DE2522998A1 - Neues cephalosporinderivat, verfahren zu seiner herstellung und arzneimittel - Google Patents

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patentanwXlti

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER DR.-ING. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KINZEBACH

D-BOOO MÜNCHEN AO. BAUERSTRASSE 22 ■ FERNRUF (O89) 37 63 S3 · TELEX S21S2OB ISAR D POSTANSCHRIFT: D-8000 MÜNCHEN 43. POSTFACH 78O

München, den 23. Mai 1975 M/16117

BRISTOL-MYERS COMPANY

345 Park Avenue, New York, N.Y. 10022, USA

Neues Cephalosporinderivat, Verfahren zu seiner Herstellung und Arzneimittel

Die Erfindung betrifft ein neues kristallines Sesquihydrat von 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure, das insbesondere als antibakterielles Mittel brauchbar ist.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung und Arzneimittel, die diese Verbindung enthalten.

! 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamldo]-3-(1,2,3-tria- ! zol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure ist ein neues

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Cephalosporin, das auch als BL-S64O bezeichnet wird, das durch David Willner und Leonard B. Crast, Jr. in der deutschen Patentanmeldung P 2 364 192 (Priorität 26. Dezember 1972) beschrieben und beansprucht ist; die gesarate Offenbarung dieser Anmeldung ist in der vorliegenden Anmeldung als Bezug eingeschlossen.

Bei der Herstellung von 7-[D-nr-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido ]-3- (1,2,3-tr iazol-5-yl-thiomethyl) ^-cephem^- carbonsäure durch die in der oben erwähnten Deutschen Patentanmeldung P 2 364 192 offenbarten Arbeitsweisen ist das bei der chemischen Herstellung erhaltene rohe amorphe Produkt durch Rückstände der Reagentien und durch zahlreiche Zersetzungsprodukte stark verunreinigt, von denen es durch Umkristallisation oder die anderen üblichen Techniken, wie Waschen mit Lösungsmitteln, nicht in vernünftiger Ausbeute abgetrennt werden kann. Alle Bemühungen, das amorphe rohe Produkt durch Bilden eines kristallinen Zwitterions oder eines Hydrats davon nach üblichen Methoden, beispielsweise Kristallisation aus einer wäßrigen Reaktionsmischung durch Einstellen des pH auf den isoelektrischen Punkt, zu reinigen, haben versagt. Das Problem der Reinigung dieses besonderen Cephalosporins ist weiter durch die Tatsache kompliziert, daß bei einem alkalischen pH, d.h. pH 7 oder höher, die Verbindung sich sehr schnell durch Verlust der Thioleinheit zersetzt.

In einem Versuch, die amorphe 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure zu isolieren und zu reinigen, wurde das amorphe rohe Produkt mit Erfolg in ein kristallines Methanolsolvat überführt. Dieses Methanolat ist jedoch aufgrund der Toxizität des Methanols für eine pharmazeutische Verwendung beim Menschen nicht wünschenswert. Darüber hinaus

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schafft das Methanolsolvat eine geringe Reinigung des Rohprodukts, wie sie durch eine Zunahme der Biowirksamkeit, eine Verminderung der Färbung oder eine Abnahme des Gehalts an Verunreinigungen gemessen wird. Es wurde auch ein Äthanolsolvat hergestellt, das zwar kristallin ist, dessen Bildung jedoch nicht von irgendeiner signifikanten Reinigung begleitet wurde. Dazu verlor das Äthanolat beim Suspendieren in Wasser allmählich sein Äthanol, um sich in eine feste, klebrige Form zu verwandeln, die ihre Kristallinität verlor, nicht gleichmäßig suspendierte und gummiartig wurde. Es wurde kein Weg gefunden, aus den Solvaten die Lösungsmittel zu entfernen, um im wesentlichen wasserfreie, reine Verbindung zu erhalten, und die so erhaltenen Produkte wurden klebrig und waren für pharmazeutische Formulierungen nicht brauchbar. Lyophilisieren der Wasserlösungen der Methanol- oder Äthanolsolvate (5 bis 10 mg/ml) ergab ein amorphes Monohydratprodukt, das biologisch ijistabil (es verlor bei der Lagerung während 1 Monats bei 56⁰C 37 % seiner Wirksamkeit) und für eine pharmazeutische Verwendung unannehmbar war.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines stabilen, nicht-toxischen, nicht-solvatisierten kristallinen Hydrats von 7-[D-a-Amino-oc-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-0,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure, das im wesentlichen frei von Verunreinigungen ist und bei der Herstellung pharmazeutischer Dosisformen des Cephalosporin-Antibiotikums sowohl für orale als auch für parenterale Verabreichung brauchbar ist.

Die vorliegende Erfindung schafft ein neues kristallines Sesquihydrat von 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure und Verfahren zu seiner Herstellung. Das erfindungsgemäße Hydrat ist eine besonders brauchbare Form des oben er-

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wähnten Cephalosporins insofern, als es im wesentlichen frei von den Verunreiniglingen hergestellt wird, die in Proben von Cephalosporin gefunden werden, das durch angewandte handelsübliche Verfahren hergestellt wird. Zusätzlich besitzt es eine gute biologische Stabilität (als Feststoff verliert es bei einer 1-monatigen Lagerung bei 56⁰C weniger als 6 % seiner Bioaktivität) und die gewünschte, für eine Formulierung für orale und parenterale Dosisformen erforderlichen physikalischen Eigenschaften. Beim Suspendieren in Wasser verliert das kristalline Sesquihydrat keine biologische Aktivität und unterliegt beim Stehen auch keinen schädlichen Änderungen, wie Verlust von Kristallinität, ungleichförmiger Suspension, Verölen, Verklumpen, Absetzen oder Klebrigwerden. Das kristalline Sesquihydrat ist ein brauchbares Breitband-Spektrum antibakterielles Mittel und man stellt fest, daß es sowohl bei oraler als auch bei parenteraler Verabreichung wirksame Blutspiegel schafft.

Die neue kristalline Form von 7-[D-a-Amino-oc-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesquihydrat, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben und beansprucht ist, weist im wesentlichen das nachfolgende Pulver-Röntgenbeugungsspektrum

auf:

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Linie	Abstand d(Ä)	Relative In tensität
1	9,31	45
2	6,77	93
3	6,17	32
4	5,56	14
5	4,42	100
6	3,97	76
7	3,78	95
8	3,55	55
9	3,41	53
10	3,10	26
11	3,01	19
12	2,94	9
13	2,83	17
14	2,77	23
15	2,55	19
16	2,32	10
17	2,23	12
18	2,05	10
19·	1,97	6
20	1,88	7

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Die Einzelheiten für diese Bestimmung des Röntgenbeugungsspektrums sind wie folgt:

Eine kleine Menge einer Probe wird in einem Kapillarrohr mit 0,2 mm Durchmesser aus wenig streuendem Glas, das zur Belichtung in einer 114,6 mm Durchmesser Debye-Scherrer-Pulverbeugungskamera befestigt wurde, verschlossen. Die Belichtungszeit betrug 8 Stunden auf einem Norelco-Röntgenstrahlgenerator (x-ray generator), der bei 35 KV/20 mA unter Verwendung einer Röntgenröhre mit einem Standardfokus und einer Kupferanode (weighted CuK -Wellenlänge λ = 1,5418 ä) betrieben wurde. Man verwendete Kodak No-Screen X-Ray Film und entwickelte 3 Min. bei 20 ⁰C in Kodak Liquid X-Ray-Entwiekler.

Eine sehr kleine Menge kristallines Natriumfluorid wurde in einige Proben eingemischt, um eine interne Kalibirierung zu schaffen. Zusätzlich wurde eine Probe reines NaF für denselben Zweck dem gesamten Verfahren unterworfen.

Die Filme wurden auf einem Norelco-Debxe-Scherrer-Filmlesegerät gelesen, das die Positionen der Beugungsringe bis auf 0,05 mm aufzeichnete. Die Daten wurden bezüglich der Filmschrumpfung korrigiert und die Netzebenenabstände (d-Abstände) wurden aus den korrigierten Daten berechnet. Ein Computerprogramm (XRAY von P. Zugenmaier) wurde für alle Berechnungen angewendet. Die Genauigkeit der erhaltenen d-AbStandsdaten betrug ungefähr 1 %.

Eine Intensitätsaufnahme aller Filme wurde unter Verwendung eines Joyce-Loeble Mark IIIC Recording Micro-Densitometers (Scan-Verhältnis 5:1, 0,1 O.D. Graukeil) erhal-

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ten. Relative Intensitäten auf einer Skala von 1 bis 100 wurde allen erkennbaren Beugungsringen zugeordnet, wobei man bezüglich der Hintergrundsaufnahme korrigierte Spitzenintensitäten (peak intensities) verwendete.

Eine Probe des kristallinen Sesquihydratprodukts wurde IR- und NMR-Analysen unterworfen,und die Daten der funktionellen Gruppen aus den Spektren sind nachfolgend zusammengestellt:

IR (als KBr-Scheibe)

2400 - 3600 cm (breite, überlappende Peaks) Amid,

NH, NH₃ ⁺, OH(H₂O)

1780 ß-Lactam C=O

1707 Amid C=O

1570 COO"

1520 aromatische C=C

NMR (DMSO, verdünntes PCI)

7,96 ppm <f Singulett, 1H, H

6,7-7,6 Multiplett, 4H, H_b

5,7 Düblett, 1H, H_c

4,9 - 5,2 Multiplett, 2H, H_d, H_e

3,2 - 4,2 Multiplett, 4H, H , H-

1,1 Düblett*

* restliches Propylenglykol

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Das kristalline Sesquihydrat hat einen Zersetzungsbereich von 188 bis 194°C und erscheint bei der Beobachtung unter einem polarisierenden Mikroskop in Form von Mikrokristallen. Das Sesquihydrat besitzt eine Löslichkeit in Wasser von angenähert 10 mg/ml bei 25°C.

Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Herstellung von kristallinem 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-^-carbonsäure-sesquihydrat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-methanolsolvat in Wasser bei einem pH-Bereich von angenähert 2,5 bis 7,0 suspendiert und das gewünschte kristalline Sesquihydratprodukt aus der wäßrigen Reaktionsmischung gev.'innt.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von kristallinem 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thicmethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesquihydrat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine wäßrige Suspension von 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-methanolsolvat mit ausreichend Base behandelt,

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um den pH der wäßrigen Suspension auf zwischen ungefähr 6 und 7 und vorzugsweise in den Bereich von ungefähr 6,2 bis 6,7 anzuheben, bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 5°C bis 85°C während eines Zeitraums von ungefähr 1 bis 24 Std. behandelt, das kristalline Hydrat aus der wäßrigen Reaktionsmischung gewinnt und bei einer Temperatur zwischen ungefähr 37 bis 45°C an der Luft trocknet, wobei man das gewünschte kristalline Sesquihydratprodukt erhält.

Das Methanolsolvat der 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-ace tamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure wird in Wasser aufgeschlämmt, um eine wäßrige Suspension mit einem pH im Bereich von ungefähr 3 bis 4 zu bilden. Das Methanolsolvat-Ausgangsmaterial kann direkt aus dem rohen amorphen Cephalosporin-Zwitterion durch die in der deutschen Patentanmeldung P 2 364 192 beschriebenen Verfahren, beispielsweise Kristallisation des rohen Zwitterions aus einer Methanollösung, oder durch die nachfolgend unter dem Abschnitt "Herstellung der Ausgangsmaterialien" beschriebenen verbesserten Verfahren hergestellt werden. Am vorteilhaftesten wird jedoch das rohe Cephalosporin-Zwitterion als das Methanolsolvat gewonnen, das Methanolsolvat wird in ein Propylenglykolsolvat überführt und das Propylenglykolsolvat wird schließlich in ein reineres kristallines Methanolsolvat überführt, das als Ausgangsmaterial beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung des kristallinen Sesquihydrats verwendet wird. Die Arbeitsweisen zur Herstellung der Methanol- und Propylenglykolsolvate sind nachfolgend im Abschnitt "Herstellung der Ausgangsmaterialien" beschrieben. Die oben erwähnte bevorzugte Reinigungs-Arbeitsweise führt die im Methanolat-Ausgangsmaterial vorhandenen Verunreinigungen auf ein Minimum zurück und führt zur Herstellung des Hydratprodukts mit

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höchster Qualität. Da Wasser offensichtlich die Propylenglykolreste im kristallinen Methanolat nicht ersetzt, ist es ebenfalls wünschenswert, ein Methanolsolvat zu verwenden, das im wesentlichen frei von Propylenglykolverunreinigungen ist. Dieses Propylenglykol-freie Methanolsolvat kann beispielsv/eise durch Umkristallisation des Methanolats aus Methanol, bis im wesentlichen alle Propylenglyko!verunreinigungen entfernt sind, hergestellt werden. Die wäßrige Suspension des Methanolsolvats kann irgendeine gewünschte Konzentration besitzen, jedoch ist es für höchste Ausbeuten bevorzugt, eine Konzentration von ungefähr 250 mg Methanolat pro ml Wasser zu verwenden. Das Methanolat wird vorzugsweise auf eine Teilchengröße von weniger als 0,074 mm (200 mesh) vermählen.

Nach der Herstellung der wäßrigen Suspension des Methanolsolvats und vorzugsweise Rühren während eines Zeitraums von ungefähr 1 bis 24 Std., kann das kristalline Hydrat aus der wäßrigen Reaktionsmischung durch gebräuchliche Methoden, wie Filtrieren oder Zentrifugieren, gewonnen werden. Das Produkt wird mit Wasser gewaschen und bei einer Temperatur zwischen ungefähr 37°C und 45°C, vorzugsweise während eines Zeitraums von ungefähr 24 bis 48 Stunden, an der Luft getrocknet.

In der bevorzugten Arbeitsweise wird das Methanolsolvat in Wasser aufgeschlämmt, um eine wäßrige Suspension zu bilden und der pH der Suspension wird dann langsam auf einen derartigen Wert angehoben, daß die maximale Menge an kristallinem Hydrat aus der Reaktionsmischung auskristallisiert. Man erhält die besten Ergebnisse, wenn man den pH durch Zugabe von Base auf ungefähr 6 bis 7 und am bevorzugtesten in den Bereich von ungefähr 6,2 bis 6,7, anhebt. Die Art der zur Änderung des pH-Werts verwendeten Base ist nicht wlclrci.* und jede

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mit Viasser mischbare Base ist annehmbar. Die aufgrund der Zugänglichkeit und Kosten am meisten bevorzugten Basen sind die Alkalimetallhydroxyde, beispielsweise Natriumoder Kaliumhydroxyd. Man gibt die Base langsam unter Rühren während einer Zeit zu, die ausreicht, die Ausfällung des gewünschten kristallinen Hydrats zu bewirken. Es wird angenommen, daß die Bildung des kristallinen Hydrats nach kurzer Zeit erfolgt, jedoch ist es bevorzugt, die Reaktionsmischung während einer Zeit von ungefähr 1 bis 24 Std., am bevorzugtesten ungefähr 2 Std., zu rühren, um eine vollständige Reaktion und die Bildung von Kristallen guter Qualität zu erlauben. Die Temperatur der Reaktionsmischung während der pH-Einste1lungsstufe ist nicht besonders kritisch und kann vorteilhaft im Bereich von ungefähr 5°C bis 85°C liegen. Am günstigsten wird jedoch das gesamte Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt.

Das kristalline Sesquihydrat wird aus der Reaktionsmischung durch übliche Methoden, v/ie Filtrieren oder Zentrifugieren gev/onnen, mit Wasser gewaschen und bei Temperaturen im Bereich von ungefähr 37 "bis 45°C, vorzugsweise während eines Zeitraums von ungefähr 24 bis 48 Std. an der Luft getrocknet.

Eine leichte Variation des obigen bevorzugten Verfahrens borteht darin, daß man das Methanolat-Ausg-rngsmaterial direkt zu einer wäßrigen Lösung mit einem pH von ungefähr bis 7 und am bevorzugtesten im Bereich von ungefähr 6,2 bis ungefähr 6,7, zugibt. Die wäßrige Methanolatsuspension wird dann vorzugsweise zwischen ungefähr 1 und 24 Std. aufgeschlämmt und das kristalline Hydrat wird wie oben beschrieben gewonnen.

Bei der Gewinnung des kristallinen Hydrats aus der Reaktionsmischung und Kühlen auf Raumtemperatur wird das Hydrat üb-

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licherweise in Form des kristallinen Dihydrats isoliert. Man stellt auch fest, daß das Dihydrat unter sehr milden Bedingungen ein halbes Molekül gebundenes Wasser verliert· und somit führt die Lufttrocknung des Hydratprodukts bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 37 bis 45°C während 24 Std. zu einer Umwandlung des Dihydrats in das stabilere kristalline Sesquihydratprodukt. Es wird auch festgestellt, daß die Lufttrocknung des kristallinen Dihydrats bei Raumtemperatur während eines Zeitraums von ungefähr 24 Std. in Gegenwart von trockener Laborluft ebenfalls zu einer Umwandlung in die bevorzugte kristalline Sesquihydratfοrm führt. Das erfindungsgemäße kristalline Sesquihydrat kann extremeren Trocknungsbedingungen, beispielsweise Lufttrocknung bei Temperaturen oberhalb ungefähr 45°C und/oder Vakuumtrocknen unterworfen werden, wobei andere kristalline Hydrate mit geringeren Mengen an gebundenem Wasser gebildet werden. So kann das kristalline Sesquihydrat mit 1,5 Mol Wasser pro Mol Cephalosporin-Zwitterion in ein kristallines Monohydrat durch Lufttrocknen während 24 Std. bei 56⁰C überführt werden. Beim Vakuumtrocknen bei 56⁰C während 24 Std. wird ein kristallines Halbhydrat mit 0,5 Mol gebundenem Wasser pro Mol Cephalosporin gebildet. Alle oben erwähnten neuen kristallinen Hydrate fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Bei der in vitro und in vivo Untersuchung zeigt das erfindungsgemäße kristalline 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesquihydrat im wesentlichen dieselbe Wirksamkeit und dasselbe Aktivitätsspektrum, wie in der deutschen

Patentanmeldung P 2 364 192 (US-Patentanmeldung Serial Number 318 340) berichtet.

Bei der Behandlung bakterieller Infektionen beim Menschen wird das kristalline 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acet-

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amido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesquihydrat entweder oral oder parenteral, vorzugsweise durch den Arzt, in einer Menge von ungefähr 5 bis 200 mg/kg/Tag und vorzugsweise ungefähr 5 bis 20 mg/kg/Tag in aufgeteilten Dosen, beispielsweise drei- oder viermal täglich, verabreicht. Es wird in Dosiseinheiten verabreicht, die beispielsweise 125, 250 oder 500 mg aktiven Bestandteil zusammen mit geeigneten physiologisch verträglichen Trägern oder Bindemitteln enthalten. Die Dosiseinheiten können in fester Form, wie Tabletten oder Kapseln, oder in flüssiger Form, wie wäßrigen Lösungen oder Suspensionen, vorliegen.

Herstellung der Ausgangsmaterialien

Man stellt D-(-)-2-(p-Hydroxyphenyl)-glycylchlorid-hydrochlorid in hoher Reinheit und sehr wirksam nach der nachfolgenden Arbeitsweise her:

10,0 g (ungefähr 0,06 Mol) D-(-)-2-(p-Hydroxyphenyl)-glycin (U.S.-Patentschrift 3 489 752) werden in 100 ml Dioxan aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wird gerührt und man leitet COCl₂ (Phosgen) ein, während die Temperatur der Aufschlämmung bei 50 bis 58°C gehalten wird. Das COCl₂ wird während insgesamt 3,5 Std. eingeleitet. Man erhält eine gelbe Lösung. Die Lösung wird mit Stickstoff gespült, um das überschüssige COCl₂ zu entfernen. Man perlt HCl-Gas 2,5 Std. lang durch die Lösung. Die Lösung wird gerührt und eine kleine Menge wird mit etwas Äther verdünnt, um einige Kristalle zu erhalten, die als Impfkristalle dem Ansatz zugesetzt werden. Die Lösung wird 16 Std. bei 20 bis 25°C gerührt. Die erhaltene Aufschlämmung von kristallinem D-(-)-2-(p-Hydroxyphenyl)-glycylchlorid-hydrochlorid wird filtriert, um das Produkt zu sammeln. Den Filterkuchen wäscht man mit Dioxan und Methylen-

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chlorid und trocknet dann in einem Vakuumexsikkator über P₂O₁-. Die Ausbeute an D-(-)-2-(p-Hydroxyphenyl)-glycylchlorid-hydrochlorid beträgt 7,3 g.

IR - ausgezeichnet.

Analyse:	ber.: gef.:	- 98,6 % - keines - keines.	Cl	93 96	43 42	C	4 4	H	6 6	N
	S äure Chloriduntersuchung:	31, 31,			,14 ,46		,09 ,22		,37 ,56
	Säurechlorid Freies COOH Freies HCl

D-a-tert.-Butoxycarbonylamino-a-(p-hydroxyphenyl)-essigsäure

Man gibt in einen Dreihalskolben, der mit einem Rückflußkühler, einem überkopfrührer und Thermometer versehen ist, eine gut gemischte Mischung von 8,36 g (0,05 Mol) D-(-)~p-Hydroxyphenylglycin und 3,02 g (0,075 Mol) Magnesiumoxyd in 120 ml 50 %igem wäßrigem Dioxan. Die Mischung wird 1 Std. gerührt und anschließend mit 10,74 g (0,075 Mol) tert.-Butoxycarbonylazid behandelt. Die Mischung wird dann 17 Std. unter N₂ gerührt und auf 45 bis 50⁰C erhitzt. Man verdünnt die Lösung mit 400 ml Wasser und extrahiert zweimal mit 300 ml Äthylacetat. Die wäßrige Phase wird mit 10 %iger Zitronensäurelösung auf pH 4 angesäuert und mit NaCl gesättigt. Man extrahiert die wäßrige Mischung mit 3 x 400 ml Äthylacetat. Die Lösung wird über Na₂SO^ getrocknet und das Lösungsmittel wird eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit "Skellysolve B", wobei man D-oc-tert,·

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Butoxycarbonylamino-a-(p-hydroxyphenyl)-essigsäure in Form eines Feststoffes mit einem Gewicht von 10,4 g (78,5 %) erhält.

7_ [D-rr-tert. -Butoxycarbonylamino-σ- (p-hydroxyphenyl) -acetamido ]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)^-cephem-A-carbonsäure

Zu einer Suspension von 6,0 g (19,0 mMol) 7-Amino-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure in 100 ml trockenem Methylenchlorid gibt man 8,5 ml (40,9 mMol) ¹ »1»1,3,3,3-Hexamethyldisilazan. Die Mischung wird 4 Std. gerührt und zum Rückfluß erhitzt, wobei man eine klare Lösung erhält. Das Lösungsmittel wird eingedampft und das zurückgebliebene Öl wird über Nacht bei Raumtemperatur einem Hochvakuum ausgesetzt. Der schaumige Rückstand wird in 85 ml trockenem THF gelöst und auf ungefähr -15°C gekühlt, bevor man ihn in die nachfolgende Reaktionsmischung einführt.

4,4 g (16,5 mMol) D-a-tert.-Butoxycarbonylamino-o:-(4-hydroxyphenyl)-essigsäure werden in 145 ml trockenem THF gelöst. Man rührt die Lösung und kühlt auf -20⁰C. 1,6 g (16 mMol) N-Methylmorpholin und 2,3 g (16,8 mMol) Isobutylchlorformiat werden nacheinander in einer Geschwindigkeit zugesetzt, daß die Temperatur der Mischung nicht Über ungefähr -1O°C ansteigt. Die erhaltene Mischung wird dann 20 Min. bei -12 bis -15⁰C gerührt. Man kühlt dann auf -20⁰C und gibt die THF-Lösung der silylierten 7-Amino-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure auf einmal zu. Die Temperatur steigt auf ungefähr -12°C. Die Außenkühlung wird unterbrochen, bis die Temperatur auf 0⁰C ansteigt. Zu diesem Zeitpunkt wird ein Eis/Wasserbad angewendet, und die Mischung wird 3 Std. bei 2 bis 3°C gerührt. Dies wird von einem Zeitraum von 1 Std. .ohne äußeres

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Kühlen gefolgt* wobei die Temperatur auf 20°C ansteigt. Man gibt insgesamt 30 ml Methanol zu und rührt noch 15 Min. bei Raumtemperatur. Nach dem Eindampfen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck wird der Rückstand in 300 ml Äthylacetat suspendiert. Der suspendierte Feststoff (11 »8 g) wird abfiltriert. Man extrahiert die Äthylacetatlösung dreimal mit einer 5 ^igen ITaHCO-,-Losung. Die vereinigten Natriumbicarbonatextrakte werden in einem Eisbad gekühlt, mit Äthylacetat überschichtet und mit 42,5 %iger H^POr auf pH 2,5 angesäuert. Die Phasen werden geschüttelt und dann getrennt. Die Äthylacetatlösung wird dann durch Durchgeben, durch Natriumsulfat getrocknet und anschließend auf ungefähr 15 bis 20 ml eingedampft. Diese Lösung wird dann tropfenweise zu *~-' 400 ml gerührtem Cyclohexan, das in einem Erlenmeyerkolben enthalten ist- zugegeben. Nach 1/2 Std. Rühren wird der ausgefällte Feststoff durch Filtrieren gesammelt. Die gesammelte, feste 7-[D-oc-tert,-Butoxycarbonylamino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure wird an der Luft getrocknet. Sie wiegt 1,75 g.

Man löst 3,5 g 7-[D-a-tert.-Butoxycarbonylamino-a-(phydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure in 80 ml 98 bis 100 %iger HCOOH und rührt 2 Std. bei Raumtemperatur. Die HCOOH wird unter vermindertem Druck (Aspiratorbadtemperatur nicht oberhalb 40°c)eingedampft und schließlich dreimal mit 30 ml Toluol azeotropiert. Der Feststoff wird über Nacht unter Hochvakuum über P?°5 getrocknet. Man erhält insgesamt 3,5 g eines Schaums. 2 g des Schaums werden mit 300 ml H₂OrCH₃OH (8:2) gerührt. Man filtriert das Lösungsmittel von etwas Feststoff (0,3 g) ab, behandelt mit 700 mg "Darko KB"-Aktivkohle, filtriert durch Diatomeenerde ("Celite") und gefriergetrocknet, wobei man 0,9 g rohe 7- [D-a-Amino-a- ( ρ-hydroxyphenyl) -acetamido ]-3- (-1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl-3-cephem-4-carbonsäure erhält. Zur

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Kristallisation wird die nachfolgende Arbeitsweise gebraucht. Eine Suspension von 0,2 g des rohen Materials in 6 ml 99 %igem Methanol wird in einem Reagenzglas zum Kochen erhitzt. Das Erhitzen wird unmittelbar unterbrochen und die Schmelze wird mit Impfkristallen verrieben. Die Schmelze verfestigt sich zu einer kristallinen Masse. Auf diese Weise erhält man aus 0,400 g Rohmaterial insgesamt 0,211 g 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamidoJ-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure. Das Material wird 20 Std. bei 56°C/0,1 mm über P₂O₅ getrocknet; Schmelzpunkt > 200°C (Zersetzung). IR und NMR stehen im Einklang mit der Struktur. Das NMR zeigt auch die Anwesenheit von 1/3 Mol CH₅OH an.

Analyse C₁3H₁3NgO₅S₂'H₂O*1/3CH₅OH:

C HNS

ber.: 44,83 4,38 17,10 13,09 96 gef.: 43,97 4,36 15,84 6,18%

Insgesamt 6,5 g (11,55 Mol) 7-[D-n-tert.-Butoxycarbonylamino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure werden in 175 ml 98 bis 100 ?oiger Ameisensäure unter wasserfreien Bedingungen gelöst. Man rührt die Mischung 2,5 Std. bei Raumtemperatur. Ein Teil der Lösung, nämlich 125 ml, wird unter vermindertem Druck zu einem bernsteinfarbenen Öl eingedampft. Das Öl wird dann dreimal mit 70 ml Toluol unter vermindertem Druck azeotropiert. Den Rückstand suspendiert man in 700 ml einer 80:20 H₂0/CH,0H-Lösung und rührt 0,5 Std. bis die Hauptmenge des Feststoffs gelöst ist und filtriert dann. Das Filtrat wird mit 1,5 g Aktivkohle ("Darko") während ungefähr 20 Min. behandelt. DLe Aktivkohle wird durch ein "CeJite"-Bett abfiltriert. Die Lo'ung wird dann in neun getrennten 100 mI-Rundkolben gefri< rgetrocknet;, Das gefriergetrocknete Material wiegt 2,415 g. Man kristalli-

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siert es in Ansätzen von 0,200 g wie oben beschrieben um, wobei man insgesamt 0,923 g 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure erhält. Das NMR-Spektrum steht im Einklang mit der Struktur und zeigt die Anwesenheit von 1/3 Mol CH₃OH an.

Analyse C₁₈H₁₈N₆O₅S₂-H₂O- 1/3 CH₃OH:

C HNS

ber.: 44,83 4,38 17,10 13,09 %

gef.: 45,77 4,44 16,61 13,01 %

44,36 4,34 16,52 13,01 %

Die Acylierung von 7-Amino-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiometnyl)-3-cephem-4-carboiibäure (7-TACA) zu BL-S640 wird mit D-(~)-p-Hydroxyphenylglycylchlorid-hydrochlorid in Methylenchlorid durchgeführt. Die Ausbeute an BL-S 640-Methanolsolvat beträgt ungefähr 45 % auf der Basis der Biovirksamkeit, In der Mutterlauge befinden sich ungefähr 15 % Aktivität und ungefähr 25 % unlösliche Feststoffe, bei denen es sich um unumgesetzte 7-TACA und um ein 7-TACA-Zersetzungsprodukt mit abgebautem ß-Lactam handelt.

Das Verfahren bringt im wesentlichen eine Silylierung von

in
7-TACA/-Iethylenchlorid mit HMDS und eine Acylierung mit Säurechlorid.HCl bei 0 bi;j 5°C, gefolgt von einer Abschreckung (quench) mit Methanol mit sich. Die Reaktion wird dann vom Methylenchlorid befreit (stripped) und die Msthanollösung wird mit "Darco KB^H behandelt, Man konzentriert das Piltrat im Vakuum und stellt dann mit konzentriertem NH. OH auf pH 4,8 bis 5,0 ein, impft an und kristallisier t.

- 18

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GLEICHUNGEN

COOH

J»

N H J» + (CH₃)₃-SiNH-Si-(CH₃)₃

MeCl₂ Rückfluß

313.3 7-TACA (US-PS 3 759 904)

(CH₃)₃Si-N

CH₂-S COOSi(CH₃)₃

(I) + NH, N

SI(CH₃)₃

I + HO

⁰ •CH-C-Cl

NH₂ HCl DMA

DMA^HCl O - 5⁰C

462.45 II

O CH-C-NH

NH₂

CH₂

-S

il + DMA-HCl N

COOH

N" H

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ί,ο

MATERIALIEN (bezogen auf 1,0 kg 7-TACA)

Reagens	g	ml Mol
7-TACA	1000,0	-3,20
D_(_)-p-Hydroxyphenyl- glycylchlorid.HCl	797,0	-3,60
HMDS (Hexamethyldisilazan)	965,0	1245,0 ~5,95
DMA-HCl (30 % in MeCl2)		320,0
DMA (Dimethylanilin		480,0 ~3,78
Methylenchlorid *] (trocken <0,01 % KF) j
Methanol [ (trocken 0,01 % KF)	ν wie erforderlich
Ammoniumhydroxyd "Darco KB" (Aktivkohle) J
Imidazol	21.8	0.32

ARBEITSWEISE;

1000 g (3,20 Mol) 7-TkCk werden zu 25 Ltr. trockenem Methylenchlorid (KF H₂O <O,O1 %) zugesetzt. Man rührt die Aufschlämmung und setzt 1245 ml (ungefähr 5,95 Mol) HMDS zur Aufschlämmung zu.

Die Aufschlämmung wird zum Rückfluß erwärmt und trockenes Stickstoffgas wird durch die Aufschlämmung durchgeperlt. Das Rückflußkochen wird fortgesetzt, bis eine vollständige Lösung und keine absetzbaren Feststoffe- festge-

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stellt werden. Chargen von 7-TACA werden 12 bis 22 Std. am Rückfluß gehalten, um eine trübe Lösung zu erhalten.

3. Nach Beendigung der Silylierungsstufe wird die Lösung auf ungefähr 15 bis 20⁰C gekühlt und 320 ml DMA·HCl (30 % in MeCl₂) werden zugesetzt, gefolgt von 480 ml DMA (Dimethylanilin) und 21,8 g Imidazol. Die Reaktionsmischung wird auf 0 bis 5°C gekühlt und 797 g (3,60 Mol) D-(-)-p-Hydroxyphenylglycylchlorid»HCl werden in fünf Anteilen im Verlauf von 1 Std. zugesetzt. Man rührt die Aufschlämmung 10 bis 12 Std. oder so lange, bis das gesamte Säurechlorid in Lösung geht, bei 0 bis 5°C.

4. Die Reaktionsmischung wird im Verlauf von 3 Std. langsam auf 20°C erwärmt und 2 Std. bei 20⁰C gehalten. Es sollte eine vollständige Lösung des Säurechlorids festgestellt werden.

5. 8,3 Ltr. trockenes Methanol (KF <O,O1 %) werden innerhalb einer Minute unter gutem Rühren zur Lösung zugesetzt. Man rührt die Mischung 10 bis 15 Min. und filtriert dann sofort sehr schnell, um unlösliche Bestandteile zu entfernen (im Labor wird das Filtrieren mit einem Buchner-Trichter durchgeführt und der Kuchen wird mit einer Waschflüssigkeit aus zwei Teilen trockenem MeCl₂ und einem Teil trockenem Methanol gewaschen ). Dieses Filtrieren muß schnell erfolgen und die Filtriereinrichtung muß vorher vorbereitet sein, so daß die Filtration wie festgestellt durchgeführt werden kann. Das Filtrat und die Waschungen weisen nach der Filtration noch Feststoffe auf. Es ist nicht bekannt, ob diese Feststoffe Produkt sind (möglicherweise .HCl-SaIz). Es kann sein, daß während die Reaktion mit dem Methanol erfolgt oder aufgrund der Aufnahme von

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M/16117 .

Feuchtigkeit im Labor, eine Hydrolyse des Silylesters stattfindet und Produkt auszufallen beginnt. Die bei dieser Stufe herausfiltrierten dunklen Feststoffe enthalten etwas Produkt, 7-TACA und zersetztes 7-TACA. Die Waschungen des Kuchens belaufen sich auf ungefähr 10 Ltr. im MeCl₂/Me0H (2/1).

Das Filtrat und die YJaschflüssigkeiten werden im Vakuum konzentriert, um das MeCIp zu entfernen und trockenes Methanol wird, soweit erforderlich, zugesetzt. Die Lösung wird auf ungefähr 15 bis 18 Ltr. konzentriert und man gibt 600 g "Darco KB" zu. Man rührt die Aufschlämmung 20 bis 25 Min. und filtriert dann die Aufschlämmung durch eine Schicht von Diatomeenerde ("Dicalite") und wäscht den Kuchen gut mit 8,0 Ltr. Methanol. Diese Behandlung ergibt üblicherweise ein gelb-oranges Filtrat.

Das Filtrat wird im Vakuum auf 12,0 bis 13,0 Ltr. konzentriert und 480 ml entionisiertes Wasser werden zur Lösung zugegeben. Der pH liegt im Bereich von 2,4 bis 3,2. Man titriert die Lösung langsam im Verlauf von 30 Min. mit konzentriertem Ammoniumhydroxyd auf pH 4,8 bis 5,0. Eine Aufrechnung der Laborergebnisse würde eine Menge von 420 bis 440 ml Ammoniumhydroxyd erfordern. Die Lösung wird, sobald der pH auf 4,0 eingestellt ist, angeimpft. Die pH-Einstellung wird bei 20°C durchgeführt, worauf die Aufschlämmung 1 Std. bei 20 C gerührt und anschließend 16 Std. auf O⁰C gekühlt wird. Im Labor wird der Kolben nach 3-stündigem Rühren in einem Eisbad in Eis eingebettet und über Nacht im Kühlschrank gehalten. Nach dem Stehenlassen über Nacht wird stets ein Kristallwachstum an den Seiten des Kolbens beobachtet. Es ist derzeit nicht bekannt, ob eine kürzere Wartezeit angemessen ist. Jedoch ergibt sich aus diesen

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M/16117 Vi

visuellen Beobachtungen, daß 3 Std. nicht adäquat sind. Das ausgefällte Produkt wird durch Filtrieren gesammelt, mit MeOH gewaschen (ungefähr Filtratvolumen) und bei 45°C getrocknet. Die übliche Ausbeute beträgt 750 bis 770 g Methanolsolvat von 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl )-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure.

Diese Arbeitsweise ist wasserfrei und alle Vorkehrungen sind erforderlich, um eine Kontamination mit Wasser oder ein Schwitzen zu verhindern, das eine Hydrolyse des Silylesters und eine anschließende schlechte Acylierung bewirken würde.

Herstellung des kristallinen Methanolsolvats von 7-[D-a-Amino-a- (p-hydroxyphenyl )-ace tamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäTxre

1. 50 g 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure werden in 250 ml 95 % Vol./Vol. MethanolA'asser (95 % Methanol)-Lösung bei 22 bis 25⁰C aufgeschlämmt.

2. Man gibt unter schnellem Rühren konzentrierte Chlorwasserstoff säure bis zu einem pH von 1,3 bis 1,5 zu. Es wird eine Lösung oder eine beinahe Auflösung erhalten.

3. Der pH wird mit Triäthylamin auf 1,7 eingestellt.

4. Man gibt 7,5 g Aktivkohle ("Darco G-60") zu und schlämmt 0,5 Std. auf.

5. Die Kohle wird durch Filtrieren entfernt und mit 75 ml

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M/16117 \l

Methanol gewaschen, das dem FiItrat zugesetzt wird. Die Stufen 2)„ 3) und 4) sollten innerhalb 5 Std. beendet sein.

6. Die vereinigte Wäsche und das FiItrat von Stufe 5) werden schnell gerührt. Man gibt im Verlauf von 5 Min. Triäthylamin bis zum pH 4,5 zu. Die Kristallisation beginnt in ungefähr 1 bis 3 Min. Man schlämmt die Mischung 1 Std. auf.

7. Die Kristalle werden durch Filtrieren gesammelt, mit 100 ml Methanol gewaschen und bei 56°C 24 Std. im Vakuum getrocknet. Bioausbeute: 75 bis 90 %; Biountersuchung = 850 bis 900 γ/mg; NMR-IR = in Einklang mit 1 Mol Methanol; % H₂O, KF » 2 bis 4,0.

Herstellung von kristallinem BL-S640-1,2-Propylenglykolsolvat

1. 25 g des Methanolsolvats von 7-[D-a-Amino-a-(phydroxyphenyl)-ace tamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure, das wie oben hergestellt ist, werden in 150 bis 200 ml 75 %iger Vol./Vol. Propylenglykol/Wasserlösung bei 20 bis 25⁰C aufgeschiämmt.

2. Man gibt konzentrierte Chlorwasserstoffsäure bis zu einem pH von 1 bis 1,2 zu, um eine Lösung oder eine beinahe Auflösung zu erhalten.

3» Unter schnellem Rühren wird Triäthylamin (TEA) langsam zugegeben, um einen pH von 1,7 bis 1,8 zu erhalten.

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4. Man gibt 5 g "Darco G-60" zu und schlämmt die Mischung 0,5 Std. auf. Die Kohle wird durch Filtrieren entfernt (Filtration ist langsam, ein 18,5 cm SS No.576 Papier wird vorgeschlagen). Der Kohlenstoff-Filterkuchen wird mit 40 ml 75 %iger Vol./Vol. Propylenglykol/' Wasser-Lösung gewaschen. Die Waschflüssigkeit wird dem Filtrat zugegeben.

Die obigen Stufen 2), 3) und 4) sollten innerhalb von 5 Std. beendet sein.

5. Man gibt im Verlauf von 10 Min. zum schnellrührenden Filtrat/Waschmischung von Stufe 4) Triäthylamin bis pH 4,5 zu. In ungefähr 1 bis 3 Min. bilden sich Kristalle. Man schlämmt die Mischung 1 Std. auf.

6. Die Kristalle des Propylenglykolsolvats von 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure werden durch Filtrieren gesammelt. Die Filtration ist langsam (es wird ein 12,5 bis 15,0 cm SS No.576-Papier empfohlen). Man wäscht die Kristalle nacheinander mit 50 ml 75 % Propylenglykol, 50 ml Methanol, 50 ml Aceton und trocknet 24 Std. im Vakuum bei 56°C. Biologische Ausbeute: 80 bis 95 %.

Eigenschaften von 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido ]-3- (1,2,3-triazol-5-yl-thiome thyl) ^-cephem^-carbonsäure-propylenglykolsolvat

a) Biountersuchung = 750 bis 790 γ/mg.

b) IR-NMR im Einklang mit einer Struktur, die 1,3 bis 1,5 Mol Propylenglykol (17 bis 19 % Propylenglykol) enthält. Kein Verlust der 3-Triazolseitenkette ersichtlich«

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_## 252299B

Μ/16117 Η

c) % Wasser, KF = 1 bis 3,0.

d) Kristallmorphologie= 100 96 kristalline Mikrokristalle, von dreieckiger Gestalt.

e) Schmelzpunkt =182 bis 184⁰C (Zers., heiße Bank).

f) i>]jp (C - 1 %; 1n HCl) = +53°.

g) Wasserlöslichkeit = angenähert 10 mg/ml in Wasser von 23°C.

h) Verlust an Bioaktivität bei der Lagerung bei erhöhten Temperaturen:

1OO°C, 24 Std. = <6 %; 48 Std. »<12 %;

56°C, 1 Monat -<1O %,

Herstellung des kristallinen Methanolsolvats aus kristallinem Propylenglykolsolvat

50 g des wie oben beschrieben hergestellten Propylenglykolsolvats von 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido ]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure werden in 250 ml 95 % (Vol./Vol.) Methanol/Wasserlösung bei 22 bis 25°C aufgeschlämmt. Man gibt unter schnellem Rühren konzentrierte HCl auf einen pH von 1,3 bis 1,5 zu, worauf man eine Lösung oder eine beinahe Auflösung erhält. Den pH stellt man mit Triethylamin auf 1,7 ein und gibt 7,5 g Aktivkohle unter Aufschlämmen während 0,5 Std.,zu. Die Aktivkohle wird durch Filtrieren entfernt und mit 75 ml Methanol gewaschen. Die Waschlösung wird dann zum Filtrat zugesetzt (die Stufen von der Zugabe der HCl bis zu diesem Punkt sollten innerhalb 5 Std. beendet sein). Die vereinigten Wasch-

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flüssigkeiten und FiItrat werden schnell gerührt und man gibt im Verlauf von 5 Min. Triäthylamin zu, bis ein pH von 4,5 erreicht ist. Die Kristallisation beginnt in ungefähr 1 bis 3 Minuten. Man schlämmt die Mischung 1 Std. auf und entfernt die Kristalle durch Filtrieren, wäscht mit 100 ml Methanol und trocknet 24 Std. im Vakuum bei 56°C. Bioausbeute: 75 bis 90 %; Biountersuchung = 850 bis 900 γ/mg; NMR-IR = in Übereinstimmung mit 1 Mol Methanol; % H₂O, KF = 2 bis 4,0.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Beispiel 1

Herstellung von kristallinem 7-[D-α-Amino-a-(p-hydroxyphenyl) -acetamido ]- 3- (1 ,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesquihydrat

3,0 g 7-[D-α-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl) ^-cephem^-carbonsäuremethanolsolvat werden 18 Std. bei Raumtemperatur in 20 ml Wasser aufgeschlämmt, wobei man eine Suspension mit einem pH von 3,9 erhält. Die Kristalle werden durch Filtrieren entfernt und mit 5 ml Wasser gewaschen. Ein Aliquot wird 24 Std. bei 45°C an der Luft getrocknet, wobei man das kristalline Titelprodukt erhält. % H₂O, KF = 5,54 (theoretisch für Sesquihydrat = 5,51). Schmelzpunkt = 188 bis 194°C (Zersetzung). Die IR- und NMR-Analysen stehen im Einklang mit der vorgeschlagenen Struktur und zeigen an, daß das Produkt kein Methanol enthält.

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Κ/16117 ²⁵²²"⁸

Beispiel

7- [D-a-Amino-nr-(p-hydroxyphenyl) -acetamido ]-3- (1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesquihydrat

15 g 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-methanolsolvat werden in 60 ml Wasser aufgeschlämmt. Durch Zugabe von 4n NaOH wird der pH auf 6,5 angehoben und die Mischung wird durch ein Sieb mit 0,074 mm (200 mesh) gegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur 2 Std. aufgeschlämmt, wobei der pH während dieser Zeit bei 6,5 gehalten wird. Man entfernt die Kristalle durch Filtrieren, wäscht mit 20 ml Wasser und trocknet 24 Std. bei 37°C an der Luft, wobei man 11,5 g kristallines Titelprodukt erhält. Biountersuchung = 924 γ/mg (Mittelwert). % HpO, KF = 5,26. NMR und IR stehen im Einklang mit der vorgeschlagenen Struktur und zeigen an, daß das Produkt kein Methanol enthält, jedoch eine Spur an Propylenglykol aufweist.

Beispiel

Herstellung von kristallinem 7-[D-a-Amino-α-(p-hydroxyphenyl)■ acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)^-cephem-Zj-carbonsäure-sesquihydrat und Bildung anderer kristalliner Hydrate

10,0 g 7-[D-a-Araino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-methanolsolvat von 0,074 mm (200 mesh), das im wesentlichen frei von Propylenglykol ist, werden in 30 bis 40 ml entionisiertem Wasser bei Umgebungstemperatur (20 bis 25⁰C) aufgeschlämmt, wobei man eine wäßrige Suspension mit pH 3 bis 4 erhält. Man gibt langsam 40 %ige NaOH unter haftigem Rühren zu, um den pH auf 6,3 bis 6,7 zu bringen. Die Mischung wird 2 Std. bei pH 6,3 bis 6,7 aufge schlämmt. Man entfernt

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die Kristalle unter Filtrieren, wäscht mit Wasser und trocknet bei Raumtemperatur 24 Std. an der Luft, wobei man eine Ausbeute von 75 bis 80 Gew.-% an Kristallen von 7-[D-a-Amino-a(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-dihydrat mit 950 bis 1000 γ/rng erhält. Die IR- und NMR-Analysen stehen im Einklang mit der vorgeschlagenen Struktur und zeigen an, daß das Produkt kein Methanol enthält, jedoch eine Spur von Propylenglykol aufweist. H₂O, KF = 6,56.

Eine Probe des kristallinen Dihydrats wird 24 Std. bei 37°C an der Luft getrocknet, wobei man das kristalline Sesquihydrat von 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure erhält; H₂O, KF = 5,26.

Eine zweite Probe des Dihydrats wird 24 Std. bei 45⁰C an der Luft getrocknet, wobei man das kristalline Sesquihydrat erhält. H₂O, KF = 5,5.

Eine Probe des Dihydrats wird 24 Std. bei 56⁰C an der Luft getrocknet, wobei man das kristalline Monohydrat von 7-[D-rr-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure erhält. H₂O, KF « 4,38 (theoretischer Prozentgehalt an H₂O für das Monohydrat = 3,75).

Eine Probe des Dihydrats wird 24 Std. bei Raumtemperatur über P₂Oc im Vakuum getrocknet, wobei man das kristalline Halbhydrat von 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure erhält. H₂O, KF = 2,63 (theoretischer Prozentgehalt an beim Halbhydrat = 1,91).

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M/16117

Eine Probe des Dihydrats wird 24 Std. bei 56°C im Vakuum getrocknet, wobei man das kristalline Halbhydrat erhält. H₂O, KF = 1,6 bis 2,0.

Beispiel

7- [D-n^-Amino-ύ-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol^-yl-thiomethy^^-cephem^-carbonsäure-sesquihydrat (mikronisiert) für intramuskuläre Suspension

Formulierung

Steriles, mikronisiertes 7-[D-or-Amino-cY-(p-hydroxyphenyl)-acetamido J-3-(1»2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesquihydrat

Lecithin Methylparaben Propylparaben Polyvinylpyrrolidon (Povidone) Natriumchlorid Tween 80 ■

Für Für

1 Dosierung 15 Dosierungen

0,275 g (äquivalent zu 250 mg BL-S640 Aktivität)

0,002 g

0,0009

0,0001

0,005
0,002
0,001

4,125 g

0,030 g

0,0135

0,0015

0,075

0,030

0,015

Das zu verwendende BL-S640-Sesquihydrat muß steril und pyrogenfrei sein und muß während der Verarbeitung aseptisch gehandhabt werden.

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M/16117 ^*

BL-S640-Sesquihydrat (mikrcnisiert) für intramuskuläre Verabreichung (Etikettangabe ist 250 mg/ml BL-S640 Aktivität als BL-S640-Sesquihydrat

1. Das zu verwendende BL-S640-Sesquihydrat muß steril und pyrogenfrei sein und muß durch das gesamte Verfahren aseptisch gehandhabt werden.

2. Das BL-S640-Sesquihydrat wird in einer sterilen Zerkleinerungsvorrichtung steril mikronisiert.

3. Das sterile mikronisierte BL-S640-Sesquihydrat und das sterile Natriumchlorid werden dann in eine sterile Patterson Kelly V-Mischvorrichtung eingegeben, die mit einem für Flussigkeitszugabe eingerichteten Verstärkungsstab ausgerüstet ist. Der Mischer wurde 16 Std. vor Gebrauch durch Besprühen mit Peressigsäure und Aussetzen gegenüber Äthylenoxydgas steril gemacht. Bevor der Mischer beladen wird, muß dafür Sorge getragen werden, daß innerhalb des Mischers keine Kondensation der Gase erfolgt ist. Die Kondensation kann verhindert werden, indem man richtige atmosphärische Raumtemperatur erhält. Der Mischer wird 30 Min. unter Verstärkungswirkung laufengelassen, um eine anfängliche Mischung des Materials sicherzustellen.

4. Das Lecithin, das Methyl- und Propylparaben, das Tween und Povidone werden in einem Volumen Methylenchlorid gelöst, das angenähert einem Fünftel (1/5) des Gewichts des erforderlichen BL-S640-Sesquihydrats, gleich ist.

5. Unter Anwendung aseptischer Bedingungen wird die Lösung von Stufe 4) unter positivem Druck durch ein steriles 0,22/u Milliporenfilter in einen geeigneten sterilen Behälter durchgegeben, der sich in einem sterilen Bereich befindet.

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M/16117 ^

6. Unter Verwendung der "Fluss igke its Zugabevorrichtung¹¹ des Mischers wird das erforderliche Volumen der sterilen, pyrogenfreien Methylenchloridlösung von Stufe 5) in fünf gleichen Anteilen zugegeben. Nach jeder Zugabe der Lösung wird der Verstärkungsstab maximal 2 Min. verwendet, wobei man vier "Rühr"-Perioden während der bei jeder Zugabe der Lösung erforderlichen 15-minütigen Mischperiode gebraucht. Am Ende jeder Mischperiode muß der während des Mischprozesses entwickelte Druck freigesetzt werden (auf der Skala . am Gehäuse der Mischvorrichtung festgestellt) und man muß ein Vakuum anwenden, um die Methylenchloriddämpfe zu entfernen. Dies muß wiederholt werden, um ein vollständiges Entfernen der Dämpfe sicherzustellen. Zur Unterstützung der Verdampfung und des Entfernens der Dämpfe kann Hitze bis zu 62,1⁰C (115⁰F) durch zirkulierendes heißes Wasser durch die Wände auf das Gehäuse angewendet werden.

7. Wenn die gesamte Lösung zugegeben ist und die Mischung ordnungsgemäß von dem Dämpfen befreit wurde, wird das Material aus dem Mischer herausgeschüttet und zum Trocknen auf Horden gegeben. Man gibt das Material in überdeckte Horden und bringt diese in einen Ofen mit heißer atmosphärischer Luft und trocknet 6 Std. Die Temperatur der erhitzten Luft sollte nicht über 70,4°C (130⁰F) steigen. Nach 6 Std. Erhitzen wird die Hitze abgestellt und man zirkuliert 10 Std. lang Luft über die Horden, um ein vollständiges Trocknen sicherzustellen.

8. Man pulverisiert nochmals das überzogene Material unter Anwendung der Arbeitsweise von Stufe 2), so daß die folgende Bedingung erfüllt ist:

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Auf einem 0,074 mm Sieb (200 mesh) zurückgehalten

0,1 % Maximum

9. Man sammelt in sterile Behälter als fertige Bulkware zur endgültigen Verteilung.

10. Die richtige Menge an überzogenem BL-S640-Sesquihydrat wird unter Verwendung aseptischer Technik in mit Silikon überzogene, offiziell ausgezeichnete Ampullen eingefüllt.

Beispiel

Herstellung einer Lösung von 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesquihydrat zur Verwendung in intramuskulärer oder intravenöser Dosisform

Formulierung

Pro 4 ml

BL-S640 Sesquihydrat 1,08 g (äquivalent zu 250 mg/ml

BL-S640 Aktivität)

Natriumbicarbonat 0,27 g entionisiertes Wasser 3,0 g

Die obigen Komponenten werden geschüttelt, wobei eine bernsteinfarbene Lösung mit einem pH von 7,1 gebildet wird. Man läßt die Lösung bei Raumtemperatur stehen und untersucht sie periodisch,um die Stabilität festzustellen. Die Untersuchungsergebnisse sind wie folgt:

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M/16117 H

Zeit	O	Biountersuchung	96 Verlust
15 Minuten	240 mg/ml
30 Minuten	238	- 0,8
60 Minuten	238	- 0,8
90 Minuten	226	- 5,8
2 Stunden	220	- 8,3
202	-15,9

Die obige 250 mg/ml Lösung ist mindestens 90 Minuten bei Raumtemperatur stabil und stellt eine verträgliche intramuskuläre (IM) oder intravenöse (IV) Dosisform dar.

Biologische Daten

Bei einer Probe von BL-S64O Sesquihydrat wird nach Lösen in Wasser und Verdünnen mit Nährbrühe gefunden, daß es die nachfolgenden minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) in γ/ml gegen die aufgeführten Mikroorganismen, bestimmt durch übe macht-Inkubation bei 37°C durch Röhrenverdünnung, aufweist. Die nachfolgende Tabelle I enthält auch die MIC-Werte für Cephalexin, ein handelsübliches, oral absorbiertes Cephalosporin.

Die nachfolgende Tabelle II vergleicht das BL-S640 Sesquihydrat und das Cephalexin bezüglich der Blutspiegel bei Mäusen nach oraler Verabreichung. Die danach folgende Tabelle III vergleicht das BL-S640 Sesquihydrat und Natriumcefazolin hinsichtlich der Blutspiegel bei Mäusen nach intramuskulärer Verabreichung.

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M/16117

	TABELLE I	A9531	BL-S640	Cepha
	(MIC (yug/ml)	A15119	Sesquihydrat	lexin
Organismus		A9675	0,02	0,08
		A9977
D. pneumoniae bei	10"3 Α9585	AI5130	0,02	0,08
+ 5 % Serum* Λ	Verdünnung	A9900
Str. Pyogenes bei	10"5 Α9604	A15153	0,3	0,6
+ 5 % Serum*	Verdünnung	A9843A	1	2,5
S. aureus Smith**	A9537	A20019
S. aureus Smith**	A9537	A9656	0,6	1
+ 5 % Serum		A9657
S. aureus BX1633-2	bei 10"5 A96O6	A965.9	2	2
Verdünnung
S. aureus BX1633-2	bei 10 A9606
Verdünnung		8	32
S. aureus (Methicillin-resistent)	0,6	2
bei 10-3 Verdünnung A15097	2	4
SaI. enteritidis**	4	16
E. CoIi Juni**	1	2
E. CoIi**	2	8
K. pneumoniae**	0,5	2
K. pneumoniae**	16 >	125
Pr. mirabilis**	>125 >	•125
Pr. morganii**	125 >	•125
Ps. aeruginosa**	>125 >	125
Ser. marcescens**	1	2
Ent. cloacae**	32 . >	•125
Ent. cloacae**
Ent. cloacae**

* 50 % Nährbrühe - 45 %ige antibiotische Untersuchungsbrühe ** bei 1O~⁴ Verdünnung

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TABELLE II

Blutspiegel bei Mäusen nach oraler Verabreichung von
100 mg/kg Körpergewicht BL-S640 Sesquihydrat

Verbindung

CD CD CO

BL-S640 Sesquihydrat Cephalexin-monohydrat

Anzahl Mäuse

8 32 Blutspiegel ( ,ug/ml)

0,5 1 2 3,5 Stunden nach Verabreichung

46	,0	42	,5	22,	5	11	,9
42	,4	26	,9	8,	5		,6

NJ Ni CD CO 0C5

TABELLE III

Blutspiegel bei Mäusen nach intramuskulärer (IM) Verabreichung einer 10 mg/kg Dosis BL-S640 Sesquihydrat

co oo cn co

Verbindung

BL-S640 Sesquihydrat

Cefazolin - Natriumsalz

Blutspiegel (/Ug/ml)

30 60

Minuten nach Verabreichung

15,0
16,1

13,5
11,1

9,4 5,7

90

N₁) NJ CO CO OO

Claims (10)

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von kristallinem 7-[D-a-Amino-oc-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesquihydrat, dadurch gekennzeichnet, daß man 7-[D-rt-Amino-a-(phydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-methanolsolvat in Wasser bei einem pH-Bereich von ungefähr 2,5 bis ungefähr 7,0 suspendiert und das gewünschte kristalline Sesquihydratprodukt aus der wäßrigen Reaktionsmischung gewinnt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man:

• a) zu einer wäßrigen Suspension von 7-[D-rx-Amino-nr-(phydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-methanolsolvat ausreichend Base zugibt, um den pH auf ungefähr zwischen 6 und 7 anzuheben;

b) das kristalline Hydrat nach Aufschlämmen während ungefähr 1 bis 24 Std. aus der Reaktionsmischung gewinnt; und

c) das genannte kristalline Hydrat zwischen ungefähr 37 bis 45⁰C an der Luft trocknet, um das gewünschte kristalline Sesquihydratprodukt zu erhalten.

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M/16117 ^

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Suspension auf
einen pH zwischen ungefähr 6,2 und 6,7 bringt.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktionsmischung ungefähr 2 Stunden aufschlämmt.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das kristalline Hydrat ungefähr 24 bis ungefähr 48 Stunden an der Luft trocknet.

6. Kristallines 7-[D-cr-Amino-o:-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiome thyl) ^-cephem^-carbonsäure-sesquihydrat, das im wesentlichen das nachfolgende Pulver-Röntgenbeugungsspektrum besitzt:

Linie 1 2

4 5 6

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

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Abstand d(£) relative Intensität 9,31 45 6,77 93 6,17 32 5,56 14 4,42 100 3,97 76 3,78 95 3,55 55 3,41 53 3,10 26 3,01 19 2,94 9 2,83 17 2,77 23 2,55 19 2,32 10 2,23 12 2,05 10 1,97 6 1,88 7

M/16117 HO

7. 7-[D-nr-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesqulhydrat, hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.

8. 7-[D-a-Amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesquihydrat, hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und durch das nachfolgende Pulver- RöntgenbeugungsSpektrum gekennzeichnt:

Linie Abstand d(£) relative Intensität

1 9,31 45 2 6,77 93 3 6,17 32 4 5,56 14 VJl 4,42 100 6 3,97 76 7 3,78 95 8 3,55 55 9 3,41 53 10 3,10 26 11 3,01 19 12 2,94 9 13 2,83 17 14 2,77 23 15 2,55 19 16 2,32 10 17 2,23 12 18 2,05 10 19 1,97 6 20 1,88 7

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M/16117 M

9. Pharmazeutisches Mittel zur oralen oder parenteralen Verabreichung bei Säugern, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Bestandteil kristallines 7-[D-or-Amino-σ-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-sesquihydrat enthält.

10. Mittel gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die aktive Verbindung und gegebenenfalls übliche Hilfsmittel und/oder pharmazeutisch verträgliche Träger enthält.

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