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DE2539219A1 - Radioimmunologisches untersuchungsverfahren zur in-vitro-bestimmung der renin-aktivitaet und besteck zur durchfuehrung dieses verfahrens - Google Patents

Radioimmunologisches untersuchungsverfahren zur in-vitro-bestimmung der renin-aktivitaet und besteck zur durchfuehrung dieses verfahrens

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Publication number
DE2539219A1
DE2539219A1 DE19752539219 DE2539219A DE2539219A1 DE 2539219 A1 DE2539219 A1 DE 2539219A1 DE 19752539219 DE19752539219 DE 19752539219 DE 2539219 A DE2539219 A DE 2539219A DE 2539219 A1 DE2539219 A1 DE 2539219A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
angiotensin
unknown
reaction mixture
radioimmunological
generated
Prior art date
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Pending
Application number
DE19752539219
Other languages
English (en)
Inventor
James Lee Brown
Joel Glovsky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mallinckrodt Inc
Original Assignee
Mallinckrodt Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mallinckrodt Inc filed Critical Mallinckrodt Inc
Publication of DE2539219A1 publication Critical patent/DE2539219A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
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Description

PATENTANWÄLTE
DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER . DR.-ING. ANN EKÄTE WEISERT DIPL.-1NG. FACHRICHTUNS CHEMIE D - 8 MÜNCHEN 19 · FLÜ SGENSTRAS S E 17 · TELEFON 089/177061 · TELEX O5-215145 ZEUS
TELEGRAMM KRAUSPATENT
1137/WK/rm
Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Mo. / USA
Radioimmunologisches Untersuchungsverfahren zur in-vitro-BeStimmung der Renin-Aktivität und Besteck zur Durchführung dieses Verfahrens
Die Erfindung betrifft in vitro durchgeführte radioimmunologische Analysenverfahren und insbesondere ein verbessertes radioimmunologisches Untersuchungsverfahren zur Analyse bzw. Bestimmung der Plasma-Renin-Aktivität.
Hochdruckkrankheiten werden oftmals von hohen Aldosterongehalten im Blut begleitet. Beim primären Aldosteronismus rührt dieser Zustand von einer Krankheit her, die direkt
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die Nebennierendrüse betrifft. Bei renalen Gefäßkrankheiten können andererseits hohe Aldosteronwerte von hohen Konzentrationen von Angiotensin II im Blut herrühren. Angiotensin II ist ein potenter Vasopressor und es stimuliert die Bildung von Aldosteron durch die Nebennierendrüse. Somit können sowohl beim primären Aldosteronismus als auch bei renalen Gefäßkrankheiten im Blut hohe Aldosteronwerte beobachtet werden und der Aldosterongehalt stellt daher als solcher noch keine Basis dar, um eine Unterscheidung zwischen zwei unterschiedlichen Gründen für eine Hypertonie vorzunehmen.
Es ist bekannt, daß der primäre Aldosteronismus von der durch Angiotensin II induzierten Aldosteronausscheidung unterschieden werden kann, wenn man die Plasma-Renin-Aktivität bestimmt. Renin ist ein proteolytisches Enzym, das von den juxtaglomulären Zellen der Niere abgeschieden wird. Angiotensinogen, ein durch die Leber gebildetes oü -2-Globulin, wird durch Renin in das Decapeptid Angiotensin I umgewandelt. Obgleich das Angiotensin I selbst biologisch inaktiv ist, wird es im Lungenkreislauf zu Angiotensin II umgewandelt. Bei Patienten, die an einem renalen Hochdruck leiden, ist die Plasma-Renin-Aktivität und somit die Angiotensinerzeugungsrate hoch, während beim primären Aldosteronismus die Renin-Aktivität niedrig ist.
Es sind bereits bioanalytische Techniken bekannt, um die Plasma-Renin-Aktivität zu bestimmen. Die Durchführung von Bestimmungen der Renin-Aktivität ist durch die Entwicklung von radioimmunologischen Analysentechniken für diese Messung stark verbessert worden. Die radioimmunologische Analyse ist eine Methode, die sich auf der Erscheinung der
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konkurrierenden Proteinbindung aufbaut. Hierbei wird ein Reaktionssystem bereitet, welches eine bekannte Menge eines radioaktiv markierten Antigens, eine unbekannte Menge des nicht-markierten Antigens, das bestimmt werden soll, und eine Standardmenge eines Antikörpers für das Antigen enthält. Das System wird bei vorgewählter Temperatur über einen vorgewählten Zeitraum inkubiert, der ausreichend ist, daß die Konkurrenzreaktion des markierten und des nicht-markierten Antigens mit dem Antikörper bis zu einem analytisch signifikanten Ausmaß fortschreitet. Sodann wird die Verhältnismenge des markierten Antigens, das an den Antikörper gebunden ist, im Untersuchungsreaktionssystem durch eine radioaktive Zählung bestimmt. Diese Bestimmung liefert auch die Verhältnismenge des nicht-markierten Antigens, das an den Antikörper gebunden ist, und durch Rückschluß die Menge des nicht-markierten Antigens, die anfänglich in das Reaktionssystem eingegeben wurde.
Untersuchungen über die konkurrierende Proteinbindung werden herkömmlicherweise anhand der folgenden Reaktionsgleichungen erläutert;
Ag* + Ab χ > Ag*Ab
Ag
iAb
Darin bedeutet
Ag* radioaktiv markiertes Antigen Ag nicht-markiertes Antigen
Ab Antikörper spezifisch für Ag/Ag* Ag*Ab markierter Antigen-Antikörper-Komplex ^ AgAb nicht-markierter Antigen-Antikörper-Komplex
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Vorausgesetzt, daß- die Gesamtmenge von markierten und nicht-markierten Antigenen im Überschuß vorliegt, konkurriert das nicht-markierte Antigen von einer unbekannten Probe mit dem markierten Antigen nach den Bindungsstellen auf dem Antikörper. Für gegebene Mengen des Antikörpers und des markierten Antigens nimmt die Verhältnismenge des an den Antikörper gebundenen markierten Antigens mit steigenden Mengen von nicht-markiertem Antigen in dem Reaktionssystem ab. Bei Verwendung von bekannten Standardmengen von nicht-markiertem Antigen können Werte entwickelt werden, die das Verhältnis von gebundenem zu freiem markierten Antigen zu der Menge des nicht-markierten Antigens in dem Reaktionssystem in Beziehung setzen. Eine aus solchen Werten erstellte Kurve kann sodann dazu verwendet werden, um die Mengen des nicht-markierten Antigens in einem Testreaktionssystem zu bestimmen, in das eine Probe eingegeben worden ist, welche eine unbekannte Menge des nicht-markierten Antigens enthält.
Da derzeit keine radioimmunologischen Analysenmethoden zur direkten Bestimmung der Reninmenge in einer Plasmaprobe verfügbar sind, wird die Renin-Aktivität anhand der Geschwindigkeit der Bildung von Angiotensin I in der Probe gemessen. Es sind Methoden verfügbar, bei denen eine Plasmaprobe aufgeteilt wird, wobei ein Teil kalt gehalten . wird, um eine signifikante Bildung von Angiotensin I zu verhindern, und eine andere Teilprobe bei erhöhter Temperatur, z.B. Körpertemperatur, inkubiert wird, um die Bildung von Angiotensin I durch Einwirkung von Renin auf Angiotensinogen zu bewirken. Dem Bildungsgemisch werden Inhibitoren zugesetzt, um die Bildung von Angiotensin II durch Einwirkung von umwandelnden Enzymen auf Angiotensin I
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oder die Zerstörung von Angiotensin I durch verschiedene proteolytische Enzyme zu verhindern. Nach Beendigung der Bildungsstufe werden sowohl die Bildungsprobe als auch die Grundprobe, die kalt gehalten wurde, zur Bestimmung des Angiotensin-I-Gehalts einer radioimmunologischen Analyse unterworfen. Die Differenz zwischen dem Angiotensin-I-Gehalt der Bildungsprobe und demjenigen der Grundprobe kann durch die Bildungszeit dividiert werden, wodurch die Renin-Aktivität, ausgedrückt als Angiotensin I, gebildet pro Volumeneinheit pro Zeiteinheit, bestimmt werden kann.
Ein schwerwiegender Nachteil der derzeit verfügbaren radioimmunologischen Untersuchungsmethoden zur Bestimmung der Renin-Aktivität ist die Notwendigkeit, die radioimmunologische Stufe in der Kälte, typischerweise bei 4°C, durchzuführen. Aufgrund der Anwesenheit von Renin sowohl in der Grundprobe als auch in der Bildungsprobe hat man es bislang für erforderlich gehalten, bei derart niedrigen Temperaturen zu arbeiten, um Fehler zu vermeiden, die durch Bildung oder Zerstörung von Angiotensin I während der radioimmunologischen Analyse eingeführt werden könnten. Als Folge der angewendeten niedrigen Temperaturen ist der Zeitraum für eine angemessene Reaktion lang, z.B. 18 bis 24 h. Solche langen Inkubationszeiten sind aber offensichtlich unzweckmäßig und sie machen die Analyse teurer.
Es besteht daher ein Bedürfnis nach einer verbesserten radioimmunologischen Analysenmethode zur Bestimmung der Plasma-Renin-Aktivität, bei der keine ausgedehnte Inkubationsperiode erforderlich ist, welche bislang zur Vermeidung einer nicht-beabsichtigten Bildung von Angiotensin I als erforderlich angesehen wurde.
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Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte radioimmunologische Untersuchungsmethode zur Bestimmung der Plasma-Renin-Aktivität zur Verfügung zu stellen. Insbesondere soll die radioimmunologische Untersuchung innerhalb einer erheblich kürzeren Zeitspanne durchgeführt werden können, als es bislang als möglich angesehen wurde. Weiterhin soll bei dieser Methode eine scharfe, definierte Trennung zwischen gebundenem und nicht-gebundenem markierten Angiotensin I realisiert werden können.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Gegenstand der Erfindung ist daher ein radioimmunologisches Untersuchungsverfahren zur in-vitro-Bestimmung der Renin-Aktivität einer unbekannten Plasmaprobe. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst eine unbekannte Bildungsprobe hergestellt, indem man die unbekannte Plasmaprobe mit einer Bildungspuff er lösung und einem Inhibitor für Enzyme, die Angiotensin I in andere Substanzen umwandeln, vermischt. Die unbekannte Bildungsprobe wird inkubiert, um durch Einwirkung von Renin auf Angiotensinogen Angiotensin I zu bilden. Auf diese Weise wird eine generierte unbekannte Probe erzeugt. Ein generiertes unbekanntes radioimmunologisches Untersuchungsreaktionsgemisch wird erhalten, indem man die generierte unbekannte Plasmaprobe mit einer vorgewählten Menge von radioaktiv markiertem Angiotensin I, einer vorgewählten Menge eines Antikörpers für das Angiotensin I und einer Menge einer Untersuchungspufferlösung vermischt. Die Menge der Untersuchungspufferlösung ist ausreichend, um in dem generierten unbekannten Reaktionsgemisch Renin- und Angiotensinogenkonzentrationen zu ergeben, bei denen bei den Temperaturen, welchen das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch nachfol-
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gend ausgesetzt wird, keine wesentliche Bildung von Angiotensin I erfolgt. Das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von mindestens etwa 12°C inkubiert, so daß eine konkurrierende Bindungsreaktion zwischen dem Antikörper und sowohl dem markierten als auch dem nicht-markierten Angiotensin I erfolgt. Gebundenes Angiotensin I wird von ungebundenem Angiotensin I abgetrennt und die relativen Verhältnisse von gebundenem und ungebundenem markierten Angiotensin I in dem Reaktionsgemisch werden bestimmt. Der Angiotensin-I-Gehalt der generierten unbekannten Reaktionsgemische wird durch einen Vergleich der relativen Verhältnisse des gebundenen und ungebundenen markierten Angiotensin I in dem unbekannten Reaktionsgemisch mit den relativen Verhältnisse des gebundenen und ungebundenen markierten Angiotensin I in radioimmunologischen Standarduntersuchungsreaktionsgemischen, welche bekannte Mengen von nicht-markiertem Angiotensin I enthalten, bestimmt. Die Renin-Aktivität des Plasmas wird aus der Differenz zwischen dem Angiotensin- I-Gehalt des generierten unbekannten Reaktionsgemisches und dem Angiotensin-I-Gehalt eines nicht-generierten radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemisches, welches eine Probe des gleichen unbekannten Plasmas enthält, ermittelt.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein abgepacktes Testbesteck zur Verwendung bei einer radioimmunologischen Untersuchungsmethode zur in-vitro-Bestimmung der Renin-Aktivität von Blutplasma. Das Besteck enthält die Kombination einer Bildungspufferlösung, enthaltend eine Pufferkomponente aus der Gruppe saures Kaliumphthalat und 2,2-Dimethylglutarsäure, ein Reaktionsmedium mit einem pH-Wert
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von ungefähr 9» enthaltend eine Pufferkomponente, Humanserumalbumin, ein Alkalimetallazid und radioaktiv markiertes Angiotensin I, ein Antiserum, enthaltend einen Antikörper für Angiotensin I, eine Vielzahl von Standardlösungen, enthaltend bekannte Mengen von nicht-markiertem Angiotensin I, und eine Vielzahl von relativ dünnen Streifen . einer Membran, die im wesentlichen aus einem Ionenaustauscherharz besteht.
Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 ein halblogarithmisches Standarddiagramm, das zur Analyse der Plasma-Renin-Aktivität des Patienten LR verwendet wird. Dieses Diagramm gibt den Prozentsatz des markierten Angiotensin I, das an den Antikörper gebunden ist, als Funktion des Angiotensin-I-Gehalts von radioimmunologischen Standarduntersuchungsreaktionssystemen an;
Fig. 2 ein ähnliches Diagramm wie Figur 1, das eine Standardkurve darstellt, die bei der Analyse der Plasma-Renin-Aktivität »des Patienten GM verwendet wurde;
Fig. 3 ein ähnliches Diagramm wie Figur 1, das eine Standardkurve darstellt, die bei der Analyse der Plasma-Reriin-Aktivität des Patienten PS verwendet wurde; und
Fig. 4 ein Diagramm, das eine Reihe von ähnlichen Kurven wie in Figur 1 enthält, die jedoch bei verschiedenen Kombinationen von Temperatur und Gleichgewichtsinkubationszeiten aufgenommen wurden.
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Entsprechende Bezugszeichen geben in den verschiedenen Ansichten der Zeichnungen entsprechende Teile an.
Es wurde gefunden» daß - wenn das radioinmunologische Untersuchungsreaktionssystem genügend verdünnt ist - die radioimmunologische Untersuchung des Angiotensin T. zur Bestimmung der Plasma-Renin-Aktivität bei Temperaturen durchgeführt werden kann, die erheblich oberhalb 4°C liegen, ohne daß nebenbei erhebliche Mengen von Angiotensin I gebildet werden. Im Hinblick auf das bisherige Festhalten von Untersuchungsinkubierungstemperaturen von 4 C ist die Auffindung als überraschend anzusehen, daß eine angemessene Verdünnung es gestattet, die Untersuchung sehr gut bei Temperaturen in der Gegend von 37°C vorzunehmen, wobei reproduzierbare Werte erhalten werden, die definitiv sowohl eine hohe als auch eine niedrige Plasma-Renin-Aktivität identifizieren. Bei solchen Temperaturen eliminiert eine angemessene Verdünnung praktisch die Bildung von Angiotensin I, gestattet aber, daß die immunologische Gleichgewichtsreaktion rasch voranschreitet. Durch Vornahme der Untersuchung bei den relativ hohen Temperaturen, die nunmehr angewendet werden können, wird hiermit eine erhebliche Verringerung der Zeitspanne erzielt, die zur Durchführung der radioimmunologischen Untersuchung erforderlich ist. Weiterhin werden die Kosten für die Bestimmung der Plasma-Renin-Aktivität erheblich vermindert, während die Einfachheit des Tests stark erhöht wird.
Bei der klinischen Durchführung des erfindung.Hgstaäßen Verfahrens wird das Plasma mit einem Inhibitor fiir Enzyme, die das Angiotensin I in andere Substanzen umwandeln, behandelt, worauf mit einem Puffer vermischt wird. j\n£ diese
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Weise wird eine unbekannte Bildungsprobe erhalten. Diese unbekannte Bildungsprobe wird sodann inkubiert, wodurch eine generierte unbekannte Probe erhalten wird, während eine unbekannte Grundprobe der gleichen Zusammensetzung verdünnt und bei etwa 37° C oder darunter während der Inkubierung der Bildungsprobe gehalten wird, so daß in der Grundprobe eine signifikante Umwandlung von Angiotensinogen in Angiotensin I vermieden wird. Sowohl mit der generierten unbekannten als auch mit der unbekannten Grundprobe wird in radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemischen eine radioimmunologische Untersuchung durchgeführt. Die Reaktionsgemische haben eine genügende Verdünnung, daß die Bildung von Angiotensin I bei der Temperatur vermieden wird, bei der die konkurrierende Untersuchungsbindungsreaktion durchgeführt wird. Nach der Untersuchungsreaktion wird jedes Untersuchungsreaktionsgemisch so verarbeitet, daß gebundenes Angiotensin I von ungebundenem Angiotensin I abgetrennt wird. Durch die Zählung der Radioaktivität werden die relativen Verhältnisse von gebundenem und ungebundenem markierten Angiotensin I gemessen. Die Angiotensin-I-Gehalte sowohl von dem unbekannten radioimmunologischen Grunduntersuchungsreaktiongsgemisch als auch von dem generierten unbekannten Reaktionsgemisch werden anhand einer Standardkurve bestimmt, welche durch radioimmunologische Untersuchungen mit Reaktionsgemischen erhalten worden ist, die variierende bekannte Mengen von nicht-markiertem Angiotensin I und die gleichen nicht-variierenden Verhältnismengen von markiertem Antigen und Antikörper wie die unbekannten Reaktionssysteme enthalten. Die Eichkurve wird in der Weise erstellt, daß die relativen Verhältnismengen von gebundenem und ungebundenem markierten Angio-
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tensln I als Funktion der bekannten Mengen von nicht-markiertem Angiotensin I, die in dem Standardreaktionsgemisch vorhanden sind, aufgetragen werden.
Am Beginn dieses Vorgehens wird das Blut des Patienten in ein Rohr abgezogen, sofort auf eine Temperatur von 4°C oder weniger abgekühlt und das Plasma wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Wenn das Plasma über signifikante Zeiträume gehalten werden soll, sollte es eingefroren werden. Es wird jedoch sehr stark bevorzugt, daß der radioimmunologische Untersuchungstest am gleichen Tag durchgeführt wird, an dem das Blut abgezogen wurde.
Wie in herkömmlicher Weise, wird das Rohr, in das das Blut abgezogen worden ist, mit einem Cheliermittel, wie Äthylendiamintetraessigsäure, beschichtet. Dieses Cheliermittel wirkt nicht nur als Antikoagulans, sondern inhibiert auch die Aktivität der proteolytisehen Enzyme, die in dem Serum enthalten sind, wodurch die Zerstörung von Angiotensin I oder anderen Proteinen, die in dem Blut enthalten sind, verhindert wird.
Die kalte Plasmaprobe wird geeigneterweise in aliquote Teile aufgeteilt. Von diesen aliquoten Teilen wird einer zur Bildung verwendet, während der zweite aliquote Teil (die Grundprobe) dazu verwendet wird, um die radioimmunologische Grunduntersuchung vorzunehmen. Zu der Plasmaprobe oder zu jedem aliquoten Teil davon wird ein Inhibitor für Enzyme gegeben, die das Angiotensin I in andere Substanzen umwandeln. Insbesondere ist es erforderlich, einen Inhibitor für das Umwandlungsenzym, das Angiotensin I in Angio-
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tensin II umwandelt, und auch für die Angiotensinasen, die dats Angiotensin I und das Angiotensin II aufbrechen, zuzusetzen.
Geeignete Inhibitoren sind z.B. 8-Hydroxychinolin und 2,3-Dimercaptopropanol. Beide Inhibitoren werden vorzugsweise mit der Plasmaprobe vermischt. Eine wirksame Inhibierung wird z.B. erzielt, indem man das Plasma mit ungefähr 4,5 Mol/l 8-Hydroxychinolin und ungefähr 8 Mol/l- 2,3-Dimercaptopropanol versetzt.
Wie bereits zum Ausdruck gebracht wurde, wird es sehr bevorzugt, die Inkubierungen der Bildungsprobe und der radioimmunologischen Untersuchungsprobe am gleichen Tag vorzunehmen, an dem das Blut abgezogen wird. Wenn jedoch eine signifikante Verzögerung zwischen dem Abziehen des Plasmas und der Durchführung der Untersuchung bestehen soll, dann sollte das den Inhibitor enthaltende Plasma eingefroren und bei einer Temperatur von ungefähr -20 C gelagert werden.
An dem Tag, an dem die Untersuchung durchgeführt werden soll, wird eine unbekannte Bildungsprobe hergestellt, indem der inhibierte aliquote Bildungsteil des Plasmas mit einer Bildungspufferlösung vermischt wird. Vorzugsweise wird ein Volumenteil inhibiertes Plasma mit 2 Volumenteilen Puffer verdünnt. Ein aliquoter Teil der Bildungsprobe kann weiter verdünnt und als unbekannte Grundprobe verwendet werden. Die Generierung wird in der Weise durchgeführt, daß die Bildungsprobe erwärmt und bei einer Temperatur gehalten wird, bei der die Renin-Aktivität genügend hoch ist, daß eine Umwandlung des Angiotensinogens zu Angiotensin I mit an-
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nehmbarer Geschwindigkeit bewirkt wird. Da die Renin-Aktivität bei einem pH-Wert von ungefähr 5,5 optimalisiert ist, wird vorzugsweise ein solcher Puffer verwendet, der die Bildungsprobe bei diesem pH-Wert oder nahe davon stabilisiert. Bevorzugte Puffer sind z.B. saures Kaliumphthalat und 2,2-Dimethylglutarsäure. Letzterer Puffer ist besonders dazu wirksam, um eine rasche Bildung und ein Überleben des Angiotensin I zu fördern. Die Pufferlösung ist hinsichtlich der Pufferkomponente vorzugsweise ungefähr 0,1 molar.
Um eine Renin-Aktivität zu erhalten, die ausreichend ist, um das Angiotensin I mit annehmbarer Geschwindigkeit zu bilden, wird die Temperatur der Bildungsprobe wischen etwa 10 C und etwa 600C, vorzugsweise bei 35 bis 500C, während des Generierungsprozesses gehalten. Die, an? meisten bevorzugte Temperatur für die Generierungsinkubierung ist ungefähr 37°C. Die Generierung kann in 1 h oder weniger durchgeführt werden, jedoch wird der Zeitraum vorzugsweise Lis ungefähr 3 h bei 37°C ausgedehnt, so daß die nachfolgendο radioimmunologische Untersuchung auch gegenüber einer abnorm niedrigen Renin-Aktivität sowie einer hohen Aktivi-^t empfindlich ist.
Der zweite (Grund-) aliquote Teil des Plasmas «Ird ebenfalls mit dem Untersuchungspuffer verdünnt, wodurch eine unbekannte Grundprobe erhalten wird, die zu Jedem geeigneten Zeitpunkt untersucht werden kann. Wie bereü-s ausgeführt, kann die unbekannte Grundprobe ein aliquoter Teil der unbekannten Bildungsprobe sein, die schon mit Puffer verdünnt ist. Vorzugsweise wird die unbekannte Grundprobe weiter verdünnt und bei 370C oder darunter während der
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Generierung der unbekannten Bildungsprobe gehalten, so daß später gleichzeitig die radioimmunologische Untersuchung der generierten und der Grundprobe vorgenommen werden kann. In jedem Falle werden sowohl generierte als auch unbekannte radioimmunologische Grunduntersuchungsreaktionsgemische hergestellt, welche die gleichen Verhältnismengen der jeweiligen unbekannten Plasmen, von markiertem Angiotensin I, von Antiserum für Angiotensin I und der Untersuchungspufferlösung enthalten. Die Konzentrationen von Renin und Angiotensinogen in jedem Reaktionssystem sind genügend niedrig, daß bei den Temperaturen, denen die Reaktionssysteme nachfolgend ausgesetzt werden, keine wesentliche Bildung von Angiotensin I erfolgt. Damit das markierte und das nichtmarkierte Angiotensin I, die in den Reaktionsgemischen enthalten sind, miteinander hinsichtlich der Bindungsstellen auf dem Antikörper konkurrieren, ist die Menge des in dem Reaktionsgemisch enthaltenen Antiserums geringer als diejenige, die erforderlich ist, um das gesamte darin enthaltene Antigen zu binden. Vorzugsweise ist der Antikörpergehalt des Reaktionsgemisches ausreichend, um etwa 50% des markierten Antigens in Abwesenheit von nicht-markiertem Antigen zu binden.
Die Untersuchungspufferlösung, die in den Reaktionsgemischen enthalten ist, enthält eine Pufferkomponente, überschüssiges Protein und ein Konservierungsmittel. Um die Probleme einer signifikanten Bildung von Angiotensin I während der radioimmunologischen Untersuchungsreaktion auf einen Minimalwert zurückzuführen, wird als Pufferkomponente der Untersuchungspufferlösung vorzugsweise eine solche verwendet, die den pH-Wert des Reaktionsgemisches bei ungefähr 9 hält.
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Eine geeignete Pufferkomponente ist z.B. Tris(hydroxymethyl)aminomethan mit einer Molarität in der Gegend von 0,08.
Die Gegenwart von überschüssigem Protein (z.B. 0,5 Gew.-% der Pufferlösung) in der Pufferlösung stabilisiert sowohl das Antigen als auch den Antikörper und hierdurch die immunologische Reaktion. Die Anwesenheit dieses Proteins dient auch dazu, die nicht-spezifische Adsorption von Reaktionskomponenten auf der Behälterwand zu inhibieren. Humanserumalbumin wird vorzugsweise als überschüssiges Protein verwendet, da das bei der Untersuchung verwendete Antiserum von Tieren hergeleitet ist und es somit unwahrscheinlich ist, daß dieses Antikörper für Humanserumalbumin enthält. Außerdem ist Humanserumalbumin naturgemäß mit der Plasma-" probe verträglich, die von einem Menschen herrührt.
Ein geeignetes Konservierungsmittel für die Untersuchungspufferlösung ist z.B. ein Alkalimetallazid. Natriumazid in einer Menge von etwa 0,01 Gew.-?6 der Pufferlösung wird bevorzugt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Untersuchungspufferlösung mit dem markierten Angiotensin I vorkombiniert, wodurch ein Reaktionsmedium erhalten wird, zu dem die unbekannte generierte Plasmaprobe und das den Antikörper enthaltende Antiserum am Beginn der Untersuchungsreaktion zugesetzt werden. Das gleiche Reaktionsmedium wird vorzugsweise dazu verwendet, um am Anfang den aliquoten Grundteil zu verdünnen und ein Grund-Vorreaktionssystem zu liefern. Nach vervollständigter Generierung wird das Antiserum zu dem Vorreaktionsgemisch gegeben,
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wodurch ein radioimmunologisches Grunduntersuchungsreaktionsgeraisch erhalten wird, das parallel zu dem unbekannten generierten Reaktionsgemisch umgesetzt wird.
Es ist wesentlich, daß das Volumen des Reaktionsmediums ausreichend ist, um die Renin- und Angiotensinogenkonzentrationen auf Werte zu verdünnen, bei denen keine erhebliche Bildung von Angiotensin I in dem radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemisch bei den Temperaturen erfolgt, denen das Reaktionsgemisch ausgesetzt ist. Normalerweise sollten die Renin- und Angiotensinogenkonzentrationen in dem Reaktionsgemisch nicht über etwa 1/10 der Konzentrationen dieser zwei Komponenten in dem Plasma selbst hinausgehen. Vorzugsweise wird eine 20-fache oder höhere Verdünnung angewendet.
Die radioimmunologischen Untersuchungen werden in der Weise durchgeführt, daß man das unbekannte generierte und das Grundreaktionsgemisch bei der gleichen Temperatur und über den gleichen Zeitraum inkubiert. Damit die konkurrierende Proteinbindungsreaktion innerhalb einer geeigneten Zeitspanne, z.B. von 15 min bis 5 h, vorzugsweise 15 min bis 3 h, zu einem genügenden Ausmaß fortschreitet, sollte die Untersuchungsreaktion bei Temperaturen von mindestens etwa 12°C durchgeführt werden. Vorzugsweise sollte die Untersuchungstemperatur mindestens etwa 200C betragen. Wenn eine Temperatur von 37 C angewendet wird, wie es stark bevorzugt wird, dann ist eine angemessene Untersuchungsreaktion von ungefähr 1 h vollständig. Man kann auch bei Temperaturen oberhalb 37 C arbeiten, doch sind diese im allgemeinen nicht notwendig. Temperaturen oberhalb 40°C bringen praktisch keine Vorteile mit sich. Bei Anwendung von
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zu hohen Temperaturen beginnt eine Denaturierung der Proteine mit so hohen Geschwindigkeiten zu erfolgen, so daß Temperaturen oberhalb etwa 550C vermieden werden sollten.
Wenn die radioimmunologischen Untersuchungsreaktionen vollständig sind, dann wird gebundenes von ungebundenem Angiotensin I abgetrennt und die relativen Verhältnisse von gebundenem und ungebundenem markierten Angiotensin I werden durch Zählung der Radioaktivität gemessen. Der Gehalt an Angiotensin I von jedem Reaktionsgemisch wird anhand von Eichkurven bestimmt, die durch radioimmunologische Untersuchungen mit bekannten Proben von nicht-markiertem Angiotensin I erstellt worden sind, wobei Reaktionsgemische verwendet werden, die die gleichen Verhältnismengen von markiertem Angiotensin I und von Antiserum wie die unbekannten Reaktionsgemische enthalten. Die Renin-Aktivität des Plasmas wird sodann aus der Differenz zwischen der Angiotensin-I-Konzentration in der generierten Probe und dieser Konzentration in der Grundprobe ermittelt.
Nicht-gebundenes Angiotensin I kann durch beliebige Methoden, die bekannt sind, von dem antikörpergebundenen Angiotensin I abgetrennt werden. Diese Trennung kann z.B. durch Elektrophorese, chromatographische Elektrophorese, Ausfällung des Antikörper/Antigen-Komplexes durch einen zweiten Antikörper, nicht-spezifische Salzausfällung oder Adsorption auf einem festen Adsorptionsmittel, wie dextranbeschichteter Holzkohle, bewirkt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das nicht-gebundene Angiotensin I von dem gebundenen Angiotensin I durch Adsorption des ersteren auf einem relativ
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dünnen Streifen einer Membrane abgetrennt, die im wesentlichen aus einem Ionenaustauscherharz besteht. Die Ionenaustauscherharzmembranen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind relativ dünne Streifen, Platten oder Filme eines festen wasserhaltigen Gels, welches aus einer unlöslichen polymeren Matrix besteht, an die dissoziierbare kationische oder anionische Gruppen angefügt sind, wobei das Gel vorzugsweise mit einem geeigneten Fasermaterial verstärkt ist. Es sind viele geeignete Harzmembranen dieser Art bekannt, z.B. aus den US-Patentschriften 2 730 768, 2 780 604, 2 800 445 und 2860 097. Ein Beispiel für ein geeignetes handelsübliches anionenselektives Harz wird unter der Warenbezeichnung AR-103-PZL-183 (von Ionics, Inc., Watertown, Massachusetts) vertrieben. Die Verwendung eines solchen Harzstreifens ergibt eine hochwirksame Trennung des ungebundenen Antigens von dem gebundenen Antigen, da der Harzstreifen nicht nur ein wirksamer Abfänger für das nicht-gebundene Antigen ist, sondern auch nach beendigter Adsorption von dem Reaktionsgemisch rasch und leicht abgetrennt werden kann. Zur Durchführung der Abtrennung wird der Harzstreifen in das Reaktionsgemisch nach Vervollständigung der Bindungsreaktion eingesetzt und das Reaktionsgemisch wird in Kontakt mit dem Streifen bei Raumtemperatur oder darunter, vorzugsweise bei Temperaturen von 22 bis 250C, ungefähr 1/2 h lang inkubiert. Nach beendigter Inkubierung wird der Streifen entnommen und die restliche Feuchtigkeit wird vom Rand der Reaktionsampulle weggewischt, so daß im wesentlichen das gesamte antikörpergebundene Antigen in das Reaktionsgemisch zurückgeschickt wird.
Zur Bestimmung der relativen Verhältnisse von gebundenem zu ungebundenem Angiotensin I wird die Radioaktiv!-
609813/07U
tat des Reaktionsgemisches sowohl vor der Einsetzung des Harzstreifens als auch nach dessen Entfernung gezählt. Das prozentuale markierte Angiotensin I, das an den Antikörper gebunden ist, ist dann gleich wie die Nachzählung dividiert durch die Vorzählung.
Das abgepackte Testbesteck gemäß der Erfindung erlaub^ in der Klinik rasche und genaue Bestimmungen der Plasma-Renin-Aktivität durchzuführen. Das Besteck enthält Ampullen, welche Bildungspufferlösungen, vorkombinierte Reaktionsmedien, Antiseren, Standardlösungen von bekannten Mengen von nichtmarkiertem Angiotensin I und Ionenaustauscherharz-Membranstreifen enthalten. Jede Ampulle für das Reaktionsmedium enthält das richtige Volumen des Reaktionsmediums und die richtige Menge von markiertem Angiotensin I, um eine radioimmunologische Untersuchungsreaktxon durchzuführen. Das markierte Angiotensin I enthält vorzugsweise 125 J, doch können auch andere Markierungsisotopen, wie 131 J, verwendet werden.
Das in dem Besteck enthaltene Antiserum wird vorzugsweise erhalten, indem Angiotensin I zu Rinderserumalbumin gegeben wird und indem das resultierende Immunogen einem Kaninchen eingespritzt wird. Das anschließend dem Kaninchen entnommene Serum kann direkt verwendet werden oder es kann ein Antiserum hergestellt werden, indem man den £ -Globulin-Antikörper von dem Kaninchenserum abtrennt und eine Lösung des Antikörpers herstellt.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.
-20-
609813/071&
Beispiel 1
Es wurde ein Besteck für die radioimmunologische Untersuchung der Plasma-Renin-Aktivität hergestellt, welches 100 Reaktionsampullen, 4 Antikörperampullen, 35 Bi1dungsampullen, 1 8-Hydroxychinolin-Inhibitorampulle, 1 Dimercaprol-Inhibitorampulle, 2 Ampullen jeweils mit 100 Anionenaustauscherstreifen und 9 Ampullen jeweils mit einer Standard-Angiotensin-I-Lösung enthielt.
Das vorkombinierte Reaktionsmedium, das in jeder Reaktionsampulle enthalten war, hatte die folgende Zusammensetzung:
Angiotensin I 1-125 0,0202±0,008 uCi
Humanserumalbumin 5,0 mg
Trishydroxymethylaminomethan 10,0 mg
Natriumazid 0,1 mg
Salzsäure 23,83^2,97 Ug
Wasser 1 ml
Jede Standardampulle enthielt eine bekannte Menge von nichtmarkiertem Angiotensin I. Die jeweiligen Zusammensetzungen der in diesen Ampullen enthaltenen Lösungen waren wie folgt:
A. 10 ng/ml Standard
Eisessig 60 ng
Lysozym 60 u g
Trishydroxymethylaminomethan 10,1 mg
Humanserumalbumin 5 mg
Natriumazid 0,1 mg
Salzsäure 23,83^2,97 Wg
Angiotensin I 10 ng
Wasser 1 ml
609813/07U
6 ng/ml Standard 35,8 ng
Eisessig 35,8 ^g
Lysozym 10,1 yag
Trishydroxymethylaminomethan 5 mg
Humans erumalbumin 0,1 mg
Natriumazid 23,83*2,97 ^ig
Salzsäure 6 ng
Angiotensin I 1 ml
Wasser
3 ng/ml Standard 17,95 ng
Eisessig 17,95 jig
Lysozym 10,1 mg
Tri shydroxymethylaminomethan 5 mg
Humanserumalbumin 0,1 mg
Natriumazid 23,83^2,97 jig
Salzsäure 3 ng
Angiotensin I 1 ml
Wasser
2 ng/ml Standard 12 ng
Eisessig 1-i /ig
Lysozym 10,1 mg
Trishydroxymethylaminomethan 5 mg
Humanserumalbumin 0,1 mg
Natriumazid 23,83-2,97 jig
Salzsäure 2 ng
Angiotensin I 1 ml
Wasser
1 ng/ml Standard 6 ng
Eisessig
-22-
609813/07U
Lysozym 6 jig
Trishydroxymethylaminomethan 10,1 mg
Natriumazid 0,1 mg
Human s e rumalbumin 5 mg
Salzsäure 23,83^2,97 Jig
Angiotensin I 1 ng
Wasser 1 ml
0,8 ng/ml Standard
Eisessig 6 ng
Lysozym 6 jig
Tri shydroxymethylaminomethan 10,1 mg
Natriumazid 0,1 mg
Humanserumalbumin 5 mg
Salzsäure 23,83^2,97 ^g
Angiotensin I 1 ng-
Wasser 1 ml
0,6 ng/ml Standard
Eisessig 3,59 ng
Lysozym 3,59 Jig
Trishydroxymethylaminomethan 10,1 mg
Natriumazid 0,1 mg
Humanserumalbumin 5 mg
Salzsäure 23,83^2,97 ng
Angiotensin I 0,6 ng
Wasser 1 ml
0,3 ng/ml Standard
Eisessig 1,795 ng
Lysozym 1,795 ^g
Trishydroxymethylaminomethan 10,1 mg
Humanserumalbumin 5 mg
609813/07U ~23~
Natriumazid 0,1 mg
Salzsäure 23,8Ϊ2,97 jxg
Angiotensin I 0,3 ng
Wasser 1 ml
0 ng/ml Standard
Trishydroxymethylaminomethan 10,1 mg
Humanserumalbumin 5 mg
Natriumazid 0,1 mg
Salzsäure 23,83^2,97 Jig
Wasser 1 ml
Die Antiserumlösung, die in den Antikörperampullen enthalten war, hatte die folgende Zusammensetzung:
Antiserum (Kaninchen) 1,4 ill
Trishydroxymethylaminomethan 28,28 mg
Humanserumalbumin 14,0 mg
Natriumazid 0,28 mg
Salzsäure 6,67^0,83 iig
Wasser 2,8 ml
Der Bildungspuffer, der in den Bildungsampullen enthalten war, hatte folgende Zusammensetzung:
Kaliumhydrogenphthalat 40,84 mg
Natriumhydroxid 216^65 »g
Wasser 2 ml
Die 8-Hydroxyehinolin-Inhibierungslösung hatte folgende Zusammensetzung:
-24-
S09813/071
8-Hydroxychinolin 66 mg
Wasser 1 ml
Die Dimercaprol-Inhibierungslösung hatte folgende Zusammensetzung:
2,3-Dimercaptopropanol 100 mg
Benzylbenzoat 210 mg
Erdnußöl 680 mg
Die 100 Harzstreifen des Bestecks bestanden aus einem wasserfreien Gel eines Anionenaustauscherharzes, wie es unter der Warenbezeichnung AR-1O3-PZL-183 (von Ionics, Inc., Watertown, Massachusetts), verstärkt mit einem Fasermaterial, vertrieben wird.
Beispiel 2
Unter Verwendung eines Bestecks gemäß Beispiel 1 wurde eine radioimmunologische Untersuchung durchgeführt, um die Plasma-Renin-Aktivität des Patienten LR zu bestimmen.
Dem Patienten LR wurde Blut in ein Rohr abgezogen und mit EDTA beschichtet. Das Plasma wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und auf 4°C abgekühlt. Zu 1 ml des kalten Plasmas wurden Portionen der 8-Hydroxychinolin-Inhibierungslösung (10 Ml) und d?r Dimercaprol-Inhibierungslösung (10 ill) gegeben. Die resultierende unbekannte Plasmaprobe wurde in eine Bildungsampulle überführt, welche die Bildungspufferlösung enthielt. Es wurde damit vermischt.
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609813/07U
Eine unbekannte Grundprobe (100 ul) wurde aus der BiI-dungsampulle entnommen und sofort in eine Reaktionsampulle gegeben, wodurch ein unbekanntes Grund-Vorreaktionsgemisch erhalten wurde, welches nicht-generiertes Plasma, Humanserumalbumin, Natriumazid als Konservierungsmittel, HCl und 125 J markiertes Angiotensin I, gepuffert auf einen pH-Wert von 9,0, enthielt. Dieses Vorreaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur während der nachfolgenden Bildung bzw. Generierung des Teils der unbekannten Probe, die in der Bildungsampulle zurückgeblieben war, gehalten.
Die Bildungsampulle wurde in ein auf 37°C eingestelltes Wasserbad gegeben und die Bildung bzw. Generierung wurde 3 h lang durchgeführt. Am Ende dieses Zeitraums wurde die generierte unbekannte Bestimmungsprobe aus dem Wasserbad entnommen, in einem Eisbad abgekühlt und drei 100 ul aliquote Teile davon wurden in drei ReaktionsampulIen überführt, wodurch drei unbekannte generierte radioimmunologische Untersuchungsvorreaktionsgemische erhalten wurden, welche generiertes Plasma, Humanserumalbumin, Natriumazid als Konservierungsmittel, HCl und 125 J markiertes Angiotensin I enthielten.
Eine Reihe von Standard-Vorreaktionsgemischen wurde hergestellt, indem 0,1 ml aliquote Teile von nicht-markierten Standard-Angiotensin-I-Lösungen aus den Standardampullen in eine Reihe von Reaktionsampullen überführt wurden. Es wurden Standard-Vorreaktionsgemische unter Verwendung der Standardlösungen hergestellt, welche 6, 3, 2, 1, 0,8, 0,6 und 0,3 ng/ml nicht-markiertes Angiotensin I enthielten. Zwei Blind-Vorreaktionsgemische wurden hergestellt, indem 0,1 ml pH-9,0-Puffer in eine Reaktionsampulle gegeben wurden.
809813/07H ~26~
Reaktionsgemische wurden hergestellt und die radio immunologische Untersuchung wurde "begonnen, indem zu allen unbekannten Grund-, generierten unbekannten, Standard- und Blindvorreaktionsgemischen die Antiserumlösung (0,1 ml) gegeben wurde. Von einer Reaktionsampulle wurde Antiserum zurückgehalten und als Kontroll versuch verwendet. Die Reaktionsgemische, die in jeder Ampulle enthalten waren, wurden sodann auf einer Wirbeleinrichtung miteinander vermischt und 1 h bei 37°C inkubiert. Nach beendigter Inkubierung wurde jede Reaktionsampulle aus dem Wasserbad herausgenommen und die Abdeckung wurde entfernt. In den Ampulleninhalt wurde ein Anionenaustauscherharzstreifen eingetaucht. Die Ampulle wurde sodann wiederum verschlossen und 30 min bei Raumtemperatur (21 bis 23 C) auf eine Rotationseinrichtung gegeben. Am Ende der 30 min wurde der Harzstreifen aus jeder Ampulle entnommen und in eine leere Ampulle gegeben. Die Radioaktivität sowohl des Streifens, der das nicht-gebundene ("freie") Angiotensin I enthielt, als auch diejenige der überstehenden Flüssigkeit, die das antikörpergebundene ("gebundene") Angiotensin I enthielt, wurde bestimmt. Anhand folgender Gleichung wurde das prozentual gebundene Angiotensin I ermittelt:
, , Zählung der überstehenden Flüssigkeit geDunaen - Zählung der überstehenden Flüssigkeit + Zählung des Streifens
Die Ergebnisse der Zählung und das .daraus errechnete prozentuale gebundene Angiotensin I bei Standardreaktionsgemischen sind in Tabelle I zusammengestellt:
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609813/07U
Tabelle I Standardreaktionssysteme
Radioaktivitätszählungen pro min
überstehende Flüssigkeit Streifen % gebunden
Kontrollversuch (kein
Antikörper) 576 12409 4,44
0,6 ng 2253 10835 17,21
0,3 ng 3879 9284 29,47
0,2 ng 4700 8448 35,75
0,1 ng 5980 7041 45,93
0,08 ng 6404 6663 49,01
0,06 ng 6563 6365 50,77
0,03 ng 7231 5605 56,33
0,0 ng 7665 5165 59,74
0,0 ng 7706 5061 60,36
Ein Duplikatsatz von radioimmunologischen Standarduntersuchung sr eaktionen lieferte die in Tabelle II angegebenen
Werte.
Tabelle II Duplikat-Standardreaktionssysteme
Radioaktivitätszählungen pro min
überstehende Flüssigkeit Streifen % gebunden
0,6 ng 0,3 ng 0,2 ng 0,1 ng 0,08 ng
-28-609813/07U
2150 10877 16,50
3972 8709 31,32
4473 8289 35,05
5814 7053 45,19
619O 6540 48,63
5902 53,62
5693 55,20
5046 60,76
5068 61,40
Fortsetzung Tabelle II
überstehende Flüssigkeit Streifen % gebunden
0,06 ng 6826
0,03 ng 7016
0,0 ng 7812
0,0 ng 8060
Aus den Werten der Tabellen I und II wurde ein Diagramm erstellt, in dem die Prozent gebundenes Angiotensin I gegen die in Nanogramm ausgedrückten Mengen von nicht-markiertem Standard-Angiotensin I, welches in zwei Standardreaktionslösungen bei zwei Sätzen von Standardreaktionen enthalten war, aufgetragen wurden. Dieses Diagramm ist in Figur 1 dargestellt.
Die Werte der radioaktiven Zählung für das Plasma des Patienten LR sind in Tabelle III angegeben. Aus dem prozentual gebundenen 125 J markierten Angiotensin I wurde die Verhältnismenge des nicht-markierten Angiotensin I in jeder unbekannten Plasmaprobe anhand der Kurven der Figur 1 bestimmt. Auch diese Werte sind in Tabelle III angegeben.
Tabelle III Radioaktive Zählung für das Plasma von LR (Phthalatbildungs-
puffer) Streifen % gebun
den		 Angioten
sin I
(ng/ml)
überstehende
Flüssigkeit		 5607 57,10 0,014
Grundprobe 7463 6677 49,36
generierte Probe 6510 6018 52,79
(dreifach) 6729 6314 51,13
6605 51,09 0,056
generierte Probe
(Mittelwert)		 609813/0714 -29-
Die Renin-Aktivität des Plasmas des Patienten LR wurde durch die Bildungsrate bzw. -geschwindigkeit von Angio tensin I nach folgender Beziehung bestimmt:
Renin-Aktivität (ng/ml/h Angiotensin-I-Bildung) = [ng/ml (generiert) - ng/ml (Grund-)]30
Der Faktor 30 wird verwendet, weil das Plasma am Anfang dreifach verdünnt wird und nur 0,1 ml des verdünnten Plasmas bei der radioimmunologisehen Untersuchung verwendet werden, während die Angiotensin-I-Bildungsrate bzw. -geschwindigkeit auf 1 ml bezogen wird.
Die Renin-Aktivität des Plasmas von LR wurde als 0,42 ng/ml/h bestimmt.
Beispiel 3
Eine weitere Probe des Plasmas des Patienten LR wurde gemäß Beispiel 2 untersucht, mit der Ausnahme, daß 2,2-Dimethylglutarsäure anstelle von saurem Kaliumphthalat als Pufferkomponente des Bildungsgemisches verwendet wurde. In Tabelle IV sind die Ergebnisse der radioaktiven Zählung der Grund- und generierten radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemische zusammengestellt, die bei der Untersuchung dieses Beispiels erhalten wurden:
609813/0714
Tabelle IV von LR (Glutaratbildungs- Angioten-
sin I
(ng/ml)
Radioaktive Zählung für das Plasma Streifen % gebun
den		 0
0,07
puffer)
überstehende
Flüssigkeit		 4979
6565
6459
6541		 61,71
49,34
50,66
49,79
49,93
Grundprobe
generierte Probe
(dreifach)
generierte Probe
(Mittelwert)		 8025
6404
6632
6485
Bei dieser Untersuchung wurde die Renin-Aktivität als 0,7 ng Angiotensin I/ml/h bestimmt.
Beispiel 4
Nach der Arbeitsweise des Beispiels 2 wurde mit dem Plasma des Patienten GM eine radioimmunologische Untersuchung der Renin-Aktivität durchgeführt. In den Tabellen V und VI sind die Ergebnisse der radioaktiven Zählung und die Prozent gebundenes Antigen für zweifache radioimmunologische Standarduntersuchungsreaktionsgemische zusammengestellt:
-31-
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Tabelle V pro min
Streifen		 % gebunden
12627 5,76
Standardreaktionssysteme 10804 17,98
Kontrollver
such (kein
Antikörper		 Radioaktivitätszählungen
überstehende Flüssigkeit		 9530 28,06
0,6 ng 772 9524 29,50
0,3 ng 2369 7328 45,21
0,2 ng 3717 6956 48,16
0,1 ng 3986 6805 49,30
0,08 ng 6046 6353 54,06
0,06 ng 6462 5458 59,73
0,03 ng 6618 5563 59,35
0,0 ng 7477
0,0 ng 8094 Duplikat-Standardreaktionssysteme
8122
Tabelle VI
Radioaktivitätszählungen pro min
überstehende Flüssigkeit Streifen % gebunden
0,6 ng 0,3 ng 0,2 ng 0,1 ng 0,08 ng 0,06 ng 0,03 ng 0,0 ng 0,0 ng
2306 10944 17,40
3580 10032 26,30
3801 9589 28,39
5780 7625 43,12
6330 6783 48,27
6540 6764 49,16
7325 6173 54,27
8386 5526 60,28
8165 5615 59,25
-32-
809813/071
Die Werte der Tabellen V und VI wurden aufgetragen, wodurch die Figur 2 erhalten wurde. Diese wurde zur Bestimmung cfes Angiotensin-I-Gehalts des Plasmas verwendet, welches in den Grund- und unbekannten generierten radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemisehen des Patienten GM enthalten waren.
In Tabelle VII sind die Ergebnisse der radioaktiven Zählung, die Prozent gebundenes Antigen und der Angiotensin-I-Gehalt des Plasmas für die Grund- und unbekannten generierten radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemische, die das Plasma des Patienten GM enthielten, zusammengestellt.
Tabelle VII
Radioaktive Zählung für das Plasma von GM (Phthalatbildungs-
puffer) Streifen % gebun
den		 Angioten-
sin I
(ng/ml)
überstehende
Flüssigkeit		 6071 56,04 0,009
Grundprobe 7738 8750 36,06
generierte Probe 4935 8742 35,09
(zweifach) 4727' 35,58 0,153
generierte Probe
(Mittelwert)
Die Renin-Aktivität des Plasmas von GM wurde zu 1,41 ng
Angiotensin i/ml/h bestimmt.
Beispiel 5
Eine weitere Probe des Plasmas des Patienten GM wurde ge-
-33-
609813/07U
maß Beispiel 4 untersucht, mit der Ausnahme, daß 2,2-Dimethylglutarsäure anstelle von saurem Kaliumphthalat als Pufferkomponente des Bildungsgemisches verwendet wurde. In der Tabelle VIII sind die Ergebnisse der radioaktiven Zählung der Grund- und der generierten radioimmunulogischen Untersuchungsgemische zusammengestellt, die in diesem Beispiel erhalten wurden.
Tabelle VIII Radioaktive Zählung für das Plasma von GM (Glutaratbildungs-
puffer)
überstehende Streifen % gebun- Angioten-Flüssigkeit den sin I
(ng/ml)
Grundprobe (es wurden die nicht-generierten Phthalat-
werte verwendet, vgl. Tabelle VII) generierte Probe 3977 10122 28,21 (zweifach) 3943 10088 28,10
fenerierte Probe
Mittelwert) 28,15 0,3
Bei der Untersuchung dieses Beispiels wurde die Renin-Aktivität des Plasmas von GM zu 2,91 ng/ml/h bestimmt.
Beispiel 6
Eine radioimmunologische Untersuchung der Renin-Aktivität wurde mit dem Plasma des Patienten PS durchgeführt. Es wurde wie im Beispiel 2 verfahren, mit der Ausnahme, daß zur Erstellung der Eichkurve nur eine Reihe von Reaktionen durchgeführt wurde. In Tabelle IX sind die Ergebnisse
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der radioaktiven Zählung und die Prozent gebundenes Antigen für die radioimmunologischen Standarduntersuchungsreaktionsgemische zusammengestellt.
Tabelle IX pro min .:.
Streifen		 % gebunden
Standardreaktionssystem 12013 5,47
Radioaktivitätszählungen
überstehende Flüssigkeit		 10404 17,61
Kontrollver
such		 695 9088 27,55
0,6 ng 2224 8342 34,97
0,3 ng 3456 6743 46,72
0,2 ng 4486 6653 48,93
0,1 ng 5912 5935 52,76
0,08 ng 6373 5481 56,75
0,06 ng 6628 5089 60,84
0,03 ng 7191
0,0 ng 7911
Die Werte der Tabelle IX wurden aufgetragen, wodurch Figur 3 erhalten wurde, welche zur Bestimmung des Angiotensin-I-Orshalts des Plasmas verwendet wurde, das in den Grund- und unbekannten generierten radioimmunologischen Untersu-„Lungsreaktionsgemisehen des Patienten PS enthalten war.
In Tabelle X sind die Ergebnisse der radioaktiven Zählung, die Prozent gebundenes Antigen und der Angiotensin-I-Gehaib des Plasmas für die Grund- und die unbekannten generiex-ten radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemische, die das Plasma von PS enthielten, zusammengestellt.
-35-
609813/07U
Tabelle X Radioaktive Zählung für das Plasma von PS (Phtl-alatbildungs-
puffer)
überstehende Streifen % gebun- Angioten-Flüssigkeit den sin I
(ng/ml)
Grundprobe Probe 7190 5510 56,61 0 ,0315
generierte 5828 7217 44,68
(dreifach) 5909 7433 44,29
Probe 5908 6999 45,27
generierte (Mittelwert)
44,75 0 ,114
Die Renin-Aktivität des Plasmas von PS wurde zu 0,849 ng/ ml/h bestimmt.
Beispiel 7
Eine weitere Probe des Plasmas des Patienten PS wurde gemäß Beispiel 6 untersucht, mit der Ausnahme, daß 2,2-Dimethylglutarsäure anstelle von saurem Kaliumphthalat als Pufferkomponente des Bildungsgemisches verwendet wurde. Die Ergebnisse der radioaktiven Zählung der Grund- und generierten radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemische zusammen mit dem Angiotensin-I-Gehalt der nicht-generierten und generierten Proben sind in Tabelle XI zusammengestellt.
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60981 3/07H
Tabelle XI Radioaktive Zählung für das Plasma von PS (Glutaratbildungs-
puffer)
überstehende Streifen % gebun- Angioten-Flüssigkeit den sin I
(ng/ml)
Grundprobe Probe 7979 4840 62,24
generierte 5433 7289 42,71
(dreifach) 5416 7539 41,81
Probe 5248 7316 41,77
generierte (Mittelwert)
42,1
0,131
Bei dieser Untersuchung wurde die Renin-Aktivität zu 1,31 ng/ml/h bestimmt.
Beispiel 8
Es wurden unter Verwendung von doppelten Blindproben und Standardlösungen, die jeweils 0,03, 0,06, 0,08, 0,1, 0,2, 0,3 und 0,6 ng nicht-markiertes Angiotensin I pro ml enthielten, radioimmunologische Standarduntersuchungsreaktionen durchgeführt. Es wurde auch ein Kontrollversuch durchgeführt, bei dem zu dem Vorreaktionsgemisch kein Antiserum gegeben worden war. Es wurde wie im Beispiel 2 verfahren, mit der Ausnahme, daß die Temperatur und die Zeit der Inkubierung der radioimmunologischen Untersuchungsreaktion variiert wurden. Die folgenden Kombinationen von Zeit und Temperatur wurden bei diesen radioimmunologischen Standardreaktionen angewendet:
-37-
60981 3/07H
Temperatur Zeit
37°C 1 h
200C 1 h
200C 5 h
120C 1 h
12°C 5 h
Die Ergebnisse der Zählung der überstehenden Flüssigkeit Und der Harzstreifen nach ihrer Abtrennung und die errechne Len Prozent gebundenes Angiotensin I bei diesen Standardreaktionsgemischen sind in den Tabellen XII bis XVI zusammengestellt:
Tabelle XII
Standardreaktionssystem 37°Ct 1 h
Radioaktivitätszählungen pro min
überstehende Flüssigkeit Streifen % gebunden
Kontrollversuch (kein
Antikörper) 592
0,6 ng std. 1982
0,3 ng std. 3304
0,2 ng std. 3620
0,1 ng std. 5019
0,08 ng std. 5089
0,06 ng std. 5769
0,03 ng std. 6310
0,0 ng std. 4848
0,0 ng std. 6384
11207 5,02
9869 16,72
8700 27,52
8137 30,79
6664 42,96
6062 45,64
5801 49,86
5302 54,34
3951 55,10
4041 61,24
-38-
609813/071
Tabelle XIII
Standardreaktionssystem 2O0C, 1 h
Radioaktivitätszählungen pro min überstehende Flüssigkeit Streifen
% gebunden
0,6 0,3 0,2 0,1 0,08 0,06 0,03 0,0 0,0
1772 2659 3572
4587 3986 5052 5473 5744 5384
9629
855'!·
7373
6815
-M
6-':62
6293
5968
5767
15,54 23,71 31,21
40,23 37,90 43,88 46,52 49,04 48,28
0,6 0,3 0,2 0,1 0,08 0,06 0,03 0,0 0,0
Tabelle XIV
Standardreaktlonssystem 200C, 5 h
Radioaktivitätszählungen pro min
überstehende Flüssigkeit Streifen % gebunden
1742 2863 3787 5634 6115 7076 7486 7816 7599
9872
8475
7963
5573
5265
4323
4171
3586
4361
15,0
25,25
32,23
50,27
53,73
62,08
64,22
68,55
63,54
-39-
609813/071 U
Tabelle XV
Standardreaktionssystem 12°C, 1 h
Radioaktivitätszählungen pro min
Verstehende Flüssigkeit Streifen % gebunden
1823 9623 15,9
2922 8412 25,8
3115 8317 27,2
3897 7457 34,3
3980 7479 34,7
4221 7315 36,6
4406 7083 38,3
4764 6664 41,7
4742 6523 42,1
Tabelle XVI
Standardreaktionssystem
12°C, 5 h
0,08 0,06 0,03
Radioaktivitätszählungen pro min überstehende Flüssigkeit Streife:
% gebunden
0,08 0,06 0,03
1816 2791 3859 5366
5747 5974 6889 7046 7748
9131
8630
7471
5927
5658
5316
4445
4096
3871
16,6 24,4 34,1 47,5 50,4 52,9 60,8 63,2 66,7
-40-
RO 9 8 1 3/07U
Die Werte der Tabellen XII bis XVI wurden aufgetragen, wodurch eine Kurve erhalten wurde. Diese Kurvenroihe ist in Figur 4 wiedergegeben.
Die Ergebnisse der Standardreaktionsversuche dieses Beispiels zeigen, daß die radioimmunologische Untersuchungsreaktion gemäß der Erfindung bei einer Vielzahl von Temperaturen mit geeignet kurzen Reaktionszeiten durchgeführt werden kann.
-41-609B13/07U

Claims (25)

  1. Patentansprüche
    1 .J Radioimmunologisches Untersuchungsverfahren zur invitro-Bestimmung der Renin-Aktivität einer unbekannten Plasmaprobe, dadurch gekennzeichnet , daß man eine unbekannte Bildungsprobe herstellt, indem man die unbekannte Plasmaprobe mit einer Bildungspufferlösung und einem Inhibitor für Enzyme, die Angiotensin I in andere Substanzen umwandeln, vermischt, die unbekannte Bildungsprobe inkubiert, um durch Einwirkung von Renin auf Angiotensinogen Angiotensin I zu bilden, wodurch eine generierte unbekannte Plasmaprobe erhalten wird, ein generiertes unbekanntes radioimmunologisches Untersuchungsreaktionsgemisch herstellt, indem man die generierte unbekannte Plasmaprobe mit einer vorgewählten Menge von radioaktiv markiertem Angiotensin I, einer vorgewählten Menge eines Antikörpers für Angiotensin I und einer ausreichenden Menge einer Untersuchungspufferlösung, daß in dem generierten unbekannten Reaktionsgemisch Renin- und Angiotensinogen-Konzentrationen erhalten werden, bei denen bei Temperaturen, welchen das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch nachfolgend ausgesetzt wird, keine wesentliche Bildung von Angiotensin I erfolgt, vermischt, das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch bei einer Temperatur von mindestens etwa 12°C inkubiert, so daß eine konkurrierende Bindungsreaktion zwischen dem Antikörper und dem markierten und nicht-markierten Angiotensin I erfolgt, gebundenes Angiotensin I von ungebundenem Angiotensin I abtrennt, die relativen Verhältnisse von gebundenem zu ungebundenem markierten Angiotensin I in dem Reaktionsgemisch bestimmt, den Angiotensin-I-Gehalt des gene-
    609813/07U
    rierten unbekannten Reaktionsgemisch.es durch Vergleich der relativen Verhältnisse von gebundenem zu ungebundenem markierten Angiotensin I in dem unbekannten Reaktionsgemisch mit den relativen Verhältnissen von gebundenem zu ungebundenem markierten Angiotensin I in radioimmunologischen Standarduntersuchungsreaktionsgemischen, welche bekannte Mengen von nicht markiertem Angiotensin I enthalten, bestimmt, und daß man die Reninaktivität der unbekannten Plasmaprobe aus der Differenz zwischen dem Angiotensin-I-Gehalt des generierten unbekannten Reaktionsgemisches und des Angiotensin-I-Gehalts eines nicht-generierten radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemisches, welches eine Probe des gleichen unbekannten Plasmas enthält, bestimmt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch bei einer Temperatur von zwischen etwa 120C und etwa 55°C inkubiert.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch bei einer Temperatur von zwischen etwa 200C und etwa 400C inkubiert.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß man das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch einen Zeitraum von zwischen etwa 15 Minuten und etwa 3 Stunden inkubiert .
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch bei einer Temperatur von ungefähr 37°C inkubiert.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch g e k e η η -
    609813/07U
    -43-
    zeichnet, daß man das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch einen Zeitraum von ungefähr 1 Stunde inkubiert.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Konzentration des Renins in dem generierten unbekannten radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemisch nicht größer ist als etwa 1/10 der Konzentration des Renins in der unbekannten Plasmaprobe .
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Reninkonzentration in dem generierten unbekannten radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemisch nicht größer als etwa 1/20 der Konzentration des Renins in der unbekannten Plasmaprobe ist.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der pH-Wert des generierten unbekannten radioimmunologischen Untersuchungsreaktionsgemisches in der Gegend von etwa 9 liegt.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die Untersuchungspufferlösung eine Pufferkomponente, Humanserumalbumin und ein Alkalimetallazid enthält.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch in der Weise herstellt, daß man die generierte unbekannte Probe und den Antikörper zu einem vorkombinierten Reaktionsmedium gibt, welches die Untersuchungspufferlösung und das radioaktiv markierte Angiotensin I enthält.
    R09fl13/n7U
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das radioaktiv markierte Angiotensin I 125 J enthält.
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das ungebundene Angiotensin I von dem gebundenen Angiotensin I in der Weise abtrennt, daß man einen relativ dünnen Streifen einer Membran, die im wesentlichen aus einem Ionenaustauscherharz besteht, in das inkubierte generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch eintaucht, wodurch ungebundenes Angiotensin I auf dem Harzstreifen adsorbiert wird, und daß man den Streifen, der das ungebundene Angiotensin I trägt, aus dem Reaktionsgemisch herausnimmt.
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß man die relativen Verhältnisse von gebundenem zu ungebundenem markierten Angiotensin I in dem inkubierten Reaktionsgemisch in der Weise bestimmt, daß man das Reaktionsgemisch vor dem Eintauchen des Harzstreifens einer Vorzählung unterwirft und daß man das Reaktionsgemisch nach Entnahme des Harzstreifens einer Nachzählung unterwirft.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die unbekannte Bildungsprobe bei einer Temperatur von zwischen etwa 10°C und etwa 60°C inkubiert.
  16. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die unbekannte Bildungsprobe bei einer Temperatur von zwischen etwa 35°C und etwa 50°C inkubiert.
    -45-6 0 9 8 1 3 / 0 7 U
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , da8 man die unbekannte Bildungsprobe bei einer Temperatur von ungefähr 37°C inkubiert»
  18. 18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildungspufferlösung einen pH-Wert von ungefähr 5*5 aufweist.
  19. 19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildungspufferlösung einen Puffer aus der Gruppe saures Kaliumphthalat und 2,2-Dimethylglutarsäure enthält.
  20. 20. · Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor aus der Gruppe 8-Hydroxychinolin und 2,3-Dimercaptopropanol ausgewählt wird.
  21. 21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nicht-generierte Grundprobe, die das unbekannte Plasma enthält, mit einer vorgewählten Menge von radioaktiv markiertem Angiotensin I, einer vorgewählten Menge eines Antikörpers für das Angiotensin I und einer ausreichenden Menge einer Untersuchungspufferlösung vermischt, um ein unbekanntes radioimmunologisches Untersuchungs-Grundreaktionsgemisch herzustellen, welches im wesentlichen die gleichen Verhältnismengen von unbekanntem Plasma, markiertem Angiotensin I und Antikörper enthält wie das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch, daß man das unbekannte radioimmunologische Untersuchungs-Grundreaktionsgemisch bei der gleichen Temperatur und über den gleichen Zeitraum inkubiert wie das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch, daß man in dem Grundreaktiongsgemisch enthaltenes ungebundenes Angiotensin I von gebundenem Angiotensin I abtrennt, daß man die relativen
    609813/07U -^-
    Verhältnisse von gebundenem zu ungebundenem markierten Angiotensin I in dem Grundreaktionsgemisch bestimmt und daß man den Angiotensin-I-Gehalt des unbekannten Grundreaktionsgemisches bestimmt, indem man die relativen Verhältnisse von gebundenem zu ungebundenem markierten Angiotensin I in dem Grundreaktionsgemisch mit den relativen Verhältnissen von gebundenem zu ungebundenem markierten Angiotensin I in radioimmunologischen Standarduntersuchungsreaktionsgemisehen, welche bekannte Mengen von nicht-markiertem Angiotensin I enthalten, miteinander vergleicht.
  22. 22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet , daß man die unbekannte Grundplasmaprobe, welche einen aliquoten Grundteil des inhibierten Plasmas und die Bildungspufferlösung enthält, mit einem Reaktionsmedium verdünnt, welches die Untersuchungspufferlösung und das markierte Angiotensin I enthält, um ein Grundvorreaktionsgemisch herzustellen, daß man das Grundvorreaktionsgemisch während der Inkubierung der unbekannten Bildungsprobe bei einer Temperatur nicht wesentlich oberhalb etwa 37°C hält, daß man sodann ein unbekanntes radiöimmunologisches Grunduntersuchungsreaktionsgemisch herstellt, indem man den Antikörper zu dem Grundvorreaktionsgemisch gibt und daß man die radioimmunologische Uhtersuchungsreaktion durchführt, indem man das Grundreaktionsgemisch die gleiche Zeitlang und bei identischen Bedingungen wie bei der Inkubierung des generierten unbekannten radioimmunologischen üntersuchungsreaktionsgemisches inkubiert .
  23. 23. Radioimmunologisches untersuchungsverfahren zur invitro-BeStimmung der Renin-Aktivität einer unbekannten Plasmaprobe, dadurch gekennzeichnet , daß man die Plasmaprobe mit einer Inhibierungslösung vermischt,
    -47-609813/071 4
    welche einen Inhibitor aus der Gruppe 8-Hydroxychinolin und 2,3-Dimercaptopropanol enthält, eine unbekannte Bildungsprobe herstellt, indem man die unbekannte Plasmaprobe, die den Inhibitor enthält, mit einer Bildungspufferlösung vermischt, welche einen Puffer aus der Gruppe saures Kaliumphthalat und 2,2-Dimethylglutarsäure enthält, eine unbekannte Grundprobe herstellt, welche die gleiche Zusammensetzung hat wie die unbekannte Bildungsprobe, ein unbekanntes Grundvorreaktionsgemisch herstellt, indem man die unbekannte Grundprobe mit einer vorgewählten Menge von mit 125 J markiertem Angiotensin I und einer ausreichenden Menge einer Untersuchungspufferlösung, daß in dem unbekannten Grundreaktionsgemisch eine Renin-Konzentration von nicht größer als etwa 1/10 der Renin-Konzentration in der Plasmaprobe erhalten wird, vermischt, die unbekannte Bildungsprobe inkubiert, um Angiotensin I durch Einwirkung von Renin auf Angiotensinogen zu bilden, wodurch eine generierte unbekannte Plasmaprobe erhalten wird, das unbekannte Grundvorreaktionsgemisch bei einer Temperatur von nicht wesentlich höher als etwa 37°C während der Inkubierung der unbekannten Bildungsprobe hält, ein generiertes unbekanntes radioimmunologisches Untersuchungsreaktionsgemisch herstellt, indem man die generierte unbekannte Probe mit einer vorgewählten Menge von mit 125 J markiertem Angiotensin I, einer vorgewählten Menge eines. Antikörpers für das Angiotensin I und einer ausreichenden Menge einer Untersuchungspufferlösung, daß in dem generierten unbekannten Reaktionsgemisch eine Renin-Konzentration von nicht mehr als etwa 1/10 der Renin-Konzentration in der Plasmaprobe erhalten wird, vermischt, ein unbekanntes radioimmunologisches Grunduntersuchungsreaktionsgemi sch herstellt, indem man das Grundvorreaktionsgemisch mit einer vorgewählten Menge eines Antikörpers für Angiotensin I vermischt, sowohl das unbekannte radioimmunologische Grunduntersuchungsreaktionsgemisch als auch das generierte unbekannte radioimmunologische Untersuchungsreaktionsgemisch bei einer Temperatur von ungefähr 37°C
    609813/07U _48_
    inkubiert, so daß eine konkurrierende Bindungsreaktion zwischen dem Antikörper und sowohl dem markierten als auch nicht-markierten Angiotensin I in jedem der Reaktionsgemische erfolgen kann, jedes Reaktionsgemisch im Kontakt mit einem relativ dünnen Streifen einer Membrane, bestehend im wesentlichen aus einem Ionenaustauscherharzstreifen, inkubiert, um eine Adsorption des ungebundenen Angiotensins I auf dem Harzstreifen zu bewirken, den Harzstreifen aus jedem der Reaktionsgemische herausnimmt, um eine Abtrennung von ungebundenem Angiotensin I von gebundenem Angiotensin I zu bewirken, die Radioaktivität durch Zählung bestimmt, um zu ermitteln, welche Verhältnismenge des am Anfang in jedem der Reaktionsgemische enthaltenen markierten Angiotensins I gebunden ist und welche Verhältnismenge ungebunden ist, den Angiotensin-I-Gehalt sowohl in dem generierten unbekannten Reaktionsgemisch als auch dem unbekannten Grundreaktionsgemisch durch Vergleich der relativen Verhältnisse von gebundenem zu ungebundenem markiertem Angiotensin I in jedem der Reaktionsgemische mit den relativen Verhältnissen von gebundenem und ungebundenem markierten Angiotensin I in radioimmunologischen Standarduntersuchungsreaktionsgemisehen, welche bekannte Mengen von nicht-markiertem Angiotensin I enthalten, bestimmt, und daß man die Renin-Aktivität des Plasmas aus der Differenz zwischen dem Angiotensin-I-Gehalt des generierten unbekannten Reaktionsgemisches und dem Angiotensin-I-Gehalt des unbekannten Grundreaktionsgemisches bestimmt.
  24. 24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet , daß man die relativen Verhältnisse von gebundenem zu ungebundenem markierten Angiotensin I in den Reaktionsgemischen bestimmt, indem man die Reaktionsgemische vor dem Eintauchen der Harzstreifen einer Vorzählung unterwirft und indem man die Reaktionsgemische nach Herausnahme des Harzstreifens einer Nachzählung unterwirft.
    609813/07U
    -49-
  25. 25. Abgepacktes Testbesteck zur Verwendung bei einer radioimmunologischen Untersuchungsmethode zur in-vitro-BeStimmung der Renin-Aktivität von Blutplasma, gekennzeichnet durch die Kombination von folgendem:
    a) einer Bildungspufferlösung, welche eine Pufferkomponente aus der Gruppe saures Kaliumphthalat und 2,2-Dimethylglutarsäure enthält,
    b) einem Reaktionsmedium mit einem pH-Wert von ungefähr 9, welches eine Pufferkomponente, Humanserumalbumin, ein Alkalimetallazid und Angiotensin I, das mit einem Radioisotop aus der Gruppe 125 J und 131 J markiert ist, enthält,
    c) einem Antiserum, welches einen Antikörper für Angiotensin I enthält,
    d) eine Vielzahl von Standardlösungen, die bekannte Mengen von nicht-markiertem Angiotensin I enthalten, und
    e) eine Vielzahl von relativ dünnen Streifen einer Membrane, die im wesentlichen aus einem Ionenaustauscherharz besteht.
    609813/07U
DE19752539219 1974-09-06 1975-09-03 Radioimmunologisches untersuchungsverfahren zur in-vitro-bestimmung der renin-aktivitaet und besteck zur durchfuehrung dieses verfahrens Pending DE2539219A1 (de)

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