratstank eingespeist, bis sich darin ein Volumen angesammelt hatte, das bei den gegebenen Zuflußgeschwindigkeiten des geklärten Lysats und der Magnesiumsulfatlösung einer Verweilzeit von 15 Minuten entsprach. Dann wurde damit begonnen, aus dem Vorratstank das Gemisch mit der gleichen Geschwindigkeit abzuziehen und der Zentrifuge zuzuführen, mit der der Vorratstank gespeist wurde. Die Zufuhrgeschwindigkeit zur Zentrifuge wurde also, anders gesagt, so eingestellt, daß das Flüssigkeitsniveau im Vorratstank konstant blieb. Der Schale wurde alle 10 Minuten ein "Teilschuß" verpaßt, indem der Schalenbetriebswasserdruck vermindet wurde.

Nachdem die jeweiligen Ansätze vollständig zentrifugiert waren, wurde der Enzymrückstand von der Oberfläche der Zentrifuge mit destilliertem Wasser entfernt und jeweils mit dem stabilisierten Enzymkonzentratprodukt vereinigt. Die auf diese Weise gewonnenen stabilisierten Enzymkonzentrate wurden jeweils gerührt, bis sie homogen waren, in Flaschen abgefüllt und bei 4°C gelagert.

Die Tabellen IV und V geben eine Zusammenfassung der in den verschiedenen Verfahrensschritten jeweils erzielten Enzymausbeuten wieder. Tabelle V zeigt insbesondere eine vollständige Analyse der stabilisierten Enzymkonzentrate.

Tabelle IV

Analysenwerte zur Gewinnung von stabilisiertem Enzym

Tabelle V

Analysenwerte der stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrate

Beispiel 3

Analog Beispiel 1a) wurde ein weiterer großer Ansatz Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 715 hergestellt. Nach beendeter Fermentation wurde die Kulturbrühe im ca. 75 m³ fassenden Fermenter auf etwa 20°C abgekühlt und vor dem Konzentrieren der Zellfeststoffe eine kurze Zeit ohne Belüftung und Rühren ruhengelassen. Die fertige Kulturbrühe (60 565,6 Liter) besaß eine Isomeraseaktivität von 21,0 IGIU/g Kulturbrühe, eine maximale Zelltrockensubstanzkonzentration von 16,5 g/Ltr. und eine Gesamtaktivität von 1270,7×10⁶ IGIU.

Die die intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende ganze Kulturbrühe wurde dann durch Zentrifugieren in einer Zentrifuge bei einer Einspeisrate von etwa 18,93 Liter/ Minute mit einer Schalen-Schuß-Zeit von 1,75 Minuten konzentriert. Der Leichtphasenüberlauf wurde in regelmäßigen Abständen analysiert und dann verworfen. Die Schwerphasen-Zellpasten- Schüsse wurden in einem Aufnahmekanister gesammelt und dann kontinuierlich zu einem der drei Tanks gepumpt, in denen der Zellabbau durchgeführt wurde. Die Konzentrationsstufe führte zu einer etwa 6,4fachen Erhöhung der Zellfeststoffkonzentration (auf Volumenbasis). Es wurden insgesamt 9463,5 Liter Zellpaste mit einem Gewicht von 9393,4 kg und einem Gesamttrockensubstanzgehalt von 1102,6 kg gewonnen. Die Analyse der Zellpaste ergab einen Aschegehalt von 131,09 kg, einen Proteingehalt von 649,99 kg, einen Wassergehalt von 8290,76 kg, eine Isomeraseaktivität von 132 IGIU/g und eine Gesamtaktivität von 1240,0×10⁶ IGIU (98% der Theorie).

Wenn das in einem Abbautank vorgelegte Zellpastenvolumen 757 Liter erreicht hatte, wurden jeweils 757 bis 870,6 Liter 91,5%iger Propan-2-ol zugesetzt, bis der Abbautank voll war. Nach jedem Alkoholzusatz wurde der pH-Wert der dabei erhaltenen Aufschlämmung in dem betreffenden Abbautank geprüft und erforderlichenfalls mit wasserfreiem Mononatriumphosphat auf 7,0 bis 7,2 gesenkt. Nach dem Beginn der Alkoholzugabe in den jeweiligen Abbautanks wurde während des Restes der Auffüllperiode jeweils portionsweise Lysozym-Enzym (wie in Beispiel 1) in einer ungefähr 6,8 Einheiten/mg Zelltrockensubstanz entsprechenden Menge zugegeben. Wenn der Tank gefüllt war, wurde jeweils eine Endeinstellung der Alkoholkonzentration in der Aufschlämmung auf 42±1 Gew.-% vorgenommen. Das Lysat (Alkohol/Zellpaste/ Lysozym-Aufschlämmung) wurde ständig gerührt sowie durch außenliegende Wärmeaustauscher umgepumpt, um die Temperatur beim Sollwert zu halten. Der Mantel der Wärmeaustauscher wurde jeweils mit temperiertem Wasser gespeist, um die Temperatur des Lysats in einem Bereich von 28 bis 30°C zu halten. Der Grad der Enzymsolubilisierung wurde mittels Enzymvergleichsanalysen überwacht und verfolgt, wobei der analytisch ermittelte Enzymgehalt einer ganzen Lysatprobe und einer Vergleichsprobe, aus der die Zellfeststoffe durch Zentrifugieren abgetrennt worden waren, miteinander verglichen wurden. Wenn der Abbau in einem Abbautank so weit fortgeschritten war, daß die Solubilisierung in etwa 100% betrug, war die Lysat-Aufschlämmung jeweils für die Klärung zum Entfernen der Zelltrümmer bereit. Die hierfür erforderlichen Abbauzeiten lagen in einem Bereich von etwa 52 bis 73 Stunden, vom Beginn des Auffüllens an gerechnet. Die Gesamtmenge der Lysat-Aufschlämmungen aus den drei Abbautanks betrug 19 994,94 Liter und hatte ein Gesamtgewicht von 17 957,72 kg sowie einen Gesamttrockensubstanzgehalt von 1019,2 kg. Die Analyse der Lysat-Aufschlämmung ergab einen Aschegehalt von 187,78 kg, einen Proteingehalt von 649,09 kg, einen Propan-2-ol-Gehalt von 7221,2 kg und einen Wassergehalt von 9717,3 kg. Das Lysat hatte eine Isomeraseaktivität von 66,6 IGIU/ g und eine Gesamtaktivität von 1178,9×10⁶ IGIU, entsprechend 93% der Theorie, d. h., der ursprünglich in der als Ausgangsmaterial verwendeten Fermentationsbrühe enthaltenen Gesamtaktivität.

Die Lysat-Aufschlämmung wurde mit einem Anschwemmfilter, der mit Filterhilfe 5,72 bis 6,35 cm dick vorbeschichtet worden war, geklärt. Zur Klärung der Lysat-Aufschlämmung wurden insgesamt 272,16 kg Filterhilfe verwendet. Die Vorbeschichtungsaufschlämmung, deren Filterhilfegehalt 5% betrug, wurde mit 50%iger Propan-2-ol-Lösung angerührt. Um die Vorbeschichtungs-Ansetz-Lösung zu erhalten, ließ man den Vorbeschichtungsablauf in den Vorbeschichtungsabsetztank zurücktropfen bzw. -fließen, sobald die Vorbeschichtung aufgetragen war. Unmittelbar nach dem Austropfen des Vorbeschichtungsablaufes wurde die abgebaute Lysat-Aufschlämmung in den Filter gebracht. Die Filtrationsgeschwindigkeiten bei der Klärung schwankten zwischen 1,06 und 1,59 Liter/Stunde und dm² Filterfläche, wobei der durchschnittliche Durchsatz 1,18 Liter/ Stunde und dm² betrug. Nach dem Filtrieren wurde das geklärte Filtrat in ca. 3800 Liter fassende Lagertanks gepumpt. Die vom Filter abgenommenen Filterkuchen-Schnittstücke wurden in regelmäßigen Zeitabständen geprüft und verworfen. Das Lysat hatte ein Gesamtvolumen von 17 556,7 Litern, wog 16 200,5 kg und enthielt insgesamt 351,08 kg Trockensubstanz. Die Analyse des geklärten Lysats ergab einen Aschegehalt von 48,08 kg, einen Proteingehalt von 223,17 kg, einen Propan-2-ol-Gehalt von 7165,9 kg und einen Wassergehalt von 8673,59 kg. Die Isomeraseaktivität des geklärten Lysats betrug 54,0 IGIU/g und seine Gesamtaktivität 875,7×10⁶ IGIU, entsprechend 69% der Theorie, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität der Fermentationsbrühe.

Nach dem Klären wurde die Alkoholkonzentration in den einzelnen, das geklärte Lysat enthaltenden Lagertanks jeweils auf 44 bis 45 Gew.-% (bestimmt durch Dichtemessung) erhöht. Danach wurde die Ausfällung und Stabilisierung der in der geklärten Lysat- Lösung enthaltenen Glucoseisomerase durchgeführt, indem das geklärte Lysat und 439,1 Liter einer 2molaren wäßrigen Magnesiumsulfatheptahydrat- Lösung aus 105,23 kg MgSO₄ und 426,8 kg Wasser kontinuierlich durch ein Misch-T-Rohr in einen mit einer Zentrifuge verbundenen Versorgungstank eingespeist, wobei pro Liter geklärten Lysats 0,025 Liter 2,0molare Magnesiumsulfatlösung zugeführt wurden, um eine Endlösung mit einem Magnesiumsulfatgehalt von 0,05 Mol/Liter zu erhalten.

Dabei wurden zunächst nur die Magnesiumsulfat- und die geklärte Lysat-Lösung so lange in den Versorgungstank eingespeist, bis darin ein Volumen vorgelegt war, das bei den gegebenen Fließgeschwindigkeiten einer Verweilzeit von 15 Minuten entsprach. Wenn dieses Volumen erreicht war, wurde damit begonnen, kontinuierlich das im Versorgungstank enthaltene Gemisch abzuziehen und in eine Zentrifuge einzuspeisen, wobei die Entnahmegeschwindigkeit der Zuflußgeschwindigkeit zum Tank entsprach, d. h. so gewählt wurde, daß das Füllniveau im Versorgungstank und damit die Verweilzeit konstant blieb.

Der Überlauf aus der Zentrifuge wurde einem ca. 30 m³ fassenden Tank zugeführt und nachfolgend in einer Destillationsanlage zur Wiedergewinnung des darin enthaltenen Propan-2-ols aufgearbeitet, der wiederverwendet wurde. Das stabilisierte Enzymkonzentrat wurde in 75,7 Liter fassenden Eimern aus nichtrostendem Stahl gesammelt und dann in einem ca. 380 Liter fassenden Kessel vereinigt. Das stabilisierte Enzymkonzentrat wies eine schlammartige Konsistenz auf und war mittelbraun gefärbt. Zum stabilisierten Enzymkonzentrat wurde intermittierend destilliertes Wasser zugesetzt, um das Enzym in der erforderlichen Weise zu resolubilisieren (die Wiederauflösung wurde visuell bestimmt). Wenn das destillierte Wasser zugesetzt war und das stabilisierte Enzymkonzentrat sich löste, schlug die Farbe in ein verhältnismäßig klares Kaffeebraun bzw. -schwarz um, und das Produkt wies eine derjenigen eines leichten Öls gleichende Konsistenz auf.

Auf diese Weise wurden 276,3 Liter (287,57 kg) stabilisiertes Enzymkonzentrat in resolubilisierter Form gewonnen, deren Trockensubstanzgehalt 76,66 kg betrug. Die Analyse des stabilisierten Enzymkonzentrats ergab einen Aschegehalt von 8,6 kg, einen Proteingehalt von 57,15 kg, einen Propan-2-ol-Gehalt von 47,17 kg und einen Wassergehalt von 163,29 kg. Das stabilisierte Enzymkonzentrat besaß eine Isomeraseaktivität von 11 654 IGIU/g Trockensubstanz und eine Gesamtaktivität von 892,8×10⁶ IGIU, entsprechend einer Aktivitätsausbeute von 70,3% der Theorie, wobei der größte Teil des Aktivitätsverlustes (23 bis 24%) beim Klären des Lysats auftrat. Von diesem Teil des eingetretenen Aktivitätsverlustes ging rund die Hälfte (etwa 11,8%) mit den abgeschälten Filterkuchenstücken verloren. Der Rest der Verluste war auf Inaktivierung zurückzuführen.

Die nachfolgenden Tabellen VI und VII geben einen zusammenfassenden Überblick über die in den einzelnen Verfahrensschritten erzielten Enzymgewinnungsausbeuten. Die Tabelle VII gibt insbesondere eine vollständige Aufstellung aller wesentlichen Analysenkennwerte des stabilisierten Enzymkonzentrats wieder.

Tabelle VI

Analysenwerte zur Gewinnung von stabilisiertem Enzymkonzentrat (Ansatz 11)

Tabelle VII

Analysenwerte des stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrats

Beispiel 4

Mehrere Proben der nach den Beispielen 1 bis 3 erhaltenen stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrate und andere gleichartige Proben unterschiedlicher Aktivität wurden bezüglich ihrer Lagerungsstabilität bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Die Proben wurden bei 4, 18, 26 bzw. 37°C gelagert und nach 4, 8 und 12 Monaten jeweils hinsichtlich ihrer Glucoseisomeraseaktivität untersucht. Die nachfolgende Tabelle VIII gibt die Ergebnisse dieser Untersuchung wieder.

Tabelle VIII

Untersuchung der Temperaturstabilität von stabilisierten Enzymkonzentraten

Die in der Tabelle VIII angegebenen Werte lassen erkennen, daß die erfindungsgemäßen stabilisierten Enzymkonzentrate bei bis zu 12monatiger Lagerung bei 4 und bei 18°C mehr als 80±10 und im allgemeinen sogar mehr als 90±10% ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität, d. h. ihrer Isomeraseaktivität am Beginn des Stabilitätstestes bzw. der Lagerung, behalten sowie, daß sie, selbst wenn man sie bei 26°C lagert, immer noch bis zu 8 Monate lang etwa 80±10% ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität behalten können. Anders gesagt, verloren die stabilisierten Enzymkonzentrate im Durchschnitt weniger als 5% ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität, wenn sie 12 Monate bei 4°C gelagert wurden, durchschnittlich weniger als etwa 15% ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität, wenn sie 12 Monate bei 18 oder bei 26°C gelagert wurden.

Beispiel 5

64,35 Liter einer analog Beispiel 1a) hergestellten, intrazellulare Glucoseisomerase enthaltenden Kulturbrühe wurden zur Herstellung einer Zellpaste zunächst mit Wasser verdünnt und dann zentrifugiert (die Ausgangsmaterialcharge stammte aus zwei Fermenteransätzen von je 37,85 Litern, von denen die eine eine spezifische Isomeraseaktivität von 18,0 IGIU/ml und die andere eine spezifische Isomeraseaktivität von 16,8 IGIU/ml aufwies; die beiden Fermenteransätze wurden für die Verwendung als Ausgangsmaterial für die Herstellung der Zellpaste vereinigt). Der Zentrifugenkuchen bzw. die Zellpaste wurde in einen 7,5 Liter fassenden Fermenterkolben gegeben und mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4,5 Litern verdünnt. Die dabei erhaltene Aufschlämmung wurde 2 Tage bei einer Raumtemperatur von 4°C stehengelassen und dann 77 mg eines aus Eiweiß stammenden Lysozym-Enzympräparats mit etwa 8000 Lysozymeinheiten/mg und 1930 ml Propan- 2-ol versetzt. Die Aufschlämmung wurde 4 Stunden gerührt, worauf weitere 500 mg Lysozym-Enzympräparat zugesetzt wurden. Nachdem hierauf zunächst seine Temperatur auf 20 bis 30°C eingestellt worden war (die Temperatur war nach der zweiten Lysozymzugabe auf etwa 35 bis 40°C gestiegen, was vermutlich zu einer gewissen Enzymdesaktivierung führen dürfte), wurde die Aufschlämmung über Nacht gerührt. Nach dem Abbau wurde eine 500-ml-Probe des rohen Lysats mit 500 ml Wasser verdünnt. Proben von jeweils 123 ml des verdünnten Lysats wurden dann mit so viel Propan-2-ol versetzt, daß ihr Propan-2-ol-Gehalt etwa 50 Vol.-% (V/V) betrug. Eine Lysatprobe wurde für einen Blindversuch verwendet. Die Lysatproben wurden dann mit den in der nachstehenden Tabelle IX angegebenen Mengen Natriumchlorid (zum Vergleich) bzw. Magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO₄ · 7H₂O) versetzt. Nach der Salzzugabe wurden die Suspensionen, einschließlich der Blindprobe, zentrifugiert und auf ihre Glucoseisomeraseaktivität und ihren Proteingehalt, der anhand des Verhältnisses der optischen Dichte bei 260 und 280 nm unter Verwendung des Nomographen von E. Adams auf der Basis der von Warburg und Christian in Biochem. Z. 310, 384 (1942), angegebenen Extinktionskoeffizienten für Enolase und Nucleinsäuren bestimmt wurde, analysiert. Die weiteren Einzelheiten bezüglich der Durchführung und Ergebnisse dieser Versuche sind aus der nachstehenden Tabelle IX zu ersehen.

Tabelle IX

Die in Tabelle IX angegebenen Versuchsergebnisse zeigen, daß die Zugabe des Magnesiumsulfats zu dem alkoholisch-wäßrigen Lysat zu einer Abnahme der Isomeraseaktivität in der überstehenden Flüssigkeit führt, ohne den in der überstehenden Flüssigkeit vorhandenen Nucleinsäuregehalt (Nucleinsäuren absorbieren Licht einer Wellenlänge von 260 nm) wesentlich zu verringern. Dieser Effekt trat bei der Zugabe von Natriumchlorid nicht auf. Der Zusatz des Magnesiumsulfats zum alkoholisch-wäßrigen Lysat bewirkt somit eine Trennung der Glucoseisomerase von den löslichen Nucleinsäuren. Dieser Effekt war offensichtlich kein typischer "Aussalzeffekt", da die Magnesiumsulfatkonzentration hierfür zu niedrig war und mit Natriumchlorid eine derartige Trennung nicht erreicht wurde. Die unter Verwendung von Natriumchlorid durchgeführten Versuche ergaben nämlich keinerlei nennenswerte Abnahme der Isomeraseaktivität in der überstehenden Flüssigkeit.

Beispiel 6

Dem Rest des 4,5 Liter rohen, solubilisierte Glucoseisomerase enthaltenden Lysats von Beispiel 5 wurden Filterhilfe und so viel Propan-2-ol zugesetzt, daß die Aufschlämmung einen Propan-2-ol-Gehalt von 50 Vol.-% (V/V) besaß. Die Aufschlämmung wurde langsam filtriert, um die solubisierte Glucoseisomerase zu klären. Eine Probe von 335 ml dieses Filtrats mit einer analytisch bestimmten Isomeraseaktivität von 65,2 IGIU/ml, entsprechend einem Gesamtaktivitätsgehalt der Probe von 21 842 IGIU, wurde bei einem pH-Wert von 8 mit je 16,5 ml Propan-2-ol und 1molarer Magnesiumsulfatheptahydratlösung versetzt. Der Magnesiumsulfatgehalt des Gemisches betrug somit 1%, bezogen auf das ganze Gemisch, bzw. 2%, bezogen auf das darin enthaltene Wasser. Nach der Zugabe des Magnesiumsalzes bildete sich sofort ein öliger Niederschlag. Die den Niederschlag enthaltende Lösung wurde zentrifugiert und der Niederschlag dadurch abgetrennt. Der Niederschlag wurde mit Wasser in einer ein Volumen von insgesamt 10,5 ml ergebenden Menge wieder aufgelöst. Diese Probe wurde mit Wasser im Verhältnis (zu Probe) von 402 : 1 verdünnt, worauf die optische Dichte der verdünnten Lösung bei 260 und 280 nm bestimmt wurde, die 0,284 bzw. 0,350 betrug. Aus diesen Werten wurde der Proteingehalt der verdünnten Lösung zu 0,33 mg/ml ermittelt, entsprechend einem Proteingehalt der unverdünnten Probe (10,5 ml-Lösung) von 133 mg/ml. Die Bestimmung der Isomeraseaktivität der Lösung ergab einen Wert von 2040 IGIU/ml, so daß die Gesamtaktivität der Probe 21 400 IGIU betrug, entsprechend einer Ausbeute von 98%, bezogen auf die anfängliche Aktivität des geklärten Lysats. Das stabilisierte Glucoseisomerase- Enzymkonzentrat besaß eine spezifische Isomeraseaktivität von 15,3 IGIU/mg Protein. Diese Werte zeigen in Verbindung mit den in der Tabelle IX aufgeführten Ergebnissen, daß das Magnesiumsulfat die Isomerase selektiv ausfällt und reinigt.

Beispiel 7

Eine Probe (67 ml) resolubilisierten Alkoholfraktionats, die solubilisierte, zellfreie Glucoseisomerase enthielt, wurde mit 67 ml der Propan-2-ol-Lösung verrührt. Dabei konnte keine Niederschlagsbildung beobachtet werden. Hierauf wurden der geklärten, Isomerase enthaltenden Alkohol/Wasser-Lösung je 2 ml einer 1molaren Magnesiumsulfatheptahydrat-Lösung und der Propan-2-ol-Lösung zugesetzt, worauf sich sofort eine grau-weiße, feste Fällung bildete, die anschließend abgetrennt und in Wasser zu einem Volumen von 13,0 ml gelöst wurde. Das stabilisierte Enzymkonzentrat wurde erneut zentrifugiert und im Verhältnis 101 : 1 (Wasser : Enzymkonzentrat) mit Wasser verdünnt, um dann analysiert zu werden. Die Lichtdurchlässigkeit der verdünnten Lösung bei 260 nm betrug 0,288 und diejenige bei 280 nm Wellenlänge 0,437. Hieraus wurde der Proteingehalt der verdünnten Lösung zu 0,46 mg/ml ermittelt. Die das solubisierte, stabilisierte Enzymkonzentrat enthaltende unverdünnte Lösung, deren Isomeraseaktivität mit 482 IGIU/ml ermittelt wurde, besaß somit einen Proteingehalt von 46,5 mg/ml und eine spezifische Isomeraseaktivität von 10,4 IGIU/mg Protein. Die in den 13,0 ml stabilisierten Enzymkonzentrats vorhandene Gesamtaktivität betrug 6266 IGIU. Das Zentrifugat enthielt dagegen nur 150 IGIU.

Beispiel 8

Eine Probe von 3250 ml des geklärten, solubilisierte Glucoseisomerase enthaltenden Lysats der ursprünglich 4,5 Liter großen Charge von Beispiel 5 mit einer Isomeraseaktivität von 109 IGIU/ ml wurde mit je 162 ml der Propan-2-ol-Lösung und der 1molaren Magnesiumsulfatheptahydrat-Lösung versetzt. Dabei bildete sich sofort ein öliger Niederschlag, der durch Zentrifugieren abgetrennt und gewonnen wurde. Der Niederschlag hatte ein Volumen von 69 ml und wies, wie die Analyse ergab, eine Isomeraseaktivität von 4040 IGIU/ml, entsprechend einer Gesamtaktivität von 278 760 IGIU auf. Zur Durchführung der Proben bzw. Analysen wurde ein kleiner Teil des stabilisierten Enzymkonzentrats in einem Verhältnis von 1 : 1000 verdünnt. Die bei einer Wellenlänge von 260 bzw. 280 nm gemessene Lichtdurchlässigkeit betrug 0,315 bzw. 0,345. Daraus wurde der Proteingehalt zu 0,299 mg/ml und die spezifische Aktivität zu 13,5 IGIU/mg Protein bestimmt. Der Rest des stabilisierten Enzymkonzentrats wurde 48 Stunden lang stehengelassen, worauf sich drei Schichten gebildet hatten. Die dreischichtige Aufschlämmung wurde zentrifugiert und analysiert, wobei sich zeigte, daß die oberste, lipidhaltige Schicht (18,2 ml) eine Isomeraseaktivität von 565 IGIU/ml, die mittlere (39 ml) eine Isomeraseaktivität von 1970 IGIU/ml und die unterste Schicht (36 ml) eine Isomeraseaktivität von 50,80 IGIU/ml besaß. Die Bodenschicht bzw. unterste Schicht wies den niedrigsten Lichtdurchlässigkeitsmeßwert bei 260 nm und den höchsten Lichtdurchlässigkeitsmeßwert bei 280 nm auf. Die oberste Schicht wies den höchsten Lichtdurchlässigkeitsmeßwert bei 260 nm auf.

Beispiel 9

104,096 Liter analog Beispiel 1a) hergestellter, intrazellulare Glucoseisomerase enthaltender Kulturbrühe mit einer Isomeraseaktivität von 17,5 IGIU/ml wurden mit der gleichen Volumenmenge Wasser vermischt und dann zu einem festen Kuchen zentrifugiert. Der Kuchen wurde bei pH 7,45 mit so viel Wasser vermischt, daß das sich ergebende Volumen 26 Liter betrug. Diese Aufschlämmung wurde mit 0,250 g Lysozym und 11,5 Liter Propan-2-ol bei einer Temperatur von 27°C vermischt. Außerdem wurde eine kleine Menge eines Antischaummittels zugesetzt und die Aufschlämmung dann gerührt. Die wäßrige Suspension (37,5 Liter) enthielt 37 bis 44 IGIU/ml. Nach 20,5 Stunden wurden zwei Proben von je 8 Litern entnommen, worauf Propan-2-ol in einer Menge zugesetzt wurde, die einen Alkoholgehalt von 50 Vol.-% (V/V) ergab. Dann wurden die Aufschlämmungen zunächst mit Filterhilfe in einer Menge von 3 g/g Zellen versetzt und dann filtriert sowie anschließend mit 2 Litern 50%iger Propan-2-ol-Lösung gewaschen. Die Analyse des Filtrats ergab eine Isomeraseaktivität von 15 IGIU/ml. In die restlichen 21,5 Liter des rohen Lysats wurde ein weiteres Gramm Lysozym eingerührt, wodurch man eine Isomeraseaktivität von 24,3 IGIU/ml im Filtrat erhielt. Das im Filtrat enthaltene Enzym wurde durch Zugabe von je 1,1 Liter Propan-2-ol-Lösung und 1molarer Magnesiumsulfatlösung sofort ausgefällt. Die das stabilisierte Enzymkonzentrat enthaltende Fällung wurde abzentrifugiert und in einer kleinen Menge Wasser zu einem Volumen von 200 ml gelöst. Die dabei erhaltene Lösung besaß eine Isomeraseaktivität von 3450 IGIU/ml, entsprechend einer Gesamtaktivität von 690 000 IGIU und eine spezifische Aktivität von etwa 12,5 IGIU/mg Protein.

Zwei Proben des so erhaltenen stabilisierten Enzymkonzentrats (200 ml), von denen eine mit Propanol als Konservierungsmittel versetzt wurde, die andere dagegen nicht, wurden einem Lagerungsstabilitätstest bei Raumtemperatur (etwa 26°C) unterworfen. Am Beginn des Lagerungsstabilitätstestes wiesen beide Proben eine Isomeraseaktivität von 3300 IGIU/ml auf. Die Proben wurden in regelmäßigen Zeitabständen geprüft. Nach 31tägiger Lagerung wies die Probe mit dem Konservierungsmittelzusatz eine Isomeraseaktivität von 3165 IGIU/ml und die andere Probe (ohne Konservierungsmittel) eine Isomeraseaktivität von 3140 IGIU/ml auf. Dieses Versuchsergebnis zeigt, daß die stabilisierten Enzymkonzentrate der Erfindung (mit oder ohne Konservierungsmittel) ziemlich lagerungsstabil sind und, wenn sie bei Raumtemperatur über 30 Tage lang gelagert werden, bis zu 95% oder mehr ihrer Anfangsaktivität behalten können.

Beispiel 10 (Vergleichsversuche)

Der Zweck der in diesem Beispiel beschriebenen Versuche ist es, die Wirksamkeit und Effektivität verschiedener erfindungsgemäß zu verwendender wasserlöslicher Magnesiumsalze im Vergleich zur Verwendung anderer für ihre Fähigkeit, Proteine auszufällen bekannter Salze, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und Natriumchlorid, aufzuzeigen. In den Vergleich wurden auch andere Salze zweiwertiger Metalle einbezogen.

Eine große Probe des Lysats (Alkohol/Wasser/Glucoseisomerase- Lösung) von Ansatz 6 (vgl. Beispiel 2 und Tabelle IV) wurde in einer Laborzentrifuge mit 18 000 UpM vor ihrer Verwendung 10 Minuten zentrifugiert. Der Alkoholgehalt wurde zu 41,6 Gew.-% bzw. 49,3 Vol.-% (V/V) bestimmt. Jeder der jeweils aus 30 ml geklärtem Lysat (bei Raumtemperatur) bestehenden Proben wurde eine 1molare Lösung eines der in der nachfolgenden Tabelle X aufgeführten Salze in der weiter unten angegebenen Menge sowie die gleichhohe Volumenmenge an Propan-2-ol zugesetzt. Nach dem Zusatz von Salz und Alkohol wurden die Proben durchgemischt und dann jeweils 10 Minuten bei 18 000 UpM zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde jeweils entfernt und der Niederschlag aus den Zentrifugengläsern ausgewaschen und auf ein Gesamtvolumen von 25 ml mit einem Kobaltphosphatpuffer (10^-3 m Co⁺⁺; pH 7,5; 0,05 mPO₄) verdünnt, worauf die Glucoseisomeraseaktivität und der Proteingehalt bestimmt wurden. Die Wirkung der Verwendung verschiedener Salze und Konzentrationen bezüglich der Selektivität der Fällung und der Reinigung der solubilisierten Glucoseisomerase ist aus der nachfolgenden Tabelle X zu ersehen.

Tabelle X

Einfluß der Anwendung verschiedener Salze und Salzkonzentrationen auf die Enzymfällung

Die in Tabelle X wiedergegebenen Versuchsergebnisse zeigen, daß Natrium- und Ammoniumsulfat Glucoseisomerase nicht so wirksam und in so niederen Konzentrationen auszufällen vermögen, wie die Magnesiumsalze. Ammoniumsulfat fällte überhaupt kein Enzym, und Natriumsulfat ergab nur eine Ausbeute von 19%. Abgesehen davon, daß diese Ausbeute sehr gering ist, war sie nicht notwendigerweise auf eine Fällung zurückzuführen, sondern könnte auch einer Phasentrennung in eine Alkohol/Wasser- und eine Salzwasserphase zuzuschreiben sein. Das Protein ist in der Salzwasserphase besser löslich als in der Alkohol/Wasser-Phase. Die Salzwasserphase extrahiert somit (nicht spezifisch) Protein aus der Alkohol/Wasser-Phase. Da die Salzwasserphase eine höhere Dichte besitzt, wird sie als Produkt gewonnen. Auch das als weiteres Salz eines einwertigen Metalls in die Untersuchung einbezogene Natriumchlorid fällte die Glucoseisomerase nicht aus.

Die geprüften Salze anderer zweiwertiger Metalle als Magnesium fällten die Glucoseisomerase zwar ebenfalls aus, jedoch waren bei ihrer Verwendung die Ausbeuten und Reinheiten nicht so hoch wie bei der Verwendung der erfindungsgemäß einzusetzenden Magnesiumsalze. Die Barium- und Strontiumsalze erwiesen sich von den geprüften Nicht-Magnesiumsalzen als noch am besten geeignet bzw. leistungsfähigsten, jedoch sind diese Salze im Hinblick auf eine Verwendung für Lebensmittel unerwünscht.

Von den geprüften Salzen fällten nur die Magnesiumsalze das Enzym wirksam mit hoher spezifischer Aktivität aus. Die angewandte Magnesiumsalzkonzentration beträgt nur einen Bruchteil derjenigen, die erforderlich ist, um Proteine aus einer wäßrigen Lösung nach klassischen "Aussalztechniken", d. h. unter Verwendung von Ammonium- und Natriumsulfat, auszufällen. Tatsächlich steht dieses Phänomen im Gegensatz zu den einschlägigen Angaben in der Literatur (vgl. zum Beispiel Advances in Protein Chemistry, Band XI, Seiten 416 bis 418 [1956], und Advances in Protein Chemistry, Band 16, Seite 216 [1961] ). Insbesondere die letztgenannte Literaturstelle behauptet, daß Magnesiumsulfat beim Aussalzen von Proteinen weniger effektiv als Natrium- oder Ammoniumsulfat sei.

Aus den in der Tabelle X angegebenen Werten ist auch klar zu ersehen, daß beim Erhöhen der Magnesiumsulfatlösungskonzentration (über 0,08molar) die spezifische Aktivität abnimmt, was darauf hinweist, daß dann eine weniger selektive Fällung stattfindet, d. h. mehr anderes Protein zusammen mit der Glucoseisomerase ausgefällt wird. Es wurde beobachtet, daß mit dem Magnesiumsulfat Phasentrennung stattfand. Die Abnahme der spezifischen Aktivität entspricht der anscheinend erhöhten Löslichkeit von Protein in der Salzwasser-Phase. Bei der Verwendung von Magnesiumchlorid und -acetat trat keine Phasentrennung auf, und die spezifischen Aktivitäten blieben mit steigender Magnesiumsalzkonzentration konstant, soweit sie nicht, wie bei Magnesiumchlorid, sogar zunahmen.

Beispiel 11 Immobilisierung löslicher Glucoseisomerase

Dieses Beispiel zeigt, daß die hochgereinigten und stabilisierten erfindungsgemäßen Enzymkonzentrate eine immobilisierte Glucoseisomerase mit höherer Bindungskapazität liefern können als auf übliche Weise solubilisierte Glucoseisomerase. Aus gemäß Beispiel 1a) hergestellten, intrazellulare Glucoseisomerase enthaltenden ganzen Zellen wurde solubilisierte Glucoseisomerase hergestellt. Um die Gewinnung der ganzen Zellen zu unterstützten, wurden der Kulturbrühe Filterhilfe (Sil-Flo) und Magnesiumhydroxyd zugesetzt und das Gemisch dann mit Propan-2-ol gewaschen, getrocknet und in einer Wiley-Mühle gemahlen. Während der Extraktion der Glucoseisomerase aus den Zellen wurde das die Zellen enthaltende Gemisch mit so viel Magnesiumsulfatheptahydrat behandelt, daß die Aufschlämmung 0,01 Mol Magnesiumsalz/Liter enthielt und mit 0,1 m Kalilauge auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Das rohe Glucoseisomerase-Enzym wurde aus einer 6,5-g-Probe (wie Material vorlag) trockenem Zellpräparat mit 50 ml Extraktionsmittel extrahiert. Das Gemisch wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann bei 4°C zentrifugiert. Dabei wurden 42 ml eines Extraktes mit einer Isomeraseaktivität von 26 bis 27 IGIU/ml erhalten. Die so hergestellte Glucoseisomerase-Enzymlösung und das erfindungsgemäße stabilisierte Enzymkonzentrat [hergestellt nach Beispiel 1b) ] wurden nach folgenden Verfahren an eine Vielzahl verschiedener wasserunlöslicher Träger sorbiert:

In einem 150 ml fassenden Becherglas wurden jeweils 2 g (Trockensubstanz) des wasserunlöslichen Trägers mit 30 ml einer mit KOH auf pH 8,0 eingestellten 0,01molaren Magnesiumsulfatheptahydratlösung vermischt. Diesem Gemisch wurde so viel Isomeraseflüssigkeit (entweder die auf herkömmliche Weise solubilisierte Isomerase oder das erfindungsgemäße Enzymkonzentrat) zugesetzt, daß der Träger (je nach seiner Kapazität) mit 1000 bis 2000 IGIU in Kontakt gebracht wurde. Danach wurde durch Zugabe weiterer 0,01molarer Magnesiumsulfatheptahydratlösung das Flüssigkeitsvolumen auf 50 ml ergänzt. Das das Enzym und den wasserunlöslichen Träger enthaltende Gemisch wurde dann zunächst 30 Minuten durch Rühren gründlich durchgemischt und darauf filtriert und mit der 0,01molaren Magnesiumsulfatheptahydratlösung gewaschen. Die Filtrate und Waschflüssigkeiten wurden dann vereinigt und in einen 250-ml- Meßkolben überführt, wo sie durch Auffüllen bis zur Eichmarke mit 0,01molarer Magnesiumsulfatheptahydratlösung verdünnt und danach im Vergleich zum ursprünglichen löslichen Isomerase Enzympräparat mit Hilfe eines automatischen Analysengerätes (Technician Auto Analyzer) auf ihre Isomeraseaktivität untersucht wurden.

Die "Bindungskapazität" ("BC") der jeweiligen wasserunlöslichen Träger wurde durch Differenzrechnung nach folgender Formel berechnet:

In der Tabelle XI sind die Ergebnisse dieser Versuchsreihe zusammengefaßt, in der die Bindungskapazitäten verschiedener Träger für auf normale bzw. bekannte Weise solubilisierte Glucoseisomerase einerseits und das stabilisierte Enzymkonzentrat der Erfindung andererseits miteinander verglichen werden.

Tabelle XI

Bindungskapazität verschiedener Träger bei Verwendung solubilisierter Glucoseisomerase

Die in der Tabelle XI angegebenen Werte zeigen, daß die Bindungskapazität von DEAE-Cellulose für das erfindungsgemäße stabilisierte Enzymkonzentrat nahezu zweimal so hoch wie die für in herkömmlicher Weise solubilisiertes Enzym ist sowie, daß auch die synthetischen Anionenaustauscherharze für die erfindungsgemäßen Enzymkonzentrate eine zwei- bis dreimal so hohe Bindungskapazität aufweisen, wie für das zum Vergleich untersuchte, in herkömmlicher Weise solubilisierte Enzym. Im Verlauf dieser Versuche wurde außerdem gefunden bzw. festgestellt, daß die Bindungskapazität von DEAE-Cellulose für das erfindungsgemäße stabilisierte Enzymkonzentrat beträchtlich gesteigert wird, wenn man den Träger bei einem niedrigeren pH-Wert vorkonditioniert. Beispielsweise bindet der Träger bei einem pH-Wert von 6,5 3120 IGIU/g, während der unbehandelte Träger nur 1634 IGIU/g zu binden vermag. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen stabilisierten Enzymkonzentrats war es möglich, an DEAE-Cellulose (Type 20) pro dm³ 0,386 Mill. ("MM") IGIU zu binden. Der so erhaltene Biokatalysator konnte dann zur Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltigen Maissirup durch kontinuierliches Durchleiten einer Glucoselösung durch den Biokatalysator, der in Kolonnen bzw. Säulen oder in Druck- Blattfilter-Elementen angeordnet werden konnte, verwendet werden.

Aus Tabelle XI ist auch zu ersehen, daß die höchste unter Verwendung auf herkömmliche Weise solubilisierter Glucoseisomerase erreichte Bindungskapazität 936 IGIU/g betrug und bei Selectacel Type 40 erreicht wurde, das eine Austauschkapazität von 0,89 mäq./g besaß. Obwohl Selectacel Type 20, das eine Austauscherkapazität von 0,87 mäq./g hatte, eine etwas niedrigere Bindungskapazität als die Type 40 aufwies, ist es für den Einsatz in der industriellen Praxis besser geeignet, weil es eine größere Teilchengröße besitzt und daher bessere Fließgeschwindigkeiten zu erzielen sind.

Beispiel 12

Bei den nachfolgenden Versuchen wurde das erfindungsgemäße stabilisierte Enzymkonzentrat an einer Anzahl verschiedener wasserunlöslicher Träger immobilisiert und dann jeweils bezüglich seiner Verwendbarkeit bei der kontinuierlichen enzymatischen Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltigen Maissirup erprobt. Zum Vergleich wurden auch kontinuierliche Umwandlungen unter Verwendung immobilisierter ganzer Zellen durchgeführt. Für die Umwandlungen wurde außer in den Fällen, in denen in der Tabelle XII etwas angegeben ist, jeweils eine Kolonne bzw. Säule mit den Abmessungen 1,5×8 cm verwendet.

Die Kolonnen wurden vorbereitet, indem zunächst am unteren Ende ein Glaswollpfropfen eingesetzt und die Kolonne dann teilweise mit Wasser gefüllt wurde. Bei der Verwendung wasserunlöslicher Träger wurden diese dann in die Kolonnen gefüllt und mit einem Glaswollpfropfen abgedeckt. Dann wurde das erfindungsgemäße stabilisierte Enzymkonzentrat [Beispiel 1b), Ansatz 1] langsam durch die Kolonne geführt, worauf mit einer kleinen Menge destillierten Wassers nachgewaschen wurde. Die Wasch- und anderen Kolonnenabläufe wurden vereinigt und auf ihre Glucoseisomeraseaktivität untersucht. Die in der Kolonne sorbierte Enzymmenge wurde durch Differenzrechnung ermittelt.

Bei der Verwendung immobilisierter ganzer Zellen [das Sil-Flo- Filterhilfe enthaltende Produkt von Beispiel 1a) ] wurden 5 g des Enzympräparats mit oder ohne Zusatz von 100 mg Magnesiumhydroxyd in die Kolonnen gefüllt, worauf ebenfalls Glaswollpfropfen aufgesetzt wurden.

Zur Durchführung der kontinuierlichen Umwandlung wurden die Kolonnen jeweils kontinuierlich mit einer durch Auflösen kristalliner Dextrose erhaltenen, 50gew.-%igen, d. h. 600 g Glucose/ Liter Lösung enthaltenden Glucoselösung, beschickt, die pro Liter 0,004 bis 0,0055 Mol Magnesiumsulfat enthielt und einen pH-Wert von 8,4 bis 8,6 besaß. Die Kolonnen wurden erforderlichenfalls ins Gleichgewicht gebracht und die kontinuierliche enzymatische Isomerisation bei 60°C durchgeführt, indem durch den Mantel der Kolonnen jeweils 60°C warmes Wasser gepumpt wurde. Der Durchfluß der den Kolonnen zugeführten Lösung durch die Kolonnen wurde durch Anlegen eines Vakuums am Kolonnenboden und durch Aufpressen von Stickstoffgas auf die Beschickung aufrechterhalten. Die Durchflußgeschwindigkeit wurde durch Variieren des auf der Beschickung lastenden Gasdrucks reguliert. Die anscheinende Enzymaktivität "KE" wurde nach der Beziehung

bestimmt bzw. errechnet, in der

BVHdie Säulenfließgeschwindigkeit in Bettvolumina/h, % Leden Dextrose/Fructose-Gleichgewichtswert, der bei 60°C 51,2 beträgt, und % Lden Ketosegehalt des Kolonnenablaufs

bedeuten.

Die Säulenfließgeschwindigkeit in Bettvolumina pro Stunde bei einem Lävulosegehalt von 45%, abgekürzt "BVH₄₅" ist somit gleich KE/0,916.

Die Halbwertszeit, d. h. diejenige Zeit, die erforderlich ist, bis die Hälfte der "anscheinenden Aktivität" der Kolonne verlorengegangen ist, wurde bestimmt, indem während einer 2 Wochen oder länger dauernden Kolonnenbetriebsperiode Proben gezogen und an ihnen die "KE" gemessen wurde. Die dabei erhaltenen Analysenwerte wurden graphisch ausgewertet, indem in einem Diagramm lnKE gegen die Zeit aufgetragen und aus der Steigung der dabei erhaltenen Kurve, die nach der Methode der kleinsten Felderquadrate bestimmt wurde, die Halbwertszeit erhalten. Bei dieser Methode wird unterstellt, daß der Abfall der Enzymaktivität wie eine Reaktion erster Ordnung verläuft. Die anfängliche bzw. ursprüngliche Säulenfließgeschwindigkeit in Bettvolumina/h bei einem Lävulosegehalt von 45%, BVH₄₅, wurde aus dem Schnittpunkt der Regressionsgeraden bestimmt.

Die Effizienz, "Eff", wurde nach der Beziehung

Eff = BVH₄₅ / MM IGIU / dm³

bestimmt.

Die bei diesen kontinuierlichen Umwandlungen erzielten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle XII wiedergegeben.

Tabelle XII

Ergebnisse der kontinuierlichen Umwandlung unter Verwendung verschiedener immobilisierter Glucoseisomerase-Enzympräparate

Die in der Tabelle XII angegebenen Daten zeigen, daß das stabilisierte Enzymkonzentrat der Erfindung effizient an einer Vielzahl wasserunlöslicher Träger sorbiert und zur kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in hoch-fructosehaltige Maissirupe verwendet werden kann. Die beste Enzymausnutzung wurde beim Sorbieren bzw. Immobilisieren des stabilisierten Enzymkonzentrats an dem Aluminiumoxydträger mit geregelter Porosität erzielt. Die dabei erreichte hohe Enzymausnutzung ist das Ergebnis der dadurch erzielten hohen Effizienz und langen Halbwertszeit. Das basische Magnesiumcarbonat und die synthetischen Anionenaustauscherharzträger (Amberlite® IRA-904) lieferten in Kombination mit dem erfindungsgemäßen stabilisierten Enzymkonzentrat bei der kontinuierlichen Umwandlung ebenfalls gute Ergebnisse.

Die vorstehend in bezug auf den Aluminiumoxydträger mit geregelter Porosität beschriebene Arbeitsweise wurde unter Verwendung des stabilisierten Enzymkonzentrats von Beispiel 3 wiederholt. In der Tabelle XIII sind die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt.

Tabelle XIII

Effekt der Enzymbeladung bei kontinuierlicher Umwandlung¹)

Das stabilisierte Enzymkonzentrat der Erfindung läßt sich effizient an dem Aluminiumoxydträger mit geregelter Porosität unter Bildung eines Biokatalysators sorbieren, der zur kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltige Maissirupe gut geeignet ist. Die hohe Bindungseffizienz und die lange Halbwertszeit dieses Biokatalysators ermöglichen seinen wirtschaftlichen Einsatz in großtechnischen Verfahren.

Beispiel 13

Wenn auch in den vorhergehenden Beispielen nur die Verwendung von Propan-2-ol als wassermischbares organisches Lösungsmittel bei der Herstellung der stabilisierten Enzymkonzentrate erläutert ist, so können erfindungsgemäß, wie bereits erwähnt, jedoch auch noch andere wassermischbare organische Lösungsmittel verwendet werden. Der nachfolgende Versuch wurde durchgeführt, um die Verwendbarkeit anderer wassermischbarer organischer Lösungsmittel als Propan-2-ol aufzuzeigen.

Gemäß Beispiel 1a) wurde eine intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Kulturbrühe mit einer Isomeraseaktivität von 18,1 IGIU/g Kulturbrühe hergestellt. Diese Kulturbrühe wurde filtriert, wobei eine Zellpaste mit einer Isomeraseaktivität von 120 IGIU/g erhalten wurde. Die Zellpaste wurde mit einem Lysozym-Enzympräparat behandelt, um die Zellwände der intrazellularen Glucoseisomerase abzubauen. Die löslichen Bestandteile des so erhaltenen Lysats besaßen eine Isomeraseaktivität von 123 IGIU/g. Das Lysat wurde mit so viel Wasser verdünnt, daß seine Isomeraseaktivität nach dem Verdünnen 110 IGIU/ml betrug. Proben von jeweils 50 ml dieses Lysats wurden jeweils allmählich mit einem der nachstehend angegebenen wassermischbaren organischen Lösungsmittel versetzt. Dabei wurde jeweils so lange Lösungsmittel zugesetzt, bis das Isomeraseprotein gerade auszufallen begann. Das Lösungsmittel/Lysat-Gemisch wurde dann jeweils 5 bis 10 Minuten gerührt, worauf das unlösliche Material, einschließlich der Zelltrümmer und Nucleinsäuren durch Zentrifugieren abgetrennt wurde. Proben von jeweils 20 ml der dabei gewonnenen überstehenden Flüssigkeiten wurden dann unter Rühren mit 1 ml einer 1molaren Magnesiumsulfatheptahydratlösung (5 Vol.-%) und so viel Lösungsmittel versetzt, wie erforderlich war, um die durch die zugesetzte Magnesiumsulfatlösung bedingte Verdünnung der Probe in bezug auf den Lösungsmittelgehalt auszugleichen. Die die zellfreie Glucoseisomerase, das wassermischbare organische Lösungsmittel und Magnesiumsulfatheptahydrat enthaltenden wäßrigen Gemische wurden dann jeweils etwa 15 Minuten stehengelassen, wobei sie zwischendurch gelegentlich gerührt wurden. Dann wurden die Gemische zentrifugiert, wobei die ausgefällten stabilisierten Enzymkonzentrate als Produkt gewonnen wurden. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle XIV wiedergegeben.

Tabelle XIV

Aus den vorstehenden Versuchsergebniss 01775 00070 552 001000280000000200012000285910166400040 0002002712007 00004 01656en bzw. -werten ist zu ersehen, daß eine Reihe verschiedener wassermischbarer organischer Lösungsmittel wirksam für die Zwecke der Erfindung verwendet werden kann. Die Alkohole und Ketone mit bis zu 3 C-Atomen erwiesen sich als die bezüglich der selektiven Gewinnung des Isomeraseenzyms wirksamsten Lösungsmittel. Ihre Verwendung stellt daher eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung dar. Aus den vorstehend angegebenen Werten ist weiterhin zu ersehen, daß um so mehr Lösungsmittel erforderlich ist, um die Isomerase wirksam bzw. in hoher Ausbeute und selektiv zu gewinnen, je niedriger das Molekulargewicht des betreffenden Lösungsmittels ist. Beispielsweise benötigt man zur selektiven Abtrennung bzw. Gewinnung pro Volumen Lysat bei der Verwendung von Methanol 2,4 Volumina (etwa 67 Gew.-%), bei der Verwendung von Propan-2-ol dagegen nur 1 Volumen (42 Gew.-%).

Es sei darauf hingewiesen, daß der Fachmann die in den vorstehenden Beispielen erläuterte Erfindung ohne weiteres in vielerlei Hinsicht abwandeln und modifizieren kann, ohne den Rahmen des in der Beschreibung offenbarten und in den Ansprüchen gekennzeichneten Erfindungsgedankens zu verlassen.

Es sei abschließend darauf hingewiesen, daß ein wichtiges Definitionskriterium der erfindungsgemäßen stabilisierten Glucoseisomeraseenzymkonzentrate neben dem Proteingehalt, dem Magnesiumgehalt, dem Verhältnis dieser beiden Größen und der spezifischen Isomeraseaktivität eben die Stabilität ist, die so groß ist, daß das Präparat bei bis zu 30tägiger Lagerung bei 26°C 95% seiner ursprünglichen Stabilität beibehält.

Claims (19)

1. Stabilisiertes Glucoseisomerase-Enzymkonzentrat, das

• 1) zellfreie Glucoseisomerase, die im wesentlichen nucleinsäurefrei ist, und
• 2) Mg⁺⁺

enthält, gekennzeichnet durch

• a) einen Proteingehalt von 50 bis 80 Gew.-%, bezogen auf Trockensubstanz,
• b) einen Mg⁺⁺-Gehalt von 3 bis 45 mg/ml Enzymkonzentrat,
• c) ein Mg⁺⁺/Protein-Verhältnis von 0,02 bis 0,75,
• d) eine spezifische Isomeraseaktivität von mindestens 10 IGIU/mg Protein und
• e) eine solche Stabilität, daß es bei 30tägiger Lagerung bei 26°C 95% seiner anfänglichen Isomeraseaktivität behält.

2. Enzymkonzentrat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Proteingehalt von 60 bis 75 Gew.-%, bezogen auf Trockensubstanz.

3. Enzymkonzentrat nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch ein Mg⁺⁺/Protein-Verhältnis von 0,03 bis 0,5 und einen Mg⁺⁺-Gehalt von 5 bis 25 mg/ml Enzymkonzentrat.

4. Enzymkonzentrat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich 5 bis 25 Gew.-% Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p- Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol, enthält.

5. Enzymkonzentrat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch einen Wassergehalt von 50 bis 80 und einen Trockensubstanzgehalt von 5 bis 30 Gew.-%.

6. Enzymkonzentrat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch eine Aktivität von mindestens 5000, vorzugsweise mindestens 8000 IGIU/g Trockensubstanz.

7. Enzymkonzentrat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es eine so hohe Stabilität besitzt, daß es bei einjähriger Lagerung bei 18°C mindestens 80±10% seiner Anfangs-Isomeraseaktivität behält und eine spezifische Isomeraseaktivität von mindestens 12 IGIU/mg Protein aufweist.

8. Enzymkonzentrat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die darin enthaltene Glucoseisomerase von den Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 713, ATCC 21 714 und/oder ATCC 21 715 stammt.

9. Enzymkonzentrat nach einem der Ansprüche 3, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß es 20 bis 30 Gew.-% Propan-2- ol und 55 bis 70 Gew.-% Wasser enthält und sein Mg⁺⁺- Gehalt aus Magnesiumacetat, -chlorid und/oder -sulfat stammt.

10. Verfahren zur Herstellung des stabilisierten Glucoseisomerase- Enzymkonzentrats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) durch Behandeln eines zellfreie Glucoseisomerase und Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2- ol, enthaltenden, wäßrigen Gemisches mit einem im wesentlichen wasserlöslichen Magnesiumsalz in einer Menge, die eine Magnesiummolarität von 0,002 bis 0,3 (Mol Magnesiumsalz/ Liter Gemisch) im Gemisch ergibt, eine Enzym- Magnesium-Fällung erzeugt und
• b) das stabilisierte, konzentrierte Glucoseisomerase, Magnesium in einer Mg⁺⁺-Molarität von 0,1 bis 2 entsprechenden Menge, Wasser und Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol, umfassende Enzymkonzentrat gewinnt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als im wesentlichen wasserlösliches Magnesiumsalz Magnesiumacetat, -chlorid und/oder -sulfat einsetzt.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol, in der Verfahrensstufe a) in einer einem Gehalt von 30 bis 60 Gew.-%, bezogen auf das Gemisch, entsprechenden Menge einsetzt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das zellfreie Glucoseisomerase und Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol enthaltende wäßrige Gemisch hergestellt wird, indem man

• a) intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Zellen in Anwesenheit von Wasser mit Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol, und einem Lysozym-Enzympräparat behandelt,
• b) das Lysozym-Enzym auf das Zellmaterial einwirken läßt,
• c) die unlöslichen Substanzen abtrennt und
• d) dabei ein wäßriges, zellfreie Glucoseisomerase und Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan- 2-ol enthaltendes Gemisch gewinnt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man dem die Zellen enthaltenden wäßrigen Gemisch so viel Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p- Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol zumischt, daß der Lösungsmittelgehalt der erhaltenen wäßrigen Mischung 40 bis 45 Gew.-% beträgt.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils so viel Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol zusetzt, wie erforderlich ist, um in den Verfahrensstufen a), b) und c) einen Lösungsmittelgehalt von 42±1 Gew.-% aufrechtzuerhalten.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß Glucoseisomerase eingesetzt wird, die von Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 713, ATCC 21 714 und/oder ATCC 21 715 stammt und gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 15 aus den Zellen abgetrennt und gewonnen wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das die zellfreie Glucoseisomerase und Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2- ol, enthaltende wäßrige Gemisch mit Magnesiumsulfatheptahydrat in einer Menge behandelt wird, die einer Konzentration von 0,05 Mol dieses Salzes pro Liter entspricht.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man das in der Verfahrensstufe b) gewonnene stabilisierte Enzymkonzentrat mit einer kleinen Menge Wasser verdünnt.