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DE2759962C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnstoff - Google Patents

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnstoff

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DE2759962C2
DE2759962C2 DE2759962A DE2759962A DE2759962C2 DE 2759962 C2 DE2759962 C2 DE 2759962C2 DE 2759962 A DE2759962 A DE 2759962A DE 2759962 A DE2759962 A DE 2759962A DE 2759962 C2 DE2759962 C2 DE 2759962C2
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DE
Germany
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urea
reagent
reaction
phthalaldehyde
concentration
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DE2759962A
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Inventor
Jerry William Carmel Ind. Denney
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AMERICAN MONITOR CORP 68505 INDIANAPOLIS IND US
Original Assignee
AMERICAN MONITOR CORP 68505 INDIANAPOLIS IND US
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Description

20
25
NyN
NH2
R1 = —Ή,— OH oder — OCH3 und
R2 = —OH oder — OCH3
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chromogene Verbindung 4,6-Dihydroxy-2-aminopyrimidin verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chromogene Verbindung 4-Methoxy-2-aminopyrimidin verwendet wird.
4. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, bestehend aus einer sauren Lösung einer chromogenen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß die chromogene Verbindung unter den Verbindungen ausgewählt worden ist, die durch die folgende allgemeine Formel mit den ihr zugeordneten Symbolen dargestellt werden:
NyN
NH2
R1 = —H,—OH oder —OCH3 und
R2 = -OH oder —OCH3
45
50
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnstoff in einer flüssigen Probe durch Behandeln der Probe mit einer sauren Lösung des o-Phthalaldehyds und einer sauren Lösung einer chromogenen Verbindung, die mit dem Reaktionsprodukt des Harnstoffs und o-Phthalaldehyds einen Chromophor bildet, und durch Messen der Extinktion der so gebildeten gefärbten Lösung sowie ein Reagenz zur Durchführung dieses Verfahrens. Das Verfahren und das Reagenz sind insbesondere zur quantitativen Analyse von Harnstoff in Blutflüssigkeiten, wie Blutplasma, Serum, Urin und Markflüssigkeit, geeignet.
Harnstoff ist das hauptsächliche Endprodukt des proteinabbauenden Stoffwechsels im menschlichen Körper und sorgt primär für die Entfernung toxischer Mengen von Ammoniak aus dem System. Harnstoff stellt ein Produkt dar, das grundsätzlich in der Leber gebildet und über die Nieren ausgesondert wird.
Somit liefern Messungen des Harnstoffs in verschiedenen Körperflüssigkeiten dem klinischen Medizinier sehr wertvolle diagnostische Anzeigen.
Eine frühzeitige Harnstoffmessung war die von Marshall vorgeschlagene (Marshall, E K.., Jr.: J. Biol. Chem. 15: 487 (1913), S. 4). Bereits 1313 benutzte Marshall das Enzym Urease als Mittel zur Bestimmung des Harnstoffs im Blut. Die Methode besteht aus einer Inkubation des Blutes mit Urease, einem Enzym, das Harnstoff in ein Molekül Kohlendioxid und zwei Moleküle Ammoniak spaltet, im Isolieren des so durch Durchlüftung freigesetzten Ammoniaks und quantitativen Bestimmen des Ammoniaks mittels Titration als ein Maß für die Harnstoffmenge.
Nesslers Reagenz (Gentzkow, C. ].: J. Biol. Chem. 143: 531 (1942) S. 5) war wahrscheinlich das am meisten gebräuchliche Reagenz unter denjenigen, die zur Bestimmung von vorliegenden Ammoniumionen (NH4 +) verwendet wurden. Jedoch zeigt das Nesslersche Verfahren die nachteilige Beschränkung der photometrischen Ablesung der entwickelten Farbe innerhalb einer Zeitdauer von einer Minute, wofür die Bildung von Farbe durch mit dem Reagenz reagierende andere Bestandteile als NH4+-Ionen verantwortlich ist, was zu einer möglichen Ungenauigkeit führt, die wiederum auf eine Überbewertung der Harnstoffmenge zurückgeht.
Nachfolgend nach dem Verfahren von Marshall ist ein Übermaß neuer Verfahren vorgeschlagen und erprobt worden, um der zunehmenden Kenntnis über die grundlegende Bedeutung genauer, zuverlässiger und reproduzierbarer Harnstoffmessungen und der Tatsache Rechnung zu tragen, daß keines sämtliche Nachteile überwindet, ohne daß neue auftreten.
Diese Verfahren besaßen die Gemeinsamkeit des Einsatzes des Enzyms Urease und unterschieden sich lediglich in der Art und Weise der Bestimmung des gebildeten Ammoniaks.
Möglicherweise war die am häufigsten verwendete enzymatische Methode diejenige, die die Berthelot-Reaktion ausnutzt (Henry, R. J.: Clinical Chemistry: Principles and Techniques, New York, Harper & Row (1968) S. 513), bei dem Serum während etwa 15 Minuten mit Urease behandelt wird. Anschließend werden zu dieser Mischung zwei zusätzliche Reagenzien gegeben und wiederum für etwa 5-10 Minuten bei erhöhter Temperatur einer Inkubation unterzogen, um die gewünschte Indikatorreaktion ablaufen zu lassen. Jedoch bestanden auch hier Nachteile und Schwierigkeiten bei der gesamten Klasse von Verfahren, die das enzymatische Spalten von Harnstoff ausnutzen. Die Hauptnachteile bestanden in den ausgedehnten Inkubationszeiten, die erforderlich waren, um den Harnstoff in der Probe vollständig umzusetzen, und in den Stabilitätsschwierigkeiten des Reagenssystems. Vielleicht war der am schwersten wiegende Nachteil die Tatsache, daß diese Methoden nicht sehr gut zum Messen von im Urin enthaltenen Harnstoff geeignet waren, da große Mengen an freiem Ammoniak in diesen Proben vorliegen können und somit eine fehlerhafte Messung des Harnstoffs bewirken, was wiederum eine Überbewertung und folglich eine falsche Diagnose und Behandlung nach sich zieht.
Obwohl die enzymatischen Methoden mit Nachteilen behaftet waren, beruhten die Verfahren des Standes der Technik viele Jahre trotz der ihnen innewohnenden
Nachteile auf dieser Grundlage. Da die Vorteile der Harnstoffuntersuchungen bereits lange bekannt waren, so war man doch der Auffassung, daß sogar nachteilige Untersuchungen besser als gar keine sind. Jedoch fuhr man mit den Versuchen fort, eine vorteilhafte Harnstoffbestimmung bzw. -untersuchung aufzufinden.
1939 löste sich Fearon (Fearon, W. R.: Biochem. J.: 33: 902 (1939), S. 7) von der Methodenlehre des Ureaseenzyms und zeigte, daß Harnstoff mit Diacetylmonoxim bei erhöhten Temperaturen in Gegenwart einer starken Säure und eines Oxydationsmittels reagiert, um ein Chromogen zu erzeugen. Ormsby (Ormsby, A. A.: J. Biol. Chem.; 146: 595 (1942), S. 7) wandte 1942 die Fearon-Reaktion an, um Blut und Urinharnstoff in einer proteinfreien Lösung zu messen. Obwohl diese Methodenlehren, die auf der Anwendung der Fearon-Reaktion beruhen heutzutage eine ziemlich weite Anerkennung gefunden haben, insbesondere in Verbindung mit der Verwendung eines automatischen chemischen Analysator, zeigen sie ein oder mehrere Nachteile: Erstens: die entwickelte Farbe ist lichtempfindlich, so daß es erforderlich ist, daß der Versuch unter geregelter und minimaler Lichteinstrahlung durchgeführt wird; zweitens: es mangelt an der Übereinstimmung mit dem Beerschen Gesetz, so daß die Verwendung einer Vielzahl von Standards erforderlich ist; drittens: die Reagenzien zeigen eine unangenehme Natur; viertens: die Reaktion ist nicht vollständig spezifisch für Harnstoff, was zu ungenauen Untersuchungen führt, wenn störende Substanzen anwesend so sind; in vielen und möglicherweise sogar in der Mehrzahl der Fälle wird der Techniker sich nicht über das Vorliegen dieser Substanzen im klären sein und keine Ursache der Ungenauigkeit der Messung vermuten; fünftens: eine strenge Temperatureinrege- ^ lung bzw. -kontrolle und die Anwendung sehr erhöhter Reaktionstemperaturen sind erforderlich.
Obwohl das Fearon-Verfahren derzeit vielleicht das am häufigsten verwendete Verfahren darstellt, stellt die Anwendung erhöhter Reaktionstemperaturen und die «o saure Natur der Reagenzien eine besondere "Gefahr dar, wenn es in einer kontinuierlichen Fließanalyseneinrichtung angewandt wird, was auf einen Druckaufbau und die gleichzeitige Möglichkeit des Zerreißens von Leitungen zurückgeht, wodurch das Hinausschleudern "5 heißer Säure in die Luft und schwerwiegende Folgen für das Augenlicht des Bedienungspersonals hervorgerufen werden.
Nach 1942 wurden von verschiedenen Forschern noch weiter andere Änderungen oder Methoden zur Harnstoffmessung vorgeschlagen, einschließlich manometrischer Techniken (Messung des Drucks von Gasen, die in der Reaktionsfolge freigesetzt werden). Dennoch hat kein einziges Verfahren breite Anerkennung gefunden, was möglicherweise auf solche Nachteile zurückgeht, wie die Komplexität des Verfahrens oder das Erfordernis einer teueren und schwierig zu handhabenden Einrichtung.
Somit wurde viele Jahre auf verschiedenen Wegen und mit unterschiedlichen Versuchen darum gerungen, ein erwünschtes Harnstoffmeßverfahren aufzufinden.
Andere bekannte Versuche im Verlaufe dieses langen Ringens um eine zufriedenstellende und erfolgreiche Harnstoffbestimmung haben lange den Versuch umfaßt, die Reaktion zwischen Harnstoff und Aldehyd auszunutzen und ein gefärbtes Reaktionsprodukt oder ein Reaktionsprodukt zu erhalten, das bei der Reaktion mit einem Chromogen gefärbt wird.
Eines der ersten dieser Verfahren, bei denen die Verwendung eines Aldehyds versucht wurde, stammte offensichtlich von Brown, der eine Harnstoffbestimmung unter Anwendung dieser Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd (DMAB) versuchte (Brown, H. H„ Anal. Chem.31:1844(1959), S.9).
Jedoch waren trotz der Arbeiten vieler Forscher (Roijers, A. F. M. und Tas, M. M„ Clin. Chem. Acta, 9:197 (1964), S. 10) Probleme bei der Methode von Brown geblieben. Die Probleme waren die eventuellen Störungen dieser Verfahren durch die üblicherweise verwendeten Arzneimittel (mit der begleitenden Möglichkeit der Fehldiagnose) und die Empfindlichkeit der entwickelten Entfärbung gegen Temperaturschwankungen (mit der Notwendigkeit des Einsatzes teurer Laborausrüstungen, um die Farbstabilität während des Messens der Absorption bzw. der Extinktion sicherzustellen).
Während es noch 1973 versucht wurde, eine verbesserte, auf der Aldehydreaktion basierende Bestimmungsmethode zu finden, schlugen Morin und Prox (Morin, L. G. und Prox, J., CHn. Chem. Acta, 47:27 (1973), S. 10) ein auf der Umsetzung zwischen Harnstoff und dem Aldehyd p-Dimethylaminobenzaldehyd (DMAB) beruhendes Verfahren vor, wobei sie versuchten, Harnstoff direkt durch Messen der Extinktion des durch den Aldehyd hervorgebrachten Chromophors quantitativ zu erfassen, chne daß die Notwendigkeit bestand, Protein aus der Probe zu entfernen. Obwohl die Ausschaltung der Notwendigkeit der Proteinentfernung eine Verbesserung darstellte, litt das Verfahren von Morin und Prox dennoch unter dem Problem der Störung durch üblicherweise verwendete Arzneimittel.
Nach Jung und Mitarbeiter (Jung et al. Clin. Chem. 21: 1136 (1975), S. 10) und dem US-Patent 38 90 099 von Jung wurde Harnstoff mit einem anderen Aldehyd, nämlich dem o-Phthalaldehyd, umgesetzt. Sie gingen dann einen Schritt weiter und kuppelten das Produkt dieser Reaktion mit N-(l-Naphthyl)-äthylendiamindihydrochlorid. Obwohl der Vorschlag von Jung gegenüber dem Stand der Technik gewisse Vorteile bot, indem zumindest keine erhöhten Temperaturen zur Entwicklung des Chromophors erforderlich waren, zeigte er dennoch die nachfolgend wiedergegebenen Nachteile.
Zunächst erforderte das Verfahren nach Jung N-(l-Naphthyl)-äthyIendiamindihydrochIorid. Hierbei handelt es sich um ein aus a-Napthylamin synthetisiertes Material. Somit kann es wahrscheinlich mindestens Spuren an a-Naphthylamin enthalten, d. h. einer Verbindung, die nach allgemeiner Kenntnis ein starkes Karzinogen darstellt (ein krebserregendes Mittel) (Merck Index,8. Auflage,S. 717, Merck(1969),S. 11).
Des weiteren ist als eine mögliche Gefahr und als ein Nachteil des Verfahrens von Jung das erforderliche N-(l-Naphthyl)-äthylendiamindihydrochlorid wegen dessen unbekannter Wirkungen bei der Lagerung in der im Reagens erforderlichen Säure zu sehen, wobei das N-(I-Naphthyl)-äthylendiamindihydrochlorid zerfallen kann, wobei das vorgenannte karzinogene a-Naphthylamin anfällt.
Des weiteren gibt es die mögliche Gegenwart von a-Naphthylamin in den Laborräumen mit den damit verbundenen Risiken der unmittelbaren oder langzeitigen Einwirkung auf die Gesundheit des Laborpersonals.
Darüber hinaus zeigt das Verfahren von Jung die bedeutsame Störung durch eine Klasse von Arzneimitteln, insbesondere den Sulfa-Arzneimitteln, die gewöhnlich verwendet werden, um spezielle Krankheitszustän-
de zu behandeln, bei denen die Harnstoffmessung als ein entscheidender diagnostischer Test durchgeführt wird. Hierbei wird bis zu einem gewissen Ausmaß infolge der Gegenwart dieser Arzneimittel der Harnstoff fehlerhaft überbewertet, was diese Harnstoffmessung unzuverlässig und ungenau macht
Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, die oben genannten Nachteile der bekannten Verfahren möglichst weitgehend zu beheben.
Die Erfindung löst diese Aufgabe ausgehend von einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch, daß die chromogene Verbindung unter den Verbindungen ausgewählt wird, die durch die folgende allgemeine Formel mit den ihr zugeordneten Symbolen dargestellt werden:
R2
\
NyN
NH2
R1 = —H,—OH oder —OCH3 und
R2 = —OH oder—OCH3
Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich deutlich von den verschiedenen Lehren nach dem Stand der Technik und überwindet viele Nachteile desselben. Ganz besonders hqt es sich gezeigt, daß bei der Erprobung der vorliegenden Erfindung die Reagenzien stabil bleiben, die Farbreaktion dem Beerschen Gesetz über einen weiten Harnstoffkonzentrationsbereich gehorcht, nicht die Anwendung erhöhter Reaktionstemperaturen oder einer unüblichen Laboreinrichtung erfordert, eine beachtliche Störfestigkeit, die älteren Lehren anhaftet, insbesondere gegen durch Arzneimittel hervorgerufene Störungen, zeigt und extrem schnell verläuft, da weniger als fünf Minuten zur vollständigen Analyse erforderlich sind.
Das erfindungsgemäß verwendete Chromophor ist nicht lichtempfindlich und ermöglicht ein stabiles Reagenz für die Untersuchung.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß Harnstoff und nicht freie Ammoniumionen gemessen werden, so daß das Verfahren ohne durch die Vorbehandlung einer Probe hervorgerufene Kosten und Zeitaufwand zur Messung von aus Urin stammendem Harnstoff geeignet ist.
Dadurch, daß wie erwähnt die der Erfindung zugrundeliegende Reaktion dem Beerschen Gesetz über einen weiten Harnstoffkonzentrationsbereich genügt, d. h. die Konzentrations/Extinktions-Ablesungen in direkt linearem Verhältnis stehen, wird die Fchlermöglichkeit vermindert und damit das wiederholte Durchführen von Analysen verringert, wodurch der klinische Mediziner mit einem Minimum an Kostenaufwand verläßlichere Ergebnisse erhält.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Probe einer Körperflüssigkeit, die Harnstoff enthält, in ein Reaktionsrohr gegeben. Dazu werden eine saure Lösung des o-Phthalaldehyds und eine saure Lösung der chromogenen Verbindung gegeben. Die Bildung des Chromophors beginnt sofort. Die Geschwindigkeit der Farbbildung kann, wenn gewünscht, durch Inkubation der Reaktionsmischung bei 37CC beschleunigt werden. Innerhalb einer Zeitdauer von 3 bis 5 Minuten ist genug Farbe gebildet worden, so daß das üblicherweise in klinischen Labors vorhandene Photometer verwendet werden kann, um die gebildete Farbmenge zu vermessen. Die Menge des in der ursprünglichen Probe vorhandenen Harnstoffs wird durch Vergleich der Extinktion bzw. der Absorption der Probe des Patienten mit der Extinktion berechnet, die eine in gleicher Weise behandelte Standardlösung des Harnstoifs zeigt, deren genaue Konzentration bekannt ist.
ίο Das o-Phthalaldehyd-Reagenz wird hergestellt, indem 200 bis 2000 mg o-Phthalaldehyd zu einer aliquoten Menge einer näherungsweise 3,75 η Schwefelsäure gegeben werden. Zu dieser Mischung wird zweckmäßigerweise eine solche Menge eines Polyoxyäthylenlauryläthers (z. B. BRI] 35) oder eines Alkylarylpolyäthers (z. B. TRITON) gegeben, so daß die endgültige Konzentration des grenzflächenaktiven Mittels etwa 1 bis 3% (GewyVol.) ist. Die Mischung wird dann auf das endgültige Volumen von einem Liter gebracht.
Die Konzentration des o-Phthalaldehyds kann innerhalb der hier gegebenen Parameter schwanken, was von dem besonderen Anwendungsbereich des Reagenzsystems abhängt. So führt z. B. die Erhöhung der Konzentration des o-Phthalaldehyds in diesem Reagenz zu einem bedeutenden Anstieg der Geschwindigkeit der Farbbildung. Somit würde es für den Laboranalytik.er, der einen Hochgeschwindigkeitsanalysator zur Bestimmung chemischer Verbindungen besitzt, erstrebenswert sein, die Konzentration des Reagenzes zu erhöhen, so daß die Farbe schnell gebildet und gemessen werden kann, wodurch die Produktivität und der Durchlauf der Analysen erhöht wird.
Wenn jedoch das Verfahren manuell durch einen Labortechniker betrieben wird, wird es umgekehrt erstrebenswert sein, die Konzentration dieses Reagenzes zu erniedrigen, um genügend Zeit für die Analyse zu haben, um die Schritte zu vollziehen, die zur Behandlung einer Vielzahl von Proben in einer planmäßigen Art und Weise erforderlich sind.
Somit dürfte ersichtlich sein, daß die endgültige Konzentration des eingesetzten Reagenzes von dem jeweiligen besonderen Anwendungsgebiet abhängen wird, obwohl alle Konzentrationen innerhalb der gegebenen Farameter zu einer genauen und richtigen Untersuchung führen.
Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare chromogene Verbindungen sind:
(a) 4,6-Dihydroxy-2-aminopyrimidin und
(b) 4-Methoxy-2-aminopyrimidin.
Das chromogene Reagenz wird durch Auflösen einer geeigneten Menge der zu verwendenden chromogenen Verbindung in einer Lösung hergestellt, die etwa 4 Mol/l Schwefelsäure und zweckmäßigerweise etwa 80 Mol/l Borsäure und ein grenzflächenaktives Mittel, wie Polyoxyäthylenlauryläther (z. B. BRIJ 35) oder Alkylarylpolyäther(z. B.TRITON) oder ein anderes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel, in einer endgültigen Konzentration von etwa 1 bis 3% enthält. Die genaue
bo Menge der zu verwendenden chromogenen Verbindung wird durch die Molarität des o-Phthalaldehyd-Reagenzes, das für den besonderen Anwendungszweck vorgesehen ist, bestimmt. Als allgemeine Richtlinie kann gelten, daß die Molarität der chromogenen Verbindung idealerweise etwa bei 0,1 bis 1,0 mal so viel wie die Konzentration des o-Phthalaldehyds in der endgültigen bzw. fertigen Reaktionsmischung sein sollte. Im allgemeinen können höhere molare Verhältnisse von
chromogener Verbindung zu Aldehyd verwendet werden, wenn die chromogene Verbindung keine freie Aminogruppe besitzt.
Vorstehend ist die Herstellung des o-Phthalaldehyd-Reagenzes in einer 3,75 η Schwefelsäurelösung beschrieben worden. Eine derartige Konzentration der Schwefelsäure in diesem Reagenz führt zu einer optimalen Abstimmung zwischen der angestrebten Reaktionsgeschwindigkeit und der Verwendung dieser starken Säure in Form von Schwefelsäure. Es ist jedoch erfindungsgemäß nicht notwendig, diese exakte Konzentration der Säure einzuhalten. Vielmehr sind auch Abweichungen von dieser exakten Konzentration der Säure möglich, ohne den Erfindungsgedanken zu verlassen.
Bei den oben beschriebenen Ausgestaltungen wird die chromogene Verbindung in einer 8 η Schwefelsäurelösung eingesetzt. Jedoch kann man von der genauen Normalität der vorstehend erläuterten bevorzugten Ausgestaltung auch abweichen. Als allgemeine Richtlinie für die Säurekonzentrationsabweichungen gilt, daß entweder das Erhöhen oder Vermindern der Säurekonzentration des Reagenzes zu einer Verminderung der Geschwindigkeit der in der fertigen Reaktionsmischung beobachteten Farbbildung führt. Während beträchtliche Schwankungen der Säurekonzentration toleriert werden können, können ziemlich große Abnahmen der Säurekonzentra'iion zu einer beträchtlich verminderten Farbbildungsgeschwindigkeit führen. Ziemlich große Erhöhungen der Säurekonzentration können zu einer verminderten Stabilität und zu unerwünschten Auswirkungen auf das Laborpersonal und die Ausrüstung, die den starken Säuren ausgesetzt werden, führen.
Als allgemeine Richtlinie für die Herstellung des vorstehend beschriebenen Reagenzes gilt, das beide zweckmäßigerweise die Verwendung eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels einschließen. Dieses grenzflächenaktive Mittel kann zwei Zwecken dienen, was von der verwendeten besonderen chromogenen Substanz anhängt Zum Beispiel verleiht im allgemeinen der Einschluß eines grenzflächenaktiven Mittels dem Reaktionssystem bessere Fließeigenschaften, wodurch ein akzeptableres Reagenz für jene analytischen Verfahren zur Verfügung steht, bei denen die Extinktion in einem Photometer abgelesen wird, das mit einer
Fließzelle versehen ist (z. B. ein System, bei dem eine Einzelzelle verwendet wird, um alle Extinktionen mittels eines automatischen Mitteis zum Füllen und zum Entleeren des Gehalts der Zelle zu messen).
Die zweite Aufgabe des verwendeten grenzflächenaktiven Mittels ist darin zu sehen, das Auflösen der verwendeten besonderen chromogenen Verbindung zu erleichtern. Durch die Wahl einer geeigneten Konzentration des grenzflächenaktiven Mittels ist es möglich, die Löslichkeit zu beeinflussen und das Auftreten einer Trübung in der fertigen Reaktionsmischung zu verhindern.
Beispiel
Herstellung des Reagenzes
Das o-Phthalaldehydreagenz wird durch Lösen von etwa 2 g o-Phthalaldehyd in 1 I einer 3,5 η Schwefelsäure hergestellt, die 4 ml/1 Alkylarylpolyäther und 1 ml/1 Polyoxyäthylenlauryläther, wobei es sich in beiden Fällen um grenzflächenaktive Mittel handelt, enthält. Das chromogene Reagenz wird durch Lösen von 291mg 4,6-Dihydroxy-2-aminopyrimidin in 11 5 η Schwefelsäure hergestellt, die 15 ml/l Polyoxyäthylenlauryläther enthält.
Analytisches Verfahren
Hierbei werden 20 μΙ (0,02 ml) einer Körperflüssigkeit mit einem nicht bekannten Gehalt an Harnstoff in ein 3,0 ml Aldehydreagenz enthaltendes Rohr gegeben und gemischt. 1,0 ml des Aufnahmereagenzes wird hinzugegeben und gemischt. Die erhaltene Mischung wird dann bei 37°C 10 min lang einer Inkubation unterzogen und die entstandene Extinktion mit einem Spektralphotometer gegen ein Blindreagenz gemessen, das 20 μΐ Wasser, 3 ml des Aldehydreagenzes und 1,0 ml des Aufnahmereagenzes enthielt, das in der entsprechenden Weise behandelt worden war, wobei das Vermessen bei 470 nm erfolgt. Die Extinktion der unbekannten Probe wird dann mit der Extinktion verglichen, die in einer Standardlösung des Harnstoffstickstoffs auftrat, wobei diese Standardlösung in gleicher Weise wie die unbekannte Lösung zwecks Berechnung des Harnsioffgehaltes der unbekannten Probe behandelt worden ist.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnstoff in einer flüssigen Probe durch Behandeln der Probe mit einer sauren Lösung des o-Phthalaldehyds und einer sauren Lösung einer chromogenen Verbindung, die mit dem Reaktionsprodukt des Harnstoffs und des o-Phthalaldehyds einen Chromophor bildet, und durch Messen der Extinktion der so gebildeten gefärbten Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß die chromogene Verbindung unter den Verbindungen ausgewählt wird, die durch die folgende allgemeine Formel mit den ihr zugeordneten Symbolen dargestellt werden:
15
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