DE2613011A1 - Verfahren zur herstellung traegergebundener biologisch aktiver verbindungen - Google Patents
Verfahren zur herstellung traegergebundener biologisch aktiver verbindungenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Herstellung von unlöslichen biologisch aktiven Verbindungen wie z. B. Enzymen, Coenzymen,
Enzyminhibitoren, Hormonen, Antigenen usw. durch Bindung löslicher biologisch aktiver Verbindungen, die eine oder
mehrere primäre Aminogruppen enthalten, an einem definierten reaktiven polymeren Träger, der durch Copolymerisation
von geeigneten Monomeren (vgl. die CS-PS ........ gemäß der CS-Patentanmeldung PV 7413-74) hergestellt ist.
Unlösliche biologisch aktive Verbindungen finden bei zahlreichen Verfahren immer weitere Anwendungsmöglichkeiten,
auch wurden verschiedene neue Verfahren für ihre Anwendung entwickelt; besonders weite Anwendung finden derartige Pro-
233-(S 8866)-SPE
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dukte beispielsweise in der analytischen sowie der präparativen AffinitätsChromatographie.
In jüngster Zeit wurde eine Reihe von Methoden zur Herstellung dieser Stoffe angegeben, die sich in erster
Linie auf die Herstellung geeigneter Träger, vorzugsweise von polymerem Charakter, sowie ihre weitere Umwandlung
(Modifizierung) beziehen, die zur Möglichkeit der Bindung aktiver Stoffe führt. Hierbei können zwei grundsätzliche
Wege beschritten werden. Entweder wird ein Copolymer aus geeigneten Monomeren hergestellt, so daß damit eine Art
Matrix vorgegeben ist, an der dann durch einfache Verfahren biologisch aktive Stoffe gebunden werden können, oder es
wird ein Polymer eingesetzt, das geeignete, reaktionsfähige
Gruppierungen enthält, die durch chemische Modifizierung in eine Form umgewandelt werden, die die Bindung aktiver Verbindungen
ermöglicht.
Bisher ist eine Reihe von Verfahren angegeben worden, die zur kovalenten Bindung des Trägers und des biologischen
Präparats führen. Entscheidend für eine gute Aktivität des gebundenen Präparats ist das Vorliegen eines nicht geschädigten
aktiven Zentrums, das die Aktivität der Verbindung bestimmt. Dieser Gegebenheit muß deshalb hinsichtlich der Bedingungen
bei der Herstellung der Bindung Rechnung getragen werden.
Biologisch aktive Verbindungen sind zumeist chemisch über eine der freien primären Aminogruppen gebunden. Das
zur Reaktion mit dieser Aminogruppe befähigte reaktive Zentrum am Träger entsteht z. B. durch Reaktion von Hydroxylgruppen
mit Bromcyan, Phosgen oder Thiophosgen, wobei ein
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instabiles Zwischenprodukt gewonnen wird. Durch Diazotierung der primären aromatischen Aminogruppen im Polymer kann das
entsprechende Diazoniumsalz hergestellt werden, durch dessen Kupplung mit der aktiven Verbindung, die ein geeignetes aromatisches
System enthält, auch eine kovalente Bindung erzielt werden kann.
Die angeführten Verfahren zur Herstellung unlöslicher biologisch aktiver Stoffe erfordern die Anwendung gefährlicher
bzw. hoch toxischer Stoffe bei den zur Bildung der reaktiven Positionen im Polymer führenden Reaktionen. Hierzu
gehören die Reaktionen mit Bromcyan, Phosgen, Thiophosgen usw.
Auf diese Weise modifizierte Träger sind zudem relativ wenig wärmefest und chemisch beständig und verlangen rasche
und präzise Arbeitsvorgänge, insbesondere beispielsweise ein sorgfältiges Auswaschen von Reagenzresten, die die biologische
Aktivität der weiter reagierenden Verbindungen negativ beeinflussen können.
Erfindungsgegenstand ist die Herstellung unlöslicher biologisch aktiver Verbindungen durch Bindung löslicher
biologisch aktiver Verbindungen an einem definierten polymeren Träger, der in der Seitenkette das p-Phenylengerüst als
aktives Bindungszentrum enthält.
Das System kann durch folgende Formel dargestellt werden:
ι2
R1-CO-(O-CH2-CH2)χ - N - ((~)\ -NH2 (I),
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in der
R. den polymeren Rest und
Rp eine niedere Alkylgruppe bedeuten und
1 4: χ ^ 4 ist.
Durch Oxidation des aromatischen Systems entsteht eine reaktive Form, die mit einer Aminogruppe der biologisch aktiven
Verbindung unter Bildung einer festen kovalenten Bindung zu reagieren vermag. Die Oxidation wird in wäßrigem Medium
in Gegenwart der biologisch aktiven Verbindung innerhalb eines geeignet gewählten pH-Bereichs durchgeführt.
Zur Oxidation können verschiedene Oxidationsmittel verwendet werden, die die im Reaktionsgemisch vorliegenden biologisch
aktiven Stoffe nicht beeinträchtigen, beispielsweise Kaliumhexacyanoferrat(III) oder Cu -Ionen in alkalischem
Medium, d. h. komplexe Redoxionen. Des weiteren können Alkalimetallarsenate sowie ggfs. Substanzen mit ähnlichem Redoxpotential
angewandt werden.
Es kann ferner auch unter biologisch verträglichen Bedingungen in geeignetem Milieu gearbeitet werden, wobei als
Oxidationsmittel Sauerstoff (ggfs. Luftsauerstoff) in Gegenwart geeigneter Ionen für das Redox-System dient, beispiels-
2+
weise von Cu -Ionen in alkalischem Medium oder Cu-Amminkomplexen.
In diesen Reaktionen können schließlich auch organische Redox-Systeme wie z. B. Chinon-Hydrochinon herangezogen
werden.
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Die Temperatur, bei der die Oxidationsreaktionen durchgeführt werden, ist hauptsächlich durch die Wärmebeständigkeit
der biologisch aktiven Verbindungen definiert und liegt
im Bereich von -5 bis +10 0C, vorteilhaft im Bereich von O
bis +5 0C.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen biologisch aktiven Stoffe können vorteilhaft verschieden geformte Copolymere
als wasserlösliche oder vernetzte Copolymere in Form von Blöcken, Platten, Röhren o. dgl. eingesetzt werden. Zur Anwendung
von biologisch aktiven Präparaten auf verschiedenen Applikationsgebieten sind kugelförmige, poröse vernetzte Copolymere
vorteilhaft geeignet. Diese Materialien sind durch eine hohe spezifische Oberfläche und demzufolge nach der
Bindung der biologisch aktiven Stoffe durch eine relativ hohe Aktivität gekennzeichnet. Derartige Materialien werden
deshalb bei verschiedenen Applikationsverfahren eingesetzt, beispielsweise bei verschiedenen Formen der Affinitätschromatographie,
bei Trenn- und Reinigungsvorgängen usw.
Die Erfindung wird im folgenden durch Beispiele näher erläutert.
Ein polymerer Träger wurde durch heterogene Suspensionscopolymerisation
eines Monomerengemisches aus Glycol-monomethacrylat,
Glycol-dimethacrylat und N-Äthyl-N-(2-methacroyläthyl)-Nf-acetyl-p-phenylendiamin
so hergestellt, daß das Endprodukt lh % des funktioneilen Monomeren enthielt und porö-
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sen Charakter mit einer spezifischen Oberfläche von 65,6 m /g
aufwies.
0,5 g dieses Materials wurden nach der sauren Hydrolyse in 10 ml einer 40 mg Trypsin enthaltenden 0,05 K M Borax-Lösung
suspendiert. Zu dieser Suspension wurden während 1 h 2 ml einer 0,01 M Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung in 0,05 M
Borax hinzugefügt. Das Gelmaterial mit dem gebundenen Enzym wurde anschließend in standardisierter Weise mit einer mit
Borax gesättigten 1 N NaCl-Lösung bei 5 0C, einer 1 N NaCl-Lösung
mit 0,1 N Acetatpuffer von pH = 4,7 und zum Schluß mit 0,01 N Acetatpuffer gewaschen. Im Anschluß daran wurde
die Aktivität des gebundenen Enzyms bestimmt. Die Festigkeit der Bindung wurde durch Bestimmung der gebundenen Aminosäuren
nach dem Waschen des Produkts mit einer 6 N Guanidinhydrochlorid-Lösung kontrolliert.
0,5 g des in Beispiel 1 beschriebenen polymeren Trägers wurden zur Bindung von Glucoseoxidase verwendet. 40 mg Glucoseoxidase
wurden in 10 ml einer 0,05 M Borax-Lösung mit dem Polymer vermischt und 1 h mit 2 ml einer 0,01 M Hexacyanoferrat-(III)-Lösung
in einer 0,05 M Borax-Lösung oxidiert. Nach dem Abfiltrieren des Reaktionsmediums wurde das polymere Material
mit einer 1 N NaCl-Lösung in 0,1 N NaHCO., sowie mit destilliertem Wasser gewaschen und in 0,1 M Phosphatpuffer übergeführt.
Die gemessene Aktivität der gebundenen Glucoseoxidase betrug 18,7 Einh./mg.
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Ein nach Beispiel 5 der CS-PS (vgl. die
CS-Patentanmeldung PV 7^13-7^) hergestellter Träger zur Herstellung
von trägergebundenem Chymotrypsin wurde nach dem Waschen mit destilliertem Wasser und Äthanol der sauren Hydrolyse
in verdünnter Salzsäure unterworfen. Dieses Polymer (0,5 g) wurde nach dem Waschen mit 50 mg in einem Ammonium-
Puffer von pH 10 gelöstem Chymotrypsin in Gegenwart von Cu -Ionen vermischt. Das Gemisch wurde unter Luftzutritt gerührt,
wobei der pH-Wert durch Zugabe von Natriumcarbonat auf dem Ausgangswert gehalten wurde. Nach 2-stündiger Reaktion wurde
das Reaktionsgemisch abfiltriert; nach dem Waschen wurde die
Aktivität des trägergebundenen Chymotrypsins zu 6,2*1 Einh.
ji
A2g0/min»mg«10 bestimmt.
Ein wie in Beispiel 1 hergestellter polymerer Träger wurde zur Bindung von Trypsin verwendet. 0,5 g des Polymeren
wurden mit einer Lösung von 50 mg Trypsin in 5 ml destilliertem
Wasser vermischt. Anschließend wurden 5 ml eines 22 mg
Hydrochinon enthaltenden Ammonium-Puffers hinzugefügt und 3 h bei 5 0C unter Luftzutritt gemischt. Nach dem Waschen
des polymeren Materials wurde die Aktivität des gebundenen Trypsins zu 5»O6 I.E./mg bestimmt.
In Gegenwart von 1 Mol Essigsäure wurde Pepsin durch
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Di"" *" '" ß '4 · y ir. J NACHCäEREICHTI
lit ο ο« » π 32, ü-^.iu^fwr. 10 I ——— J
Oxidationsreaktion unter Verwendung von Chinon als Oxidationsmittel
an das nach Beispiel 3 hergestellte Polymer gebunden.
An das nach Beispiel 3 hergestellte Polymer wurde Chymotrypsinogen
in Gegenwart von 0,1 IJ NaHCO- durch Oxidation
mit Hexacyanoferrat(III) nach Beispiel 1 gebunden; die Eigenschaften des Produkts wurden UV-spektrometrisch untersucht.
Die Menge des gebundenen Chymotrypsinogens betrug 100 mg/g Polymer.
Auf einen polymeren Träger nach Beispiel 1 wurde Trypsin durch ^Oxidation- arsensaure^frFüTtfe «3r Borax ^l
gebunden. Nach dem Waschen auf vorgeschriebene Weise wurde die enzymatische Aktivität des trägergebundenen Trypsins zu
6,2 I.E./mg bestimmt.
An das nach Beispiel 3 hergestellte Polymer wurde ChymotrypsIn/Gurch
Oxidationsreaktion unter Luftzutritt in Gegenwart eines Ammonium-Kupfer-Komplexes bei pH 11 gebunden. Das
Gemisch wurde 3 h bei O - 5 °C gerührt. Nach dem Waschen wurde die Menge des trägergebundenen Chymotrypsinogens zu 120 mg/g
Polymer bestimmt.
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NACHQEiFElOHT
Ein aus 2 g Cyclohexanol, 1 g Laurylalkohol, 2 g Athylenglycolmonomethacrylat, 0,5 g N-Äthyl-N-(2-methacaf*Oyläthyl)-N-acetyl-p-phenylendiamin,
0,5 g Athylenglycoldimethacryl· at und 0,015 g AIBN wurde bei 55 0C 6 h zwischen planparallelen
Platten zu einer porösen Schicht von 1 mm Dicke polymerisiert.
Die spezifische Oberfläche des erhaltenen Materials betrug
ρ
0,8 m /g. An das so hergestellte Material wurde Glucoseoxidase in einer 0,05 M Borax-Lösung durch Oxidation mit Hexacyanoferrat(III) nach Beispiel 2 gebunden. Die Aktivität der trägergebundenen Glucoseoxidase betrug ^>7 I.E./mg.
0,8 m /g. An das so hergestellte Material wurde Glucoseoxidase in einer 0,05 M Borax-Lösung durch Oxidation mit Hexacyanoferrat(III) nach Beispiel 2 gebunden. Die Aktivität der trägergebundenen Glucoseoxidase betrug ^>7 I.E./mg.
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Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung biologisch aktiver unlöslicher Verbindungen an einem Träger, der in der Seitenkette das
p-Phenylendiamingerüst enthält,
dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Polymer der allgemeinen Formel I
R1-CO-(0-CH2-CH2) χ - N - ((J) -NH2 (I),
in der
R. einen polymeren Rest und
R2 eine niedere Alkylgruppe bedeuten und
I^ χ ^ 4 ist,
in Gegenwart einer löslichen biologisch aktiven Verbindung, die eine primäre oder mehrere Aminogruppen enthält, wie z. B.
Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Hormone und Antigene, oxidiert«
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Oxidation mit Oxidationsmitteln durchgeführt wird, die die im Reaktionsgemisch anwesenden biologisch aktiven Stoffe
nicht schädigen und die z. B. unter Kaliumhexacyanoferrat(III),
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261301
Cu -Ionen in alkalischem Milieu und Alkalimetallarsenaten ausgewählt sind.
3« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation mit Sauerstoff in Gegenwart von Ionen für ein
2+
Redox-System wie Cu -Ionen in alkalischem Milieu oder Kupfer-Amminkomplexen durchgeführt wird.
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|---|---|---|---|
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Publications (1)
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|---|---|
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Family Applications (1)
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