DE2711270A1 - Organische materialien mit spezifisch reaktiven gruppen - Google Patents
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Description
Dipl.-Chem. Bühling Dipl.-Ing. Kinne ' 3- Dipl.-lng. Grupe
2711270 Bavariarlng 4, Postfach 20 24
8000 München 2 Tel.: (0 89) 53 96 53-56 m Telex: 5 24 845 tipat
cable. Germaniapatent München
15. März 1977
B 8031 ICI case Q.28623
IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES LIMITED London, Großbritannien
Organische Materialien mit spezifisch reaktiven
Gruppen
Die Erfindung bezieht sich auf organische Materialien und die Herstellung und Anwendung derselben sowie
auf Vorrichtungen, die solche Materialien umfassen.
In der DT-OS 25 41 308, Al, wird eine Membran mit
einem hydrophoben Polymersubstrat beschrieben, das anhängend bzw. anhaftend (im wesentlichen) Kohlenwasserstoff
ketten aufweist, die mit einer chemischen Verbindung, insbesondere einem Polypeptid,spezifisch reaktive
Gruppen aufweisen. In der obigen DT-OS wird insbesondere die Präparation einer solchen Membran durch Kontakt einer
Membran mit anhängenden Kohlenwasserstoffketten mit einer Verbindung mit geeigneten reaktiven Zentren beschrieben,
welche ihr gestatten, den Kohlenwasserstoff mit der spezifisch reaktiven Gruppe zu verknüpfen. Als
besonderes Beispiel wird die Verwendung eines nicht-ioni-
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ν
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sehen Materials wie Epichlorhydrin oder eines Bis-epoxids
als verknüpfende Verbindung beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun eine Abwandlung dieses Konzepts, indem statt einer nicht-ionischen
Verbindung ein ionisches Material zur Verknüpfung der spezifisch reaktiven Gruppe mit der Kohlenwasserstoffkette
verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß ein spezifisch reaktives Material mit einem hydrophoben organischen
Polymermaterial mit daran anhängenden (im wesentlichen) Kohlenwasserstoffketten, die mit einer chemischen
Verbindung spezifisch reaktive Gruppen tragen, welche den Kohlenwasserstoffketten über ionische Gruppierungen
angefügt sind.
Bei einem bevorzugten Material gemäß der Erfindung ist das Bindeglied oder die Brücke eine ionische, proteinbindende
Brücke, die zur Verbindung oder Verknüpfung eines Proteins mit der Kohlenwasserstoffkette des Materials
befähigt ist. Irgendeine geeignete ionische Verbindung kann angewandt werden, unter der wesentlichen Voraussetzung,
daß sie zur Verbindung mit zumindest einem Teil der anhängenden Kohlenwasserstoffketten des Materials und Erzeugung
eines Bindegliedes bzw. einer Brücke zu der spezifisch reaktiven Gruppe befähigt ist und daß im Falle
der Erzeugung eines Bindegliedes zu einem Protein dieses unter den angewandten Bedingungen oder Bedingungen,denen
das Material ausgesetzt wird, keine unerwünschte Denaturierung (plurch das Bindeglied) erleidet.
Solche Materialien wurden z.B. als milde Vernetzungsmittel der Proteinchemie beschrieben (selbstverständlich
sind solche am zutreffendsten,wenn eine Proteinkomponente des Materials in Betracht gezogen wird).
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Das bevorzugte ionische Bindeglied bzw. die bevor zugte Verknüpfung leitet sich von einem Imidoester der
Formel:
+
NH. X"
NH. X"
OR
ab, wobei R eine Alkylgruppe und zweckmäßigerweise eine niedere Alkylgruppe wie z.B. Methyl oder Äthyl und vorzugsweise
Methyl bedeutet und X gleich HCl oder HBr und vorzugsweise HCl ist.
Eine Kohlenwasserstoffkette mit einem solchen Bindeglied
kann also durch einen Imidoester der Formel:
.NH. X
R1-C
R1-C
wiedergegeben vrerden,wobei R1 eine Kohlenwasserstoffkette ist,
die gesättigt oder ungesättigt und verzweigt oder gerade sein kann. R1 wird üblicherweise 6 bis 20 Kohlenstoffatome
enthalten, obgleich mehr Kohlenstoffatome anwesend sein können, insbesondere wenn die Kette verzweigt und
ungesättigt ist. Vorzugsweise enthält sie 8 bis 14 Kohlenstoff atome. üblicherweise wird der Kohlenwasserstoff
aliphatisch sein.
Bevorzugt wird der Methyl-dodecylimidoester.
Das erfindungsgemäße Material kann zahlreiche An-Wendungen finden, wo eine Verknüpfung einer Gruppierung
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mit einem hydrophoben Substrat erwünscht ist, wie beispiels weise in der chromatographie oder bei selektiven Reaktionssystemen,
und die Materialien der Membranen der oben genannten DT-OS können ebenfalls ähnlich angewandt werden.
5
Das Material ist jedoch besonders nützlich in Form einer Membran, die in Verbindung mit einem geeigneten elektrischen
System, beispielsweise einem Elektrodensystem für eine Analyse, einen Nachweis oder eine Konzentrationsbestimmung
angewandt werden kann. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung wird daher eine hydrophobe
Membran mit "Proteinimmobilisierungsfähigkeit" in Verbindung
mit (z.B. als Mantel oder Hülle) einer Elektrode vorgesehen, die zweckmäßigerweise eine hochleitende Elektrode,z.B.
aus Platin,ist.
Wenn ein Protein, z.B. ein Antikörper, mit einer Selektivität für eine Umsetzung mit einem speziellen
Protein (Antigen) am protein-reaktiven Zentrum umgesetzt wird, erhält man beim Eintauchen einer solchen beschichteten
Elektrode in Verbindung mit einer Bezugselektrode in eine wässrige Lösung, die das Antigen enthält, ein
elektrisch empfindliches System, das in der Lage ist, die Änderung der elektrischen Ladung der Lösung/Polymer-Grenzfläche
zu messen, die durch den Einfang eines speziellen Proteins (Antigens) durch die Elektrode mit einem immunoreaktiven
Antikörper verursacht wird. Alternativ kann ein Antigen an der Membran für einen selektiven Einfang
eines entsprechenden Antikörpers immobilisiert werden.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird daher eine mit einer Schicht bzw. einem Mantel aus spezifisch
reaktiver Membran,wie oben beschrieben, umhüllte Elektrode vorgesehen.
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Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit und optimal der
Konzentration einer Verbindung in einer die Verbindung zusammen mit anderen Molekülen, wie z.B. Lösungsmittelmolekülen,
enthaltenden Mischung durch Kontakt der Mischung mit einer Elektrode vorgesehen, die in eine Membran
eingeschlossen ist, welche, wie oben beschrieben, mit der Verbindung spezifisch reaktiv ist und Nachweis irgendeiner
resultierenden Änderung der elektrischen Ladung an der Membran. Geeigneterweise kann dies durch Vergleich
mit einer geeigneten Bezugselektrode erreicht werden.
Nachfolgend wird das Verfahren in beispielhafter Form beschrieben:
Eine hydrophobe Polymermembran mit selektiver immunochemischer Fähigkeit (d.h. eine spezifisch reaktive
Membran) wird unter Erzeugung einer Membran eines hydrophoben Polymeren hergestellt. Das Polymere ist vorzugsweise
ein Materialjdas mit einem organischen Lösungsmittel
oder einer Lösungsmittelmischung, insbesondere aliphatischen Lösungsmitteln, aufgequollen werden kann. Besonders
brauchbare Polymere für die praktische Durchführung der Erfindung sind solche hydrophoben Polymeren, die keine
anhängenden polaren Gruppen enthalten. Zu typischen Polymeren für diesen Zweck gehören thermoplastische Polymere
wie Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen, Silicongummi, Polyurethan, Polycarbonat.Polytetrafluoräthylen
und dergleichen. Warmhärtende Polymere wie Epoxyharze und vernetzte Polyester können ebenfalls benutzt
werden. Bevorzugte Polymere sind solche, die auf eine Elektrode durch Tauchguß oder Aufschrumpfen aufgeschichtet
werden können.
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Die Polymermembran wird dann mit einem zum Anquellen der Membran befähigten Lösungsmittelsystem ausreichend lange zur Anquellung der Membran in zumindest einem solchen Ausmaße, daß die Kohlenwasserstoffkette in
die Membran in ausreichender Konzentration, wie nachfolgend beschrieben, eingebaut werden kann, behandelt. Das
Lösungsmittelsystem enthält neben einem geeigneten Lösungsmittel eine Kohlenwasserstoffverbindung mit einem
daran befindlichen reaktiven Zentrum,vorzugsweise an ei
nem Ende der Kohlenwasserstoffkette oder in dessen Nähe.
Die zum Anquellen der Polymermembran benutzten Lösungsmittel sind vorzugsweise solche, die durch "Trocknen"
des Polymeren bequem entfernt werden können. So werden Lösungsmittel mit geringerem Molekulargewicht im allge
meinen gegenüber Lösungsmitteln mit höherem Molekularge
wichten bevorzugt. Wie im Nachfolgenden aufgezeigt wird, sollte das Lösungsmittel vorzugsweise einen niedrigeren
Siedepunkt haben und leichter verdampfbar sein als die Kohlenwasserstoffverbindung mit einem daran befindlichen
reaktiven Zentrum. Eine typische Lösungsmittelmischung für PVC umfaßt Petroläther mit einem Siedebereich von
30 bis 6o°C und Toluol. Andere Lösungsmittel oder Mischungen derselben können zum Quellen von PVC oder anderer Polymermaterialien benutzt werden, Jedoch sind die-
se dem Fachmann bekannt oder sie können durch einfache Vorversuche ermittelt werden.
Nach dem "Einweichen" der Polymermembran in dem Lösungsmittelsystem ftir eine ausreichend lange Zeit zur
Herbeiführung des geforderten Quellungsgrades wird die Membran bei einer geeigneten Temperatur zur Entfernung
des Lösungsmittels ohne Abtrennung wesentlicher Mengen der Kohlenwasserstoffverbindung mit dem reaktiven Zentrum
"getrocknet". Bei Verwendung von Petroläther, Toluol und
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typische Trockentemperatur bei etwa 50 bis 1000C, zweckmäßigerweise 50 bis 6O0C (vorzugsweise im Vakuum). Die
Entfernung des Lösungsmittels liefert eine Membran mit daran anhängenden Kohlenwasserstoffketten, deren jede
eine reaktive Gruppe aufweist.
Die Auswahl des Lösungsmittels (und damit seines Siedepunkts) und der für seine Abtrennung anzuwendenden
Drucke erfolgt unter Berücksichtigung der Natur und Eigenschäften der Membran und des Kohlenwasserstoffs. Für die
hier angewandten Polymeren existieren bekannte Lösungsmittel für ihre Anquellung.
Anschließend an die Anfügung der Kohlenwasserstoffkette an die Polymermembran kann sich eine Serie von
Behandlungen zur Erzielung einer spezifisch reaktiven Membran, d.h. einer Membran mit der Fähigkeit zum Einfang einer spezifischen Verbindung, wie z.B. eines Proteins, eines Enzyms oder eines Mono- oder Polysaccharids,
z.B. in einer immunochemischen Reaktion, anschließen.
Es ist zu bemerken, daß die Kohlenwasserstoffkette
mit der spezifischen reaktiven Gruppe vor ihrem Einbau in die Membran versehen werden kann (in welchem Falle
es natürlich notwendig ist, sicherzustellen, daß die
Gruppe für die Entfaltung ihrer Reaktivität frei bleibt
- vorzugsweise indem man sicherstellt, daß sie nicht weniger als etwa 4 bis 6 Kohlenstoffatome von der Membran
entfernt ist), oder die Gruppe kann in die Kette nach ihrer
Vorzugsweise wird die Kohlenwasserstoffkette mit ihrem protein-reaktiven Bindeglied vor dem Einbau in das
Polymere versehen. So kann der Einbau eines Imidoesters in das Polymere mit nachfolgendem Kontakt mit einer
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proteinartigen spezifischen reaktiven Gruppe schematisch wie folgt wiedergegeben werden:
POLYfIER
NH. X
OR
m einem
Quellungsmittel
NH.X
POLYMER 1WVV—C
OR
+ Protein-NH,
POLYMER^WW" C
NH. X
NH - Protein
Wenn die Kohlenwasserstoffkomponente verzweigt und von ausreichender Größe ist, kann der Einbau in das Polymere
an mehr als einer Stelle erfolgen, d.h. zwei oder mehrere Verzweigungen können Verknüpfungen mit dem Polymeren
bilden. Wenn ein verzweigter Kohlenwasserstoff angewandt wird, befindet sich die Verzweigung vorzugsweise
an einem oder mehreren Kohlenstoffatomen, die von dem <*-Kohlenstoffatom verschieden sind, so daß die Funktion der
Esterbrücke dadurch nicht übermäßig gestört wird.
Erwünschtermaßen besteht keine Wahrscheinlichkeit für eine Vernetzung zwischen einem Paar von anhängenden
Gruppen, die von der Membranoberfläche vorragen bzw. an dieser hängen.
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• AA.
Nach der Umsetzung der protein-reaktiven Bindungskomponente bzw. -Verbindung (d.h. der Verbindung mit einer immobilisierenden Gruppe) mit der von der Membranoberfläche vorragenden Kette zur Erzeugung der proteinverknüpfenden Gruppierung wird sie vorzugsweise gewaschen
und in eine Lösung gebracht, die das zu immobilisierende Protein enthält. Zimmertemperatur wird als Reaktionstemperatur bevorzugt und im allgemeinen wird eine Kontaktzeit von 1 bis 2 Tagen für den Ablauf der Reaktion bevorzugt. Die Umsetzung erfolgt im allgemeinen in einem
leicht basischen Medium.
Nach Anfügung des Proteins erfolgt eine Behandlung zum Wegwaschen von Resten nicht-umgesetzten Materials
und eine weitere Reaktion mit einer Verbindung zur Neutralisation von irgendwelchen nicht-umgesetzten protein-reaktiven, d.h. immobilisierenden Gruppen, die nach der Reaktion mit dem Proteinmolekül zurückbleiben.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Anwendung einer Kohlenwasserstoffveibindung
bevorzugt, die eine ausreichende Kettenlänge besitzt, um eine gewisse Distanz der reaktiven Gruppe von der Membranoberfläche zu ermöglichen. Im allgemeinen hat die
gemäß der Erfindung benutzte Kohlenwasserstoffverbindung zumindest 6 Kohlenstoffatome in der Hauptkettenlänge.
Bevorzugt wird eine Länge, bei der die Hauptkette der Kohlenwasserstoffverbindung etwa 8 bis lh Kohlenstoffatome enthält und in jedem Falle wird eine solche Aus-
wahl bevorzugt, daß die spezifische reaktive Gruppe von der Membranoberfläche um zumindest 4, vorzugsweise zumindest 6 oder sogar 8 Kohlenstoffatome entfernt ist.
Wenn eine proteln-reaktive verknüpfende Verbindung, die damit umgesetzt wird, eine beachtliche Kettenlänge be
sitzt, so daß die schließlich erzeugte protein-reaktive
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• ft-
Gruppe von der Oberfläche um zumindest 6 Kohlenstoffatome
vorragt, braucht die Kettenlänge des Kohlenwasserstoffs nicht so lang zu sein.
Die erfindungsgemäßen Membranen sind besonders brauchbar bei Anwendung in Vorrichtungen zum qualitativen
und vorzugsweise quantitativen Nachweis der Anwesenheit spezieller Verbindungen in einer gegebenen Mischung,wie
z.B. einer Lösung, in der die nachzuweisende Verbindung enthalten ist.
Um eine Meßelektrode (die sog. "Immunoelektrode") wird eine Hülle aus der hydrophoben Polymermembran mit
Kohlenwasserstoffketten mit reaktiver Gruppe in einer Stärke von etwa 10 bis 50 μ gebildet, wobei Schichtdicken
von etwa 20 bis 40 μ besonders bevorzugt sind. Vorzugsweise ist die Membran nicht stärker als 100 μ und nicht
schwächer als 5 μ. Ein Protein oder eine andere angemessene Verbindung eines immunochemischen Paares wird in
der Membran immobilisiert bzw. festgelegt. Die Meßelektrode
wird in Verbindung mit einer Bezugselektrode verwendet. Die beiden Elektroden werden in eine Mischung, typischerweise
eine Lösung, getaucht, die ein Protein oder eine andere Verbindung des zu identifizierenden Typs enthält.
Die Meßelektrode und die Bezugselektrode werden elektrisch mit einem für sehr geringe Änderungen des elektrischen
Potentials empfindlichen Meßgerät verbunden. Beim Einfang des besonderen Proteins durch die Meßelektrode ändert
sich das elektrische Potential an der Polymer/Lösungsgrenzflache.
Die geringe Änderung wird mit dem Meßgerät nachgewiesen, das eine hohe Impedanz in der elektrischen
Schaltung aufweist und die Anwesenheit der Verbindung somit angezeigt. Nach entsprechender Eichung kann das Meßgerät
für die quantitative Bestimmung der Menge der in der Lösung anwesenden Verbindung benutzt werden.
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Die Bezugselektrode kann aus irgendeinem einer brei ten Vielfalt von geeigneten Elektrodenmaterialien sein,
von denen viele bekannt sind, obgleich sich die Anwendung einer zweiten Immunoelektrode als Bezugselektrode
als vorteilhaft erwiesen hat, die im wesentlichen zur Meßelektrode identisch ist, außer daß die spezifischen
reaktiven Zentren mit einem geeignet reaktiven Blockierungsmittel blockiert sind, so daß die Bezugselektrode
nicht langer auf das besondere zu testende Material anspricht. Sie spricht dagegen auf eine nicht-selektive
Adsorption von anderen Molekülen in der Testlösung ebenso an, wie die Meßelektrode, so daß die Wirkung einer
nicht-selektiven Adsorption,soweit eine solche auftritt,
kompensiert werden kann;eine Messung des Potentials einer aktiven Meß-Immunoelektrode gegen das Potential
einer identischen Bezugs-lmmunoelektrode mit blockierten Bindungszentren kann die Wirkung nicht-spezifischer
Störungen wirksam eliminieren.
Materialien und insbesondere Membranen gemäß der Erfindung sind auch als präparative oder Reaktionshilfen
anwendbar, welche eine Immobilisierung von einer oder mehreren Reaktanten mit dem reversiblen Immobilisierungs
potential zum Beispiel durch Änderung der Polarität der Membran durch Hindurchleiten eines elektrischen Stromes
erleichtern bzw. ermöglichen.
Nachfolgend wird die Erfindung an einem Beispiel erläutert.
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5,0 ml Dodecylnitril wurden in 5,0 ml trockenem
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Methanol und 50 ml trockenem Äther in einem Kolben mit
Rückflußkühler gelöst. Die Mischung wurde in einem Eisbad gekühlt und trockener Chlorwasserstoff wurde 1 Stunde
lang langsam hindurchgeleitet. Das Ende des Kühlers war mit einem Trockenaufsatz versehen. Der Kolben wurde
dann verschlossen und 24 Stunden lang bei 00C aufbewahrt.
Danach wurde der Äther unter vermindertem Druck (bei 3O0C) abgedampft, bis der Ester als weißer Feststoff
auskristallisierte. Dieser wurde dreimal mit trockenem Äther gewaschen. Der trockene Feststoff wurde im Exsiccator
bei +40C aufbewahrt.
FVC-Folie wurde 5 Minuten lang in trockenem Toluol angequollen und dann in eine Mischung von Methanol:Toluol:
Petroläther (30-60°) (1:2:1) mit 3 % Imidoester (s.o.) gebracht. Nach 3 Stunden wurde die Folie eine Stunde
lang in einen Vakuum-Exsiccator gegeben, wonach der Überschuß des Imidoesters mit trockenem Methanol weggewaschen
wurde. Irgendwelche Spuren der Quellungsmischung wurden dann 12 Stunden lang in einer Vakuum-Trockenpistole
bei Zimmertemperatur entfernt. Die Folie wurde dann 48 Stunden lang bei Zimmertemperatur in einer Lösung
belassen, die 5 % zu immobilisierendes Protein enthielt (pH 8,4); am Ende dieser Zeitdauer erfolgte ein
Waschvorgang in Puffer/physiologischer Salzlösung.
Diese Verfahrensweise kann als allgemeine Prozedur zur Immobilisierung von Proteinen an hydrophoben Polymeren
benutzt werden.
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Claims (1)
- B 8031Patentansprüche1. Spezifisch reaktives Material, gekennzeichnet durch ein hydrophobes organisches Polymersubstrat mit daran anhängenden im wesentlichen durch Kohlenwasserstoff gebildeten Ketten, die mit einer chemischen Verbindung spezifisch reaktive Gruppen tragen, welche den Kohlenwasserstoffketten über eine ionische Gruppierung angefügt sind.2. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindeglied durch ein ionisches, proteinbindendes Bindeglied gebildet wird, das zur Bindung eines Proteins an die Kohlenwasserstoffkette des Materials befähigt ist.3. Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das ionische Bindeglied von einem Imidoester der Formelstammt, wobei R eine Alkylgruppe bedeutet und X~ durch HCl oder HBr gebildet wird.k. Material nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindeglied von einem Methyl-dodecyllmidoester stammt·5. Material nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat die Form einer Membran hat. 709838/0875ORIGINAL INSPECTEDB 8031Λ-6. Material nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifisch reaktive Gruppe ein Antikörper oder ein Antigen ist.7. Verwendung des Materials nach einem der vorangehenden Ansprüche in Verbindung mit einer auf eine Änderung der elektrischen Ladung des Materials ansprechenden Elektrode.8. Verfahren zum Nachweis einer chemischen Substanz in einer diese enthaltenden Mischung, insbesondere Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Substanz bzw. substanzhaltige Mischung mit einer mit Material nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Verbindung stehenden Elektrode in Kontakt bringt, die auf eine Änderung der elektrischen Ladung in dem Material anspricht, das für die nachzuweisende Substanz spezifisch reaktiv ist und daß man die resultierende Änderung der elektrischen Ladung nachweist.709838/0875
Applications Claiming Priority (1)
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