DE2430999A1 - Neue enzymatische salze, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende mittel - Google Patents
Neue enzymatische salze, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende mittelInfo
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Description
D-BOOO MÜNCHKN 4O. BAU BNaTIt ΑββΚ X* · FKRNItUF (Οββ)
>7 ββ al · TKLKX 6SIBSOB HAR O
POBTANBCHRIFTl D-BOOO MÜNCHKN 43.'POBTFACH 7BO
München, den 27. Juni 1974 M/15 334
ERREKAPPA EUROTERAPICI S.a.s.
Via Marcona, 37 , [
Mailand / Italien I
Neue enzymatische Salze, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie
enthaltende Mittel
Die Erfindung betrifft neue enzymatische Salze, ein Verfahren '
zu ihrer Herstellung und die therapeutischen Mittel, die sie
enthalten. . ι
Insbesondere betrifft diese Erfindung, extrem stabile Salze
von S-Adenosyl-L-methionin (SAM), ein Verfahren, das ihre
Herstellung auf einfache und wirtschaftliche Weise in industriellem
Maßstab erlaubt und neue pharmazeutische Mittel, die sie als aktiven Grundstoff enthalten und die auf zahlreichen
Gebieten der Humantherapie brauchbar sind.
SAM ist wohlgemerkt ein Produkt natürlichen Ursprungs, das
in allen lebenden Organismen von Bakterien bis zu Pflanzen,
von einzelligen Organismen bis zu höheren Säugetieren ein- !
schließlieh des Menschen gefunden wird und besitzt eine Struktur.1
-44-8443-^1204
die seit einiger Zeit bekannt ist und die durch die folgende Formel wiedergegeben ist:
KXJ
CH3
CH-CH-CH-CH-CH2-S^cH2-CH2-CH-COOH
LiH n°jü
worin X ein allgemeines Anion darstellt.
In lebenden Organismen wird SAM durch das Eingreifen von Enzymen (S-Adenosylmethioninsynthetase oder S-Adenosyltransferase) in
den cytoplasmatischen Bereich, ausgehend von mit den Nahrungsmitteln aufgenommenem Methionin oder von ATP, das in jeder lebenden
Zelle als Energiereserve vorliegt, gebildet.
Es ist auch seit"einiger Zeit bekannt, daß SAM ein Produkt von
fundamentaler Bedeutung bei einer großen Zahl biologischer Reaktionen
enzymatischer Transmethylierung darstellt, weshalb es
in der Biochemie stets als sehr wichtiges Reagens betrachtet wurde.
Das große Problem bei dieser Substanz bestand jedoch immer in ihrer extremen Instabilität bei oder oberhalb Umgebungstemperatur
und ihren Herstellungsmethoden, die mühsam sind und nicht leicht in industriellem Maßstab durchgeführt werden können.
In den letzten Jahren wurde die Forschung, die auf die Stabilisierung
von SAM zu einem Ausmaß gerichtet war, daß es ihren Gebrauch auf dem Gebiet biologischer Forschung ermöglichen sollte,
auf die Herstellung von Salzen gerichtet, die bei normalen Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen stabil sind.
Auf diese Weise wurden das Chlorid und das Sulfat von SAM herge-
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stellt, jedoch sind diese als Reagenzien in der Biochemie
nur kurze Zeit brauchbar, da ihre Stabilität selbst im trockenen
Zustand bei tiefen Temperaturen beschränkt ist. Darüber
hinaus sind die Verfahren zu ihrer Herstellung zwar brachbar, für die Herstellung kleiner Mengen, jedoch sicherlich nicht
für die Herstellung in industriellem Maßstab.
Es wurden nun völlig unerwartet neue Salze von SAM gefunden,
die bei Temperaturen bis zu 450C zeitlich unbegrenzt stabil
sind und die nach einem neuen Verfahren hergestellt werden können, das in industriellem Maßstab wirtschaftlich leicht
durchführbar ist, wobei man hohe Ausbeuten erhält. Es hat sich überraschend gezeigt, daß diese Salze eine starke Heilwirkung
auf vielen Qebieten der Humantherapie besitzen, zwischen denen häufig offensichtlich keine Korrelation besteht.
Die erfindungsgemäßen neuen Salze sind Doppelsalze von SAM
mit p-Toluolsulfonsäure und Schwefelsäure μηα entsprechen
der Formel SAM+^HSO4 --H2SO4'2CH3CgH4SO3H, bzw. SAM+-HF1O4 --H2SO4*
CH3C6H4SO3H. ■■"'". :
Der mit diesen neuen Salzen erzielte große technische Fortschritt
kann aus der folgenden Tabelle ersehen werden, die die Zeitstabilität bei 450C in trockenem Zustand von zwei der
stabilsten Salze von· SAM, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, d. h. das Chlorid und Sulfat, mit dem neuen Di-sulfatdi-p-toluolsulfonat
vergleicht. Die Werte beziehen sich auf den Prozentsatz von SAM-Kückstand nach den angegebenen Zeiten:
Anion 3Od 6Od 12Od 18Od
Chlorid ' 20
Sulfat , 50 5
Di-sulfat-di-p-to- ■
luolsulfonat 100,1 99,9 100,2 100,4
09883/1291
Die bei dem Di-sulfat-mono-p-toluolsulfonat erhaltenen Stabilitätswerte
entsprechen völlig denen, die für das Di-sulfat-dip-toluolsulfonat
aufgeführt sind.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen neuen Salze
besteht im wesentlichen aus den folgenden Stufen:
a) Herstellung einer an SAM reichen Lösung, entweder durch Extraktion
aus natürlichen Substanzen, die es enthalten, oder durch enzymatische Synthese aus Adenosintriphosphat (ATP) und
Methionin;
b) Ausfällung des in der filtrierten wäßrigen Lösung vorhandenen SAM durch eine gesättigte wäßrige Lösung von Pikrolonsäure
oder durch Lösungen dieser Säure in organischen Lösungsmitteln, die in Wasser löslich sind, wie Methyl-, Äthyl-,
Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, oder Isobutyl-Alkoholen; oder
Aceton, Methyläthylketon, Methylisobutylketon, Äthylacetat, Tetrahydrofuran, 2-Methoxyäthanol, 2-Äthoxyäthanol, Dioxan
oder Dimethylformamid;
c) Auflösen des filtrierten Niederschlags in einer Mischung bestehend
aus gleichen Volumenteilen eines Lösungsmittels, das teilweise mit Wasser mischbar ist, wie Methyläthylketon,
Methylisobutylketon, n-Butanol oder Isobutanol und einer Lösung
gleicher Normalität an p-Toluolsulfonsäure und Schwefelsäure;
d) Abtrennen der organischen Schicht und Zugabe zur wäßrigen Lösung
eines organischen, in Wasser vollständig löslichen Keton- oder Alkohol-Lösungsmittels;
e) Wiederauflösen des Niederschlags in einer 10 bis 20 %igen Lösung
von p-Toluolsulfonsäure in Methanol und Behandlung der Lösung mit entfärbender Aktivkohle;
f) Zugabe eines organischen Lösungsmittels zum Konzentrat, das das reine SAM in einer gut kristallinen und leicht filtrierbaren
Form ausfällt.
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Wie aufgezeigt, kann Stufe (a) des Verfahrens auf verschiedene
Weisen ausgeführt werden, die zürn Erhalt einer konzentrierten
Lösung von SAM gleich wirksam sind.
Alternativ kann Hefe (Saccharomyces Cervisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis etc.), die durch Zugabe von Methionin
unter geeigneten Bedingungen (Schlenk, Enzymologia 29, 283 (1965)) mit SAM angereichert ist, mit Äthylacetat und anschließend
mit Schwefelsäure, die eine Normalität zwischen
0,1 und 0,5, vorzugsweise 0,35 ή aufweist, bei Umgebungstemperatur
behandelt werden, so daß die Lysis der Zellen und das Inlösungtreten von praktisch 100 % des anwesenden SAM
bewirkt wird.
Bevorzugt verwendet man Mangen an Wasser und Acetat, die
zwischen 1/20 und 1/5 des Gewichts der feuchten Zellen betragen und die Behandlung wird zwischen 15 und 45 Minuten,
vorzugsweise- 30 Minuten, ausgedehnt.
Anschließend gibt man Schwefelsäure zu und die Lysis wird während
einer Zeit zwischen 1 Stunde und-2 Stunden, vorzugsweise
1 1/2 Stunden durchgeführt. Es ist zu bemerken, daß die Lysis der Hefezellen, 'die mit einer Mischung organischer
Lösungsmittel und verdünnter Schwefelsäure durchgeführt wird, geeigneter als die normalerweise mit Perchlorsäure bei
Umgebungstemperatur oder mit Ameisensäure oder Essigsäure bei
600C und dgl. durchgeführte ist und zwar insofern, als sie
nicht nur bei Umgebungstemperatur stattfindet, was der Stabilität des SAM sehr zuträglich ist, sondern weil sie auch unter
solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß die Lösung leicht von.den zellulären Rückständen filtriert werden kann
und keine der Verunreinigungen enthält, die bei der Verwendung
anderer Lysismittel vorliegen und die bei den bekannten Verfahren
zur .Herstellung von reinem SAM schwierig zu entfernen sind. . ■;■'.'
409883/1291 ':
Gemäß einer weiteren Alternative wird die Stufe (a) zur Herstellung
des SAM durch enzymatische Synthese ausgeführt durch die- Wirkung des Enzyms ATP-Methionin-adenosyltransferase
(E.C. 2.4.2.12) auf eine Inkubationsmischung, die Adenosyltriphosphat
(ATP) und Methionin enthält.
Die wesentliche Bedingung zur Durchführung dieser Methode
in industriellem Maßstab liegt darin, daß das Enzym rein ist und in einer Form vorliegt, die sowohl aus der anfänglichen
Inkubationsmischung als auch vom hergestellten SAM leicht isoliert wird.
Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren zur Reinigung des Enzyms ATP-Methionin-adenosyltransferase durch Affinitätschromatographie
und eine Säulenreaktronsmethode gefunden, das es erlaubt, die zuvor genannten Ziele zu erreichen.
Die Affinitätschromatographie des erfindungsgemäßen spezifischen Enzyms wird durchgeführt, indem man eine es enthaltende
Lösung, beispielsweise einen rohen Extrakt von Hefe oder "Escherichia coli" durch eine Säule percoliert, die mit einem
Trägerfeststoff gefüllt, an den eine Gruppe kovalent gebunden
wurde, die als konkurrierender Inhibitor des Enzyms selbst wirkt.
Es wurde überraschend gefunden, daß eine ausgezeichnete Füllung
für eine solche Reinigungssäule aus einem aktiviertem Gel von Polysacchariden besteht, an die L-Lysin kovalent gebunden wurde,
Die Affinität des spezifischen Enzyms für den an die feste Matrix gebundenen Lysinrest bewirkt eine Verzögerung beim
Eluieren des Enzyms durch die Säule, und es ist somit möglich,
eine Abtrennung von den anderen Proteinen in sehr reiner Form zu erhalten.
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Jedoch führte die Abtrennung des zur Verwendung in der nachfolgenden
enzymatischen Synthesestufe im Eluat enthaltenen Enzyms zu völlig unbefriedigenden Ergebnissen, da nach der
Abtrennung seine Stabilität mit der Zeit abnahm, und da darüber hinaus nach einer einmaligen Verwendung bei der Synthese
des SAM es bei den anschließenden Handhabungen zur Isolierung
des SAM zerstört wurde. Es wurde erfindungsgemäß gefunden, daß man demgegenüber ausgezeichnete Ergebnisse
erhält, wenn man das Eluat, das das spezifische Enzym enthält,
in einem geeigneten Trägerfeststoff absorbiert und die katalytische Reaktion zwischen Methionin und ATP, die zur
Bildung von SAM führt, in der Säule durchführt.
Ein geeigneter Trägerfeststoff besteht aus einem Polysaccharid,
das durch eine Reagenz aktiviert ist, das zur Bindung von Proteinen
an feste Träger geeignet ist, wie Bromcyan.
Percoliert man eine Lösung von ATP und Methionin in einer geeigneten
Pufferlösung durch die Säule, erhält man an der Basis
der Säule ein Eluat, das das SAM enthält.
Die Stufe (b) des Verfahrens erlaubt e*s, das SAM in hoher
Reinheit abzutrennen. In der Tat wird in saurer Umgebung durch Pikrolonsäure als einzige Verbindung das SAM ausgefällt,
wie durch Dünnschichtchromatographie gemäß Anal. Bioehem.
4, 16-28 (1971) gezeigt.wird. Pikrolonsäure besitzt somit
eine·extreme und überraschend selektive Wirkung. Die anderen
Fällungsmittel, die bislang zugesetzt wurden, wie Pikrinsäure, Reineckesalz oder Borsäure, ergeben unreine Fällungen,
die stets eine anschließende Reinigung des SAM durch Ionenaustauscher-Säulenchromatographie
erfordern, ein Verfahren, das extrem Kostspielig ist und industriell schwierig auszuführen
ist.
Es ist auch -schwierig, das Produkt in der erforderlichen Reinheit
zu erhalten. Die Verwendung wäßriger Lösungen von Pikrolonsäure oder Lösungen dieser Säure in den zuvor genannten organi-
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sehen Lösungsmitteln ergibt keine besonderen Probleme,und es
handelt sich um eine Operation, die bei Umgebungstemperatur durchgeführt wird.
Die Stufe (c) wird vorzugsweise mit Lösungen durchgeführt, die p-Toluolsulfonsäure und Schwefelsäure in Konzentrationen
jeweils zwischen 0,05 und 0,2 n, vorzugsweise 0,1 η enthalten, und mit einem organischen Lösungsmittel, das insbesondere mit
Wasser mischbar ist, wie Methyläthylketon oder n-Butanol. Die Verwendung des organischen Lösungsmittels erlaubt es,
die wäßrigen sauren Lösungen sehr zu vermindern, und es entfernt praktisch die gesamte Pikrolonsäure.
Die Stufe (d) des Verfahrens wird durchgeführt, indem man vorzugsweise
zwischen 4 und 8 Volumina (bezüglich des Volumens der wäßrigen Lösung) eines Lösungsmittels, ausgewählt unter Aceton,
Methylalkohol, Äthylalkohol und Propylalkohol, verwendet.
Es wurde überraschend gefunden, daß, wenn in Stufe (e) die
zur Auflösung des aus Stufe (d) herrührenden Niederschlags benötigten Mindestmenae an Methanol verwendet wird, sich das Doppelsalz
SAM+-HSO4 --H2SO4* 2 CH2CgH4SO3H in 'der anschließenden
Fällungsstufe (f) abtrennt.
Verwendet man jedoch in Stufe (e) ein Volumen an Methanol, das mindestens dem doppelten erforderlichen Volumen gleich
ist, trennt sich das Doppelsalz SAM+-HSO4"'H3SO4-CH3CgH4SO3H
in der anschließenden Fällungsstufe (f) ab.
Die Verwendung von dazwischenliegenden Mengen an Methanol führt zur Bildung von Mischungen der beiden Salze.
Die endgültige Fällung von einem oder dem anderen der neuen erfindungsgemäßen Salze (Stufe f) erfordert die Verwendung eines
organischen Lösungsmittels, das ausgewählt ist unter Methanol,
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Äther, Chloroform, p-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobütanol,
sec.-Butylalkohol, Isoamylalkohol und Tetrahydrofuran.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Doppelsalze von SAM können, wie
bereits erwähnt, im trockenen Zustand in praktisch.unverändertem Zustand unbegrenzt aufbewahrt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren zur Herstellung
der neuen erfindungsgemäßeh Salze; diese Beispiele dienen lediglich
der Erläuterung und schränken die Erfindung nicht ein.
Das neue erfindungsgemäße Verfahren erfordert bei keiner Stufe
Temperaturen, die höher als Umgebungstemperatur sind, und es wird in saurer Umgebung durchgeführt. Dies ist sehr wichtig,
um die Zersetzung des SAM z-u vermeiden. Darüber hinaus erfordert es keine komplizierten und mühsamen Verfahren, wie
Chromatographie Über Säulen von Ionenäustauscherharz oder Kohlenstoff,
wodurch es in industriellem Maßstab nur schwierig auszuführen wäre.
zu 90 kg Hefe, die mit -SAM (6,88 g/kg) gemäß Schlenk (Enzymologia
29, 283 (1965)) angereichert ist, gibt man bei Umgebungstemperatur 11 1 Äthylacetat und 11 Ϊ Wasser. Nach 30-minütigem
energischem Rühren werden 50 1 0,35 η Schwefelsäure zugesetzt,
wobei das Rühren weitere 1 1/2 Stunden fortgesetzt wird. Nach dem Filtrieren und Waschen mit Wasser erhält man 140 1 Lösung,
die 4,40 g/l SAM, entsprechend 99,5Xdes im Ausgangsmaterial vorhandenen, enthält.
Eine Lösung von 2,3 kg Pikrolonsäure in 25 1 Methyläthylketon gibt man unter Rühren zu der vorigen Lösung. Nach dem Stehen
über Nacht wird der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Wasser gewaschen.
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Der so erhaltene Feststoff wird unter Rühren zu einer Mischunq
von 18 1 einer 0,1 η Lösung Schwefelsäure und p.-Toluolsul fonsäure
und 18 1 Methyläthylketon gegeben. Beim Stehenlassen trennt sich die organische Phase ab und wird in das Pikrolonsäüre-Wiedergewinnungssystem
eingespeist und die wäßrige Phase wird mit'wenig Methyläthylketon behandelt, um zurückgebliebene
Spuren von Pikrolonsäure zu entfernen und anschließend gibt man entfärbende Aktivkohle zu und filtriert.
Diese Lösung (16,5 1) enthält 33,8 g/l SAM, entsprechend 90 % der in der Hefe vorhandenen Verbindung. Bei der Analyse durch
Dünnschichtchromatographie gemäß Anal. Biochem. 4, 16-28 (1971) ergibt sich, daß sie nur SAM ohne Spuren seines Zersetzungsprodukts oder anderer organischer Basen enthält. Die obige
Lösung wird unter Rühren in 100 1 Aceton gegossen. Man läßt stehen und dekantiert sie dann vom Lösungsmittel und löst den
Feststoff in 3,3 kg einer 15 %igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure
in Methanol. Nach der Zugabe von entfärbender Aktivkohle wird die Mischung filtriert und zu 25 1 Äthyläther zugegeben.
Man erhält 1184 g eines gut kristallinen SalzniederSchlages,
der leicht filtrierbar, nicht sehr hygroskopisch und sehr löslich in Wasser ist (mehr als 20 %), wobei sich eine farblose
Lösung bildet. Das Salz ist nur wenig löslich in Methanol und Äthanol und unlöslich in Aceton, Methyläthylketon, Chloroform,
höheren Alkoholen und Benzol. Durch Dünnschichtchromatographie gemäß Anal. Biochem. 4, 16-28 (1971) wird gezeigt,
daß das Produkt frei von jeglicher Verunreinigung ist.
Prozentuale Analyse des Salzes führt zu den folgenden Ergebnissen:
C 36,39 % H 4,6 % S 16,7 % N 8,8 %
Die berechneten Werte für C29H43NgO19S5 (MG 938,98) sind:
C 37,09 % H 4,51 % N 8,95 % S 17,07 %
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Weiterhin: H3SO4 * 20,5 %
p-Toluolsulfonsäure = 36,0 %
SAM = 41.,7 %
Berechnet: H3SO4 = 20,89 %
p-Toluolsulfonsäure = 36,67 % SAM = 41,54 %
Feuchtigkeit bestimmt gemäß K. Fischer: 1,7 - 2 %
Das UV-Spektrum der neuen Verbindung zeigt ein Absorptions-
1 %
maximum bei 260 nm, E. = 182.
T cm
Diese Daten stimmen überein mit einer Verbindung der Formel
NH,
CH-CH-CH-CT-CH2-S^KB2Ct2-CH-CCOH-H2SO4 * 2CT3C6H4SO3H
·!_■■]
HSO4
Die neue Verbindung wurde weiterhin durch die enzymatischc Methode auf der Basis der enzymatischen Methylierung von Nikotinamid
oder Guanidinessigsäure mit SAM (G.L. Cantoni, J. Biol.
Chem. 189, 745 (1951); G. De La Hoba, B. A. Jamieson, S. H. Mudd und H. H. Richards, J. Amer. Chem. Soc. 81, 3975 (1959)
identifiziert. .
Man gibt 1,1*5 kg Pikrolonsäure, die in 10 1 Isobutylalkohol gelöst
sind, zu 70 1 Lösung, die aus der Lysis von Hefezellen her-
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rühren und die unter Verwendung desselben rohen Materials und derselben Methode wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurden.
Nach dem Stehenlassen über Nacht wird der gebildete Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt.
Der abgetrennte Festkörper wird mit 9 1 einer 0,1 η Lösung Schwefelsäure und p-Toluolsulfonsäure und mit 9 1 Methylisobutylketon
behandelt. Nach dem Stehenlassen wird die organische Phase abgetrennt, während die wäßrige Phase durch Waschen
mit wenig Methylisobutylketon von Spuren von Pikrolonsäure befreit wird. Man gibt entfärbende Aktivkohle zu und filtriert
die Mischung, wobei das Filtrat in 70 1 Methylalkohol gegossen wird. Nach dem Stehenlassen wird der gebildete Feststoff vom
Lösungsmittel dekantiert und in einer 15 %igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure
in Methanol (1,65 kg) gelöst. Nach dem Entfärben mit Aktivkohle wird das Filtrat zu 10 1 Chloroform gegeben,
um ein leicht filtrierbares kristallines Präzipitat von SAM-disulfat-di-p-toluolsulfonat zu erhalten.
Das erhaltene Produkt (1110 g) ergibt bei der Analyse Ergebnisse,
die mit dem des Produkts gemäß Beispiel 1 identisch sind.
1,15 kg Pikrolonsäure, gelöst in 12 1 n-Butanol, werden zu 70
einer Lösung gegeben, die von .der Lysis von Hefezellen herrührt und die durch dieselbe Lysismethode und mit demselben
rohen Material wie in Beispiel 1 erhalten wurde. Nach dem Stehenlassen über Nacht wird der Niederschlag durch Zentrifugieren
abgetrennt. Der erhaltene Feststoff wird zwischen 9 einer 0,1 η Lösung Schwefelsäure und p-Toluolsulfonsäure und
12 1 n-Butan,ol verteilt. Nach dem Stehenlassen wird die organische
Phase abgetrennt, während die wäßrige Phase durch Waschen mit wenig n-Butanol von Spuren Pikrolonsäure befreit wird. Man
gibt anschließend entfärbende Aktivkohle zu und filtriert die Mischung, wobei man das Filtrat in 65 1 n-Propylalkohol gießt.
Nach dem Stehenlassen wird der ausgefällte Feststoff vom Lö-
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sungsmittel dekantiert und in einer 15 %igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure
in Methanol (1,65 g) gelöst.
Nach dem Entfärben mit Aktivkohle wird das Filtrat in 14 1
n-Butanol .gegossen, um einen gut filtrie'rbaren kristallinen
Niederschlag von SAM-disulfat-di-p-toluolsulfonat zu erhalten.
Das Endprodukt (1155 g) ergibt bei der Analyse dieselben Ergebnisse
wie das Produkt gemäß Beispiel 1.
50 ml Sepharose (Polysaccharide hergestellt durch Pharmacia
Fine Chemicals AB, Uppsala -Schweden), zusammengebacken und
in Wasser suspendiert, werden mit Bromcyan gemäß den bekannten Methoden zur Bindung von Amingruppen enthaltenden Substanzen
an Matrizen, die aus Polysaccharidgel bestehen, behandelt.
Man gibt zu dem so hergestellten Gel einen Überschuß an L-Lysin.' Nach der Reaktion wird es wiederholt mit destilliertem Wasser,
mit einer Puffermischung vonpH 8,5 und mit einer Puffermischung
von pH 4,5 gewaschen. Das Gel wird dann, zur Füllung eine Säule
mit einem Durchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 30 cm verwendet.
Eine Puffermischung von 0,05 m Triäthanolamin und 0,01 m H3SO4 mit einem pH von 8,0 wird durch die Säule gegeben, bis
eine vollständige" Äquilibrierung erreicht ist. Man gibt 2 ml
Hefeextrakt, der das spezifische Enzym enthält, und der durch Ultraschallbehandlung· (sonification) oder durch Homogenisierung mit Trockeneis
und gegebenenfalls nach Anreicherung mit dem spezifischen
Enzym erhalten wurde, auf die Säule. Die Säule wird dann mit
derselben Püffermischung, die zur Äquilibrierung verwendet wurde,
eiuiert, wobei die Verteilung der Protein im Eluat durch ultraviolett-spektroskopische Messungen verfolgt wird. Gleichzeitig
wird-die Aktivität (eynthetasis activity) in den ver-.
schiedenen Fraktionen nach J. A. Stekol, Methods' in Enzymology, Vol. 6, Seite 566 (1963) gemessen. Die Fraktionen, die eine
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relevante Aktivität aufweisen werden zusammengegeben, und die so erhaltene Lösung zeigt eine spezifische Aktivität, die mindestens
zwanzigmal größer ist als die des rohen Extraktes. Das Enzym kann in dieser Lösung durch Ausfällen mit Salzen,
mit organischen Lösungsmittel oder gemäß anderen bekannten Methoden zu Konzentrierung von Proteinlösungen weiter konzentriert
werden.
30 ml perlförmiges (caked) Sepharosegel werden mit Bromcyan
oder durch- irgendeine andere bekannte Methode zur Bindung von Proteinen an Polysaccharidgel-Matrizen, aktiviert. 4 ml einer
Lösung des wie oben gereinigten spezifischen Enzyms, die ungefähr 100 mg Protein enthält:, werden zum aktivierten Gel zuqegeben.
Die Suspension des aktivierten Gels und die EnzymlÖHuruj
werden 18 Stunden bei 40C gerührt. Das Harz wird mit Wasser gewaschen.
Diese Waschflüssigkeit enthält ungefähr 70 % der gesamten Enzymaktivität, die anfänglich in der Lösung des spezifischen
Enzyms vorhanden war. Durch Inkubieren der wie oben gemäß der zuvor genannten Methode zur Bestimmung der Aktivität
präparierten Sepharose wird festgestellt, daß angenähert 20 % der Gesamtaktivität an das Polysaccharid gebunden ist.
Man verwendet die wie oben hergestellte Sepharose, um eine Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 20· cm
zu beladen. Eine Lösung, die 0,675 m Triäthanolamin, 0,150 m
Magnesiumsulfat, 0,05 m ATP, 0,05 m L-Methionin und 0,01 m KCl enthält, wird durch die Säule in einer Geschwindigkeit von 5 ml
pro Stunde und bei einer Temperatur von 25 - 27 0C durchgegeben.
Das auf den Gehalt von SAM analysierte Eluat aus der Säule zeigt,
daß die Ausbeute der Umwandlung 30 % beträgt.
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Herstellung von Doppelsalzen vom SAM mit Schwefelsäure und
p-ToIuolsulfonsäure
103 ml Eluat, das 6 g/l SAM enthält, werden mit H0SO. angesäuert,
bis ein pH von 3 erreicht ist, und man gibt hierzu unter Rühren eine Lösung von 2,3 g Pikrolonsäure in 25 ml Methyläthylketon.
Man läßt eine Nacht stehen, filtriert den Niederschlag und wäscht mit Wasser. Der Niederschlag wird in 18 ml
einer 0,1 η Lösung H2SO4 und p-Toluolsulfonsäure und in 18 ml
Methyläthylketon wieder aufgelöst.
Nach Rühren und Stehenlassen wird die organische Schicht abgetrennt
und die wäßrige Schicht wird mit wenig Methyläthylketon behandelt, um die letzten Spuren an Pikrolonsäure zu
entfernen. Nach dem Abtrennen der Wasserschicht wird entfärbende Aktivkohle zugesetzt und die Mischung wird filtriert. Man erhält
16,5 ml einer wäßrigen farblosen Lösung, die 33,8 g/l
SAM, entsprechend 90 % des in der Ausgangslösung enthaltenen
SAM, enthält. Bei der Dünnschichtchromatographie zeigt sich, daß die Lösung nur SAM enthält. 16,5 ml der Lösung werden in
100 ml Aceton gegossen. Nach Rühren und Stehenlassen wird die Flüssigkeit durch Dekantieren abgetrennt. Der Feststoff wird
in 6,6 g einer 15 %igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol
aufgelöst. Nach der Zugabe von entfärbender Aktivkohle und nach Filtrieren wird die Lösung in 25 ml Äthyläther gegossen.
Nach dem Stehenlassen wird filtriert und das erhaltene gut kristalline Salz wiegt 0,967 g und hat die Zusammensetzung:
Analyse:
* C H N S
ber.: 34,36 4,47 10,96 16,72 %
.gef.: 33,68 4,65 10,8 16,5 %
SAM+ 50,5 %, H2O 2,1 %; H2SO4 25,3 %;
p-Toluolsulfonsäure 21,7 %.
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1 V> Das Ultraviolett-Spektrum zeigt ein Maximum bei 260 nm, E. c
Wiederholt man das Verfahren auf identische Weise, wobei man jedoch 3,3 g einer 15 %igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure
in Methanol und in der anschließenden AÜsfällungsstufe 25 ml Äthyläther verwendet, erhält man 1,18 g des Salzes
SAM+-H2SO4^CH3C6H4SO3H, das Eigenschaften besitzt, die mit
denen für das Produkt gemäß Beispiel 1 angegebenen übereinstimmen
.
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Aus der biochemischen Forschung ist es seit einigen Jahren
bekannt, daß in lebenden Organismen für biochemische Reaktionen des Transfers der CH-j-Gruppe, die fundamentale Reaktionen
beim lipidischen, protidischen und glucidischen Metabolismus ,darstellen, SAM der einzige spezifische Methyldonor
ist. Beispielhaft werden im folgenden einige der wichtigsten, von SAM abhängigen Transmethylierungsreaktionen aufgeführt:
a) N-Transmethylierung: Adenin, Carnitin, Carnosin, Creatin,
2,6-Diaminopurin, Adrenalin, Guanin, Hordenin, N1-Nicotinamid,
Phosphatidylcholin, Ricinin;
b) o-Transmethylierung: N-Acetylserotonin, Dopamin, Epinin,
d-Adrenalin, 1-Adrenalin, Ergosterin, 1-Noradrenalin, Pectin,
Ubichinon;
c) S-Transmethylierung: 2,3-Dimercaptopropanol, H3S, Methionin,
Methy!mercaptan, S-Mercaptopropionsäure, S-Mercaptoäthanol,
Thiopyrimidin, Thiouracil;
d) C-Transmethylierung: Cytosin, Thymin.
Dies bedeutet unter besonderer Bezugnahme auf den menschlichen Organismus, daß SAM be,i den folgenden metabolischen Prozessen
wirkt:
Biosynthese von Cholin, Biosynthese von Phosphatidylcholin,
Aktivität von Enzymen, die SH-Gruppe- erfordern; Metabolismus von Catecholaminen; Metabolismus von biogenen centroencephalischen
Aminen; Metabolismus von Serotonin; Metabolismus von Histamin; Metabolismus von Vitamin B12 und von Folsäure;
Metabolismus von Creatin; Metabolismus von Myosin; Metabolismus von Histonen; Metabolismus von RNA; Metabolismus von DNA;
Metabolismus von Proteinsubstanzen; Metabolismus einiger Hormone
des Cyclopentan-perhydrophenanthrenkerns, deren hauptsächliche die östrogene sind; Metabolismus der Triglyceride.
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Es ist auch seit, einiger Zeit bekannt, das SAM, sobald es durch
die Methyltransferaseenzyme demethyliert ist, in S-Adenosylhomocystein
(SAO) umgewandelt wird (das ein indirekter Donor von Hydrosülfidgruppen ist und daher entscheidende Bedeutung
beim Metabolismus aller Verbindungen be'sitzt, die zur Ausübung ihrer biologischen Aktivität SH-Gruppen erfordern.
Besonders wichtig unter diesen sind einige Thioenzyme und die sulfurierten Aminosäuren.
SAO wird bei seinem Umlauf im Organismus decarboxyliert,und das decarboxylierte Produkt ist der Hauptdonor der Aminopropylgruppe,
die gemäß neuester biochemischer Kenntnis für die Biosynthese von Polyaminen unerläßlich ist. Das Verfahren
wird durch verschiedene Enzyme katalysiert, unter denen ein spezifisches die Aminopropyl-Transferase ist.
Zusammenfassend ist festzustellen, daß es bekannt ist, das SAM im menschlichen Organismus eng verknüpft ist mit allen
biochemischen Reaktionen von:
A - Transmethylierung (spezifische Lieferung der CH3-Gruppe)
B - Transsulfurierung (spezifische Lieferung der SH-Gruppe)
C - Transaminopropylierung (spezifische Lieferung der Aminopropylgruppe).
Die Gesamtheit dieses Wissens könnte zu der Überlegung führen, daß SAM bei der Behandlung pathologischer Zustände, die mit
der Knappheit oder anderen Mangelzuständen im Organismus bezüglich einiger der vielen oben erwähnten Produkte einige therapeutische
Wirksamkeit besitzt.
Jedoch hat die extreme Instabilität von SAM und der bis heute
bestehende Mangel an einer Methode, es ausreichende Zeit unter normalen Umgebungsbedingungen stabil zu machen, verhindert, daß
mit diesem Produkt irgendwelche pharmakologischen oder klinischen
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Tests durchgeführt warden, und es wurde so verhindert, daß auf dem Gebiet der Humantherapie irgendeine praktische Verwendung
dafür gefunden wurde.
Erst nach der Herstellung erfindungsgemäßen neuen SAM-Salze,
Salze,die bei Umgebungstemperatür praktisch unbegrenzt stabil
sind, ist es möglich geworden, eine systematische pharmakologische und klinische Untersuchung durchzuführen, die zur Auffindung
von therapeutischen Eigenschaften bei den neuen Salzen geführt hat, die in ihrer Qualität und Intensität völlig überraschend
sind.
Aus der enormen Zahl pharmakologischer und klinischer Daten, die für dieses neue Produkt gesammelt wurden, werden im folgenden
nur einige Elemente angegeben, die ausreichen, um dem Fachmann die wesentlichen Merkmale des neuen Produkts und seine hauptsächlichen
Verwendungen bei der Humantherapie klar aufzuzeigen. Aus Gründen der Einfachheit werden im folgenden durch den Begriff
."SAM-Salz" die zwei erfindungsgemäßen Doppelsalze bezeichnet
und zwar aufgrund ihrer absolut identischen Verwendung.
Bei den pharmakologischen und klinischen Daten wird aus Gründen der Einfachheit mit der Abkürzung SAM das Salz SAM+-HSO4 --H2SO4*
2CH3CgH4SO3H bezeichnet. Auch die verabreichten Mengen beziehen
sich stets auf SAM+«HSO4""'H2SQ4\2CH3C6H4SO3H. Jedoch betreffen
die Daten genauso auch das andere Doppelsalz.
Toxizität: Das erfindungsgemäße SAM-Salz hat sich als absolut
frei von akuter Toxizität, chronischer Toxizität, lokaler Unverträglichkeit
oder von Nebeneffekten erwiesen.
Insbesondere ist die LD5Q bei Mäusen bei größer als 6 g/kg/os
und 2,5 g/kg/i.ρ.
Die Toleranz- und chronischen Toxizitätsteste wurden bei Ratten
vom Wistar und Sprague-Dowley-Stamm durchgeführt, wobei man
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12 Monate lang täglich 10 bis 20 mg/kg Produkt verabreichte:
Am Ende der Behandlung zeigten die verschiedenen Organe und Systeme (apparatus) keine pathologische Veränderung. Die Teratogenese-Untersuchungen
wurden bei Kaninchen und Ratten durchgeführt: 'Selbst bei der Verabreichung massiver Dosen an SAM,
angenähert 10 χ der maximalen der therapeutischen Dosen, wurden keine teratogenen Wirkungen oder irgendwelche Fehlbildungen
bei den Embryos oder terminalen Föten festgestellt.
Die Zugabe von Dosen bis zu 0,1 - 0,2 mg/ml Produkt bei überlebenden
Kulturen menschlicher Lymphocyten oder hepatischer Mäusezellen ergibt keinerlei Änderung beim Blastizierungsindex
für die zellulären Elemente.
Die intravenöse Verabreichung von Dosen bis zu 40 mg/kg ruft keiner pyrogene Manifestation beim Kaninchen hervor.
Die venöse Verabreichung von Dosen in Höhe von 40 mg/kg beim Kaninchen und bei der Katze bewirkt keinerlei Änderung des
Karotisdrucks, der Herz- und Atemfrequenz oder der elektrokardischen Spur.
Die lokale Verträglichkeit der intermuskulären Injektion, selbst nach über 180 Tagen wiederholten Verabreichungen und der intravenösen
Injektion* in die Randvene (marginal vein) der Ohrmuschel (auricular pavilion) des Kaninchens, ist ausgezeichnet.
Beim Menschen, nämlich bei jungen, gesunden, Freiwilligen beiden Geschlechts, die einer Verabreichung durch die schnelle
intravenöse Methode oder durch phleboklyse Dosen von SAM entsprechend
10 - 300 mg/(mittleres Gewicht 70 kg) unterworfen wurden, zeigt die gleichzeitige Untersuchung des minimalen
und maximalen Drucks und des Pulses und der Atmungsfrequonz bei 1,5,15,20,30,60 Minuten und bei 2,3,6,8,10,12,24 Stunden
nach dem Ende der Verabreichung kein Abweichen von normalen Werten.
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Die elektrocardiographische Spur zeigt im PQ-Intervall, im
ST-Abschnitt keine Variation und auch kein Auftreten extrasistolischer
oder anderer Änderungen bei 30", 1',2',3·,5',
10' und 20.' nach der Verabreichung.
Im hämatopoetischen Apparat und bei hepatischen und renalen
Operationen traten keine Änderungen auf, die gegenüber der Norm statistisch signifikant waren.
Pharmakologie:
Wenn im folgenden von der Verabreichung von SAM gesprochen wird, wird damit zum Ausdruck gebracht, daß verabreicht wurde:
SAM+-HSO4"'H3SO4-2 CH3CgH4SO3H und/oder SAM+VHSO4 --H2SO4'CH3C6
H.SO-.H. Zur indikativen Bestimmung, wie SAM in den Geweben ver-
14 teilt ist, wurde S-Adenosilmethionin (Methyl C ) hergestellt.
Die Verteilung dieses Produkts bei Ratten wurde durch Verabreichung
einer Dosis von 10 mg/kg/e.v., entsprechend 24 pci radioaktivem Produkt untersucht. Die spezifische Aktivität
des Produkts betrug 58 mCi/Millimol. Parallel hierzu wurde
eine autoradiographische Untersuchung bei der Maus vorgenommen. Die Ergebnisse dieser zwei Experimente zeigen, daß SAM
sehr schnell auf alle Gewebe verteilt wird.
Ein Teil der Daten, die sich jeweils auf die betreffenden Organe
beziehen, seien beispielhaft aufgeführt:
Verteilung von SAM in einigen Rattengeweben.
Die Werte sind ausgedrückt in ugr/gr.
Gewebe 15' 1 h 4h 8h 24 h
| Leber - |
4,02 | 7,47 | 13,1 | 13,4 | 13,5 |
| Suprarenale.Drüsen | 4,26 | 8,46 | 11,7 | 10,8 | 10,9 ' |
| Milz | 3,15 | 2,96 | 8,1 | 6,2 | 6,7 |
| Hypophyse " | 5/6 | 5,8 | 19,5 | 11,3 | 10,3 |
| Hypothalamus | 0,7 | 1,5' | 2,4 | 3,0 | 3,2 |
| Haut · | 0,6 | 1,1 | 1,8 | 2,1 | 2,3 |
| Plasma | 18,6 | 5,2 | 5,3 | 4,5 | 3,1 |
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Es wurde folglich der Schluß gezogen, daß die neuen erfindungsgemäßen
Salze die CH3~Gruppe an alle Gewebe abgeben,
die mit Methyltransferase-Aktivität versehen sind. Mit anderen Worten wurde die Kapazität der neuen erfindungsgemäßen
Produkte, sich elektiv in all den Organen anzusammeln, die mit Methyltransferase-Systemen versehen sind, abgeleitet.
Dies wurde durch nachfolgende pharmakologische Teste bestätigt. Eine ganze Serie von. Tests, die bei Ratten ausgeführt
wurden, hat gezeigt, daß die neuen Verbindungen eine beträchtliche schützende und abschwellende Wirkung bei hepatischer
Steatose durch hyperlipide-hyperproteinische Diät gemäß Handler, bei Steatose durch akute alkoholische Intoxikation
und durch andere toxische Mittel (Kohlenstofftetrachlorid,
Brombenzol usw.) durch die Verabreichung von nur 15 mg/kg/i.p. bewirken. Sowohl von morphohistochemischen
und analytischen Gesichtspunkten aus gesehen reduziert SAM beträchtlich die Akkumulierung von Lipiden auf der hepatocytischen
Höhe, während es gleichzeitig -die Wiederherstellung normaler, nach Intoxikation mit CCl4 reduzierter Phospholipid-Spiegel
begünstigt.
Hepatische Phospholipide bei Ratten nach Intoxikation mit CCl. und Behandlung mit SAM.
Behandlung Gesamte Phospholipide (mg/g)
Physiologische Lösung 30,57 - 1,18
CCl4 18,87 - 1,06
CCl4 + SAM 15 mg/kg/i.p. 27,20 - 1,25
CCl4 + SAM 150 mg/kg/i.p. 20,87 - 0,42
CCL. + Ad+Met 15 mg/kg/i.p. 19,9 - 0,92
Die Werte ßind die Mittel - E.S. von 10 Werten für jede
Gruppe.
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Beim Studium der hepatoprotektiven Aktivität wurde eine
Versuchsvorrichtung verwendet, die bei der Ratte die sog. hepatische Cholesterindegeneration (Ridout and Coll., Biochem.
J. 52, 99, 1952) hervorruft. r
Bei dieser Methode wird mittels' einer geeigneten Diät eine
deutliche Zunahme der gesamten hepatischen Fette und des hepatischen Cholesterins bei den Tieren erhalten. Die Substanzen,
die im Lipidmetabolismus wirken, reduzieren oder annulieren diese Zunahme.
Die Tiere wurden in sechs Gruppen aufgeteilt. Der ersten Gruppe wurde eine Diät verabreicht, die nach Wunsch variiert
wurde. Der zweiten Gruppe wurde die Basisdiät von Ridout (20 g pro Ratte pro Tag) verabreicht. Den anderen Gruppen
wurde dieselbe Diät in denselben Dosen, jedoch mit Cholesterin bis zu 0,2 g/Ratte/Tag angereichert, verabreicht. Die Behandlung
dauerte 3 Wochen.
Den Gruppen 4, 5, 6 wurde SAM in den folgenden Dosen verabreicht.
1, 2, 5 mg/kg/i.p. pro Tag.
Am Ende der drei Wochen wurden alle Tiere getötet, die Leber
wurde jeweils entfernt und die gesamten Fette (Best and Coll.,
Biochem. J. 40, 368, 1966) und das Cholesterin (Sperry and Brand, J. Biol. Chem. 150, 315, 1943) wurden bestimmt.
Die Ergebnisse zeigten, daß die Gruppen, die einer Behandlung mit SAM in Dosen von 1 - 2 mg/kg/i.p. unterworfen wurden, wenig
geschützt waren, während die Gruppe, die mit 5 mg/kg/i.p. behandelt
war.; völlig geschützt war.
Hepatisches Cholesterin und gesamte Fette am Ende des Experiments
(Mittel pro Gruppe)
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| Gruppe | Frische Gewicht |
Leber g |
gesamte g |
Fette | Cholesterin mg % |
2,6 |
| I | 15 | 1,41 | 9,4 ·, | 40 | 3,7 | |
| II | 18 | 1,93 | 10,6 | 68 | 5,7 | |
| III | 16 | 3,84 | 24,0 | 92 | 5,2 | |
| IV | 17 | 3,70 | 21,6 | 90 | 4,1 | |
| V | 16 | 3,5 | 21,9 | 67 | 3,8 | |
| VI | 16 | 2,0 | 12,5 | 61 |
Ein weiterer pharmakologischer Aspekt, der untersucht wurde, waren die antiinflammatorischen und analgetischen Wirkungen
von SAM.
Unter den verschiedenen Untersuchungen ist der klassischste zu nennen, nämlich das ödem durch Carragenin und durch Eiweiß
als Test für akute Inflammation und Gränulome durch Baumwollpellets
und Arthritis durch Adjuvans als Test für chronische Inflammation. In allen Fällen erwies sich SAM sowohl bei oraler
Verabreichung (Dosis zwischen 20 und. 100 mg/kg) als auch parenteraler Verabreichung (Dosis zwischen 10 und 20 mg/kg)
im Vergleich mit anderen· bekannten pharmazeutischen Produkten (Ipuprofen - Indometacin) als aktiv. Die analgetischen Tests
wurden in Form des heißen Plattentests und der Streckung durch Essigsäure und des Randal- und Selitto-Test bei der Ratte vorgenommen.
Das pharmazeutische Produkt zeigte sich bei diesen Untersuchungen im Vergleich mit untersuchten bekannten pharmazeutischen
Produkten als wirksam.
Ein weiterer Aspekt, der betrachtet wurde, war die mögliche Wirkung von SAM auf die durch Barbiturate hervorgerufene Schlafzeit.
Zu diesem Zweck wurde ein Experiment vorgenommen, indem Gruppen von Mäusen Hexobarbital in einer Dosis von 80 mg/kg/i.p.
409883/1291
gemäß der Methode von Holten und Larsen (Acta Pharmacol. Toxicol,
1956, 12, 346), erhielten; eine Gruppe war die Kontrollgruppe und die zweite Gruppe erhielt SAM in einer Dosis von 10 mg/
kg/i.ρ. (Tabelle).
Kontrollen Schlafzeit (min)
24,4 ± 2,7
SAM 10 mg/kg/i.p. 41,2.± 5,8
Eine Untersuchung der Daten zeigte, daß SAM bei der Verlängerung
der durch Hexobarbital hervorgerufenen Schlafzeit wirksam ist.
Klinische Tests:
Wenn im folgenden die Verabreichung von SAM erwähnt wird, bedeutet
dies die Verabreichung von SAM+-HSO4-H3SO4-2CH3C6H4SO3H
und/oder +-
Unter Verfolgung der aus den pharmakologischen Tests gewonnenen
Informationen wurden die klinischen Tests auf krankhafte Zustände
(affections) ausgerichtet, bei denen das folgende anfänglich oder sekundär geändert wurde:
1. der Metabolismus von Lipiden;
2. der Metabolismus von Protiden und Gluciden;
3. der Metabolismus von Catecholaminen und der biogenen Amine.
1. Von den bei Hunderten von Subjekten durchgeführten klinischen Tests unter Verwendung von Dosen an SAM, die über einen sehr weiten
Bereich variieren, wurde gefunden, daß die neue Verbindung einen schnellen Abfall bei den hepatischen Lipiden bei der
Hepatosteatose der verschiedensten Pathogenese hervorruft, was durch eine bioptische Untersuchung, die nach dem Ende des Behandlungszyklus
wiederholt wird, selbst nach 60 Tagen ab Ende der Behandlung feststellbar ist.
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Die Verabreichung des Produkts bewirkt auch ein deutliches
Abfallen der hohen Werte der gesamten Cholesterinämie, der Hypertriglyceridämie und normalisiert die geänderten ß/cxi-lipoproteinischen
Verhältnisse bei Subjekten mit Uyperdislipidämie im unkompe.nsierten Zustand. '
Diese hypocholesterinämische und hypolipämische Wirkung wird
selbst bei Dosen von ungefähr 20-30 mg, die zwei- bis dreimal
pro Tage verabreicht werden, verwirklicht und ist proportional der Dosis.
Bei klarer Arteriosklerose mit klinischen Manifestationen der psychoaffektiven Sphäre mit turbenesen und sekundären Centrocncophaliken
(Verschlechterung durch arteriosklerotische Encephalopathie) und Phänomenen cerebraler Hypoxie hat die Verabreichung
von SAM durch intermuskuläre oder - in schwereren Fällen - durch intravenöse Injektion oder durch langsame Tröpfcheninfusion
(phleboclysis) bei Dosen zwischen 20 und 40 mg drei- bis viermal täglich, eine sehr vorteilhafte Modifikation der Symptomatologie
gezeigt.
Insbesondere war bei klaren hypoxidotischen Zuständen die Erholung
der dem Leben benachbarten Funktionen sehr schnell und statistisch signifikant.
Bei post-apoplektischen Syndroiflen wurde bei der Verbesserung
des klinischen Zustande (framework) eine größere Geschwindigkeit festgestellt.
2. Hunderte von Subjekten, die insultiert waren mit: sekundären Hypoprotidämien und Disprptidämien; persistenten und aggressiven
chronischen Hepatopathien; präcyrrotischen und cyrrotischen Zuständen; Malabsorptions-Syndromen, Protid-Verteilungs-Syndromen,
wurden behandelt. Pie Verabreichung variabler Dosen zwischen 20 und 200 mg SAM pro Tag durch intermuskuläre oder intravenöse
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Injektion oder oral, je nach der Schwere des Falls, bewirkte eine statistisch signifikante Zunahme bei der gesamten Protidämie,
eine Zunahme in der Albuminmenge und eine Tendenz, die geänderten Prozentverhältnisse zwischen den elektrophoretischen
Fraktionen des Serums zu normalisieren. Diese Protein-anabolisierende
Aktivität wurde von einer häufig sehr wichtigen Verbesserung
der subjektiven Symptomologie und der allgemeinen objektiven Zustände und durch die Normalisierung aller Tests hepatischer
Funktionalität begleitet.
3. Insbesondere überraschende Ergebnisse wurden bei klinischen
Anwendungen des neuen erfindungsgemäßen enzymatischen Salzes erhalten, und zwar dort, wo krankhafte Zustände existierten,
die klar mit Modifikationen im Austausch biogener Amine korreliert
waren, beispielsweise:
a) pathologische Zustände neuropsychiatrischer Pertinenz;
b) Parkinson-Krankheit und Parkinsonismus verschiedener Ezipathogenesen;
-
c) antiphologistische und analgetische Wirkung bei der Behandlung,
von Osteoarthritis und antalgische Aktivität bei bestimmten neurologischen Manifestationen;
d) Störungen des Schlaf-Wachrhythmus.
Bezüglich Punkt a) zeigte eine umfangreiche klinische Kasuistik, die durch Untersuchung des klinischen Verhaltens und der Tests
von Hamilton und Wittenberg durchgeführt wurden, daß die Verabreichung
von variierenden Dosen zwischen 20 und 50 mg SAM drei-, bis viermal täglich während 5 bis 15 Tagen unter Ausschluß jeder
anderen Form von Therapie eine signifikante Remission der für
die Diagnose depressiver Formen betrachteten Hauptparameter induziert.
Bezüglich Punkt b) wurde bezüglich der Behandlung von Parkinson1
scher Krankheit und Parkinsonismus gefunden, daß:
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die Verabreichung von SAM in Dosen von 10 - 40 mg pro Tag durch intermuskuläre oder intravenöse Injektion oder oral abhängig
von der Schwere des Falls - in Verbindung mit der gebräuchlichen Therapie mit Lävodopa einß statistisch signifikantere
Verbesserung der Akinese und Steifheit bezüglich der, die bei Patienten auftritt, die nur mit Lävodopa behandelt
werden, hervorruft. Günstige Modifikationen werden auch im Ausmaß des Parkinson-Tremors gefunden,- der durch Lävodopa alleinc
nicht modifiziert werden kann.
Die Verabreichung von SAM verbessert deutlich die Lävodopaabhängigen
psychischen Störungen, insbesondere bezüglich depressiver Zustände und psychischer Manifestationen des irritativen
Typs.
Die Verabreichung von SAM in den zuvor genannten Dosen blockiert signifikant den Gang der Lävodopa-Nebeneffekte auf die verschiedenen
Organe und Apparate, insbesondere bezüglich Nausea, Erbrechen, Appetitlosigkeit, Hypotension, Asthenie, Cephalie, Hyparsudoration
und Insomnia.
Bezüglich Punkt c) hat sich SAM - bei dem pharmakologische
Ergebnisse zeigen, daß es eine starke antiphlogistische und analgetische Aktivität aufweist - als aktiv bei allen osteoarthritischen
Formen, die mit einer Dosis von 30 mg zweimal täglich durch intermuskuläre oder intravenöse Injektion und
30 - 50 mg oral viermal täglich behandelt wurden, erwiesen.
Nach nur sieben Tagen Behandlung wurden die muskulären Spasmen, die Bewegungsbeschränkung, lokalisierter Schmerz und Steifheit
in statistisch signifikanter Weise im Vergleich zum Placebo beeinflußt.
In 90 behandelten Fällen wurde kein Fall von gastrischer Pyrose beobachtet. Die Suche nach verstecktem Blut im Fäces
zeigte niemals irgendwelche Modifikation während der Behandlung. Im Vergleich mit einem nicht steroiden, antiphlogistischen Arzneimittel,
das im allgemeinen in einer doppelten Blinduntersu-
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chung verwendet wird, zeigte SAM, daß es eine therapeutische
Wirksamkeit gleich der des Indomethacins besitzt.
Die antalgische Aktivität von SAM wurde auch bei verschiedenen
Subjekten ,mit verschiedenen neurologischen Zuständen untersucht:
Neuritis, Polyneuritis,Anthralgie, Ischias, Radiocolitis, Torticollis.
Die therapeutische Wirkung war vom ersten Tag der Verabreichung einer Dosis von 15 mg zweimal täglich durch intermuskulare
Injektion oder 30 bis 50 mg drei- bis viermal täglich oral vom ersten Tag an zugänglich und wirksam.
Analoge Ergebnisse wurden bei Subjekten mit wiederkehrender und
resistenter Cephalagie durch orale Verabreichung des Arzneimittels
in Form kaubarer Tabletten erhalten.
Bezüglich Punkt c), d. h. Störungen des Schlaf-Wach-Rhythmus,
insbesondere bezüglich Schlaflosigkeit, kann das erfindungsgemäße
neue Produkt bei einer Dosis von 10 bis 30 mg oral die geänderten Schlaf-Wach-Verhältnisse beträchtlich verbessern,
indem es einen physiologischen Schlaf induziert, ohne daß zur Verwendung von Barbitura^ten oder anderen Substanzen mit kortikaler
und centroencephalischer depressiver Wirkung zurückgegriffen
wird. .
Aus den vorstehend zusammengestellten Angaben sind die zahlreichen
unerwarteten Perspektiven, die durch das neue Pharmakon auf dem Gebiet der Humantherapie aufgetan sind, offensichtlich.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß es sich bei den
bereits gesicherten Gebieten um folgende handelt: Behandlung von Hepatopien, Hyperdislipidämien, allgemeinen oder lokalen
Arteriosklerosen, psychiatrischen Manifestationen des depressiven und neurologischen Typs, degenerativer Arthropathien, ,neurologischer
algischer Manifestationen und Störungen des Schlaf-Wach-Rhythmus,
wogegen noch, viele andere Anwendungsgebiete untersucht und gesichert werden müssen. Die neue»* SAM-Salze werden
• 409883/1291
vorzugsweise durch intermuskuläre oder intravenöse Injektion oder in oralen oder sublingualen Tabletten oder in Kapseln
verabreicht.
Einige pharmazeutische Mittel sind im folgenden angegeben:
a) Eine 400 mg Tablette enthält
SAM-SaIz 66,66 mg
Bindemittel:
Stärke
Lactose
Lactose
Magnesiumstearat
Talk
Talk
Aroma soviel wie erforderlich auf 400 mg
b) Eine 250 mg Kapsel enthält
SAM-SaIz 66,66 mg
Bindemittel:
Stärke
Lactose
Magnesiumstearat
Na-,ΡΟ. soviel wie erforder-
J 4 lieh auf 250 mg
c) Eine lYophilisierte Ampulle enthält
SAM-SaIz 11,11 mg
Eine muskuläre Lösungsampulle enthält
Lidocain ' 20 mg
Lösung von Phosphatpuffern soviel wie auf 3 ml
d) Eine lyophilisierte Ampulle enthält
SAM-SaIz ' 33,33 mg
Eine muskuläre Lösungsampulle enthält
Lidocain 20 mg
Lidocain 20 mg
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Lösung von Phosphatpuffern soviel wie erforderlich auf . 3 ml
e) Ein 2 g Suppositorium enthält '
SAM-SaIz . 111,11 mg
Suppositorxenmasse soviel wie erforderlich auf 2,0 g
Andere Formen von Verabreichung können sein:
a) trinkbare Flaschen,
b) Flüssigkeiten für occulare Instillation,
c) Flüssigkeiten für intranasale Instillation,
d) Flüssigkeiten für Aerosol- oder Spray-Anwendung
e) Flüssigkeiten und Salben für topische Verwendung,
in denen der aktive Bestandteil in den üblichen, verträglichen
pharmazeutischen Lösungsmitteln verdünnt ist ("Tecnologia Farmaceutica" - 2. Band, Silvano Casadio Second
Edition - ed. Cisalpino-Goliardica - Mailand - 1972).
Abschließend ist festzustellen, daß die therapeutischen Dosen
von SAM zwischen 5 und 300 mg pro Tag liegen, in Abhängigkeit
von jeweiligen Typ und von der Schwere des behandelten Leidens.
Es können auch erforderlichenfalls größere Dosen verwendet werden,
und zwar im Hinblick auf die völlige Abwesenheit von Toxizität bei den erfindungsgemäßen Salzen.
409883/129 1
Claims (15)
- PatentansprücheVerfahren zur Herstellung von Doppelsalzen von S-Adenosyl-L-methionin (SAM) mit Schwefelsäure und p-Toluolsulfonsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man:a) eine konzentrierte Lösung von SAM herstellt;b) das in der Lösung vorhandene SAM durch Ansäuern mit einer Lösung von Pikrolonsäure ausfällt;c) das SAM-Pikrolonat in einer Mischung, bestehend aus gleichen Volumenteilen einer wäßrigen Lösung gleicher Normalitäten von p-Toluolsulfonsäure und Schwefelsäure und einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser teilweise mischbar ist, löst;d) das SAM-SaIz durch ein Lösungsmittel auf der Basis eines Ketons oder eines Alkohols, das in Wasser völlig löslich ist, aus der wäßrigen Schicht ausfällt;e) das ausgefällte Salz in einer Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol auflöst;f) das Doppelsalz von SAM mit Schwefelsäure und p-Toluolsulfonsäure durch ein geeignetes organisches Lösungsmittel ausfällt.
- 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) durch die Lysis von Hefezellen durch Behandlung mit Äthylacetat und Schwefelsäure bei Umgebungstemperatur durchführt.
- 3. Verfahren-gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mandie Stufe (a) durch enzymatische Synthese durch die Wirkung des spezifischen Enzyms ATP-Methionin-Adenosyltransferase bei hoher Reinheit auf eine Mischung von Adenosyltriphosphat (ATP) und Methionin durchführt.409883/1291
- 4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das spezifische Enzym ATP-Methionin-Adenosyltransferase in hoher Reinheit durch das selektive Eluieren einer dieses Enzym enthaltenden Lösung durch eine Säule von aktiviertem Polysaccharidgel, behandelt mit L-Lysin, erhält.
- 5. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatisch© Synthese von SAM aus ATP und Methionin durchführt, indem man eine die beiden Reagentien enthaltende Lösung durch eine Säule mit aktiviertem Polysaccharidgel, an das das spezifische Enzym hoher Reinheit gebunden ist, durchführt.
- 6. Verfahren, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (b) unter Verwendung von Lösungen von Pikrolonsäure in Wasser oder in einem in Wasser löslichen organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
- 7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (c) unter Verwendung wäßriger Lösungen gleicher Normalitäten an Schwefelsäure und p-ToluolsuIfonsäure, wobei beide zwischen 0,05 und 0,2 liegen, durchführt.
- 8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (d) unter Verwendung von 4 bis 8 Volumina eines organischen Lösungsmittels,ausgewählt unter Aceton, Methylalkohol, Äthylalkohol, Propylalkohol, bezogen auf die wäßrige Lösung, durchführt.
- 9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (e) unter Verwendung von 10-20 %-igen Lösungen von p-Toluolsulfonsäure in Methanol durchführt.
- 10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die zur Auflösung des Salzes erforderliche Mindestmenge an Methanol verwendet.409883/1291
- 11. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man einen großen Überschuß an Methanol verwendet.
- 12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Doppelsalz SAM+-HSO4 --H2SO4*2CH3CgH4SO3H während der Behandlung mit dem organischen Lösungsmittel gemäß Stufe(f) ausfällt.
- 13. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Doppelsalz SAM -HSO4 --H-SO4-CH3C6H4SO3H während der Behandlung mit dem organischen Lösungsmittel gemäß Stufe (f) ausfällt.
- 14. Verbindungen der Formel: S-Adenosyl-L-Methionin ■ H2SO4 * (CH3C6H4SO3H)n, worin η die Bedeutung 1 oder 2 besitzt.
- 15. Arzneimittel mit einem Gehalt an Verbindungen gemässAnspruch 14 und üblichen, pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln.409883/1291
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