DE2645466A1

DE2645466A1 - Verfahren zum isolieren von albumin aus plasmaprodukten

Info

Publication number: DE2645466A1
Application number: DE19762645466
Authority: DE
Inventors: Jan Haakan Bergloef; John Malcolm Curling; Lars Olof Edvard Lindquist
Original assignee: Pharmacia Fine Chemicals AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1975-10-09
Filing date: 1976-10-08
Publication date: 1977-04-21
Also published as: FR2327256B1; FR2327256A1; SE405549B; DE2645466C2; JPS5632317B2; JPS5247915A; SE7511295L; US4086222A; GB1554592A

Description

PATE NTAN WALTE

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER. DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPU-ING. FACHRICHTUNe CHEMIE D-B MÜNCHEN 19 . FLUG Θ EN STRAS SE 17 · TELEFON 089/177061 -TELEX Ο5-215145 ZEUS

TELEGRAMM KRAUSPATENT

1373 WK/nn

Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala / Schweden

Verfahren zum Isolieren von Albumin aus Plasmaprodukten

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Isolieren von Albumin aus Blutprodukten.

Die bislang zur Isolierung von Plasmaproteinen aus Blutprodukten bekannten Methoden sind fast ausschließlich auf der Fraktionierungsmethode nach Cohn aufgebaut, bei der kaltes Äthanol verwendet wird. Diese Methode wurde schon früh in den 1940er Jahren entwickelt (vgl. z.B. Cohn et al. "J. Am. Chem. Soc."68 (1946), Seiten 459 bis 475). Trotz der weiten Anwendung dieser Methode besitzt sie immer noch meh-

-2-

709816/11S5

rere Nachteile und Einschränkungen. So trägt z.B. die Verwendung von Äthanol zur Denaturierung und Inaktivierung von vielen wertvollen, biologisch aktiven Plasmaproteinen bei. Dazu kommt noch, daß das Verfahren komplex und zeitaufwendig ist, da es viele Behandlungsstufen umfaßt und nur absatzweise durchgeführt werden kann. Bei der Anwendung des Cohn-Verfahrens zum Isolieren von Albumin, das hauptsächlich als Plasmaexpander/Ersatzstoff verwendet wird, betragen die Mengen nur etwa 55 bis 60% (vgl. "Proc. Roy. Soc. Edinburgh (B)", 71 (Suppl.), 1972, Seite 31).

Der Bedarf an hochgereinigtem Albumin ist größer als die lieferbaren Mengen und es besteht daher ein dringendes Bedürfnis nach einem neuen und verbesserten Verfahren, um Albumin aus Plasmaprodukten zu isolieren. Dabei ist es insbesondere von Wichtigkeit, die Ausbeute zu erhöhen, da die verfügbaren Mengen des Rohmaterials begrenzt sind.

Durch die Erfindung wird nun diesem Erfordernis Genüge getan und ein neues Verfahren zum Isolieren von Albumin zur Verfügung gestellt. Bei diesem Verfahren können erheblich höhere Gesamtausbeuten - in der Gegend von 90% oder mehr erhalten werden als bei den bislang bekannten Fraktionierungsmethoden und das dabei erhaltene Albuminprodukt hat mindestens den gleichen Reinheitsgrad wie die Produkte, die nach den bekannten Fraktionierung smetho den erhalten werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt nur weniger Behandlungsstufen. Es werden keine Lösungsmittel, wie Äthanol, die das Protein zerstören, verwendet, sondern lediglich wäßrige Lösungen. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Ver-

-3-

709816/1 155

fahren vorzugsweise als kontinuierlicher und automatisierter Prozeß gestaltet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren baut sich auf einer zweistufigen chromatographischen Ionenaustauscherabtrennung einer spezifischen Plasmafraktion, die im wesentlichen von den Koagulationsfaktoren I, II, VII, VIII, IX und X und auch von dem Hauptteil von IgG. frei ist, auf. Solche Plasmafraktionen können in an sich bekannter Weise aus menschlichen und nicht-menschlichen Blutprodukten hergestellt werden, z.B. aus Blutplasma, Blutserum, Placentablutserum oder Placentaextrakt. Die fraglichen Koagulationsfaktoren werden durch herkömmliche Methoden, z.B. durch Cryoausfällung (Faktoren I und VIII, vgl. z.B. Pool, J.G. Thromb »Diath. Haemorrhag», Suppl. 35 (1967), Seiten 35 bis 40) und Adsorption, beispielsweise auf Anionenaustauscherpolymeren (Faktoren II, VII, IX und X, Vgl. z.B. J. Heystek et al »Vox Sang.» 25 (1973), Seiten 113 bis 123 und 29 (1975), Seiten 177 bis 183), eliminiert. Der Hauptteil von IgG wird (zusammen mit unter anderen Lipoproteinen, Makroglobulinen und restlichem Fibrinogen) vorzugsweise durch Ausfällung mit beispielsweise Polyäthylenglycol (PEG) eliminiert (vgl. z.B. A. Poison et al., »Vox Sang." 23 (1972), Seiten 107 bis 118). Das Ausfällungsprodukt dieses Ausfällungsschrittes, d.h. die albuminarme Fraktion, kann zur Gewinnung von IgG und anderen Plasmaproteinen gesammelt werden, während die albuminreiche Fraktion als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird. Es ist zu betonen, daß das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf die Anwendung von Plasmaausgangsmaterialien begrenzt ist, die in irgendeiner besonderen Weise hergestellt worden sind. Vielmehr können

-4-

709816/1155

alle beliebigen Plasmafraktionen, die den oben angegebenen Erfordernissen genügen, z.B. auch die Fraktionen V, IV + V oder IV des Cohn-Prozesses, verwendet werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der pH-¥ert des oben definierten Ausgangsmaterials auf etwa 5 bis 7,5, vorzugsweise 6,5 bis 7, eingestellt. Diese Albuminlösung wird sodann zwei verschiedenen chromatographischen Auftrennungen mittels Ionenaustauschern, beispielsweise einer Auftrennung auf einem Anionenaustauscher und einer anderen" auf einem Kationenaustauscher, unterworfen. Die zwei Ionenaustauschertrennungen können in willkürlicher Reihenfolge durchgeführt werden, wobei jedoch bevorzugt wird, mit der Auftrennung auf dem Anionenaus tauscher zu beginnen und sodann mit der Auftrennung auf dem Kationenaustauscher fortzuschreiten. Bei den zwei chromatographischen Auftrennungsstufen werden wäßrige Puffersysteme verwendet, nämlich ein Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bis 4,9 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1 für die Auftrennung auf dem Anionenaustauscher und ein Puffer mit einem pH-Wert von 5,2 bis 6,5 und einer Ionenstärke von 0,1 bis 0,05 für die Auftrennung auf dem Kationenaustauscher. Beide Auftrennungen werden vorzugsweise als herkömmliche säulenchromatographische Vorgänge durchgeführt. Jedoch können im Prinzip auch eine oder beide dieser Stufen auch absatzweise durchgeführt werden, indem beispielsweise eine Suspension des Ionenaustauschers, des Albumin enthaltenden Ausgangsmaterials und des jeweiligen Puffers gerührt werden, obgleich dieses Vorgehen vom praktischen Standpunkt aus gesehen weniger gut geeignet ist. Bei den oben angegebenen Bedingungen werden Verunreinigungen, jedoch nicht das Albumin auf dem Ionenaustauscher adsorbiert.

-5-

7 0 9 8 16/1155

- * - 26A546B

Somit liegt bei jeder der zwei Auftrennungsstufen, das Albumin in dem Eluat (wenn Ionenaustauschersäulen verwendet werden) oder in dem Filtrat, nachdem der Ionenaustauscher abgefiltert worden ist (bei absatzweiser Durchführung des Verfahrens) vor. Die Ausbeute des Albumins über die zwei chromatographischen Ionenaustauschertrennstufen ist praktisch quantitativ (und beträgt im allgemeinen > 99%) und die erhaltene Albuminlösung ist sehr rein (reiner als 96%).

Bei der Ausführungsform bei der.die erste Trennungsstufe auf einem Ionenaustauscher und die zweite Trennungsstufe auf einem Kationenaustauscher durchgeführt wird, wird es bevorzugt, die Trennung auf dem Anionenaustauscher mit einer Einführungswaschstufe zu beginnen, bei der ein Puffer mit einem pH-Wert von etwa 5 bis 5,5 und einer Ionenstärke von etwa 0,025 bis 0,1 verwendet wird. Hierdurch werden unter anderem möglicherweise vorhandenes Hämoglobin und restliches IgG in dem Eluat eliminiert, das verworfen oder gewünschtenfalls zur Isolierung beispielsweise dieser Komponenten weiterbehandelt wird. Das Albumin wird sodann mittels des oben angegebenen Puffers mit einem pH-Wert von 4,5 bis 4,9 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1 eluiert. Das albuminreiche Eluat wird zur nachfolgenden Behandlung auf dem Kationenaustauscher gesammelt.

Das albuminreiche Eluat von der Behandlung des Anionenaustauscher s wird auf einen pH-Wert von 5,2 bis 6,5, vorzugsweise 5,2 bis 5,7, und eine Ionenstärke von 0,1 bis 0,05 eingestellt und sodann auf dem ationenaustauscher mittels eines Puffers mit dem gleichen pH-Wert und der gleichen Ionenstärke herauseluiert. Das erhaltene Eluat, das hochgereinigtes Albumin enthält, wird sodann in an sich bekannter Weise aufgearbeitet.

-6-

709816/1155

Wie oben bereits ausgeführt wurde, können die zwei Ionenaustauscher-Trennungsstufen in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden, d.h. man behandelt zunächst die wie oben definierte Ausgangsfraktion auf dem Kationenaustauscher und man behandelt sodann die bei dieser Trennung erhaltenen albuminreichen Fraktionen auf dem Anionenaustauscher. Auch in diesem Falle wird die Albuminfraktion auf dem Kationenaustauscher mittels eines wäßrigen Puffers mit einem pH-Wert von 5,2 bis 6,5, vorzugsweise 5,2 bis 5,7, und einer Ionenstärke von 0,1 bis 0,05 eluiert. Bei dieser Ausführungsform ist es jedoch bei der nachfolgenden Behandlung auf dem Anionenaustauscher nicht erforderlich, eine Einführungswaschstufe mit einem pH-Wert von 5 bis 5,5 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1 vorzunehmen. Es ist jedoch möglich, das Albumin direkt mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bis 4,9 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1 zu eluieren, wobei das Eluat hochgereinigtes Albumin enthält, das zur Aufarbeitung fertig ist.

Nachdem die Ionenaustauscher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet worden sind, werden sie vorzugsweise zur Wiederverwendung bei dem Verfahren regeneriert. Die Regenerierung wird in an sich bekannter Weise, vorzugsweise durch Waschen mit dem gleichen Typ des Puffersystems, durchgeführt, das für die Trennungsbehandlungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet wird. Die Eluate der Regenerierungswaschstufe enthalten einige Blutkomponenten, die gewünschtenfalls isoliert werden können.

Die albuminreiche Fraktion, die bei der zweistufigen chromatographischen Trennung auf dem Anionenaustauscher und dem

-7-

709816/1 155

Kationenaustauscher erhalten wird (und die z.B. einen Albumingehalt in der Größenordnung von 2% hat), wird in herkömmlicher Weise" aufgearbeitet, d.h. im wesentlichen durch eine Entsalzung (z.B. durch Gel- oder Membranfiltration), Einengung auf die gewünschte Konzentration, z.B. auf eine 5-, 20- oder 259^ige Lösung, sterile Filtration und Wärmebehandlung gegen möglicherweise zurückgebliebene Hepatitisviren. Diese Aufarbeitungsstufen sind bekannt (vgl. z.B. J. Porath et al., "Nature" 183 (1959), Seite 1657, und «British Pharmacopaeia (1973), Seite 60). Sie bilden keine besonders kennzeichnenden Merkmale für das erfindungsgemäße Verfahren. Vielmehr ist das Hauptmerkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Kombination der oben beschriebenen zweistufigen Trennung auf Anionen- und Kationenaustauschern zu sehen, die auf das oben definierte besondere Ausgangsmaterial angewendet wird.

Bei den verschiedenen chromatographischen Trennvorgängen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jedes beliebige wäßrige Puffersystem verwendet werden, das den gewünschten pH-Wert und die gewünschte Ionenstärke liefert und das gegenüber den vorhandenen Proteinkomponenten, insbesondere dem Albumin, beständig ist. Das gleiche Puffersystem wird vorzugsweise sowohl für die Trennung auf dem Ionenaustauscher als auch auf dem Kationenaustauscher verwendet. Die bevorzugten Puffersystem sind Acetatpuffer, Citratpuffer und dergleichen.

Die Auswahl des Anionen- und Kationenaustauschers ist nicht kritisch. Vielmehr kann im Prinzip jeder beliebige Typ eines Ionenaustauschers verwendet werden, der auf das Albumin

-8-

709816/1155

nicht denaturierend wirkt. Es ist bereits eine große Anzahl von solchen Ionenaustauschern bekannt und im Handel erhältlich. Solche Ionenaustauscher sind aus einer Matrix eines hydrophilen organischen Polymeren aufgebaut, welches zwar unlöslich ist, aber dazu imstande ist, in Wasser aufzuquellen, und das chemisch gebundene Ionenaustauschergruppen enthält. Die Matrix ist vorzugsweise ein Polymeres auf der Grundlage eines Polysaccharide, z.B. ein vernetztes Dextran, Agarose, eine vernetzte Agarose, Cellulose und eine vernetzte Cellulose.

Die Auswahl der spezifischen Ionenaustauschergruppen der Matrix ist ebenfalls nicht sehr kritisch. Vielmehr können im Prinzip alle Arten von bekannten Ionenaustauschergruppen verwendet werden.Die Anionenaustauschergruppen können z.B. aromatische oder aliphatische Aminogruppen, vorzugsweise Dialkylaminoalkylgruppen, z.B. Diäthylaminoäthylgruppen, oder quaternäre Aminoalkylgruppen, z.B· Triäthanolamino- oder Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylgruppen, sein. Die Kationenaustauschergruppen können z.B. SuIfonat-, Sulfat-, Phosphono-, Carboxyl- oder phenolische Hydroxylgruppen, vorzugsweise Carboxymethylgruppen oder Sulfoalkylgruppen, wie z.B. Sulfoäthyl- und Sulfopropylgruppen, sein.

Die obengenannten Alkylgruppen enthalten bis zu 6 Kohlenstoff atome und insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Die Ionenaustauschergruppen können an die Matrix mittels beispielsweise Äther-, Ester- oder Glycerylbindungen angeheftet sein. Die Herstellung der gelbildenden Matrizen und ihre Substitution mit Ionenaustauschergruppen sind bekannte Techniken, vgl. z.B. US-PS'en 3 275 576, 3 277 025 und 3 629 230,

-9-

70981 6/1155

GB-PS 1 013 585 und E.A. Peterson "Cellulosic ion exchangers", North Holland Publishing Co. Amsterdam, London, 1970.

Besonders gut geeignete Anionenaustauscher sind DEAE-Sephadex und DEAE-Sepharose, erhältlich von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden. Diese bestehen aus diäthylaminoäthylsubstituiertem vernetzten Dextran bzw. Agarose. SP-Sephadex, ein sulfopropylsubstituiertes vernetztes Dextran der gleichen Firma, stellt einen besonders gut geeigneten Kationenaustauscher dar, wie z.B. auch sulfopropylsübstituierte vernetzte Agarose.

Die Kapazität der bei dem erfindungsgemäßen "Verfahren verwendeten Ionenaustauscher kann innerhalb ziemlich breiter Grenzen variieren. Die Anionenaustauscher haben eine Ionenaustauschkapazität von 0,1 bis 4,0 mÄq/g (Trockengewicht), während die Kapazität der Kationenaustauscher 0,2 bis 5,0 (Trockengewicht) beträgt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Anionenaustauscher vom Typ einer vernetzten, insbesondere DEAE-substituierten Agarose verwendet, und das Albumin wird mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4,7 bis 4,9 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,05, vorzugsweise nach dem Waschen mit einem Puffer mit einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 5,2 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,05, eluiert. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Anionenaustauscher vom Typ vernetztes, insbesondere DEAE-substituiertes Dextren verwendet und das Albumin wird mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bis 4,7 und einer Ionenstärke von 0,05 bis 0,1,

-10-

709816/1155

vorzugsweise nach dem Waschen mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 5,0 bis 5,5 und einer Ionenstärke von 0,05 bis 0,1, eluiert.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Diese beschreiben einige spezielle Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Isolieren von Albumin.

Beispiel 1

a) Abtrennung der Faktoren I und VIII:

400 ml menschliches Blut wurden in 60 ml ACD-Lösung (22,0 g Trinatriumcitrat, 8,0 g Zitronensäure und 24,5 g Dextrose pro 1 Lösung) gesammelt. Nach 30-minütigem Zentrifugieren bei 1350 g und bei einer Temperatur von +4 C wurde das Plasma von der Zellsuspension abgetrennt. Das Plasma wurde bei -30⁰C eingefroren und bei +4⁰C aufgetaut. Das Cryofällungsprodukt, Vielehes Fibrinogen (Faktor I) und Faktor VIII enthielt, wurde durch 30-minütiges Zentrifugieren bei 1350 g und +4⁰C entfernt.

b) Abtrennung der Faktoren II, VII, IX und X:

0,15 g (Trockengewicht) DEAE-Sephadex A-50 (DEAE-substituiertes vernetztes Dextran von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) wurde in einer 0,075M-NaCl-Losung quellen gelassen und dreimal dekantiert. Der gequollene Ionenaustauscher wurde 0,5 h bei 121⁰C im Autoklaven behandelt, mit 1M-NaCl gewaschen und in 0,075M-NaCl suspendiert. Er wurde zu 100 ml des Überstands der Stufe a) gegeben. Die

-11-

709816/1155

Suspension wurde 45 min lang gerührt. Sodann wurde das DEAE-Sephadex A-50-Gel mit den adsorbierten Faktoren II, VII, IX und X abfiltriert, während das Filtrat eingefroren und bei -20⁰C gelagert wurde.

c) Abtrennung von IgG:

Die gefrorene Plasmafraktion der Stufe b) wurde bei +4⁰C aufgetaut und der pH-Wert wurde mit 0,5M-NaOH-Losung auf 8,0 eingestellt. 12,0 g Polyäthylenglycol (MG 3000 bis 3700) wurden zu 100 ml der auf den pH-Wert eingestellten Plasmafraktion gegeben. Nach 30-minütigem Rühren bei +4⁰C wurde das gamma-G-Globulin enthaltende Ausfällungsprodukt durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 1800 g und +4⁰C entfernt. Der Überstand wurde mit 0,5M-HCl von +4⁰C auf einen pH-Wert von 4,8 eingestellt. Sodann wurde eine weitere Menge von Polyäthylenglycol 4000 zugesetzt, bis eine Endkonzentration von 22% (Gewicht/Volumen) erhalten wurde. Das Gemisch wurde 30 min lang bei +4⁰C gerührt und das Albumin enthaltende Ausfällungsprodukt wurde durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 1800 g und +4⁰C gesammelt. Das Ausfällung sprodukt wurde bei +4⁰C in destilliertem Wasser aufgelöst und der pH-Wert wurde mit 0,5M-NaOH auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung (Lösung Pg) enthielt 75 mg Albumin pro ml.

d) Reinigung auf dem Anionenaustauscher:

1,5 g DEAE-Sephadex A-50 wurden in 1M-Natriumacetatlösung gequollen und in einen OjOSM-Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 5,2 und einer Ionenstärke (i) von

-12-

709816/11S5

0,05 eingegeben. Das Ganze wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 26 mm zu einer Betthöhe von 87 mm und zu einem Gesamtvolumen V^. von 46 ml eingepackt. Die Säule wurde mit 2 χ V+ Natriumacetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 5,2 und I = 0,05 gewaschen. 20 ml der in der Stufe c) erhaltenen Lösung P₂ (enthaltend 75 mg Albumin/ml) wurden sodann auf die Säule gegeben, die hierauf mit 100 ml Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,2 und I = 0,05 gewaschen wurde. Die Säule wurde hierauf mit einem Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 4,7 und I = 0,1 bei einem . Eluierungsverhältnis von 100 ml/h, was 19 cm/h entspricht, eluiert. Die Albumin enthaltende Fraktion (Fraktion DE2) - 50 ml - wurde gesammelt.

Der pH-Wert wurde mit 0,5M-NaOH auf 5,2 eingestellt. Die Leitfähigkeit wurde durch Verdünnung mit destilliertem Wasser auf den ursprünglichen Wert der DE2-Fraktion eingestellt.

Die DEAE-Sephadex-Säule wurde regeneriert, indem sie mit Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 4,0 und I = 0,15 zur Eluierung von restlichem Proteinmaterial und sodann mit dem Ausgangspuffer Natriumacetat/Essigsäure mit einem pH-Wert von 5,2 und I = 0,05 gewaschen wurde.

e) Reinigung auf dem Kationenaustauscher:

1,5 g SP-Sephadex C-50 (sulfopropylsubstituiertes vernetztes Dextrangel von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) vrurden in einem Ο,ΙΜ-Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 5,2 und I = 0,1 quellen gelassen und

-13-

709816/1155

in eine Säule mit einem Durchmesser von 26 mm zu einer Höhe von 70 mm und einem Gesamtvolumen V+ von 37 ml eingepackt. Die Säule wurde mit 2 χ V+ des Quellungspuffers gewaschen. 50 ml der DE2-Fraktion von der Stufe d) (pH-Wert 5,2, I = 0,1) wurden auf die Säule aufgegeben. Die Albumin enthaltende Fraktion wurde sofort mit dem gleichen Puffer (pH-Wert 5,2, I = 0,1) mit einer Eluierungsgeschwindigkeit von 100 ml/h, was 19 cm/h entspricht, eluiert. Es wurden 85 ml gesammelt. Die Säule wurde regeneriert, indem sie mit Natriumacetat/Essigsäure-Puffer, pH-Wert 8,0, I = 0,4, zur Eluierung von restlichem Protein und sodann mit dem Ausgangspuffer, Natriumacetat/Essigsäure-Puffer, pH-Wert 5,2, I = 0,1, gewaschen wurde.

f) Aufarbeitung:

110 g Sephadex G-25 Fine (vernetztes Dextrangel von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) wurden in destilliertem Wasser quellen gelassen und in eine Säule mit einem Durchmesser von 50 mm zu einer Betthöhe von 25 cm und einem Gesamtvolumen von 495 ml eingepackt. 50 ml der gereinigten Albumin enthaltenden Fraktion der Stufe e) wurden auf die Säule aufgegeben und mit destilliertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von 495 ml/h, was 25 cm/h entspricht, eluiert. Das salzfreie Albumin wurde gesammelt - 95 ml - und lyophilisiert.

Das lyophilisierte Albumin wurde zu einer Konzentration von 20% (Gewicht/Volumen) in physiologischer Kochsalzlösung, die 0,004M-Natriumcaprylat enthielt, aufgelöst. Der pH-Wert wurde mit Natriumbicarbonat auf 6,8 eingestellt. Das End-

-14-

7 0 9 8 16/1155

produkt wurde durch sterile Filtration durch ein 0,22 mii-Filter und 10-stündige Wärmebehandlung bei 60 - 0,5°C erhalten. Die Reinheit und die Identität des Endprodukts wurden durch Gradientenelektrophorese auf Polyacrylamidgel, gekreuzte Immunoelektrophorese, Immunodiffusion und Gelfiltration auf Sephadex G-150 (vernetztes Dextrangel von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) überprüft. Es stellte sich heraus, daß das Produkt mehr als 96% menschliches Plasmaalbumin bei einer Arbuminpolymerkonzentration von weniger als 3,5% enthielt. Die Gesamtausbeute war größer als 90%. Die Ausbeute an Albumin über die Anionen- und Kationenaustauscherstufen (d und e) war größer als 99%.

Beispiel 2

120 ml einer sedimentierten Suspension von DEAE-Sepharose (DEAE-substituiertes vernetztes Agarosegel von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) wurden mit 300 ml 1M-Natriumacetat gewaschen und in einen Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit pH-Wert 5,0 und I = 0,025 überführt. Das Gemisch wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 50 mm zu einer Betthöhe von 60 mm und einem Gesamtvolumen (V^) von 120 ml eingepackt. Die Säule wurde mit 2 χ V^ Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,0 und I = 0,025 gewaschen. Es wurden 30 ml Albuminlösung der Stufe c) des Beispiels 1 aufgegeben (Lösung P₂, 75 mg Albumin/ml). Hierauf wurde die Säule mit dem Ausgangspuffer (pH-Wert 5,0, I =s 0,025) gewaschen. Die Waschfraktionen wurden verworfen. Sodann wurde die Albumin enthaltende Fraktion mit Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,9 und I = 0,05 eluiert (Eluierungsgeschwindigkeit 25 cm/h) und 90 ml wurden gesammelt.

-15-

709816/1155

Die Ionenstärke der erhaltenen Lösung wurde auf 0,1 erhöht und der pH-Wert wurde durch Zugabe von Natriumacetat auf 5,2 eingestellt. Diese Fraktion wurde auf einer SP-Sephadex-Säule behandelt und wie im Beispiel 1, Stufen e) bzw. f), aufgearbeitet. Das Endprodukt war rein und es wurde mit der gleich hohen Ausbeute wie im Beispiel 1 erhalten.

Die DEAE-Sepharose-Säule wurde regeneriert, indem sie mit Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 4,0 und I = 0,05 zur Eluierung von restlichem Protein und sodann mit 2 χ V+ Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 5,0 und I = 0,025 gewaschen wurde.

Beispiel 3

1,0 g CM-Sephadex C-50 (carboxymethylsubstituiertes vernetztes Dextrangel von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsale, Schweden) wurde im Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 6,2 und I = 0,1 quellen gelassen. Das Gemisch wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 16 mm zu einer Betthöhe von 17,5 cm und einem Gesamtvolumen (V^) von 35 ml eingepackt. Die Säule wurde mit 2 χ V^ Ausgangspuffer mit einem pH-Wert von 6,2 und I = 0,1 gewaschen. 20 ml Albumin enthaltende Lösung von der Stufe c) des Beispiels (Lösung Pp, 75 mg Albumin/ml) wurden auf die Säule aufgegeben. Die Albumin enthaltende Fraktion wurde mit dem gleichen Puffer mit einem pH-Wert von 6,2 und I = 0,1 eluiert (Eluierungsgeschwindigkeit 19 cm/h) und es wurden 32 ml gesammelt.

-16-

709816/1 155

Der pH-Wert dieser Fraktion wurde - ohne Veränderung der Ionenstärke - durch Zugabe von 1M-Essigsäure auf einen Wert von 4,7 verringert. Die Fraktion wurde weiter auf DEAE-Sephadex in Analogie zur Stufe d) des Beispiels 1 (Eluierung bei einem pH-Wert von 4,7 und I s 0,1) gereinigt und wie in Stufe f) des Beispiels 1 aufgearbeitet. Das Endprodukt war genauso rein wie dasjenige des Beispiels 1 und es wurde mit der gleich hohen Ausbeute erhalten.

-17-

709816/1155

Claims

Patentansprüche

1.) Verfahren zum Isolieren von Albumin aus Plasmaprodukten, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Plasmafraktion, die Albumin in gelöster Form enthält und die im wesentlichen von den Koagulationsfaktoren I, II, VII, VIII, IX und X und auch von dem Hauptteil des IgG frei ist, in beliebiger Reihenfolge einerseits auf einem Anionenaustauscher und andererseits auf einem Kationenaustauscher auftrennt, wobei man die Auftrennungen durch Eluierung mit wäßrigen Puffersystemen durchführt und die albuminreichen Fraktionen nach jeder Auftrennung sammelt und wobei man die albuminreiche Fraktion von der zweiten chromatographischen Stufe entsalzt und in bekannter Weise aufarbeitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Auftrennung durch Säulenchromatographie durchführt, wobei man das Albumin auf der Anionenaustauschersäule mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bis 4,9 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1 eluiert und wobei man das Albumin auf der Kationenaustauschersäule mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 5,2 bis 6,5 und einer Ionenstärke von 0,1 bis 0,05 eluiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Auftrennung auf dem Kationenaustauscher einen wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 5,2 bis 5,7 verwendet.

-18-

709 818/1136

ORIGINAL INSPECTED

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man die Auftrennung auf dem Anionenaustauscher vor der Auftrennung auf dem Kationenaustauscher vornimmt und daß man ein Waschen mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 5 bis 5,5 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1 durchführt, bevor man die albuminreiche Fraktion bei einem pH-Wert von 4,5 bis 4,9 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1 eluiert.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man Acetat- oder Citratpuffer als wäßrige Puffersysteme verwendet.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaustauscher Matrizen von hydrophilen organischen Polymeren verwendet, die wasserunlöslich, jedoch mit Wasser quellbar sind und die mit Ionenaustauschergruppen substituiert sind.

7 0 9 8 16/1155