DE2424465B2 - PROCEDURE FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF ANTIGEN AND THEIR ANTIBODIES IN THE SOLIDS RADIO IMMUNOTEST - Google Patents
PROCEDURE FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF ANTIGEN AND THEIR ANTIBODIES IN THE SOLIDS RADIO IMMUNOTESTInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Antigenen und deren Antikörpern durch einen Festkörper-Radioimmuntest, bei dem eine Probe eines unbekannten Serums mit den Wandungen eines Behälters in Berührung gebracht wird, die einen Überzug mit bekanntem Antigengehalt haben, anschließend inkubiert, absaugt und wäscht, dann ein radioaktiv markiertes, hochreines Antigen zugibt, nochmals inkubiert, absaugt und wäscht und danach die Radioaktivität der beschichteten Teile in einem y-Strahlenmeßgerät mißt.The invention relates to a method for the detection of antigens and their antibodies a solid-state radioimmunoassay that tests a sample of an unknown serum with the walls of a Container is brought into contact, which have a coating with known antigen content, then incubated, aspirated and washed, then a radioactively labeled, high-purity antigen added, incubated again, sucks off and washes and then the radioactivity of the coated parts in a y-radiation meter measures.
Es ist bekannt, daß man das Vorliegen von Antigenen oder von deren Antikörpern in einer unbekannten Probe durch direkte oder indirekte Radioimmunprüfung nachweisen kann (vgl. z. B. C a 11, K. und T r e g e a r, G. W., Science 158(1967), Seiten 1570-1572, »Solid-Phase Radioimmunoassay in Antibody-Coated Tubes«). Aus der DT-OS 22 62 479 ist auch eine Testvorrichtung für eine direkte Radioimmunprüfung auf Antigene oder deren Antikörper bekannt Es ist jedoch bisher noch nicht gelungen, Antigene oder ihre Antikörper radioim munologisch gleichzeitig in einem einzigen Testverfah ren nachzuweisen. Es stellte sich daher die Aufgabe, ir einem verhältnismäßig kurzzeitigen Verfahren durch einen kombinierten Radioimmuntest Antigene unc deren Antikörper gleichzeitig nachzuweisen. It is known that the presence of antigens or their antibodies in an unknown sample can be detected by direct or indirect radioimmuno testing (cf. e.g. C a 11, K. and T regear, GW, Science 158 (1967), Pages 1570-1572, "Solid-Phase Radioimmunoassay in Antibody-Coated Tubes"). From DT-OS 22 62 479 a test device for a direct radioimmuno test for antigens or their antibodies is known. However, it has not yet been possible to detect antigens or their antibodies radioimmunologically at the same time in a single Testverfah ren. The task was therefore to detect antigens and their antibodies at the same time in a relatively short-term process by means of a combined radioimmuno test.
Diese Aufgabe wird ausgehend von dem bekannter Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöstThis object is achieved on the basis of the known method of the type mentioned at the beginning
ίο daß man zum gleichzeitigen Nachweis von Antigener mit mindestens einer Bindungsstelle oder von derer Antikörpern, die mindestens zwei Bindungsstellen irr Molekül aufweisen, die Probe des unbekannten Serums zunächst mit einer bekannten Menge des Antikörpers inkubiert und das erhaltene Gemisch erst dann mit den Wandungen des Behälters in Berührung bringt, die einen Überzug mit bekanntem Antigengehalt haben. ίο that for the simultaneous detection of antigen with at least one binding site or one of those antibodies which have at least two binding sites in the molecule, the sample of the unknown serum is first incubated with a known amount of the antibody and the mixture obtained is only then placed with the walls of the container Brings contact that have a coating with known antigen content.
Das erfindungsgemäß zu untersuchende, sogenannte »unbekannte« Serum kann ein nicht gerinnbares Vollblut, Plasma, Serum oder eine andere Körperflüssigkeit, z. B. Urin oder Speichel, sein. The so-called "unknown" serum to be examined according to the invention can be a non-coagulable whole blood, plasma, serum or another body fluid, e.g. B. urine or saliva.
Für die erste Inkubationsstufe des Verfahrens verwendet man vorzugsweise 10 bis 15% der maxima! vom Überzug des verwendeten Reaktionsbehälters fixierbaren Menge des Antikörpers. Als Reaktionsbehälter können beispielsweise Mikrotiterplatten, Tesiröhrchen oder andere geeignete Vorrichtungen zur Anwendung gelangen. Man inkubiert z.B. i bis it Stunden innerhalb eines Temperaturbereiches von 20 bis 50°C, vorzugsweise 1 Stunde bei 37: C oder 12 Stunden bei 200C. Längere Inkubationszeiten stören da:, Verfahren nicht.For the first incubation stage of the process, 10 to 15% of the maxima are preferably used! The amount of the antibody that can be fixed by the coating of the reaction container used. For example, microtiter plates, Tesi tubes or other suitable devices can be used as reaction containers. Incubate for example i to it hours within a temperature range of 20 to 50 ° C, preferably for 1 hour at 37 C or 12 hours at 20 0 C. Longer incubation times did not interfere because :, method.
Antigen und Antikörper, die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung nachgewiesen werden können.Antigen and antibodies which can be detected by the method according to the invention.
sind z. B. Viren und Virusuntereinheiten wie Hepatitis-B-Antigene oder -Antikörper und die Co.xsackieviren Λ und B, Bakterien, Membranen, Zellwände, verschiedene Hormone, z. B. Insulin. Arzneimittel wie Antibiotika, Gammaglobuline usv..are z. B. Viruses and virus subunits such as hepatitis B antigens or antibodies and the xsackieviruses Λ and B, bacteria, membranes, cell walls, various Hormones, e.g. B. Insulin. Medicines such as antibiotics, gamma globulins, etc.
Die zum Waschen oder Spülen verwendeten Flüssigkeiten sollen vorzugsweise einen neutralen pH-Wert aufweisen.The liquids used for washing or rinsing should preferably have a neutral pH exhibit.
Da eine enge Beziehung des HB-Antigens zur Hepatitis-B als erwiesen gelten kann und HB-Antigenpositives Blut bekanntlich den Erreger der Hepatitis-B übertragen kann, der beim Empfänger, sofern er nicht immun ist, zu einer klinisch feststellbaren oder auch zu einer klinisch nicht feststellbaren Infektion führt, ist es von großer Wichtigkeit, festzustellen, ob im Blut von Spendern HB-Antigen vorhanden ist. Der HB-Antikörper hat klinische Bedeutung, weil er in einem hohen Prozentsatz in der Rekonvaleszenzphase einer Hepatitis-B-Infektion nachgewiesen werden kann. Es ist auch noch nicht bekannt, ob Blutkonserven, deren Serum HB-Antikörper enthält, auch den Erreger der Hepatitis-B übertragen können. Auch der möglichst empfindliche Nachweis des HB-Antikörpers ist daher ein wichtiges Anliegen in der Klinik. Nachstehend wird das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise an einem Verfahren zum Nachweis von HB-Antigen und -Antikörpererläutert. Since a close relationship between the HB antigen and hepatitis B can be considered proven and HB antigen positive As is well known, blood can transmit the pathogen that causes hepatitis B in the recipient if it does not is immune, leads to a clinically detectable or also to a clinically undetectable infection, it is It is of great importance to determine whether HB antigen is present in the blood of donors. The HB antibody is of clinical importance because a high percentage of it is in the convalescence phase of a hepatitis B infection can be proven. It is also not yet known whether blood products whose serum HB antibodies also contain the pathogen causing hepatitis B can transfer. The most sensitive possible detection of the HB antibody is therefore also one important concern in the clinic. The method according to the invention is for example based on a Methods for the detection of HB antigen and antibody illustrated.
A. Direkter Radioimmuntest auf HB-Antikörper. dessen grundsätzliche Verfahrensmerkmale bekannt sindA. Direct radioimmunoassay for HB antibodies. whose basic procedural features are known
Zerschneidbare Mikroliterplatten, beispielsweise der Firma Cooke, werden mit einem Gemisch gereinigtenCuttable microliter plates, for example from Cooke, are cleaned with a mixture
HB-Antigens beider Subtypen D und Y (S e h α b e ι, A„ Thorassen, R. und U. K ab ο lh, Deutsche Medizinische Wochenschrift 97 (1972), S. 1579 -1583, »Serologische Subtypen des Hepatitis-B-Antigen>, [Australia-Antigen]«) beschichtet Das Gemisc1' ist alkalisch (0,01 M-Tris-Puffer, pH 94) und enthält etwa 300 ng HB-Antigen-Protein pro ml. HB antigens of both subtypes D and Y (S eh α be ι, A “Thorassen, R. and U. K ab ο lh, Deutsche Medizinische Wochenschrift 97 (1972), pp. 1579-1583,“ Serological subtypes of hepatitis B -Antigen>, [Australia-Antigen] «) coated The mixture 1 'is alkaline (0.01 M-Tris buffer, pH 94) and contains about 300 ng HB antigen protein per ml.
Die Reinigung des HB-Antigens aus Vc'.lserum erfolgte nach dem sogenannten R0- S-Verfahren (R0 = Dichte, S = Sedimentation), d. h. einer kombinierten Dichteg'ieichgewichts- und Sedimentationsgradientenzentrifugaiion, vorgenommen in Caesiumchlorid. Kriterien der Reinheit der Präparate sind ihre fehlende Reaktion mit Anti-Humanserum im Immundiffussionstest sowie das Nichtreagieren von im Versuchstier mit diesen Präparaten erzeugten Antikörpern mit menschlichen Serumproteinen.The HB antigen was purified from Vc'.lserum according to the so-called R 0 - S method (R 0 = density, S = sedimentation), i. H. a combined density equilibrium and sedimentation gradient centrifugation, carried out in cesium chloride. The criteria for the purity of the preparations are their non-reaction with anti-human serum in the immunodiffusion test and the non-reaction of antibodies generated in the test animal with these preparations with human serum proteins.
Das zur Beschichtung verwendete KB-Antigen wird mindestens 6 Stunden bei 20°C in den Näpfchen der
Mikrotiterplatten belassen, danach abgesaugt. Nacn fünfmaliger Spülung mit neutralem Puffer (0.01 M-Tm-Puffer,
pH 7,5) werden Proben einer Verdünnungsreihe eines Eich-HB-Antiserums, das möglichst nur die
spezifische Subtypendeierminante Ami-;; enthält, einpipeuieri.
Nach einer Inkubation von z. B. 1 Stunde be. 37'C oder 12 Stunden bei 20"C wird der Inhalt e;i:ei
abgesaugt und die Platte gespült. Es wird dann ->j-ma!-
kiertes HB-Aniigen (hergestellt nach W. M. H u
und F. C. G ree η wood, Nature 194 [l%2j, -,.
ebenfalls ein Gemisch beider Subtypen. das zwische 20 000 und 40 000 impulse pro Minute (lpM)/0.1 n;
liefert, zugegeben und 1 Stunde bei 37 C cn.ii·; 1
Stunden bei 200C inkubiert. Nach erneute-.·.] Admüii;:!The KB antigen used for coating is left in the wells of the microtiter plates at 20 ° C. for at least 6 hours, then suctioned off. After rinsing five times with neutral buffer (0.01 M-Tm buffer, pH 7.5), samples of a dilution series of a calibration HB antiserum containing only the specific subtype-defining ami- ;; contains, einpipeuieri. After incubation of e.g. B. 1 hour be. 37 ° C or 12 hours at 20 ° C, the contents e; i: ei are sucked off and the plate is rinsed
and FC G ree η wood, Nature 194 [l% 2j, - ,.
also a mixture of both subtypes. between 20,000 and 40,000 pulses per minute (lpM) /0.1 n; supplies, added and 1 hour at 37 C cn.ii ·; Incubated at 20 ° C. for 1 hour. After renewed-. ·.] Admüii;:!
η ι ν 49 η ι ν 49
und Spülen werden die Mikrotiterplatten zerschnitten und die Radioaktivität in einem -/-Strahlen-Meßgerät gemessen. Bei niedrigen Serumverdürmungen dec Eich-HB-Antikörpers erhält man eine hohe Impulszahl, die in den weiter verdünnten Proben abnimmt und schließlich die Impulswerte der gleichzeitig mitgeführten negativen Kontrollen erreicht (Fig. 1). Die Spezifität dieses direkten HB-Antikörpertesis ließ sich einerseits durch Hemmversuche sichern. Dabei wird das auf HB-Antikörper zu untersuchende Maieria! mit einer bestimmten Menge von HB-Antigen versetzt und inkubiert, z. B. 1 Stunde bei 37°C, wobei Röhrchen oder Mikrotiterplatten verwendet werden, die nicht mn HB-Antigen beschichtet sind. Nach dieser Inkubation wird das Gemisch in HB-Antigen-beschichtete Planes inkubiert, danach wird abgesaugt und gewaschen. Anschließend wird 125J-markiertes HB-Antigen zugegeben und wieder inkubiert. Nach Absaugen und Waschen erfolgt die Messung der Radioaktivität. Wenn in dem zu untersuchenden Material 1 !B-Anukorr-.·.- \or'i:;nden sind, üann werden diese Antikörper durc:; das zugelügte Antigen abgebunden und können deshalb in der /« eilen Inkubation nicht mehr an das an der !ester, Oberfläche vorhandene Antigen gebunden v\erden. (Deshalb du. Bezeichnung »Hemmtest«.)and rinsing, the microtiter plates are cut and the radioactivity is measured in a - / - radiation measuring device. If the serum dilution of the c calibration HB antibody is low, a high number of pulses is obtained, which decreases in the further diluted samples and finally reaches the pulse values of the negative controls carried out at the same time (FIG. 1). The specificity of this direct HB antibody tesis could on the one hand be secured by means of inhibition experiments. The Maieria! Which is to be examined for HB antibodies is thereby mixed with a certain amount of HB antigen and incubated, e.g. B. 1 hour at 37 ° C, using tubes or microtiter plates that are not coated with HB antigen. After this incubation, the mixture is incubated in HB antigen-coated planes, then suctioned off and washed. 125 I-labeled HB antigen is then added and incubated again. After suction and washing, the radioactivity is measured. If there are 1! B-anucorr-. the attached antigen is bound and can therefore no longer be bound to the antigen present on the ester surface in the rapid incubation. (Hence you. The term "inhibited".)
W uitci iiei.i sich zeigen, »lau im "1 est^crum möglicherweise vorliegende /\migiobuline oder -Vui-p-üpopr'i- ;eine nieh; zu falsch positiven : : Dennissen iühren. Untersuchungen haben gezeigt, uaj aiic erhaltenen Impulswerte als spezifisch für HB-Anukorper anzusehen sind, oie reproduzierbar übe: dem 2,0iachen ül Mittelwertes der negativen Kontrolle liegen, wie die nachfolgende Tabelle 1 zeigt:W uitci iiei.i show themselves »lukewarm in the" 1 est ^ crum possibly present / \ migiobuline or -Vui-p-üpopr'i- ; a nieh; to false positives:: Dennissen you lead. Investigations have shown, among other things, aiic obtained To consider impulse values as specific for HB anukbodies are, oie reproducible over: the 2.0iachen ül Mean values of the negative control are as shown in Table 1 below:
-ρ,, ι u .-ρ ,, ι u.
Beziehung zwischen Spe/iiiiat und Mittelwert A' der negativen KontrollenRelationship between Spe / iiiiat and mean value A 'der negative controls
422422
B. Der unter A beschriebene Test eignet sich zum kombinierten HB-Antigen- und Ant;körpernachweis, wenn man eine Vorinkubation des zu untersuchenden Serums mit einer vorgegebenen, relativ niedrigen HB-Antikörpermenge durchführt. Enthält das Testscrum HB-Antigen, wird im anschließend nach A durchgeführten Festkörper-Radioimmuntest eine Im pulsreduktion gegenüber den negativen Kontrollen beobachtet, während beim Vorliegen ausreichende· Mengen von HB-Antikörpern eine lmpulserhöhunj: feststellbar ist, da die Impulszahl sich dem vorgegebenen Antikörper hinzuaddiert (vgl. hierzu F i g. 3).B. The test described under A is suitable for the combined HB antigen and ant ; body detection if the serum to be examined is preincubated with a given, relatively low amount of HB antibody. If the test crum contains HB antigen, a pulse reduction compared to the negative controls is observed in the solid-state radioimmuno test carried out according to A, while if sufficient amounts of HB antibodies are present, an increase in pulse can be determined because the number of pulses is added to the given antibody ( see Fig. 3).
Zur Vorinkubation wird vorzugsweise eine Antikörpermenge verwendet, die zwischen 10 und 15% der maximal fixierbaren Radioaktivität liefert, d. h. im Sättigungsbereich des betreffenden Eich-Antikörpcis bei niedriger Serumverdünnung vorliegt. Etwa 35C0 Ansätze mit negativen Kontrollen haben ergeben, daß die Standardabweichung 1 Sigma ungefähr 10% beträgt, «""in die erwähnten 10 bis 15% Antikörperbindurg Impulse zwischen 500 und 1500 je Minute liefern. Eine etwas höhere Standardabweichung der negativen Kontrollen (> 10%) ergibt sich bei Impuiszahlen unter 500 je Minute. Als Sicherheitsschwelle wurden 3 Sigma gewählt, d. h. HB-Antigen liegt vor, wenn die Impulsreduktion reproduzierbar über 30% der negativen Kontrollen beträgt. HB-Antikörpur, wenn eine Impulserhöhung von über 30% zu verzeichnen ist (F i g. 2). Auch hier hat eine Inkubationsdauer von 1 Stunde bei 37 C bei den verschiedenen Inuiibationsschriuen ausgezeichnete Ergebnisse geliefert.For the preincubation, an amount of antibody is preferably used which is between 10 and 15% of the provides maximum fixable radioactivity, d. H. in the saturation range of the respective calibration antibody present at low serum dilution. About 35C0 runs with negative controls have shown that the standard deviation of 1 sigma is approximately 10%, «" "In the mentioned 10 to 15% antibody binding Deliver impulses between 500 and 1500 per minute. One slightly higher standard deviation of the negative controls (> 10%) results from impulse numbers below 500 per minute. 3 sigma were chosen as the safety threshold, i. H. HB antigen is present when the impulse reduction reproducibly amounts to more than 30% of the negative controls. HB antibody when an increase in pulse of over 30% is recorded (Fig. 2). Here, too, has an incubation period of 1 hour 37 C for the various letters of instruction delivered excellent results.
Wie vorstehend bereits ausgeführt, liefen der beschi iebenc Test eindeutig spezifische 1 rgebnisse. Der Unterschied zwischen dem kombinierten Test und dem direkten Antikörper-Radioimmuntest hegt dabei darin, daß der im Testserum vorliegende Antikörper sich nicrbei dem vorgegebenen Antikörper hm/uaddieri. Da der HR-Antigennachweis im kombinierten Test durch Reduktion der vorgegebenen Antiköniermengc erfolgt, ist die bereits beschriebene Spczifitäi der HB-Antikör-As already stated above, the Beschi iebenc test unequivocally specific 1 results. The difference between the combined test and the direct antibody radioimmuno test entails that the antibody present in the test serum does not adhere to the given antibody. There the HR antigen detection is carried out in the combined test by reducing the specified amount of antigen, is the already described specification of the HB antibodies
perbestimmung zugleich Grundlage des spezifischen HB-Antigennachweises. Eine unspezifische Antikörperreduktion durch andere Antikörper kann ausgeschlossen werden. Eine Ausnahme bilden die im Probenmaterial möglicherweise vorliegenden Antikörper, die gegen den HB-Antikörper selbst gerichtet sind. Die Testdurchführung wird in der nachstehenden Tabelle 2 bildlich erfaßt. Es sei dabei auch darauf hingewiesen, daß fiir eine sichere Mittelwertbildung bei den negativen Konimllen mindestens K Seien mitgefühlt worden sollten.per-determination at the same time the basis of the specific HB antigen detection. An unspecific antibody reduction by other antibodies can be excluded will. The antibodies against the HB antibodies themselves are directed. The test procedure is illustrated in Table 2 below recorded. It should also be pointed out that for a reliable averaging with the negative Konimllen at least K have been sympathized should.
Zwar ist es bei der praktischen Anwendung des kombinierten Tests besonders vorteilhaft, daß die Reaktion (ohne Messung) in gut 3 Stunden abgeschlossen werden kann, wenn jedoch ausreichend Zeil zur Verfügung steht, ist es vorteilhaft, die Inkubationsdauer nach Zugabe des markierten Antigens auf 90 bis 120 Minuten zu verlängern.Although it is particularly advantageous in the practical application of the combined test that the Reaction (without measurement) can be completed in a good 3 hours, but if there is enough time for it Is available, it is advantageous to reduce the incubation time to 90 to 120 after adding the labeled antigen Minutes to extend.
Hierzu 3 Blatt ZeichnungenFor this purpose 3 sheets of drawings
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